Summary
Den streptozotocin-inducerede diabetiske sårmodel hos mandlige SD-rotter er i øjeblikket den mest anvendte model til undersøgelse af sårheling i type I diabetes mellitus. Denne protokol beskriver de metoder, der bruges til at konstruere denne model. Det præsenterer og adresserer også potentielle udfordringer og undersøger progression og angiogene egenskaber ved diabetiske sår.
Abstract
En enkelt høj dosis streptozotocin injektion efterfulgt af fuld tykkelse hud excision på dorsum af rotter er en almindelig metode til konstruktion af dyremodeller af type 1 diabetiske sår. Imidlertid kan forkert manipulation føre til model ustabilitet og høj dødelighed hos rotter. Desværre er der få eksisterende retningslinjer for type 1 diabetisk sårmodellering, og de mangler detaljer og præsenterer ikke specifikke referencestrategier. Derfor beskriver denne protokol den komplette procedure til konstruktion af en type 1 diabetisk sårmodel og analyserer progression og angiogene egenskaber ved diabetiske sår. Type 1 diabetisk sårmodellering involverer følgende trin: forberedelse af streptozotocininjektionen, induktion af type 1-diabetes mellitus og konstruktion af sårmodellen. Sårområdet blev målt på dag 7 og dag 14 efter sår, og rotternes hudvæv blev ekstraheret til histopatologisk og immunfluorescensanalyse. Resultaterne viste, at type 1 diabetes mellitus induceret af 55 mg / kg streptozotocin var forbundet med lavere dødelighed og en høj succesrate. Blodsukkerniveauet var relativt stabilt efter 5 ugers induktion. Den diabetiske sårhelingsrate var signifikant lavere end for normale sår på dag 7 og dag 14 (p < 0,05), men begge kunne nå mere end 90% på dag 14. Sammenlignet med den normale gruppe var epidermallagets lukning af diabetiske sår på dag 14 ufuldstændig og havde forsinket re-epithelialisering og signifikant lavere angiogenese (p < 0,01). Type 1 diabetisk sårmodel konstrueret baseret på denne protokol har karakteristika for kronisk sårheling, herunder dårlig lukning, forsinket re-epithelialisering og nedsat angiogenese sammenlignet med normale rottesår.
Introduction
Type 1 diabetes mellitus (T1DM) er en kronisk metabolisk sygdom præget af hyperglykæmi og ødelæggelse af β-celler i bugspytkirtlen1. Et T1DM-sår er et kronisk ikke-helende sår og den mest almindelige og ødelæggende komplikation til diabetes hos mennesker 2,3. Dyremodeller er de mest hensigtsmæssige prototyper til undersøgelse af patologiske forandringer under sårheling og sikkerheden og effektiviteten af potentielle terapeutiske midler4. Sammenlignet med andre typer er hanrotter af Sprague-Dawley (SD) mere følsomme over for streptozotocin (STZ) og viser en lavere relateret dødelighed, hvilket gør dem populære i diabetisk sårforskning 5,6.
Talrige metoder til konstruktion af T1DM sårmodeller er blevet beskrevet. Med hensyn til T1DM-modellen har undersøgelser primært fokuseret på effekten af STZ-injektionsmetoden på succesraten for diabetesinduktion 7,8. Modelleringsprocessen lider imidlertid af den inkonsekvente drift af det samme trin. I en undersøgelse fastede rotter i 18 timer før STZ-injektionen; rotter med blodsukkerniveauer højere end 16,67 mmol/l 1 uge efter STZ-injektionen blev anset for diabetiker, og diabetikersåret blev indført efter 3 uger9. Omvendt fastede Zhu et al. i en relateret undersøgelse rotter i 12 timer før STZ-injektionen; rotter med blodsukkerniveauer højere end 16,7 mmol / l 72 timer efter injektionen blev betragtet som diabetiker, og diabetisk sår blev introduceret efter 4 uger10. Samlet set er der uoverensstemmelser i STZ-injektionsprotokollerne, diabetesdiagnosekriterier og sårintroduktionstider.
Med hensyn til sårmodellering udskæres den fulde tykkelse af dorsalhuden i de fleste undersøgelser for at konstruere T1DM-sår efter vellykket diabetesinduktion11,12,13. Selvom denne model er modtagelig for hudkontraktur hos rotter, er det den mest almindeligt anvendte model i sårhelingsforskning, fordi den er mindre arbejdskrævende og er billig14,15. Ikke desto mindre mangler metodestyret forskning i denne excisionsteknik i fuld tykkelse. Desuden er der ingen ensartede standarder i eksisterende undersøgelser vedrørende sårstørrelse og placering12,16. Sårets størrelse og placering kan indirekte påvirke konsistensen af det eksperimentelle design og resultaternes videnskabelige validitet. Derfor er der et presserende behov for en standardprotokol for T1DM induktion og sårmodellering som reference for forskere. Målet med denne undersøgelse er at visualisere en specifik protokol til T1DM sårmodellering, der kan bruges som reference for T1DM sårundersøgelser.
Protocol
Protokollen blev gennemført efter Helsingfors-erklæringen, og alle dyreforsøg blev godkendt af forvaltningskomitéen fra Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Record No. 2021-13).
1. Forberedelse af streptozotocin injektion
- Vælg 15 SD-hanspecifikke patogenfrie (SPF) rotter i alderen 8 uger og vejer 220 g ± 20 g. Ved hjælp af den enkle randomiseringsmetode opdeles rotterne i en diabetisk gruppe (n = 10) og en normal gruppe (n = 5).
- Rotternes startvægt måles, og doseringen af STZ bestemmes ved administration af 55 mg/kg.
BEMÆRK: Baseret på præ-eksperimenter er 55 mg / kg den optimale STZ dosis. - STZ-pulveret vejes nøjagtigt, og det anbringes i en lystæt beholder.
- Der tilsættes en passende mængde 0,1 mol/l natriumcitratbuffer (pH 4,5) for at opløse STZ til en koncentration på 1 %.
BEMÆRK: Natriumcitratbufferen skal forkøles i 2 timer i et 4 °C køleskab før brug. Fremstillingen af STZ-opløsningen skal sikre sterilitet. - Ryst i 30 s ved hjælp af en lægemiddeloscillator. Anbring i en isboks, og sæt den til side.
BEMÆRK: Injektionen skal anvendes inden for 15 min.
2. Induktion af T1DM-modellen
- Før STZ-injektionen skal du faste rotterne i 18 timer og give fri adgang til vand.
- Udfør en intraperitoneal injektion af 1% STZ-opløsning.
- Tag fat i rotten, og udsæt mavehuden og injektionsstedet (skæringspunktet mellem linjen, der forbinder rødderne på de to lår og midterlinjen i maven).
- Desinficer injektionsstedet to gange med en vatrondel gennemvædet med 75% alkohol (en gang med uret og en gang mod uret). Placer rottens hoved under maven.
- Indsæt nålen parallelt med bugmidterlinjen i en vinkel på 45°, og efter gennemboring af huden reduceres nålevinklen til 30°, og indsæt derefter nålen 2-3 mm. Træk forsigtigt kanyleproppen ud, og sørg for, at der ikke suges blod eller væske ind i sprøjten. Injicer STZ-opløsningen, træk nålen ud og stop blødningen med en vatpind.
BEMÆRK: Hvis en gul væske trækkes tilbage i sprøjten, kan nålen være trængt ind i blæren, og hvis der trækkes en mørkegrøn væske, kan nålen være trængt ind i tyktarmen eller cæcum. I begge tilfælde skal nålen fjernes straks. Dyret skal vurderes af veterinærpersonale.
- Mål de afslappede (ikke-fastende eller fastende) blodsukkerniveauer kl. 09:00 på dag 3 og dag 7 efter STZ-induktion.
BEMÆRK: Tiden for tilfældig blodsukkermåling er fast. I denne protokol er den fastsat kl. 09:00. Det er dog ikke den eneste gang, der bruges. Blod opsamlet fra den kaudale vene ved en nålepunktur er mindre modtagelig for vævsvæske end blod taget fra en afskåret hale, så blodglukoseværdierne er mere nøjagtige.- Immobiliser rotten ved hjælp af en rottefiksator (figur 1).
- Find placeringen af den kaudale vene. Desinficer rottens hale to gange ved hjælp af en bomuldskugle gennemblødt i 75% alkohol.
- Punktering af den kaudale vene for at fremkalde blødning, og mål blodsukkeret ved hjælp af et glucometer. Stop blødningen med en vatpind.
BEMÆRK: Et glukoseniveau højere end 16,7 mmol / l på dag 7 efter STZ-injektionen betragtes som T1DM.
- Væg rotterne ugentligt, og mål blodsukkerniveauet og andre parametre, herunder kost, vandindtag og urinproduktion.
- Dyrene fodres normalt i 8 uger efter STZ-induktion.
3. Konstruktion af sårmodellen
- Barber rotterne med en elektrisk barbermaskine 1 dag før sårmodellering. Et barberet område på 5 cm x 5 cm på rottens dorsumside er generelt ideelt.
- Tør det barberede område af med en varm normal saltvandsbomuldskugle, lad det tørre, og påfør derefter hårfjerningscreme i 5 min. Rengør området med gasbind, og vask eventuel resterende hårfjerningscreme med varm normal saltvand.
- Rotterne vejes, og den nødvendige dosis Nembutal beregnes ud fra standarden på 35 mg/kg. Opløs Nembutal ved hjælp af normal saltvand i en koncentration på 3%. Andre generelle anæstetika såsom ketamin / xylazin eller isofluran kan anvendes til denne procedure. Arbejd venligst med institutionelle dyrepleje- og brugskomitéer for at sikre, hvad der er bedst.
BEMÆRK: For at sikre effektiviteten skal opløsningen være frisklavet, og Nembutal pulver og opløsning skal beskyttes mod lys. - Hurtig rotterne i 12 timer før bedøvelse. Injicer anæstesien intraperitonealt. Brug tetracyclin øjensalve eller et generelt øjensmøremiddel for at forhindre øjentørhed efter anæstesiadministrationen.
BEMÆRK: Anæstesi blev betragtet som moderat, når rottens muskler var relativt afslappede, øjenbevægelserne forsvandt, vejrtrækningen var regelmæssig, og responsen på smertefulde stimuli var lille. - Desinficer dorsalhuden to gange ved hjælp af bomuldskugler gennemblødt i jod (en gang med uret og en gang mod uret) og 75% alkohol (alternative runder).
- Efter tørring skæres huden med en cirkulær biopsistans med en diameter på 20 mm.
- Telt huden med sterile pincet, og brug derefter steril kirurgisk saks til at fjerne huden i fuld tykkelse langs punchskæremærkerne. Stop blødningen med en normal saltvand bomuldskugle.
BEMÆRK: Sårets overkant skal være 5-10 mm under den nedre skulderbladskant og 5-10 mm til højre/venstre for rottens rygsøjle (figur 2). Sårene er symmetriske langs rygsøjlen, når to sår er konstrueret. - Brug vaselingaze til at dække sårene, og pakk dem med en gasbind og åndbar bandage, der holdes på plads med gummitape. Injicer carprofen subkutant (5 mg/kg) én gang dagligt for at lindre postoperative smerter. Skift sårbandagen en gang dagligt (brug af carprofen til smertelindring).
BEMÆRK: Overhold rottens bevægelse og åndedræt for eventuelle abnormiteter, efter bandagen er afsluttet, og sørg for, at den åndbare bandage er passende stram. - Placer en lineal under såret, og fotografer såret med et digitalt kamera indtil dag 14. Aflive rotterne på dag 14 i henhold til de institutionelle retningslinjer for dyrepleje og brug. Skær sårvævet 5 mm fra sårkanten. Opdel vævsprøven i to dele, vask dem med PBS for at fjerne synlige blodpletter, og fastgør dem derefter med 4% paraformaldehydopløsning.
4. Beregning af sårområdet med ImageJ-software
- Klik på knappen Filer efter åbning af softwaren, og slip derefter ned og klik på Åbn for at åbne sårbillederne.
- Vælg værktøjet Lige , og tegn en lige linje på 1 cm langs linealen på sårbillederne.
- Klik på kommandoen Indstil skala i menuen Analysér , og indstil den kendte afstand til 1.
- Vælg markeringsværktøjet Frihånd, og skitsér omridset af såret på billedet.
- Klik på kommandoen Mål i menuen Analyser , og læs arealværdien , når resultatet dukker op.
5. Hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning
- Fjern hudvævet fra fikseringsmidlet, skær det i tynde sektioner med en skalpel i en røghætte, og læg det i en dehydreringskassette.
- Sæt dehydreringskassetten i en dehydreringsmaskine, og dehydrer vævene i følgende trin: 75% alkohol i 4 timer; 85% alkohol i 2 timer; 90% alkohol i 2 timer; 95% alkohol i 1 time; vandfri ethanol I og II i 30 minutter hver; alkoholbenzen i 5-10 minutter; xylen I og II i 5-10 minutter hver; og voks I, II og III i 1 time hver.
- Integrer vævene i voks. Afkøles ved -20 ° på et frysebord, og korriger voksblokken pænt.
- Voksblokkene skæres i længderetningen ved hjælp af en paraffinsnitsmaskine i 3 μm tykke sektioner.
- Sug sektionen i xylen I og II sekventielt i 20 minutter hver, vandfri ethanol I og II i 5 minutter hver og ledningsvand i 5 minutter.
- Oversvøm vævene med hæmatoxylinfarvning i 3-5 minutter, 0,5% vandig saltsyreopløsningsdifferentiering, 0,5% vandig ammoniakopløsning tilbage til blå og skyl med vand.
- Dehydrer vævssektionerne med 85% og 95% alkohol. Oversvøm vævene med eosinfarvningsopløsning i 5 minutter.
BEMÆRK: Normalt tager eosinfarvning 30 s til 2 min, og tiden kan justeres i henhold til farvningsresultaterne og kravene. - Sektionerne dehydreres sekventielt med følgende opløsninger: vandfri ethanol I, vandfri ethanol II, vandfri ethanol III, xylen I og xylen II, hver i 5 minutter. Til sidst skal du dække glasgliderne med neutral balsam.
- Undersøg det H&E-farvede væv under mikroskopet ved 40x, 20x og 10x, og tag billeder for at bevare repræsentative billeder af hvert dias.
6. CD31 immunofluorescens farvning
- Blødgør vævssektionerne i xylen I og II i 15 minutter hver, vandfri ethanol I og II i 5 minutter hver, 85% alkohol i 5 minutter og 75% alkohol i 5 minutter, og skyl med destilleret vand.
- Antigen reparation
- Tilsæt en passende 10 mM citronsyrebuffer med pH 6,0 til en mikrobølgeovnsbeholder, varm den op til kogning på høj, og læg derefter glasgliden ind i den.
- Kog i 8 min ved medium varme, stop i 8 min, og kog derefter igen ved medium-lav varme i 7 min.
- Lad diasene køle af, læg dem i PBS (pH 7,4), og vask dem tre gange i 5 minutter hver ved hjælp af en affarvningsryster.
- Tilsæt 5% gedeskeserum dråbevis i cirklen, og inkuber i 30 min.
- Ryst forsigtigt lukkeopløsningen (5% gedeserum) af, og tilsæt kaninanti-CD31-antistof (fortyndet med PBS i forholdet 1:200) dråbevis på sektionerne. Anbring sektionerne i en våd kasse, og inkuber natten over ved 4 °C.
- Vask objektglassene tre gange med PBS (pH 7,4) på en affarvningsryster i 5 minutter hver. Ryst sektionerne let for at tørre dem, og dæk dem derefter med en cirkulær dråbe FITC-mærket ged anti-kanin IgG. Inkuber ved stuetemperatur i 50 min i mørke.
- Vask objektglassene tre gange med PBS (pH 7,4) på en affarvningsryster i 5 minutter hver. Lufttør sektionerne med let omrystning, og tilsæt DAPI-farvningsopløsning. Inkuber sektionerne i mørke i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Efter tørring af sektionerne tegnes cirkler rundt om vævet med PepPen (for at forhindre tab af antistoffer), tilsæt et autofluorescensdæmpningsmiddel (0,3% Sudan Black B) til cirklerne i 5 minutter og skyl dem derefter under rindende vand i 10 minutter.
- Vask objektglassene tre gange med PBS (pH 7,4) på en affarvningsryster i 5 minutter hver. Ryst sektionerne lidt, og forsegl dem med et antifade monteringsmedium.
- Observer og fotografer sektionerne under et fluorescensmikroskop ved 40x, 20x og 10x.
BEMÆRK: DAPI UV-excitationsbølgelængden er 330-380 nm, og emissionsbølgelængden er 420 nm (blåt lys). FITC-excitationsbølgelængden er 465-495 nm, og emissionsbølgelængden er 515-555 nm (grønt lys).
7. Statistisk analyse
- Indsaml og analyser dataene ved hjælp af SPSS.
- Rapportér dataene som middelværdi ± standardafvigelse.
- Brug en uafhængig prøve t-test til at analysere forskellene mellem diabetiker og normale grupper.
- Indstil den statistiske signifikans til **p < 0,01 og *p < 0,05.
Representative Results
I alt 10 SD-rotter modtog en enkelt STZ intraperitoneal injektion for at inducere T1DM-modellen. En rotte døde for tidligt (10%), men diabetes blev induceret hos alle rotter (100%). Efter 3 dages STZ-injektion var blodglukoseniveauerne hos alle rotterne højere end 16,7 mmol/l, og blodsukkerniveauet stabiliserede sig 5 uger efter induktion (figur 3A). Vægten af diabetesgruppen steg gradvist efter STZ-injektionen, men faldt i uge 3 og steg derefter langsomt igen fra uge 4 (figur 3B). I modsætning hertil steg vægten af rotter i normalgruppen støt, og deres gennemsnitsvægt 3 dage efter diabetesinduktion var højere end diabetikergruppen (figur 3B). De diabetiske rotter udviste alle typiske symptomer på tørst, polyuri og vægttab, svarende til resultaterne af Hao et al.17.
På dag 7 og dag 14 efter såret afslørede den makroskopiske analyse, at re-epithelialisering var mere udtalt hos rotter i normalgruppen end i diabetikergruppen (figur 4A). De kvantitative resultater viste, at sårhelingshastigheden var signifikant lavere i diabetesgruppen end i normalgruppen på dag 7 og dag 14 (p < 0,01). På dag 14 kunne sårhelingsraterne imidlertid også være over 90% i diabetesgruppen (p < 0,05, figur 4B). Dette tyder på, at T1DM-sårmodellen er kendetegnet ved dårlig lukning, men ikke i samme omfang som den kroniske ikke-heling, der ses i humane diabetiske sår.
H&E-farvning på dag 14 af sårheling afslørede en ufuldstændig sårepidermis, langsom proliferation af keratinocytter og forsinket re-epithelialisering i diabetikergruppen sammenlignet med den normale gruppe. De diabetiske sår viste delvis tab af hårsækkene og talgkirtlerne. Der var også færre synlige kapillærer (figur 5).
Diabetes forårsager endotelcelledysfunktion, glykosylering af de ekstracellulære matrixproteiner og vaskulær denervation18. Disse komplikationer resulterer i lavere end normal sårangiogenese i diabetiske sår18. Angiogenese er nødvendig for sårheling, og sårangiogenese analyseres ofte ved CD31-immunfarvning (figur 6A)19,20. Baseret på den gennemsnitlige optiske tæthed (AOD) af CD31-ekspression var angiogenesen på sårstedet signifikant højere i normalgruppen end i diabetikergruppen (p < 0,01, figur 6B).
Figur 1: Billede af rotter immobiliseret af fixatorer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Diagram over rottesårets placering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Blodsukkerniveau og vægt af forsøgsrotterne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Hudsår i fuld tykkelse (20 mm i diameter) på ryggen af forsøgsrotterne. (A) Sårets makroskopiske udseende på dag 0, dag 7 og dag 14. Sårmorfologibillederne på dag 0, dag 7 og dag 14 blev taget med et digitalt kamera. (B) Sårområdet blev målt ved hjælp af ImageJ-software og blev brugt til at beregne sårhelingshastigheden. Sårhelingsraten (%) blev beregnet som følger: (indledende sårområde − sårområde på det angivne tidspunkt)/indledende sårområde × 100. Værdierne præsenteres som middelværdi ± SD (n = 14). Den statistiske signifikans blev fastsat til ** p < 0,01 og * p < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentative histopatologiske H&E-billeder på dag 14 efter sårdannelse. De blå pile angiver kapillærer. De røde pile viser spredning af keratinocytter. Venstre skala: en bjælke = 200 μm; Højre skala: en bjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Immunofluorescensfarvningsanalyse til ekspression af CD31. CD31 niveauer blev brugt til at bestemme tilstanden af angiogenese. (A) Repræsentative billeder af CD31-immunfluorescensfarvning i diabetiker- og normalgrupperne. IOD-værdien (integrated optical density) og pixelområdet (AREA) for hver hudprøve blev beregnet med Image-Pro Plus 6.0-softwaren. Den gennemsnitlige optiske tæthedsværdi (AOD) (AOD = IOD / AREA) blev også afledt. AOD-værdien var direkte proportional med det positive udtryk for CD31. (B) Kvantitativ sammenligning af CD31-positiv ekspression i diabetiker- og normalgrupperne. Data præsenteres som gennemsnit ± SD. ** p < 0,01. Skala: en bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne protokol præciserer de omstridte operationer i T1DM sårmodellering. Bekymringer om STZ-injektionsprotokollerne, T1DM-induktionssucceskriterier, blodsukkerstabiliseringstid og sårplacering og størrelse er blevet behandlet i dette arbejde. Desuden er de patologiske egenskaber og målbare parametre for T1DM sårhelingsvurdering blevet præciseret.
Rotterne fastede i 18 timer før STZ-injektionen for at undgå konkurrencedygtig binding af glukose eller dets analoger til β-celler, hvilket kunne påvirke effekten af STZ. Den mest almindeligt anvendte metode til at inducere T1DM er en enkelt høj dosis STZ, som øger blodsukkeret ved at beskadige øerne og nedsætte insulinsekretionen21. Pre-eksperimentelle forsøg viste, at den optimale STZ dosis for en høj succesrate og en lav dødelighed var 55 mg / kg, hvilket er lavere end de optimale doser rapporteret i tidligere undersøgelser22,23,24. I denne protokol blev T1DM induceret under anvendelse af en enkelt intraperitoneal injektion på 55 mg/kg STZ.
Blodsukkerniveauet var alle højere end 16,7 mmol/l 3 dage efter STZ-injektionen. Imidlertid er et blodsukkerniveau højere end 16,7 mmol / L på dag 7 efter STZ-injektion det anbefalede kriterium for vellykket T1DM-modellering, fordi omfanget af øskader varierer blandt rotter, og en passende forlængelse af diagnosetiden kan reducere den falsk-negative hastighed. Derudover stabiliserede blodsukkersvingningerne sig 5 uger efter STZ-injektionen, og rotterne tog gradvist på i vægt i denne periode, i overensstemmelse med tidligere fund25,26. Dette indikerer, at blodsukkerniveauet i T1DM-modellen skal stabiliseres i mindst 6 uger, og en stigning i rottevægt efter 6 uger reducerer dødeligheden under sårmodelleringen. Derfor udførte denne protokol sårmodellering 8 uger efter STZ-injektionen.
Sårlukningshastigheden på dag 7 og dag 14 efter såret var signifikant lavere hos diabetikeren end i den normale sårgruppe, hvilket indikerer langsom heling. Desuden var sårepithelialisering og angiogenese signifikant lavere hos diabetikeren end i den normale gruppe. Dette viser, at T1DM-sårmodellen viser langsommere sårheling og forsinket re-epithelialisering end hos normale rotter, hvilket kan være relateret til de patologiske ændringer af reduceret sårangiogenese. På dag 14 var T1DM-sårhelingshastigheden imidlertid også over 90%, hvilket adskiller sig fra den kroniske ikke-helende egenskab ved humane diabetiske sår. Dette kan skyldes, at gnaveres fysiologiske mekanismer til sårheling adskiller sig fra menneskers27. Derfor er den bedste sårdiameter mindst 20 mm, hvilket er stort nok til at give tid til at vurdere en interventions effektivitet i et diabetisk sårstudie. Sårplaceringen bør undgå skulderblad og rygsøjle, da kontinuerlig bevægelse på disse to steder kan forstyrre sårheling.
Afslutningsvis er konstruktionen af T1DM-sårmodellen ved hjælp af metoden i denne protokol effektiv. Protokollen replikerer nogle af egenskaberne ved kroniske diabetiske sår, såsom langsommere sårheling, forsinket re-epithelialisering og reduceret angiogenese sammenlignet med normale rottesår. Det vides dog ikke, om modellen kan replikere andre kroniske fænotyper af diabetiske sår. Desuden beskriver denne protokol den mest grundlæggende og udbredte metode, som ikke tager højde for spørgsmålet om hudkontraktion hos rotter. Fremtidig forskning kan inkorporere brugen af sårskinner i denne protokol eller udforske yderligere modeller af kroniske diabetiske sår, hvilket vil være en betydelig udfordring for forskere i fremtiden.
Disclosures
Alle forfattere erklærer, at dette manuskript ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet økonomisk af National Natural Science Foundation of China (82104877).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade mounting medium | Southern Biotechnology Associates, Inc. | 0100-01 | |
| AutoFluo Quencher | Servicebio Technology co., Ltd. | G1221 | |
| Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific Inc. | Varistain™ Gemini ES | |
| CD31 | Servicebio Technology co., Ltd. | GB11063-2 | |
| Citrate antigen retrieval solution | Servicebio Technology co., Ltd. | G1201 | |
| Cover glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 10212432C | |
| DAPI | Servicebio Technology co., Ltd. | G1012 | |
| Decolorization shaker | Scilogex | S1010E | |
| Depilatory cream | Guangzhou Ruixin Biotechnology Co., Ltd. | — | |
| Dimethyl benzene | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 64-17-5 | |
| Drug oscillator | Shenzhen Jiashi Technology Co., Ltd. | VM-370 | |
| Electric razor | Shanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd. | FC5908 | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | JB-P5 | |
| Ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 1330-20-7 | |
| Fitc-labeled goat anti-rabbit IgG | Servicebio Technology co., Ltd. | GB22303 | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific Inc. | 16210064 | |
| Hematoxylin and eosin staining solution | Beijing Regan Biotechnology Co., Ltd. | DH0020 | |
| Image J software | National Institutes of Health | — | |
| Microwave oven | Midea Group Co., Ltd. | M1-L213B | |
| Mini centrifuge | Scilogex | D1008 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Portable blood glucose meter | Sinocare Inc. | GA-3 | |
| Rapid tissue processor | Thermo Fisher Scientific Inc. | STP420 ES | |
| Rat fixator | Globalebio (Beijing) Technology co., Ltd | GEGD-Q10G1 | |
| Slicing machine | Thermo Fisher Scientific Inc. | HM325 | |
| Slides glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 80312-3181 | |
| sodium citrate buffer | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | c1013 | |
| Streptozotocin | Sigma | 57654595 |
References
- Zimmet, P., Alberti, K. G., Shaw, J. Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature. 414 (6865), 782-787 (2001).
- Grennan, D.
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 265sr6 (2014).
- Patel, S., Srivastava, S., Singh, M. R., Singh, D. Mechanistic insight into diabetic wounds: Pathogenesis, molecular targets and treatment strategies to pace wound healing. Biomedicine & Pharmacotherapy. 112, 108615 (2019).
- Deeds, M. C., et al. Single dose streptozotocin-induced diabetes: Considerations for study design in islet transplantation models. Laboratory Animals. 45 (3), 131-140 (2011).
- Chao, P. C., et al. Investigation of insulin resistance in the popularly used four rat models of type-2 diabetes. Biomedicine & Pharmacotherapy. 101, 155-161 (2018).
- Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols. 1 (4), e78 (2021).
- Wu, J., Yan, L. J. Streptozotocin-induced type 1 diabetes in rodents as a model for studying mitochondrial mechanisms of diabetic β cell glucotoxicity. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 8, 181-188 (2015).
- Yang, J., Chen, Z., Pan, D., Li, H., Shen, J. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-derived exosomes combined pluronic F127 hydrogel promote chronic diabetic wound healing and complete skin regeneration. International Journal of Nanomedicine. 15, 5911-5926 (2020).
- Zhu, Y., Wang, Y., Jia, Y., Xu, J., Chai, Y. Roxadustat promotes angiogenesis through HIF-1α/VEGF/VEGFR2 signaling and accelerates cutaneous wound healing in diabetic rats. Wound Repair and Regeneration. 27 (4), 324-334 (2019).
- Shao, Z., et al. Wound microenvironment self-adaptive hydrogel with efficient angiogenesis for promoting diabetic wound healing. Bioactive Materials. 20, 561-573 (2022).
- Asfour, H. Z., et al. Enhanced healing efficacy of an optimized gabapentin-melittin nanoconjugate gel-loaded formulation in excised wounds of diabetic rats. Drug Delivery. 29 (1), 1892-1902 (2022).
- Wei, L., et al. Mesenchymal stem cells promote wound healing and effects on expression of matrix metalloproteinases-8 and 9 in the wound tissue of diabetic rats. Stem Cells and Development. 32 (1-2), 25-31 (2022).
- Pastar, I., et al. Preclinical models for wound-healing studies. In Skin Tissue Models., edited by. , Academic Press. Cambridge, MA. 223-253 (2018).
- Yang, R. H., et al. Epidermal stem cells (ESCs) accelerate diabetic wound healing via the Notch signalling pathway. Bioscience Reports. 36 (4), e00364 (2016).
- Suliman Maashi, M., Felemban, S. G., Almasmoum, H. A., Jarahian, M. Nicaraven-loaded electrospun wound dressings promote diabetic wound healing via proangiogenic and immunomodulatory functions: A preclinical investigation. Drug Delivery and Translational Research. 13 (1), 222-236 (2023).
- Hao, M., Ding, C., Sun, S., Peng, X., Liu, W. Chitosan/sodium alginate/velvet antler blood peptides hydrogel promotes diabetic wound healing via regulating angiogenesis, inflammatory response and skin flora. Journal of Inflammation Research. 15, 4921-4938 (2022).
- Kolluru, G. K., Bir, S. C., Kevil, C. G. Endothelial dysfunction and diabetes: Effects on angiogenesis, vascular remodeling, and wound healing. International Journal of Vascular Medicine. 2012, 918267 (2012).
- Okonkwo, U. A., DiPietro, L. A.
- Yi, C., et al. Targeted inhibition of endothelial calpain delays wound healing by reducing inflammation and angiogenesis. Cell Death & Disease. 11 (7), 533 (2020).
- Goodson 3rd, W. H., Hung, T. K. Studies of wound healing in experimental diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 22 (3), 221-227 (1977).
- Luippold, G., Klein, T., Mark, M., Empagliflozin Grempler, R. a novel potent and selective SGLT-2 inhibitor, improves glycaemic control alone and in combination with insulin in streptozotocin-induced diabetic rats, a model of type 1 diabetes mellitus. Diabetes, Obesity & Metabolism. 14 (7), 601-607 (2012).
- Sayed, N., et al. Effect of dapagliflozin alone and in combination with insulin in a rat model of type 1 diabetes. The Journal of Veterinary Medical Science. 82 (4), 467-474 (2020).
- Han, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells implantation accelerates cutaneous wound healing in diabetic rats via the Wnt signaling pathway. European Journal of Medical Research. 24 (1), 10 (2019).
- Ansell, D. M., Marsh, C., Walker, L., Hardman, M. J., Holden, K. Evaluating STZ-induced impaired wound healing in rats. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 994-997 (2018).
- Liu, Y., et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells not only ameliorate blood glucose but also protect vascular endothelium from diabetic damage through a paracrine mechanism mediated by MAPK/ERK signaling. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 258 (2022).
- Zindle, J. K., Wolinsky, E., Bogie, K. M. A review of animal models from 2015 to 2020 for preclinical chronic wounds relevant to human health. Journal of Tissue Viability. 30 (3), 291-300 (2021).
