Summary
يعد نموذج الجرح السكري الناجم عن الستربتوزوتوسين في ذكور الفئران SD حاليا النموذج الأكثر استخداما لدراسة التئام الجروح في داء السكري من النوع الأول. يصف هذا البروتوكول الطرق المستخدمة لبناء هذا النموذج. كما يعرض ويعالج التحديات المحتملة ويفحص التقدم والخصائص الوعائية لجروح السكري.
Abstract
جرعة واحدة عالية من حقن الستربتوزوتوسين متبوعة باستئصال الجلد كامل السماكة على ظهر الفئران هي طريقة شائعة لبناء نماذج حيوانية من جروح السكري من النوع 1. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي التلاعب غير السليم إلى عدم استقرار النموذج وارتفاع معدل الوفيات في الفئران. لسوء الحظ ، هناك عدد قليل من الإرشادات الحالية حول نمذجة جروح السكري من النوع 1 ، وهي تفتقر إلى التفاصيل ولا تقدم استراتيجيات مرجعية محددة. لذلك ، يفصل هذا البروتوكول الإجراء الكامل لبناء نموذج جرح السكري من النوع 1 ويحلل التقدم والخصائص الوعائية لجروح السكري. تتضمن نمذجة جرح السكري من النوع 1 الخطوات التالية: تحضير حقن الستربتوزوتوسين ، وتحريض داء السكري من النوع 1 ، وبناء نموذج الجرح. تم قياس منطقة الجرح في اليوم 7 واليوم 14 بعد الجرح ، وتم استخراج أنسجة جلد الفئران لتحليل التألق النسيجي والمناعي. كشفت النتائج أن داء السكري من النوع 1 الناجم عن 55 مغ / كغ من الستربتوزوتوسين كان مرتبطا بانخفاض معدل الوفيات وارتفاع معدل النجاح. كانت مستويات الجلوكوز في الدم مستقرة نسبيا بعد 5 أسابيع من التحريض. كان معدل التئام الجروح السكري أقل بكثير من الجروح الطبيعية في اليوم 7 واليوم 14 (ص < 0.05) ، ولكن كلاهما يمكن أن يصل إلى أكثر من 90٪ في اليوم 14. بالمقارنة مع المجموعة الطبيعية ، كان إغلاق طبقة البشرة لجروح السكري في اليوم 14 غير مكتمل وأخر إعادة الظهارة وانخفاض تكوين الأوعية بشكل ملحوظ (p < 0.01). يتميز نموذج جرح السكري من النوع 1 الذي تم إنشاؤه بناء على هذا البروتوكول بخصائص التئام الجروح المزمنة ، بما في ذلك الإغلاق السيئ ، وتأخر إعادة الظهارة ، وانخفاض تكوين الأوعية مقارنة بجروح الفئران الطبيعية.
Introduction
داء السكري من النوع الأول (T1DM) هو مرض استقلابي مزمن يتميز بارتفاع السكر في الدم وتدمير خلايا β البنكرياس1. جرح T1DM هو جرح مزمن غير قابل للشفاء وأكثر المضاعفات شيوعا وتدميرا لمرض السكري لدى البشر 2,3. النماذج الحيوانية هي أنسب النماذج الأولية لدراسة التغيرات المرضية أثناء التئام الجروح وسلامة وفعالية العوامل العلاجية المحتملة4. بالمقارنة مع الأنواع الأخرى ، فإن ذكور فئران Sprague-Dawley (SD) أكثر حساسية للستربتوزوتوسين (STZ) وتظهر معدل وفيات أقل صلة ، مما يجعلها شائعة في أبحاث الجروح السكرية 5,6.
تم وصف العديد من الطرق لبناء نماذج الجرح T1DM. فيما يتعلق بنموذج T1DM ، ركزت الدراسات بشكل أساسي على تأثير طريقة حقن STZ على معدل نجاح تحريض مرض السكري 7,8. ومع ذلك ، فإن عملية النمذجة تعاني من التشغيل غير المتسق لهذه الخطوة نفسها. في إحدى الدراسات ، صامت الفئران لمدة 18 ساعة قبل حقن STZ. الفئران مع مستويات الجلوكوز في الدم أعلى من 16.67 مليمول / لتر 1 أسبوع بعد حقن STZ اعتبرت مصابة بمرض السكري ، وتم إدخال جرح السكري بعد 3 أسابيع9. على العكس من ذلك ، في دراسة ذات صلة ، Zhu et al. صام الفئران لمدة 12 ساعة قبل حقن STZ. الفئران التي لديها مستويات جلوكوز في الدم أعلى من 16.7 مليمول / لتر عند 72 ساعة بعد الحقن اعتبرت مصابة بمرض السكري ، وتم إدخال جرح السكري بعد 4 أسابيع10. بشكل عام ، هناك تناقضات في بروتوكولات حقن STZ ، ومعايير تشخيص مرض السكري ، وأوقات إدخال الجروح.
من حيث نمذجة الجروح ، في معظم الدراسات ، يتم استئصال السماكة الكاملة للجلد الظهري لبناء جروح T1DM بعد تحريض مرض السكري الناجح11،12،13. على الرغم من أن هذا النموذج عرضة لتقلص الجلد في الفئران ، إلا أنه النموذج الأكثر استخداما في أبحاث التئام الجروح لأنه أقل كثافة في العمل ورخيص14,15. ومع ذلك ، لا توجد أبحاث موجهة بالطريقة حول تقنية الاستئصال كاملة السماكة هذه. علاوة على ذلك ، لا توجد معايير موحدة في الدراسات الحالية فيما يتعلق بحجم الجرح وموقعه12,16. يمكن أن يؤثر حجم الجرح وموقعه بشكل غير مباشر على اتساق التصميم التجريبي والصلاحية العلمية للنتائج. لذلك ، هناك حاجة ملحة لبروتوكول قياسي لتحريض T1DM ونمذجة الجروح كمرجع للباحثين. الهدف من هذه الدراسة هو تصور بروتوكول محدد لنمذجة جرح T1DM يمكن استخدامه كمرجع لدراسات جرح T1DM.
Protocol
تم إجراء البروتوكول بعد إعلان هلسنكي ، وتمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة الإدارة من جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (سجل رقم 2021-13).
1. إعداد حقن الستربتوزوتوسين
- حدد 15 فأرا خاليا من مسببات الأمراض (SPF) من الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أسابيع ويزن 220 جراما ± 20 جم. باستخدام طريقة التوزيع العشوائي البسيطة ، قسم الفئران إلى مجموعة مرضى السكري (ن = 10) ومجموعة طبيعية (ن = 5).
- قياس الوزن الأولي للفئران ، وتحديد جرعة STZ من خلال إعطاء 55 ملغم / كغم.
ملاحظة: استنادا إلى التجارب المسبقة ، فإن 55 مجم / كجم هي الجرعة المثلى من STZ. - قم بوزن مسحوق STZ بدقة ، وضعه في وعاء مقاوم للضوء.
- أضف كمية مناسبة من 0.1 مول / لتر من محلول سترات الصوديوم (درجة الحموضة 4.5) لإذابة STZ إلى تركيز 1٪.
ملاحظة: يجب تبريد المخزن المؤقت سترات الصوديوم مسبقا لمدة 2 ساعة في ثلاجة 4 درجات مئوية قبل الاستخدام. يجب أن يضمن إعداد محلول STZ العقم. - يهز لمدة 30 ثانية باستخدام مذبذب المخدرات. ضعيها في صندوق ثلج واتركيها جانبا.
ملاحظة: يجب استخدام الحقن في غضون 15 دقيقة.
2. تحريض نموذج T1DM
- قبل حقن STZ ، قم بصيام الفئران لمدة 18 ساعة ، واسمح بحرية الوصول إلى الماء.
- إجراء حقن داخل الصفاق من محلول STZ 1 ٪.
- أمسك الجرذ ، وكشف جلد البطن وموقع الحقن (تقاطع الخط الذي يربط جذور الفخذين وخط الوسط للبطن).
- تطهير موقع الحقن مرتين باستخدام كرة قطنية مبللة بالكحول بنسبة 75٪ (مرة في اتجاه عقارب الساعة ومرة عكس اتجاه عقارب الساعة). ضع رأس الجرذ أسفل البطن.
- أدخل الإبرة موازية لخط الوسط البطني بزاوية 45 درجة ، وبعد ثقب الجلد ، قلل زاوية الإبرة إلى 30 درجة ، ثم أدخل الإبرة 2-3 مم. اسحب سدادة الإبرة برفق ، مع التأكد من عدم امتصاص الدم أو السوائل في المحقنة. حقن محلول STZ ، واسحب الإبرة ، وأوقف النزيف بقطعة قطن.
ملاحظة: إذا تم سحب سائل أصفر مرة أخرى إلى المحقنة ، فقد تكون الإبرة قد اخترقت المثانة ، وإذا تم سحب سائل أخضر داكن ، فقد تكون الإبرة قد اخترقت الأمعاء الغليظة أو الأعور. في كلتا الحالتين ، يجب إزالة الإبرة على الفور. يجب تقييم الحيوان من قبل الموظفين البيطريين.
- قم بقياس مستويات الجلوكوز في الدم العرضية (غير الصائمة أو الصيام) في الساعة 09:00 صباحا في اليوم 3 واليوم 7 بعد تحريض STZ.
ملاحظة: تم تحديد وقت القياس العشوائي لنسبة الجلوكوز في الدم. في هذا البروتوكول ، يتم إصلاحه في الساعة 09:00 صباحا. ومع ذلك ، ليست هذه هي المرة الوحيدة المستخدمة. الدم الذي يتم جمعه من الوريد الذيلي عن طريق ثقب إبرة أقل عرضة لسائل الأنسجة من الدم المأخوذ من الذيل المقطوع ، لذلك تكون قيم الجلوكوز في الدم أكثر دقة.- شل حركة الفئران باستخدام مثبت الفئران (الشكل 1).
- أوجد موقع الوريد الذيلي. تطهير ذيل الفئران مرتين باستخدام كرة القطن غارقة في الكحول 75 ٪.
- ثقب الوريد الذيلي للحث على النزيف ، وقياس نسبة الجلوكوز في الدم باستخدام جهاز قياس السكر. وقف النزيف بقطعة قطن.
ملاحظة: يعتبر مستوى الجلوكوز أعلى من 16.7 مليمول / لتر في اليوم السابع بعد حقن STZ T1DM.
- وزن الفئران أسبوعيا ، وقياس مستويات الجلوكوز في الدم وغيرها من المعلمات ، بما في ذلك النظام الغذائي ، وتناول الماء ، وإخراج البول.
- إطعام الحيوانات بشكل طبيعي لمدة 8 أسابيع بعد تحريض STZ.
3. بناء نموذج الجرح
- حلق الفئران مع الحلاقة الكهربائية 1 يوم قبل نمذجة الجرح. تعتبر المساحة المحلوقة التي تبلغ 5 سم × 5 سم على الجانب الظهري للفأر مثالية بشكل عام.
- امسح المنطقة المحلوقة بكرة قطنية مالحة عادية دافئة ، واتركها تجف ، ثم ضع كريم مزيل الشعر لمدة 5 دقائق. نظف المنطقة بالشاش ، واغسل أي كريم مزيل شعر متبقي بمحلول ملحي طبيعي دافئ.
- وزن الفئران ، وحساب الجرعة المطلوبة من Nembutal على أساس معيار 35 ملغم / كغم. حل Nembutal باستخدام محلول ملحي طبيعي إلى تركيز 3 ٪. يمكن استخدام أدوية التخدير العامة الأخرى مثل الكيتامين / الزيلازين أو الأيزوفلوران لهذا الإجراء. يرجى العمل مع اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها لضمان الأفضل.
ملاحظة: لضمان الفعالية ، يجب تحضير المحلول طازجا ، ويجب حماية مسحوق Nembutal والمحلول من الضوء. - صوم الفئران لمدة 12 ساعة قبل التخدير. حقن التخدير داخل الصفاق. استخدم مرهم التتراسيكلين للعين أو مزلق عام للعين لمنع جفاف العين بعد إعطاء التخدير.
ملاحظة: اعتبر التخدير معتدلا عندما كانت عضلات الفئران مسترخية نسبيا ، واختفت حركات العين ، وكان التنفس منتظما ، وكانت الاستجابة للمنبهات المؤلمة صغيرة. - تطهير الجلد الظهري مرتين باستخدام كرات القطن المنقوعة في اليود (مرة في اتجاه عقارب الساعة ومرة عكس اتجاه عقارب الساعة) و 75 ٪ من الكحول (جولات بديلة).
- بعد التجفيف ، قم بقص الجلد بخزعة دائرية قطرها 20 مم.
- خيمة الجلد بالملقط المعقم ، ثم استخدم مقص جراحي معقم لإزالة الجلد كامل السمك على طول علامات القطع المثقوبة. وقف النزيف مع كرة القطن المالحة العادية.
ملاحظة: يجب أن تكون الحدود العلوية للجرح 5-10 مم تحت الحد الكتفي السفلي و 5-10 مم إلى يمين / يسار العمود الفقري للفأر (الشكل 2). تكون الجروح متناظرة على طول العمود الفقري عند بناء جرحين. - استخدم شاش الفازلين لتغطية الجروح ، ولفها بشاش وضمادة قابلة للتنفس مثبتة في مكانها بشريط مطاطي. حقن كاربروفين تحت الجلد (5 ملغ / كغ) مرة واحدة يوميا لتخفيف آلام ما بعد الجراحة. تغيير ضمادة الجرح مرة واحدة في اليوم (استخدام كاربروفين لتخفيف الآلام).
ملاحظة: راقب حركة الفئران وتنفسها بحثا عن أي تشوهات بعد اكتمال الضمادة ، وتأكد من أن الضمادة القابلة للتنفس ضيقة بشكل مناسب. - ضع مسطرة تحت الجرح ، وصور الجرح بكاميرا رقمية حتى اليوم 14. القتل الرحيم للفئران في اليوم 14 وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها. قطع أنسجة جلد الجرح 5 مم من حافة الجرح. قسم عينة الأنسجة إلى قسمين ، واغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة بقع الدم المرئية ، ثم ثبتها بمحلول بارافورمالدهايد 4٪.
4. حساب منطقة الجرح باستخدام برنامج ImageJ
- انقر فوق الزر "ملف" بعد فتح البرنامج ، ثم قم بإسقاط الشاشة وانقر فوق فتح لفتح صور الجرح.
- حدد الأداة المستقيمة ، وارسم خطا مستقيما بطول 1 سم على طول المسطرة في صور الجرح.
- انقر فوق الأمر Set Scale في قائمة التحليل ، واضبط المسافة المعروفة على 1.
- حدد أداة التحديدات اليدوية ، وارسم الخطوط العريضة للجرح على الصورة.
- انقر فوق الأمر "قياس " في قائمة التحليل ، واقرأ قيمة المنطقة بعد ظهور النتيجة.
5. تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E & E)
- قم بإزالة أنسجة الجلد من المثبت ، وقم بتقطيعها إلى أقسام رقيقة بمشرط في غطاء دخان ، وضعها في كاسيت للجفاف.
- ضع كاسيت الجفاف في آلة الجفاف ، وقم بتجفيف الأنسجة في الخطوات التالية: 75٪ كحول لمدة 4 ساعات ؛ 85 ٪ الكحول لمدة 2 ساعة ؛ 90 ٪ الكحول لمدة 2 ساعة ؛ 95 ٪ الكحول لمدة 1 ساعة ؛ الإيثانول اللامائي الأول والثاني لمدة 30 دقيقة لكل منهما ؛ بنزين الكحول لمدة 5-10 دقائق ؛ زيلين الأول والثاني لمدة 5-10 دقائق لكل منهما ؛ والشمع الأول والثاني والثالث لمدة 1 ساعة لكل منها.
- تضمين الأنسجة في الشمع. تبرد عند -20 درجة على طاولة تجميد ، وقم بتصحيح كتلة الشمع بدقة.
- قطع كتل الشمع طوليا باستخدام آلة تقسيم البارافين إلى أقسام بسمك 3 ميكرومتر.
- انقع القسم بالتتابع في الزيلين الأول والثاني لمدة 20 دقيقة لكل منهما ، والإيثانول اللامائي الأول والثاني لمدة 5 دقائق لكل منهما ، وماء الصنبور لمدة 5 دقائق.
- غمر الأنسجة بصبغة الهيماتوكسيلين لمدة 3-5 دقائق ، وتمايز محلول حمض الهيدروكلوريك المائي 0.5٪ ، ومحلول الأمونيا المائي 0.5٪ إلى اللون الأزرق ، واشطفه بالماء.
- تجفيف أقسام الأنسجة مع 85 ٪ و 95 ٪ الكحول. اغمر الأنسجة بمحلول تلطيخ يوزين لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: عادة ، يستغرق تلطيخ eosin من 30 ثانية إلى 2 دقيقة ، ويمكن ضبط الوقت وفقا لنتائج ومتطلبات التلطيخ. - جفف الأقسام بالتتابع باستخدام المحاليل التالية: الإيثانول اللامائي الأول ، والإيثانول اللامائي الثاني ، والإيثانول اللامائي الثالث ، والزيلين الأول ، والزيلين الثاني ، لمدة 5 دقائق لكل منها. أخيرا ، قم بتغطية الشرائح الزجاجية بلسم محايد.
- افحص الأنسجة الملطخة ب H& E تحت المجهر بمعدل 40x و 20x و 10x ، والتقط صورا للاحتفاظ بالصور التمثيلية لكل شريحة.
6. تلطيخ CD31 المناعي
- انقع أقسام الأنسجة في الزيلين الأول والثاني لمدة 15 دقيقة لكل منهما ، والإيثانول اللامائي الأول والثاني لمدة 5 دقائق لكل منهما ، و 85٪ كحول لمدة 5 دقائق ، و 75٪ كحول لمدة 5 دقائق ، واشطفه بالماء المقطر.
- إصلاح المستضد
- أضف عازلا مناسبا من حامض الستريك 10 مللي متر من الرقم الهيدروجيني 6.0 إلى وعاء فرن الميكروويف ، وقم بتسخينه حتى يغلي على ارتفاع عال ، ثم ضع الشريحة الزجاجية فيه.
- يغلي لمدة 8 دقائق على نار متوسطة ، ويتوقف لمدة 8 دقائق ، ثم يغلي مرة أخرى على نار متوسطة منخفضة لمدة 7 دقائق.
- اترك الشرائح تبرد ، وضعها في PBS (درجة الحموضة 7.4) ، واغسلها ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام شاكر إزالة اللون.
- أضف 5٪ مصل الماعز بالتنقيط في الدائرة ، واحتضنها لمدة 30 دقيقة.
- تخلص برفق من محلول الإغلاق (مصل الماعز 5٪) ، وأضف الجسم المضاد للأرنب المضاد ل CD31 (المخفف باستخدام PBS بنسبة 1: 200) بالتنقيط على الأقسام. ضع الأقسام في صندوق مبلل ، واحتضنها طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS (درجة الحموضة 7.4) على شاكر إزالة اللون لمدة 5 دقائق لكل منها. هز الأجزاء برفق لتجفيفها ، ثم قم بتغطيتها بقطرة دائرية من الماعز المضاد للأرانب IgG المسمى FITC. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 50 دقيقة في الظلام.
- اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS (درجة الحموضة 7.4) على شاكر إزالة اللون لمدة 5 دقائق لكل منها. جفف الأقسام بالهواء مع اهتزاز خفيف ، وأضف محلول تلطيخ DAPI. احتضان الأقسام في الظلام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- بعد تجفيف الأقسام ، ارسم دوائر حول الأنسجة باستخدام PepPen (لمنع فقدان الأجسام المضادة) ، أضف عامل تبريد ذاتي التألق (0.3٪ سودان ب) إلى الدوائر لمدة 5 دقائق ، وبعد ذلك اشطفها تحت الماء الجاري لمدة 10 دقائق.
- اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS (درجة الحموضة 7.4) على شاكر إزالة اللون لمدة 5 دقائق لكل منها. هز الأقسام قليلا ، وأغلقها بوسط تثبيت مضاد للتلاشي.
- راقب وصور الأقسام تحت المجهر الفلوري بمعدل 40x و 20x و 10x.
ملاحظة: الطول الموجي للإثارة بالأشعة فوق البنفسجية DAPI هو 330-380 نانومتر ، والطول الموجي للانبعاث هو 420 نانومتر (الضوء الأزرق). الطول الموجي للإثارة FITC هو 465-495 نانومتر ، وطول موجة الانبعاث هو 515-555 نانومتر (الضوء الأخضر).
7. التحليل الإحصائي
- جمع وتحليل البيانات باستخدام SPSS.
- الإبلاغ عن البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري.
- استخدم اختبار t لعينات مستقلة لتحليل الاختلافات بين مجموعات مرضى السكري والمجموعات الطبيعية.
- اضبط الدلالة الإحصائية عند ** p < 0.01 و * p < 0.05.
Representative Results
تلقى ما مجموعه 10 فئران SD حقنة واحدة داخل الصفاق STZ للحث على نموذج T1DM. مات فأر واحد قبل الأوان (10 ٪) ، ولكن تم تحفيز مرض السكري في جميع الفئران (100 ٪). بعد 3 أيام من حقن STZ ، كانت مستويات الجلوكوز في الدم لجميع الفئران أعلى من 16.7 مليمول / لتر ، واستقرت مستويات الجلوكوز في الدم بعد 5 أسابيع من الحث (الشكل 3 أ). زاد وزن مجموعة السكري تدريجيا بعد حقن STZ ولكنه انخفض في الأسبوع 3 ثم زاد ببطء مرة أخرى من الأسبوع 4 (الشكل 3B). في المقابل ، زاد وزن الفئران في المجموعة الطبيعية بشكل مطرد ، وكان متوسط وزنها بعد 3 أيام من تحريض مرض السكري أعلى من وزن مجموعة السكري (الشكل 3 ب). أظهرت جميع الفئران المصابة بالسكري أعراضا نموذجية للعطش والبوال وفقدان الوزن ، على غرار نتائج Hao et al.17.
في اليوم 7 واليوم 14 بعد الإصابة ، كشف التحليل العياني أن إعادة الظهارة كانت أكثر وضوحا في الفئران في المجموعة الطبيعية منها في مجموعة السكري (الشكل 4 أ). كشفت النتائج الكمية أن معدل التئام الجروح كان أقل بكثير في مجموعة السكري منه في المجموعة العادية في اليوم 7 واليوم 14 (p < 0.01). ومع ذلك ، في اليوم 14 ، يمكن أن تكون معدلات التئام الجروح أعلى من 90٪ في مجموعة مرضى السكري (p < 0.05 ، الشكل 4B). هذا يشير إلى أن نموذج جرح T1DM يتميز بإغلاق ضعيف ولكن ليس إلى حد عدم الشفاء المزمن الذي يظهر في جروح السكري البشرية.
كشف تلطيخ H&E في اليوم 14 من التئام الجروح عن عدم اكتمال بشرة الجرح ، وبطء تكاثر الخلايا الكيراتينية ، وتأخر إعادة الظهارة في مجموعة مرضى السكري مقارنة بالمجموعة الطبيعية. أظهرت جروح السكري فقدانا جزئيا لبصيلات الشعر والغدد الدهنية. كان هناك أيضا عدد أقل من الشعيرات الدموية المرئية (الشكل 5).
يسبب مرض السكري اختلال وظيفي في الخلايا البطانية ، وغليكوزيل بروتينات المصفوفة خارج الخلية ، وإزالة التعصيب الوعائي18. تؤدي هذه المضاعفات إلى تكوين الأوعية الدموية للجرح أقل من المعتاد في جروح السكري18. تولد الأوعية ضروري لالتئام الجروح ، وكثيرا ما يتم تحليل تكوين الأوعية الدموية للجرح بواسطة التلوين المناعي CD31 (الشكل 6A)19,20. استنادا إلى متوسط الكثافة البصرية (AOD) لتعبير CD31 ، كان تكوين الأوعية في موقع الجرح أعلى بكثير في المعدل الطبيعي منه في مجموعة مرضى السكري (p < 0.01 ، الشكل 6B).
الشكل 1: صورة الفئران التي شل حركتها المثبتات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: رسم تخطيطي لموقع جرح الفئران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: مستويات الجلوكوز في الدم وأوزان فئران التجارب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: جروح جلدية كاملة السماكة (قطرها 20 مم) على ظهور فئران التجارب. أ: المظهر العياني للجروح في اليوم 0 واليوم 7 واليوم 14. تم التقاط صور مورفولوجيا الجرح في اليوم 0 واليوم 7 واليوم 14 بكاميرا رقمية. (ب) تم قياس منطقة الجرح باستخدام برنامج ImageJ وتم استخدامه لحساب معدل التئام الجروح. تم حساب معدل التئام الجروح (٪) على النحو التالي: (منطقة الجرح الأولية - منطقة الجرح في النقطة الزمنية المحددة) / منطقة الجرح الأولية × 100. يتم تقديم القيم كمتوسط ± SD (n = 14). تم تحديد الدلالة الإحصائية عند ** p < 0.01 و * p < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور H&E النسيجية المرضية التمثيلية في اليوم 14 بعد إنشاء الجرح. تشير الأسهم الزرقاء إلى الشعيرات الدموية. تظهر الأسهم الحمراء تكاثر الخلايا الكيراتينية. المقياس الأيسر: شريط واحد = 200 ميكرومتر ؛ المقياس الأيمن: شريط واحد = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تحليل التلوين المناعي للتعبير عن CD31. تم استخدام مستويات CD31 لتحديد حالة تكوين الأوعية. (أ) صور تمثيلية لتلطيخ التألق المناعي CD31 في مجموعات مرضى السكري والمجموعات الطبيعية. تم حساب قيمة الكثافة البصرية المتكاملة (IOD) ومنطقة البكسل (AREA) لكل عينة من الجلد باستخدام برنامج Image-Pro Plus 6.0. كما تم اشتقاق متوسط قيمة الكثافة البصرية (AOD = IOD / AREA). كانت قيمة AOD تتناسب طرديا مع التعبير الإيجابي ل CD31. ب: مقارنة كمية للتعبير الإيجابي CD31 في مجموعتي السكري والطبيعيين. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SD. ** p < 0.01. مقياس: شريط واحد = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يوضح هذا البروتوكول العمليات المتنازع عليها في نمذجة الجرح T1DM. تمت معالجة المخاوف المتعلقة ببروتوكولات حقن STZ ، ومعايير نجاح تحريض T1DM ، ووقت تثبيت نسبة الجلوكوز في الدم ، وموقع الجرح وحجمه في هذا العمل. علاوة على ذلك ، تم توضيح الخصائص المرضية والمعلمات القابلة للقياس لتقييم التئام الجروح T1DM.
صامت الفئران لمدة 18 ساعة قبل حقن STZ لتجنب الارتباط التنافسي للجلوكوز أو نظائره بالخلايا β ، مما قد يؤثر على فعالية STZ. الطريقة الأكثر استخداما للحث على T1DM هي جرعة واحدة عالية من STZ ، مما يزيد من نسبة الجلوكوز في الدم عن طريق إتلاف الجزر وتقليل إفراز الأنسولين21. كشفت التجارب قبل التجريبية أن الجرعة المثلى من STZ لمعدل نجاح مرتفع ومعدل وفيات منخفض كانت 55 مغ / كغ ، وهو أقل من الجرعات المثلى المبلغ عنها في الدراسات السابقة22،23،24. في هذا البروتوكول ، تم تحفيز T1DM باستخدام حقنة واحدة داخل الصفاق من 55 ملغ / كغ STZ.
كانت مستويات الجلوكوز في الدم أعلى من 16.7 مليمول / لتر بعد 3 أيام من حقن STZ. ومع ذلك ، فإن مستوى الجلوكوز في الدم أعلى من 16.7 مليمول / لتر في اليوم السابع بعد حقن STZ هو المعيار الموصى به لنمذجة T1DM الناجحة ، لأن مدى تلف الجزيرة يختلف بين الفئران ، ويمكن أن يؤدي التمديد المناسب لوقت التشخيص إلى تقليل المعدل السلبي الكاذب. بالإضافة إلى ذلك ، استقرت تقلبات الجلوكوز في الدم بعد 5 أسابيع من حقن STZ ، واكتسبت الفئران وزنا تدريجيا خلال هذه الفترة ، بما يتفق مع النتائج السابقة25,26. يشير هذا إلى أنه يجب تثبيت مستوى الجلوكوز في الدم في نموذج T1DM لمدة 6 أسابيع على الأقل ، وزيادة وزن الفئران بعد 6 أسابيع يقلل من معدلات الوفيات أثناء نمذجة الجرح. ومن ثم ، أجرى هذا البروتوكول نمذجة الجروح بعد 8 أسابيع من حقن STZ.
كان معدل إغلاق الجرح في اليوم 7 واليوم 14 بعد الجرح أقل بكثير في مرضى السكري منه في مجموعة الجرح العادية ، مما يشير إلى بطء الشفاء. علاوة على ذلك ، كانت إعادة الظهارة للجرح وتكوين الأوعية أقل بكثير في مرضى السكري منها في المجموعة الطبيعية. هذا يدل على أن نموذج الجرح T1DM يظهر تباطؤ التئام الجروح وتأخر إعادة الظهارة مقارنة بالفئران العادية ، والتي قد تكون مرتبطة بالتغيرات المرضية لانخفاض تكوين الأوعية الدموية للجروح. ومع ذلك ، في اليوم 14 ، كان معدل التئام الجروح T1DM أعلى أيضا من 90٪ ، وهو ما يختلف عن الخاصية المزمنة غير الشافية لجروح السكري البشرية. قد يكون هذا بسبب اختلاف الآليات الفسيولوجية للقوارض لالتئام الجروح عن تلك الموجودة لدى البشر27. وبالتالي ، فإن أفضل قطر للجرح هو 20 مم على الأقل ، وهو كبير بما يكفي لإتاحة الوقت لتقييم فعالية التدخل في دراسة جرح السكري. يجب أن يتجنب موقع الجرح لوح الكتف والعمود الفقري ، لأن الحركة المستمرة في هذين الموقعين يمكن أن تعطل التئام الجروح.
في الختام ، فإن بناء نموذج الجرح T1DM باستخدام طريقة هذا البروتوكول فعال. يكرر البروتوكول بعض خصائص جروح السكري المزمنة ، مثل بطء التئام الجروح ، وتأخر إعادة الظهارة ، وتقليل تكوين الأوعية مقارنة بجروح الفئران الطبيعية. ومع ذلك ، فمن غير المعروف ما إذا كان النموذج يمكن أن يكرر الأنماط الظاهرية المزمنة الأخرى لجروح السكري. علاوة على ذلك ، يصف هذا البروتوكول الطريقة الأساسية والأكثر استخداما ، والتي لا تفسر مسألة تقلص الجلد في الفئران. يمكن للأبحاث المستقبلية دمج استخدام جبائر الجروح في هذا البروتوكول أو استكشاف نماذج إضافية من جروح السكري المزمنة ، والتي ستشكل تحديا كبيرا للباحثين في المستقبل.
Disclosures
يعلن جميع المؤلفين أن هذه المخطوطة ليس بها تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82104877).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade mounting medium | Southern Biotechnology Associates, Inc. | 0100-01 | |
| AutoFluo Quencher | Servicebio Technology co., Ltd. | G1221 | |
| Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific Inc. | Varistain™ Gemini ES | |
| CD31 | Servicebio Technology co., Ltd. | GB11063-2 | |
| Citrate antigen retrieval solution | Servicebio Technology co., Ltd. | G1201 | |
| Cover glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 10212432C | |
| DAPI | Servicebio Technology co., Ltd. | G1012 | |
| Decolorization shaker | Scilogex | S1010E | |
| Depilatory cream | Guangzhou Ruixin Biotechnology Co., Ltd. | — | |
| Dimethyl benzene | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 64-17-5 | |
| Drug oscillator | Shenzhen Jiashi Technology Co., Ltd. | VM-370 | |
| Electric razor | Shanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd. | FC5908 | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | JB-P5 | |
| Ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 1330-20-7 | |
| Fitc-labeled goat anti-rabbit IgG | Servicebio Technology co., Ltd. | GB22303 | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific Inc. | 16210064 | |
| Hematoxylin and eosin staining solution | Beijing Regan Biotechnology Co., Ltd. | DH0020 | |
| Image J software | National Institutes of Health | — | |
| Microwave oven | Midea Group Co., Ltd. | M1-L213B | |
| Mini centrifuge | Scilogex | D1008 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Portable blood glucose meter | Sinocare Inc. | GA-3 | |
| Rapid tissue processor | Thermo Fisher Scientific Inc. | STP420 ES | |
| Rat fixator | Globalebio (Beijing) Technology co., Ltd | GEGD-Q10G1 | |
| Slicing machine | Thermo Fisher Scientific Inc. | HM325 | |
| Slides glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 80312-3181 | |
| sodium citrate buffer | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | c1013 | |
| Streptozotocin | Sigma | 57654595 |
References
- Zimmet, P., Alberti, K. G., Shaw, J. Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature. 414 (6865), 782-787 (2001).
- Grennan, D.
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 265sr6 (2014).
- Patel, S., Srivastava, S., Singh, M. R., Singh, D. Mechanistic insight into diabetic wounds: Pathogenesis, molecular targets and treatment strategies to pace wound healing. Biomedicine & Pharmacotherapy. 112, 108615 (2019).
- Deeds, M. C., et al. Single dose streptozotocin-induced diabetes: Considerations for study design in islet transplantation models. Laboratory Animals. 45 (3), 131-140 (2011).
- Chao, P. C., et al. Investigation of insulin resistance in the popularly used four rat models of type-2 diabetes. Biomedicine & Pharmacotherapy. 101, 155-161 (2018).
- Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols. 1 (4), e78 (2021).
- Wu, J., Yan, L. J. Streptozotocin-induced type 1 diabetes in rodents as a model for studying mitochondrial mechanisms of diabetic β cell glucotoxicity. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 8, 181-188 (2015).
- Yang, J., Chen, Z., Pan, D., Li, H., Shen, J. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-derived exosomes combined pluronic F127 hydrogel promote chronic diabetic wound healing and complete skin regeneration. International Journal of Nanomedicine. 15, 5911-5926 (2020).
- Zhu, Y., Wang, Y., Jia, Y., Xu, J., Chai, Y. Roxadustat promotes angiogenesis through HIF-1α/VEGF/VEGFR2 signaling and accelerates cutaneous wound healing in diabetic rats. Wound Repair and Regeneration. 27 (4), 324-334 (2019).
- Shao, Z., et al. Wound microenvironment self-adaptive hydrogel with efficient angiogenesis for promoting diabetic wound healing. Bioactive Materials. 20, 561-573 (2022).
- Asfour, H. Z., et al. Enhanced healing efficacy of an optimized gabapentin-melittin nanoconjugate gel-loaded formulation in excised wounds of diabetic rats. Drug Delivery. 29 (1), 1892-1902 (2022).
- Wei, L., et al. Mesenchymal stem cells promote wound healing and effects on expression of matrix metalloproteinases-8 and 9 in the wound tissue of diabetic rats. Stem Cells and Development. 32 (1-2), 25-31 (2022).
- Pastar, I., et al. Preclinical models for wound-healing studies. In Skin Tissue Models., edited by. , Academic Press. Cambridge, MA. 223-253 (2018).
- Yang, R. H., et al. Epidermal stem cells (ESCs) accelerate diabetic wound healing via the Notch signalling pathway. Bioscience Reports. 36 (4), e00364 (2016).
- Suliman Maashi, M., Felemban, S. G., Almasmoum, H. A., Jarahian, M. Nicaraven-loaded electrospun wound dressings promote diabetic wound healing via proangiogenic and immunomodulatory functions: A preclinical investigation. Drug Delivery and Translational Research. 13 (1), 222-236 (2023).
- Hao, M., Ding, C., Sun, S., Peng, X., Liu, W. Chitosan/sodium alginate/velvet antler blood peptides hydrogel promotes diabetic wound healing via regulating angiogenesis, inflammatory response and skin flora. Journal of Inflammation Research. 15, 4921-4938 (2022).
- Kolluru, G. K., Bir, S. C., Kevil, C. G. Endothelial dysfunction and diabetes: Effects on angiogenesis, vascular remodeling, and wound healing. International Journal of Vascular Medicine. 2012, 918267 (2012).
- Okonkwo, U. A., DiPietro, L. A.
- Yi, C., et al. Targeted inhibition of endothelial calpain delays wound healing by reducing inflammation and angiogenesis. Cell Death & Disease. 11 (7), 533 (2020).
- Goodson 3rd, W. H., Hung, T. K. Studies of wound healing in experimental diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 22 (3), 221-227 (1977).
- Luippold, G., Klein, T., Mark, M., Empagliflozin Grempler, R. a novel potent and selective SGLT-2 inhibitor, improves glycaemic control alone and in combination with insulin in streptozotocin-induced diabetic rats, a model of type 1 diabetes mellitus. Diabetes, Obesity & Metabolism. 14 (7), 601-607 (2012).
- Sayed, N., et al. Effect of dapagliflozin alone and in combination with insulin in a rat model of type 1 diabetes. The Journal of Veterinary Medical Science. 82 (4), 467-474 (2020).
- Han, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells implantation accelerates cutaneous wound healing in diabetic rats via the Wnt signaling pathway. European Journal of Medical Research. 24 (1), 10 (2019).
- Ansell, D. M., Marsh, C., Walker, L., Hardman, M. J., Holden, K. Evaluating STZ-induced impaired wound healing in rats. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 994-997 (2018).
- Liu, Y., et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells not only ameliorate blood glucose but also protect vascular endothelium from diabetic damage through a paracrine mechanism mediated by MAPK/ERK signaling. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 258 (2022).
- Zindle, J. K., Wolinsky, E., Bogie, K. M. A review of animal models from 2015 to 2020 for preclinical chronic wounds relevant to human health. Journal of Tissue Viability. 30 (3), 291-300 (2021).
