Summary

Ett protokoll för att konstruera en råttsårmodell av typ 1-diabetes

Published: February 17, 2023
doi:

Summary

Den streptozotocininducerade diabetiska sårmodellen hos manliga SD-råttor är för närvarande den mest använda modellen för att studera sårläkning vid typ I-diabetes mellitus. Detta protokoll beskriver de metoder som används för att konstruera denna modell. Den presenterar och adresserar också potentiella utmaningar och undersöker progression och angiogena egenskaper hos diabetiska sår.

Abstract

En enda hög dos streptozotocininjektion följt av hudexcision i fulltjocklek på ryggen hos råttor är en vanlig metod för att konstruera djurmodeller av typ 1-diabetessår. Felaktig manipulation kan dock leda till modellinstabilitet och hög dödlighet hos råttor. Tyvärr finns det få befintliga riktlinjer för typ 1-diabetisk sårmodellering, och de saknar detaljer och presenterar inte specifika referensstrategier. Därför beskriver detta protokoll den fullständiga proceduren för att konstruera en typ 1-diabetisk sårmodell och analyserar progressionen och angiogena egenskaper hos diabetessåren. Typ 1 diabetisk sårmodellering innefattar följande steg: beredning av streptozotocininjektionen, induktion av typ 1-diabetes mellitus och konstruktion av sårmodellen. Sårområdet mättes dag 7 och dag 14 efter sår, och hudvävnaderna hos råttorna extraherades för histopatologisk och immunofluorescensanalys. Resultaten visade att typ 1-diabetes mellitus inducerad av 55 mg / kg streptozotocin var associerad med lägre dödlighet och en hög framgångsgrad. Blodsockernivåerna var relativt stabila efter 5 veckors induktion. Den diabetiska sårläkningshastigheten var signifikant lägre än för normala sår dag 7 och dag 14 (p < 0,05), men båda kunde nå mer än 90% på dag 14. Jämfört med normalgruppen var epidermalt skiktförslutning av diabetessår dag 14 ofullständig och hade fördröjd reepitelisering och signifikant lägre angiogenes (p < 0,01). Typ 1-diabetessårmodellen konstruerad baserat på detta protokoll har egenskaperna för kronisk sårläkning, inklusive dålig stängning, fördröjd återepitelisering och minskad angiogenes jämfört med normala råttsår.

Introduction

Typ 1-diabetes mellitus (T1DM) är en kronisk metabolisk sjukdom som kännetecknas av hyperglykemi och förstörelse av bukspottskörtelns β-celler1. Ett T1DM-sår är ett kroniskt icke-läkande sår och den vanligaste och förödande komplikationen av diabetes hos människor 2,3. Djurmodeller är de mest lämpliga prototyperna för att studera de patologiska förändringarna under sårläkning och säkerheten och effekten av potentiella terapeutiska medel4. Jämfört med andra typer är hanråttor av typen Sprague-Dawley (SD) känsligare för streptozotocin (STZ) och uppvisar en lägre relaterad dödlighet, vilket gör dem populära inom forskning om diabetessår 5,6.

Många metoder för att konstruera T1DM-sårmodeller har beskrivits. När det gäller T1DM-modellen har studier främst fokuserat på effekten av STZ-injektionsmetoden på framgångsgraden för diabetesinduktion 7,8. Modelleringsprocessen lider emellertid av den inkonsekventa driften av samma steg. I en studie, råttor fasta för 18 h före STZ injektion; råttor med blodsockernivåer högre än 16,67 mmol / L 1 vecka efter STZ-injektionen ansågs diabetiker och diabetessåret introducerades efter 3 veckor9. Omvänt, i en relaterad studie, fastade Zhu et al. råttor i 12 timmar före STZ-injektionen; råttor med blodsockernivåer högre än 16,7 mmol/l vid 72 timmar efter injektionen ansågs diabetiker, och diabetessåret infördes efter 4 veckor10. Sammantaget finns det inkonsekvenser i STZ-injektionsprotokollen, diabetesdiagnoskriterier och sårintroduktionstider.

När det gäller sårmodellering skärs i de flesta studier hela tjockleken på rygghuden ut för att konstruera T1DM-sår efter framgångsrik diabetesinduktion11,12,13. Även om denna modell är mottaglig för hudkontraktur hos råttor, är det den vanligaste modellen inom sårläkningsforskning eftersom den är mindre arbetsintensiv och är billig14,15. Ändå saknas metodstyrd forskning om denna excisionsteknik med full tjocklek. Dessutom finns det inga enhetliga standarder i befintliga studier avseende sårstorlek och plats12,16. Sårets storlek och placering kan indirekt påverka konsistensen av den experimentella designen och resultatens vetenskapliga giltighet. Därför finns det ett akut behov av ett standardprotokoll för T1DM-induktion och sårmodellering som referens för forskare. Målet med denna studie är att visualisera ett specifikt protokoll för T1DM sårmodellering som kan användas som referens för T1DM sårstudier.

Protocol

Protokollet genomfördes efter Helsingforsdeklarationen, och alla djurförsök godkändes av förvaltningskommittén från Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Record No. 2021-13). 1. Beredning av streptozotocininjektionen Välj 15 SD-hanspecifika patogenfria (SPF) råttor i åldern 8 veckor och väger 220 g ± 20 g. Använd den enkla randomiseringsmetoden och dela råttorna i en diabetisk grupp (n = 10) och en normal grupp (n = 5). Mät råttornas initialvikt och bestäm dosen av STZ genom administrering av 55 mg/kg.OBS: Baserat på förexperiment är 55 mg / kg den optimala STZ-dosen. Väg STZ-pulvret noggrant och placera det i en ljustät behållare. Tillsätt en lämplig mängd 0,1 mol/l natriumcitratbuffert (pH 4,5) för att lösa upp STZ till en koncentration på 1 %.OBS: Natriumcitratbufferten måste förkylas i 2 timmar i ett kylskåp på 4 °C före användning. Beredningen av STZ-lösningen måste säkerställa sterilitet. Skaka i 30 s med en läkemedelsoscillator. Lägg i en islåda och lägg åt sidan.OBS: Injektionen ska användas inom 15 minuter. 2. Induktion av T1DM-modellen Innan STZ-injektionen, fasta råttorna i 18 timmar och ge fri tillgång till vatten. Utför en intraperitoneal injektion av 1% STZ-lösning.Ta tag i råttan och exponera bukhuden och injektionsstället (skärningspunkten mellan linjen som förbinder rötterna på de två låren och bukens mittlinje). Desinficera injektionsstället två gånger med en bomullstuss indränkt i 75 % alkohol (en gång medurs och en gång moturs). Placera råttans huvud under buken. För in nålen parallellt med bukens mittlinje i en vinkel på 45°, och efter att ha genomborrat huden, minska nålvinkeln till 30° och sätt sedan in nålen 2-3 mm. Dra försiktigt i nålpluggen och se till att inget blod eller vätska sugs in i sprutan. Injicera STZ-lösningen, dra ut nålen och stoppa blödningen med en bomullspinne.OBS: Om en gul vätska dras tillbaka in i sprutan kan nålen ha trängt in i urinblåsan, och om en mörkgrön vätska dras kan nålen ha trängt in i tjocktarmen eller caecum. I båda fallen ska nålen tas bort omedelbart. Djuret ska utvärderas av veterinärpersonal. Mät de tillfälliga (icke-fastande eller fastande) blodsockernivåerna klockan 09:00 på dag 3 och dag 7 efter STZ-induktion.OBS: Tiden för slumpmässig blodsockermätning är fast. I detta protokoll är det fixat klockan 09:00. Det är dock inte den enda gången som används. Blod som samlas in från den kaudala venen genom en nålpunktion är mindre mottaglig för vävnadsvätska än blod som tas från en avskuren svans, så blodsockervärdena är mer exakta.Immobilisera råttan med hjälp av en råttfixator (figur 1). Hitta platsen för den kaudala venen. Desinficera råttans svans två gånger med en bomullstuss blöt i 75% alkohol. Punktera den kaudala venen för att inducera blödning och mäta blodsockret med hjälp av en glukometer. Stoppa blödningen med en bomullspinne.OBS: En glukosnivå högre än 16,7 mmol / L på dag 7 efter STZ-injektionen anses vara T1DM. Väg råttorna varje vecka och mät blodsockernivån och andra parametrar, inklusive kost, vattenintag och urinproduktion. Foder djuren normalt i 8 veckor efter STZ-induktion. 3. Konstruktion av sårmodellen Raka råttorna med en elektrisk rakhyvel 1 dag före sårmodellering. Ett rakat område på 5 cm x 5 cm på ryggsidan av råttan är i allmänhet idealiskt. Torka av det rakade området med en varm normal saltlösning bomullstuss, låt den torka och applicera sedan hårborttagningskräm i 5 minuter. Rengör området med gasväv och tvätta eventuell kvarvarande hårborttagningskräm med varm normal saltlösning. Väg råttorna och beräkna erforderlig dos av Nembutal baserat på standarden 35 mg/kg. Lös upp Nembutal med normal saltlösning till en koncentration av 3%. Andra narkosmedel såsom ketamin/xylazin eller isofluran kan användas för denna procedur. Vänligen arbeta med institutionella djurvårds- och användningskommittéer för att säkerställa vad som är bäst.OBS: För att säkerställa effekt ska lösningen vara nyberedd och Nembutal-pulvret och lösningen ska skyddas från ljus. Fasta råttorna i 12 timmar före bedövning. Injicera anestesi intraperitonealt. Använd tetracyklin ögonsalva eller ett allmänt ögonsmörjmedel för att förhindra ögontorrhet efter anestesiadministrering.OBS: Anestesi ansågs måttlig när råttans muskler var relativt avslappnade, ögonrörelserna försvann, andningen var regelbunden och svaret på smärtsamma stimuli var litet. Desinficera dorsalhuden två gånger med bomullstussar indränkta i jod (en gång medurs och en gång moturs) och 75% alkohol (alternativa rundor). Efter torkning, skär huden med en 20 mm diameter cirkulär biopsistans. Tält huden med sterila pincett och använd sedan steril kirurgisk sax för att ta bort huden i full tjocklek längs stansskärmärkena. Stoppa blödningen med en vanlig saltlösning bomullstuss.OBS: Sårets övre kant ska vara 5-10 mm under den nedre skulderbladsgränsen och 5-10 mm till höger/vänster om ryggraden på råttan (figur 2). Såren är symmetriska längs ryggraden när två sår konstrueras. Använd vaselinväv för att täcka såren och linda dem med en gasväv och andningsbandage som hålls på plats med gummiband. Injicera karprofen subkutant (5 mg/kg) en gång dagligen för att lindra postoperativ smärta. Byt sårbandage en gång om dagen (användning av karprofen för smärtlindring).OBS: Observera råttans rörelse och andning för eventuella avvikelser efter att bandaget är klart och se till att det andningsbara bandaget är lämpligt tätt. Placera en linjal under såret och fotografera såret med en digitalkamera fram till dag 14. Avliva råttorna på dag 14 enligt de institutionella riktlinjerna för djurvård och användning. Skär sårhudvävnaden 5 mm från sårkanten. Dela vävnadsprovet i två delar, tvätta dem med PBS för att ta bort synliga blodfläckar och fixa dem sedan med 4% paraformaldehydlösning. 4. Beräkning av sårområdet med ImageJ-programvaran Klicka på Arkiv-knappen efter att du har öppnat programvaran och släpp sedan ner och klicka på Öppna för att öppna sårbilderna. Välj verktyget Rak och rita en rak linje på 1 cm längs linjalen i sårbilderna. Klicka på kommandot Ange skala i menyn Analysera och ställ in Känt avstånd till 1. Välj markeringsverktyget för frihand och skissa sårets kontur på bilden. Klicka på kommandot Mät i menyn Analysera och läs Area-värdet efter att resultatet dyker upp. 5. Färgning av hematoxylin och eosin (H&E) Ta bort hudvävnaden från fixativet, skär den i tunna sektioner med en skalpell i en dragskåp och placera den i en uttorkningskassett. Sätt uttorkningskassetten i en uttorkningsmaskin och torka ut vävnaderna i följande steg: 75% alkohol i 4 timmar; 85% alkohol i 2 timmar; 90% alkohol i 2 timmar; 95% alkohol i 1 timme; vattenfri etanol I och II i 30 minuter vardera, alkohol bensen i 5-10 min; xylen I och II i 5-10 min vardera; och vax I, II och III i 1 h vardera. Bädda in vävnaderna i vax. Kyl vid -20 ° på ett frysbord och korrigera vaxblocket snyggt. Skär vaxblocken i längdriktningen med en paraffinsektionsmaskin i 3 μm tjocka sektioner. Blötlägg sekventiellt sektionen i xylen I och II i 20 minuter vardera, vattenfri etanol I och II i 5 minuter vardera och kranvatten i 5 minuter. Översvämma vävnaderna med hematoxylinfläck i 3-5 min, 0,5% vattenhaltig saltsyralösningsdifferentiering, 0,5% vattenhaltig ammoniaklösning tillbaka till blått och skölj med vatten. Dehydrera vävnadssektionerna med 85% och 95% alkohol. Översvämma vävnaderna med eosinfärgningslösning i 5 minuter.OBS: Normalt tar eosinfärgning 30 s till 2 min, och tiden kan justeras enligt färgningsresultaten och kraven. Dehydrera sektionerna sekventiellt med följande lösningar: vattenfri etanol I, vattenfri etanol II, vattenfri etanol III, xylen I och xylen II, vardera i 5 minuter. Slutligen täck glasskivorna med neutral balsam. Undersök H &E-färgade vävnader under mikroskopet vid 40x, 20x och 10x och ta bilder för att behålla representativa bilder av varje bild. 6. CD31 immunofluorescensfärgning Blötlägg vävnadssnitten i xylen I och II i 15 minuter vardera, vattenfri etanol I och II i 5 minuter vardera, 85% alkohol i 5 minuter och 75% alkohol i 5 minuter och skölj med destillerat vatten. Antigen reparationTillsätt en lämplig 10 mM citronsyrabuffert med pH 6,0 i en mikrovågsugnsbehållare, värm den till kokning på hög och placera sedan glasskivan i den. Koka i 8 min på medelvärme, sluta i 8 minuter och koka sedan igen på medel-låg värme i 7 min. Låt objektglasen svalna, placera dem i PBS (pH 7,4) och tvätta dem tre gånger i 5 minuter vardera med en avfärgningsskak. Tillsätt 5% getserum droppvis i cirkeln och inkubera i 30 min. Skaka försiktigt av stängningslösningen (5% getserum) och tillsätt kaninanti-CD31-antikropp (utspädd med PBS i förhållandet 1:200) droppvis på sektionerna. Lägg sektionerna i en våt låda och inkubera över natten vid 4 ° C. Tvätta objektglasen tre gånger med PBS (pH 7,4) på en avfärgningsskakapparat i 5 minuter vardera. Skaka sektionerna lätt för att torka dem och täck dem sedan med en cirkulär droppe FITC-märkt getantikanin IgG. Inkubera vid rumstemperatur i 50 min i mörker. Tvätta objektglasen tre gånger med PBS (pH 7,4) på en avfärgningsskakapparat i 5 minuter vardera. Lufttorka sektionerna med lätt skakning och tillsätt DAPI-färgningslösning. Inkubera sektionerna i mörker i 10 minuter vid rumstemperatur. Efter torkning av sektionerna, rita cirklar runt vävnaden med PepPen (för att förhindra förlust av antikroppar), tillsätt ett autofluorescenssläckningsmedel (0,3% Sudan Black B) till cirklarna i 5 minuter och skölj dem därefter under rinnande vatten i 10 minuter. Tvätta objektglasen tre gånger med PBS (pH 7,4) på en avfärgningsskakapparat i 5 minuter vardera. Skaka sektionerna något och försegla dem med ett antifade monteringsmedium. Observera och fotografera sektionerna under ett fluorescensmikroskop vid 40x, 20x och 10x.OBS: DAPI UV-excitationsvåglängden är 330-380 nm och emissionsvåglängden är 420 nm (blått ljus). FITC-excitationsvåglängden är 465-495 nm och emissionsvåglängden är 515-555 nm (grönt ljus). 7. Statistisk analys Samla in och analysera data med SPSS. Rapportera data som medelvärde ± standardavvikelse. Använd ett oberoende prov t-test för att analysera skillnaderna mellan diabetiker och normala grupper. Ställ in den statistiska signifikansen på **p < 0,01 och *p < 0,05.

Representative Results

Totalt 10 SD-råttor fick en enda STZ intraperitoneal injektion för att inducera T1DM-modellen. En råtta dog i förtid (10%), men diabetes inducerades hos alla råttor (100%). Efter 3 dagars STZ-injektion var blodsockernivåerna hos alla råttor högre än 16,7 mmol/l och blodsockernivåerna stabiliserades 5 veckor efter induktion (figur 3A). Diabetesgruppens vikt ökade gradvis efter STZ-injektionen men minskade i vecka 3 och ökade sedan långsamt igen från vecka 4 (figur 3B). Däremot ökade vikten hos råttor i normalgruppen stadigt, och deras medelvikt 3 dagar efter diabetesinduktion var högre än hos diabetesgruppen (figur 3B). De diabetiska råttorna uppvisade alla typiska symtom på törst, polyuri och viktminskning, liknande resultaten från Hao et al.17. På dag 7 och dag 14 efter sår visade den makroskopiska analysen att reepitelisering var mer uttalad hos råttor i normalgruppen än i diabetesgruppen (figur 4A). De kvantitativa resultaten visade att sårläkningshastigheten var signifikant lägre i diabetesgruppen än i normalgruppen dag 7 och dag 14 (p < 0,01). Men på dag 14 kan sårläkningsgraden också vara över 90% i diabetesgruppen (p < 0,05, figur 4B). Detta tyder på att T1DM-sårmodellen kännetecknas av dålig stängning men inte i den utsträckning som kronisk icke-läkning som ses i mänskliga diabetessår. H&E-färgning på dag 14 av sårläkning avslöjade en ofullständig sårepidermis, långsam proliferation av keratinocyter och fördröjd återepitelisering i diabetesgruppen jämfört med normalgruppen. De diabetiska såren visade partiell förlust av hårsäckarna och talgkörtlarna. Det fanns också färre synliga kapillärer (figur 5). Diabetes orsakar endotelcellsdysfunktion, glykosylering av de extracellulära matrisproteinerna och vaskulär denervering18. Dessa komplikationer resulterar i lägre än normalt sårangiogenes i diabetessår18. Angiogenes är nödvändig för sårläkning och sårangiogenes analyseras ofta med CD31-immunfärgning (figur 6A)19,20. Baserat på den genomsnittliga optiska densiteten (AOD) för CD31-uttryck var angiogenesen vid sårstället signifikant högre i normalgruppen än i diabetesgruppen (p < 0,01, figur 6B). Figur 1: Bild av råttor immobiliserade av fixatorer. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 2: Diagram över råttans sårplats. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 3: Blodsockernivåer och vikt hos försöksråttorna. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 4: Hudsår i full tjocklek (20 mm i diameter) på försöksråttornas ryggar. (A) Sårens makroskopiska utseende dag 0, dag 7 och dag 14. Sårmorfologibilderna dag 0, dag 7 och dag 14 togs med en digitalkamera. (B) Sårarean mättes med hjälp av ImageJ-programvaran och användes för att beräkna sårläkningshastigheten. Sårläkningshastigheten (%) beräknades enligt följande: (initial såryta − såryta vid angiven tidpunkt)/initial såryta × 100. Värdena presenteras som medelvärde ± SD (n = 14). Statistisk signifikans fastställdes till ** p < 0,01 och * p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 5: Representativa histopatologiska H&E-bilder på dag 14 efter såretablering. De blå pilarna indikerar kapillärer. De röda pilarna visar spridningen av keratinocyter. Vänster skala: en stapel = 200 μm; Höger skala: en stapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 6: Immunofluorescensfärgningsanalys för uttryck av CD31. CD31-nivåer användes för att bestämma tillståndet för angiogenes. (A) Representativa bilder av CD31 immunofluorescensfärgning hos diabetiker och normala grupper. IOD-värdet (integrated optical density) och pixelarean (AREA) för varje skalprov beräknades med programvaran Image-Pro Plus 6.0. Det genomsnittliga värdet för optisk densitet (AOD) (AOD = IOD/AREA) härleddes också. AOD-värdet var direkt proportionellt mot det positiva uttrycket av CD31. (B) Kvantitativ jämförelse av CD31-positivt uttryck i diabetes- och normalgrupperna. Data presenteras som medelvärde ± SD. ** p < 0,01. Skala: en stapel = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Detta protokoll klargör de omtvistade operationerna i T1DM sårmodellering. Oro över STZ-injektionsprotokollen, framgångskriterier för T1DM-induktion, blodsockerstabiliseringstid och sårplats och storlek har tagits upp i detta arbete. Vidare har de patologiska egenskaperna och mätbara parametrarna för T1DM sårläkningsbedömning klargjorts.

Råttorna fastade i 18 timmar före STZ-injektionen för att undvika kompetitiv bindning av glukos eller dess analoger till β-celler, vilket kan påverka effekten av STZ. Den vanligaste metoden för att inducera T1DM är en enda hög dos av STZ, vilket ökar blodsockret genom att skada öarna och minska insulinsekretionen21. Förexperimentella studier visade att den optimala STZ-dosen för en hög framgångsgrad och en låg dödlighet var 55 mg/kg, vilket är lägre än de optimala doserna som rapporterats i tidigare studier22,23,24. I detta protokoll inducerades T1DM med en enda intraperitoneal injektion på 55 mg/kg STZ.

Blodsockernivåerna var alla högre än 16,7 mmol / L 3 dagar efter STZ-injektionen. En blodsockernivå högre än 16,7 mmol / L på dag 7 efter STZ-injektion är dock det rekommenderade kriteriet för framgångsrik T1DM-modellering, eftersom omfattningen av öskador varierar mellan råttor och en lämplig förlängning av diagnostiden kan minska den falskt negativa frekvensen. Dessutom stabiliserades blodsockerfluktuationerna 5 veckor efter STZ-injektionen, och råttorna ökade gradvis i vikt under denna period, i överensstämmelse med tidigare fynd25,26. Detta indikerar att blodsockernivån i T1DM-modellen bör stabiliseras i minst 6 veckor, och en ökning av råttvikt efter 6 veckor minskar dödligheten under sårmodelleringen. Därför utförde detta protokoll sårmodellering 8 veckor efter STZ-injektionen.

Sårstängningsfrekvensen dag 7 och dag 14 efter sår var signifikant lägre hos diabetiker än i gruppen med normala sår, vilket indikerar långsam läkning. Dessutom var sårepitelisering och angiogenes signifikant lägre hos diabetiker än i normalgruppen. Detta visar att T1DM-sårmodellen visar långsammare sårläkning och fördröjd återepitelisering än hos normala råttor, vilket kan vara relaterat till de patologiska förändringarna av minskad sårangiogenes. Men på dag 14 var T1DM-sårläkningshastigheten också över 90%, vilket skiljer sig från den kroniska icke-läkande egenskapen hos mänskliga diabetiska sår. Detta kan bero på att gnagares fysiologiska mekanismer för sårläkning skiljer sig från människors27. Följaktligen är den bästa sårdiametern minst 20 mm, vilket är tillräckligt stort för att ge tid att bedöma en interventions effektivitet i en diabetessårstudie. Sårplatsen bör undvika skulderbladet och ryggraden, eftersom kontinuerlig rörelse på dessa två ställen kan störa sårläkning.

Sammanfattningsvis är konstruktionen av T1DM-sårmodellen med metoden för detta protokoll effektiv. Protokollet replikerar några av egenskaperna hos kroniska diabetiska sår, såsom långsammare sårläkning, fördröjd återepitelisering och minskad angiogenes jämfört med normala råttsår. Det är dock okänt om modellen kan replikera andra kroniska fenotyper av diabetiska sår. Dessutom beskriver detta protokoll den mest grundläggande och mest använda metoden, som inte tar hänsyn till frågan om hudkontraktion hos råttor. Framtida forskning kan införliva användningen av sårskenor i detta protokoll eller utforska ytterligare modeller av kroniska diabetessår, vilket kommer att bli en betydande utmaning för forskare i framtiden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna studie stöddes ekonomiskt av National Natural Science Foundation of China (82104877).

Materials

Antifade mounting medium Southern Biotechnology Associates, Inc. 0100-01
AutoFluo Quencher Servicebio Technology co., Ltd. G1221
Automatic slide stainer Thermo Fisher Scientific Inc. Varistain™ Gemini ES
CD31 Servicebio Technology co., Ltd. GB11063-2
Citrate antigen retrieval solution Servicebio Technology co., Ltd. G1201
Cover glass Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. 10212432C
DAPI Servicebio Technology co., Ltd. G1012
Decolorization shaker Scilogex S1010E
Depilatory cream Guangzhou Ruixin Biotechnology Co., Ltd.
Dimethyl benzene Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. 64-17-5
Drug oscillator Shenzhen Jiashi Technology Co., Ltd. VM-370
Electric razor Shanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd. FC5908
Embedding machine Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. JB-P5
Ethanol absolute Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. 1330-20-7
Fitc-labeled goat anti-rabbit IgG Servicebio Technology co., Ltd. GB22303
Goat serum Thermo Fisher Scientific Inc. 16210064
Hematoxylin and eosin staining solution Beijing Regan Biotechnology Co., Ltd. DH0020
Image J software National Institutes of Health
Microwave oven Midea Group Co., Ltd.  M1-L213B
Mini centrifuge Scilogex D1008
Neutral balsam Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10004160
PBS buffer Biosharp G4202
Portable blood glucose meter Sinocare Inc. GA-3
Rapid tissue processor Thermo Fisher Scientific Inc. STP420 ES
Rat fixator Globalebio (Beijing) Technology co., Ltd GEGD-Q10G1
Slicing machine Thermo Fisher Scientific Inc. HM325
Slides glass Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. 80312-3181
sodium citrate buffer Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. c1013
Streptozotocin Sigma 57654595

References

  1. Zimmet, P., Alberti, K. G., Shaw, J. Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature. 414 (6865), 782-787 (2001).
  2. Grennan, D. Diabetic foot ulcers. Journal of the American Medical Association. 321 (1), 114 (2019).
  3. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 265sr6 (2014).
  4. Patel, S., Srivastava, S., Singh, M. R., Singh, D. Mechanistic insight into diabetic wounds: Pathogenesis, molecular targets and treatment strategies to pace wound healing. Biomedicine & Pharmacotherapy. 112, 108615 (2019).
  5. Deeds, M. C., et al. Single dose streptozotocin-induced diabetes: Considerations for study design in islet transplantation models. Laboratory Animals. 45 (3), 131-140 (2011).
  6. Chao, P. C., et al. Investigation of insulin resistance in the popularly used four rat models of type-2 diabetes. Biomedicine & Pharmacotherapy. 101, 155-161 (2018).
  7. Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols. 1 (4), e78 (2021).
  8. Wu, J., Yan, L. J. Streptozotocin-induced type 1 diabetes in rodents as a model for studying mitochondrial mechanisms of diabetic β cell glucotoxicity. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 8, 181-188 (2015).
  9. Yang, J., Chen, Z., Pan, D., Li, H., Shen, J. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-derived exosomes combined pluronic F127 hydrogel promote chronic diabetic wound healing and complete skin regeneration. International Journal of Nanomedicine. 15, 5911-5926 (2020).
  10. Zhu, Y., Wang, Y., Jia, Y., Xu, J., Chai, Y. Roxadustat promotes angiogenesis through HIF-1α/VEGF/VEGFR2 signaling and accelerates cutaneous wound healing in diabetic rats. Wound Repair and Regeneration. 27 (4), 324-334 (2019).
  11. Shao, Z., et al. Wound microenvironment self-adaptive hydrogel with efficient angiogenesis for promoting diabetic wound healing. Bioactive Materials. 20, 561-573 (2022).
  12. Asfour, H. Z., et al. Enhanced healing efficacy of an optimized gabapentin-melittin nanoconjugate gel-loaded formulation in excised wounds of diabetic rats. Drug Delivery. 29 (1), 1892-1902 (2022).
  13. Wei, L., et al. Mesenchymal stem cells promote wound healing and effects on expression of matrix metalloproteinases-8 and 9 in the wound tissue of diabetic rats. Stem Cells and Development. 32 (1-2), 25-31 (2022).
  14. Pastar, I., et al. . Preclinical models for wound-healing studies. In Skin Tissue Models., edited by. , 223-253 (2018).
  15. Yang, R. H., et al. Epidermal stem cells (ESCs) accelerate diabetic wound healing via the Notch signalling pathway. Bioscience Reports. 36 (4), e00364 (2016).
  16. Suliman Maashi, M., Felemban, S. G., Almasmoum, H. A., Jarahian, M. Nicaraven-loaded electrospun wound dressings promote diabetic wound healing via proangiogenic and immunomodulatory functions: A preclinical investigation. Drug Delivery and Translational Research. 13 (1), 222-236 (2023).
  17. Hao, M., Ding, C., Sun, S., Peng, X., Liu, W. Chitosan/sodium alginate/velvet antler blood peptides hydrogel promotes diabetic wound healing via regulating angiogenesis, inflammatory response and skin flora. Journal of Inflammation Research. 15, 4921-4938 (2022).
  18. Kolluru, G. K., Bir, S. C., Kevil, C. G. Endothelial dysfunction and diabetes: Effects on angiogenesis, vascular remodeling, and wound healing. International Journal of Vascular Medicine. 2012, 918267 (2012).
  19. Okonkwo, U. A., DiPietro, L. A. Diabetes and wound angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1419 (2017).
  20. Yi, C., et al. Targeted inhibition of endothelial calpain delays wound healing by reducing inflammation and angiogenesis. Cell Death & Disease. 11 (7), 533 (2020).
  21. Goodson 3rd, W. H., Hung, T. K. Studies of wound healing in experimental diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 22 (3), 221-227 (1977).
  22. Luippold, G., Klein, T., Mark, M., Empagliflozin Grempler, R. a novel potent and selective SGLT-2 inhibitor, improves glycaemic control alone and in combination with insulin in streptozotocin-induced diabetic rats, a model of type 1 diabetes mellitus. Diabetes, Obesity & Metabolism. 14 (7), 601-607 (2012).
  23. Sayed, N., et al. Effect of dapagliflozin alone and in combination with insulin in a rat model of type 1 diabetes. The Journal of Veterinary Medical Science. 82 (4), 467-474 (2020).
  24. Han, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells implantation accelerates cutaneous wound healing in diabetic rats via the Wnt signaling pathway. European Journal of Medical Research. 24 (1), 10 (2019).
  25. Ansell, D. M., Marsh, C., Walker, L., Hardman, M. J., Holden, K. Evaluating STZ-induced impaired wound healing in rats. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 994-997 (2018).
  26. Liu, Y., et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells not only ameliorate blood glucose but also protect vascular endothelium from diabetic damage through a paracrine mechanism mediated by MAPK/ERK signaling. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 258 (2022).
  27. Zindle, J. K., Wolinsky, E., Bogie, K. M. A review of animal models from 2015 to 2020 for preclinical chronic wounds relevant to human health. Journal of Tissue Viability. 30 (3), 291-300 (2021).

Play Video

Cite This Article
Wang, W., Bai, D., Wu, C., Li, H., Xie, X., Ji, W., Gao, J. A Protocol for Constructing a Rat Wound Model of Type 1 Diabetes. J. Vis. Exp. (192), e64914, doi:10.3791/64914 (2023).

View Video