Den streptozotocininducerade diabetiska sårmodellen hos manliga SD-råttor är för närvarande den mest använda modellen för att studera sårläkning vid typ I-diabetes mellitus. Detta protokoll beskriver de metoder som används för att konstruera denna modell. Den presenterar och adresserar också potentiella utmaningar och undersöker progression och angiogena egenskaper hos diabetiska sår.
En enda hög dos streptozotocininjektion följt av hudexcision i fulltjocklek på ryggen hos råttor är en vanlig metod för att konstruera djurmodeller av typ 1-diabetessår. Felaktig manipulation kan dock leda till modellinstabilitet och hög dödlighet hos råttor. Tyvärr finns det få befintliga riktlinjer för typ 1-diabetisk sårmodellering, och de saknar detaljer och presenterar inte specifika referensstrategier. Därför beskriver detta protokoll den fullständiga proceduren för att konstruera en typ 1-diabetisk sårmodell och analyserar progressionen och angiogena egenskaper hos diabetessåren. Typ 1 diabetisk sårmodellering innefattar följande steg: beredning av streptozotocininjektionen, induktion av typ 1-diabetes mellitus och konstruktion av sårmodellen. Sårområdet mättes dag 7 och dag 14 efter sår, och hudvävnaderna hos råttorna extraherades för histopatologisk och immunofluorescensanalys. Resultaten visade att typ 1-diabetes mellitus inducerad av 55 mg / kg streptozotocin var associerad med lägre dödlighet och en hög framgångsgrad. Blodsockernivåerna var relativt stabila efter 5 veckors induktion. Den diabetiska sårläkningshastigheten var signifikant lägre än för normala sår dag 7 och dag 14 (p < 0,05), men båda kunde nå mer än 90% på dag 14. Jämfört med normalgruppen var epidermalt skiktförslutning av diabetessår dag 14 ofullständig och hade fördröjd reepitelisering och signifikant lägre angiogenes (p < 0,01). Typ 1-diabetessårmodellen konstruerad baserat på detta protokoll har egenskaperna för kronisk sårläkning, inklusive dålig stängning, fördröjd återepitelisering och minskad angiogenes jämfört med normala råttsår.
Typ 1-diabetes mellitus (T1DM) är en kronisk metabolisk sjukdom som kännetecknas av hyperglykemi och förstörelse av bukspottskörtelns β-celler1. Ett T1DM-sår är ett kroniskt icke-läkande sår och den vanligaste och förödande komplikationen av diabetes hos människor 2,3. Djurmodeller är de mest lämpliga prototyperna för att studera de patologiska förändringarna under sårläkning och säkerheten och effekten av potentiella terapeutiska medel4. Jämfört med andra typer är hanråttor av typen Sprague-Dawley (SD) känsligare för streptozotocin (STZ) och uppvisar en lägre relaterad dödlighet, vilket gör dem populära inom forskning om diabetessår 5,6.
Många metoder för att konstruera T1DM-sårmodeller har beskrivits. När det gäller T1DM-modellen har studier främst fokuserat på effekten av STZ-injektionsmetoden på framgångsgraden för diabetesinduktion 7,8. Modelleringsprocessen lider emellertid av den inkonsekventa driften av samma steg. I en studie, råttor fasta för 18 h före STZ injektion; råttor med blodsockernivåer högre än 16,67 mmol / L 1 vecka efter STZ-injektionen ansågs diabetiker och diabetessåret introducerades efter 3 veckor9. Omvänt, i en relaterad studie, fastade Zhu et al. råttor i 12 timmar före STZ-injektionen; råttor med blodsockernivåer högre än 16,7 mmol/l vid 72 timmar efter injektionen ansågs diabetiker, och diabetessåret infördes efter 4 veckor10. Sammantaget finns det inkonsekvenser i STZ-injektionsprotokollen, diabetesdiagnoskriterier och sårintroduktionstider.
När det gäller sårmodellering skärs i de flesta studier hela tjockleken på rygghuden ut för att konstruera T1DM-sår efter framgångsrik diabetesinduktion11,12,13. Även om denna modell är mottaglig för hudkontraktur hos råttor, är det den vanligaste modellen inom sårläkningsforskning eftersom den är mindre arbetsintensiv och är billig14,15. Ändå saknas metodstyrd forskning om denna excisionsteknik med full tjocklek. Dessutom finns det inga enhetliga standarder i befintliga studier avseende sårstorlek och plats12,16. Sårets storlek och placering kan indirekt påverka konsistensen av den experimentella designen och resultatens vetenskapliga giltighet. Därför finns det ett akut behov av ett standardprotokoll för T1DM-induktion och sårmodellering som referens för forskare. Målet med denna studie är att visualisera ett specifikt protokoll för T1DM sårmodellering som kan användas som referens för T1DM sårstudier.
Detta protokoll klargör de omtvistade operationerna i T1DM sårmodellering. Oro över STZ-injektionsprotokollen, framgångskriterier för T1DM-induktion, blodsockerstabiliseringstid och sårplats och storlek har tagits upp i detta arbete. Vidare har de patologiska egenskaperna och mätbara parametrarna för T1DM sårläkningsbedömning klargjorts.
Råttorna fastade i 18 timmar före STZ-injektionen för att undvika kompetitiv bindning av glukos eller dess analoger till β-celler, vilket kan påverka effekten av STZ. Den vanligaste metoden för att inducera T1DM är en enda hög dos av STZ, vilket ökar blodsockret genom att skada öarna och minska insulinsekretionen21. Förexperimentella studier visade att den optimala STZ-dosen för en hög framgångsgrad och en låg dödlighet var 55 mg/kg, vilket är lägre än de optimala doserna som rapporterats i tidigare studier22,23,24. I detta protokoll inducerades T1DM med en enda intraperitoneal injektion på 55 mg/kg STZ.
Blodsockernivåerna var alla högre än 16,7 mmol / L 3 dagar efter STZ-injektionen. En blodsockernivå högre än 16,7 mmol / L på dag 7 efter STZ-injektion är dock det rekommenderade kriteriet för framgångsrik T1DM-modellering, eftersom omfattningen av öskador varierar mellan råttor och en lämplig förlängning av diagnostiden kan minska den falskt negativa frekvensen. Dessutom stabiliserades blodsockerfluktuationerna 5 veckor efter STZ-injektionen, och råttorna ökade gradvis i vikt under denna period, i överensstämmelse med tidigare fynd25,26. Detta indikerar att blodsockernivån i T1DM-modellen bör stabiliseras i minst 6 veckor, och en ökning av råttvikt efter 6 veckor minskar dödligheten under sårmodelleringen. Därför utförde detta protokoll sårmodellering 8 veckor efter STZ-injektionen.
Sårstängningsfrekvensen dag 7 och dag 14 efter sår var signifikant lägre hos diabetiker än i gruppen med normala sår, vilket indikerar långsam läkning. Dessutom var sårepitelisering och angiogenes signifikant lägre hos diabetiker än i normalgruppen. Detta visar att T1DM-sårmodellen visar långsammare sårläkning och fördröjd återepitelisering än hos normala råttor, vilket kan vara relaterat till de patologiska förändringarna av minskad sårangiogenes. Men på dag 14 var T1DM-sårläkningshastigheten också över 90%, vilket skiljer sig från den kroniska icke-läkande egenskapen hos mänskliga diabetiska sår. Detta kan bero på att gnagares fysiologiska mekanismer för sårläkning skiljer sig från människors27. Följaktligen är den bästa sårdiametern minst 20 mm, vilket är tillräckligt stort för att ge tid att bedöma en interventions effektivitet i en diabetessårstudie. Sårplatsen bör undvika skulderbladet och ryggraden, eftersom kontinuerlig rörelse på dessa två ställen kan störa sårläkning.
Sammanfattningsvis är konstruktionen av T1DM-sårmodellen med metoden för detta protokoll effektiv. Protokollet replikerar några av egenskaperna hos kroniska diabetiska sår, såsom långsammare sårläkning, fördröjd återepitelisering och minskad angiogenes jämfört med normala råttsår. Det är dock okänt om modellen kan replikera andra kroniska fenotyper av diabetiska sår. Dessutom beskriver detta protokoll den mest grundläggande och mest använda metoden, som inte tar hänsyn till frågan om hudkontraktion hos råttor. Framtida forskning kan införliva användningen av sårskenor i detta protokoll eller utforska ytterligare modeller av kroniska diabetessår, vilket kommer att bli en betydande utmaning för forskare i framtiden.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes ekonomiskt av National Natural Science Foundation of China (82104877).
Antifade mounting medium | Southern Biotechnology Associates, Inc. | 0100-01 | |
AutoFluo Quencher | Servicebio Technology co., Ltd. | G1221 | |
Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific Inc. | Varistain™ Gemini ES | |
CD31 | Servicebio Technology co., Ltd. | GB11063-2 | |
Citrate antigen retrieval solution | Servicebio Technology co., Ltd. | G1201 | |
Cover glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 10212432C | |
DAPI | Servicebio Technology co., Ltd. | G1012 | |
Decolorization shaker | Scilogex | S1010E | |
Depilatory cream | Guangzhou Ruixin Biotechnology Co., Ltd. | — | |
Dimethyl benzene | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 64-17-5 | |
Drug oscillator | Shenzhen Jiashi Technology Co., Ltd. | VM-370 | |
Electric razor | Shanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd. | FC5908 | |
Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | JB-P5 | |
Ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 1330-20-7 | |
Fitc-labeled goat anti-rabbit IgG | Servicebio Technology co., Ltd. | GB22303 | |
Goat serum | Thermo Fisher Scientific Inc. | 16210064 | |
Hematoxylin and eosin staining solution | Beijing Regan Biotechnology Co., Ltd. | DH0020 | |
Image J software | National Institutes of Health | — | |
Microwave oven | Midea Group Co., Ltd. | M1-L213B | |
Mini centrifuge | Scilogex | D1008 | |
Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
Portable blood glucose meter | Sinocare Inc. | GA-3 | |
Rapid tissue processor | Thermo Fisher Scientific Inc. | STP420 ES | |
Rat fixator | Globalebio (Beijing) Technology co., Ltd | GEGD-Q10G1 | |
Slicing machine | Thermo Fisher Scientific Inc. | HM325 | |
Slides glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 80312-3181 | |
sodium citrate buffer | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | c1013 | |
Streptozotocin | Sigma | 57654595 |