Summary
Het streptozotocine-geïnduceerde diabetische wondmodel bij mannelijke SD-ratten is momenteel het meest gebruikte model voor het bestuderen van wondgenezing bij type I diabetes mellitus. Dit protocol beschrijft de methoden die worden gebruikt om dit model te construeren. Het presenteert en behandelt ook potentiële uitdagingen en onderzoekt de progressie en angiogene kenmerken van diabetische wonden.
Abstract
Een enkele hoge dosis streptozotocine-injectie gevolgd door volledige huidexcisie op het dorsum van ratten is een veelgebruikte methode voor het construeren van diermodellen van type 1 diabetische wonden. Onjuiste manipulatie kan echter leiden tot modelinstabiliteit en hoge sterfte bij ratten. Helaas zijn er weinig bestaande richtlijnen voor type 1 diabetische wondmodellering, en ze missen details en presenteren geen specifieke referentiestrategieën. Daarom beschrijft dit protocol de volledige procedure voor het construeren van een type 1 diabetisch wondmodel en analyseert het de progressie en angiogene kenmerken van de diabetische wonden. Type 1 diabetische wondmodellering omvat de volgende stappen: voorbereiding van de streptozotocine-injectie, inductie van type 1 diabetes mellitus en constructie van het wondmodel. Het wondgebied werd gemeten op dag 7 en dag 14 na verwonding en de huidweefsels van de ratten werden geëxtraheerd voor histopathologische en immunofluorescentieanalyse. De resultaten toonden aan dat type 1 diabetes mellitus geïnduceerd door 55 mg / kg streptozotocine geassocieerd was met een lagere mortaliteit en een hoog slagingspercentage. De bloedglucosewaarden waren relatief stabiel na 5 weken inductie. Het diabetische wondgenezingspercentage was significant lager dan dat van normale wonden op dag 7 en dag 14 (p < 0,05), maar beide konden op dag 14 meer dan 90% bereiken. Vergeleken met de normale groep was de sluiting van de epidermale laag van diabetische wonden op dag 14 onvolledig en had vertraagde re-epithelisatie en significant lagere angiogenese (p < 0,01). Het type 1 diabetische wondmodel dat op basis van dit protocol is geconstrueerd, heeft de kenmerken van chronische wondgenezing, waaronder slechte sluiting, vertraagde re-epithelisatie en verminderde angiogenese in vergelijking met normale rattenwonden.
Introduction
Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is een chronische stofwisselingsziekte die wordt gekenmerkt door hyperglycemie en de vernietiging van pancreas β-cellen1. Een T1DM-wond is een chronische niet-genezende wond en de meest voorkomende en verwoestende complicatie van diabetes bij de mens 2,3. Diermodellen zijn de meest geschikte prototypes voor het bestuderen van de pathologische veranderingen tijdens wondgenezing en de veiligheid en werkzaamheid van potentiële therapeutische middelen4. In vergelijking met andere typen zijn mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten gevoeliger voor streptozotocine (STZ) en vertonen ze een lager gerelateerd sterftecijfer, waardoor ze populair zijn in diabetisch wondonderzoek 5,6.
Talrijke methoden voor het construeren van T1DM-wondmodellen zijn beschreven. Met betrekking tot het T1DM-model hebben studies zich voornamelijk gericht op het effect van de STZ-injectiemethode op het slagingspercentage van diabetesinductie 7,8. Het modelleringsproces lijdt echter onder de inconsistente werking van dezelfde stap. In één onderzoek vastten ratten gedurende 18 uur vóór de STZ-injectie; ratten met bloedglucosespiegels hoger dan 16,67 mmol / L 1 week na de STZ-injectie werden als diabetisch beschouwd en de diabetische wond werd na 3 weken geïntroduceerd9. Omgekeerd, in een gerelateerde studie, nuchterden Zhu et al. ratten gedurende 12 uur vóór de STZ-injectie; ratten met bloedglucosewaarden hoger dan 16,7 mmol / L 72 uur na de injectie werden als diabetisch beschouwd en de diabetische wond werd na 4 weken geïntroduceerd10. Over het algemeen zijn er inconsistenties in de STZ-injectieprotocollen, diabetesdiagnosecriteria en wondintroductietijden.
In termen van wondmodellering wordt in de meeste studies de volledige dikte van de dorsale huid weggesneden om T1DM-wonden te construeren na succesvolle diabetesinductie11,12,13. Hoewel dit model gevoelig is voor huidcontractuur bij ratten, is het het meest gebruikte model in wondgenezingsonderzoek omdat het minder arbeidsintensief is en goedkoopis 14,15. Toch ontbreekt het aan methodegestuurd onderzoek naar deze excisietechniek van volledige dikte. Bovendien zijn er geen uniforme normen in bestaande studies met betrekking tot wondgrootte en locatie12,16. De grootte en locatie van de wond kunnen indirect van invloed zijn op de consistentie van het experimentele ontwerp en de wetenschappelijke validiteit van de resultaten. Daarom is er dringend behoefte aan een standaardprotocol voor T1DM-inductie en wondmodellering als referentie voor onderzoekers. Het doel van deze studie is om een specifiek protocol voor T1DM-wondmodellering te visualiseren dat kan worden gebruikt als referentie voor T1DM-wondstudies.
Protocol
Het protocol werd uitgevoerd na de Verklaring van Helsinki en alle dierproeven werden goedgekeurd door het managementcomité van de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (record nr. 2021-13).
1. Bereiding van de streptozotocine-injectie
- Selecteer 15 SD mannelijke specifieke pathogeenvrije (SPF) ratten van 8 weken oud en met een gewicht van 220 g ± 20 g. Verdeel de ratten met behulp van de eenvoudige randomisatiemethode in een diabetische groep (n = 10) en een normale groep (n = 5).
- Meet het begingewicht van de ratten en bepaal de dosering van STZ door toediening van 55 mg/kg.
OPMERKING: Op basis van voorexperimenten is 55 mg/kg de optimale STZ-dosis. - Weeg het STZ-poeder nauwkeurig af en plaats het in een lichtdichte container.
- Voeg een geschikte hoeveelheid natriumcitraatbuffer van 0,1 mol/l (pH 4,5) toe om de STZ op te lossen tot een concentratie van 1 %.
OPMERKING: De natriumcitraatbuffer moet voor gebruik gedurende 2 uur worden voorgekoeld in een koelkast van 4 °C. De bereiding van de STZ-oplossing moet steriliteit garanderen. - Schud gedurende 30 s met behulp van een medicijnoscillator. Plaats in een ijskist en zet apart.
OPMERKING: De injectie moet binnen 15 minuten worden gebruikt.
2. Inductie van het T1DM-model
- Vóór de STZ-injectie vasten de ratten gedurende 18 uur en geven vrije toegang tot water.
- Voer een intraperitoneale injectie uit met 1% STZ-oplossing.
- Pak de rat vast en leg de buikhuid en de injectieplaats bloot (het snijpunt van de lijn die de wortels van de twee dijen en de middellijn van de buik verbindt).
- Desinfecteer de injectieplaats tweemaal met een watje gedrenkt in 75% alcohol (eenmaal met de klok mee en eenmaal tegen de klok in). Plaats de kop van de rat onder de buik.
- Steek de naald evenwijdig aan de buiklijn in een hoek van 45° en verklein na het doorboren van de huid de naaldhoek tot 30° en steek de naald vervolgens 2-3 mm in. Trek voorzichtig aan de naaldplug en zorg ervoor dat er geen bloed of vloeistof in de spuit wordt gezogen. Injecteer de STZ-oplossing, trek de naald eruit en stop het bloeden met een wattenstaafje.
OPMERKING: Als een gele vloeistof terug in de spuit wordt getrokken, kan de naald de blaas zijn binnengedrongen en als een donkergroene vloeistof wordt getrokken, kan de naald de dikke darm of het caecum zijn binnengedrongen. In beide gevallen moet de naald onmiddellijk worden verwijderd. Het dier moet worden beoordeeld door veterinair personeel.
- Meet de incidentele (niet-nuchtere of nuchtere) bloedglucosespiegels om 09:00 uur op dag 3 en dag 7 na STZ-inductie.
OPMERKING: De tijd voor willekeurige bloedglucosemeting is vastgesteld. In dit protocol is het om 09:00 uur vastgelegd. Het is echter niet de enige tijd die wordt gebruikt. Bloed dat door een naaldpunctie uit de caudadale ader wordt verzameld, is minder gevoelig voor weefselvloeistof dan bloed uit een afgehakte staart, dus bloedglucosewaarden zijn nauwkeuriger.- Immobiliseer de rat met behulp van een rattenfixator (figuur 1).
- Zoek de locatie van de caudale ader. Desinfecteer de staart van de rat twee keer met een watje gedrenkt in 75% alcohol.
- Doorprik de caudadale ader om bloedingen op te wekken en meet de bloedglucose met behulp van een glucometer. Stop het bloeden met een wattenstaafje.
OPMERKING: Een glucosespiegel hoger dan 16,7 mmol / L op dag 7 na de STZ-injectie wordt beschouwd als T1DM.
- Weeg de ratten wekelijks en meet de bloedglucosespiegels en andere parameters, waaronder dieet, waterinname en urineproductie.
- Voer de dieren normaal gedurende 8 weken na STZ-inductie.
3. Constructie van het wondmodel
- Scheer de ratten met een elektrisch scheermes 1 dag voor het modelleren van de wond. Een geschoren gebied van 5 cm x 5 cm aan de dorsumzijde van de rat is over het algemeen ideaal.
- Veeg het geschoren gebied af met een warm normaal zout watje, laat het drogen en breng vervolgens ontharingscrème aan gedurende 5 minuten. Reinig het gebied met gaas en was eventuele resterende ontharingscrème met warme normale zoutoplossing.
- Weeg de ratten en bereken de vereiste dosis Nembutal op basis van de standaard van 35 mg/kg. Los de Nembutal op met een normale zoutoplossing tot een concentratie van 3%. Andere algemene anesthetica zoals ketamine / xylazine of isofluraan kunnen voor deze procedure worden gebruikt. Werk samen met institutionele dierverzorgings- en gebruikscommissies om ervoor te zorgen wat het beste is.
OPMERKING: Om de werkzaamheid te garanderen, moet de oplossing vers worden bereid en moeten het Nembutal-poeder en de oplossing worden beschermd tegen licht. - Vast de ratten gedurende 12 uur voor verdoving. Injecteer de anesthesie intraperitoneaal. Gebruik tetracycline oogzalf of een algemeen oogsmeermiddel om droge ogen na toediening van de anesthesie te voorkomen.
OPMERKING: Anesthesie werd als matig beschouwd wanneer de spieren van de rat relatief ontspannen waren, de oogbewegingen verdwenen, de ademhaling regelmatig was en de reactie op pijnlijke stimuli klein was. - Desinfecteer de dorsale huid tweemaal met wattenbollen gedrenkt in jodium (eenmaal met de klok mee en eenmaal tegen de klok in) en 75% alcohol (alternatieve rondes).
- Snijd na het drogen de huid af met een cirkelvormige biopsiepons met een diameter van 20 mm.
- Tent de huid met een steriele tang en gebruik vervolgens een steriele chirurgische schaar om de huid van volledige dikte langs de ponsknipsporen te verwijderen. Stop het bloeden met een normaal zout watje.
OPMERKING: De bovenste rand van de wond moet 5-10 mm onder de onderste scapulaire rand liggen en 5-10 mm rechts/links van de wervelkolom van de rat (figuur 2). De wonden zijn symmetrisch langs de wervelkolom wanneer twee wonden worden geconstrueerd. - Gebruik vaselinegaas om de wonden te bedekken en wikkel ze in met een gaas en ademend verband dat op zijn plaats wordt gehouden met rubbertape. Injecteer carprofen eenmaal daags subcutaan (5 mg/kg) om postoperatieve pijn te verlichten. Vervang het wondverband eenmaal per dag (gebruik van carprofen voor pijnverlichting).
OPMERKING: Observeer de beweging en ademhaling van de rat op eventuele afwijkingen nadat het verband is voltooid en zorg ervoor dat het ademende verband goed strak zit. - Plaats een liniaal onder de wond en fotografeer de wond met een digitale camera tot dag 14. Euthanaseer de ratten op dag 14 volgens de richtlijnen voor verzorging en gebruik van de instelling. Snijd het wondhuidweefsel 5 mm van de wondrand. Verdeel het weefselmonster in twee delen, was ze met PBS om zichtbare bloedvlekken te verwijderen en fixeer ze vervolgens met 4% paraformaldehyde-oplossing.
4. Berekening van het wondgebied met ImageJ-software
- Klik op de knop Bestand na het openen van de software en zet vervolgens neer en klik op Openen om de wondfoto's te openen.
- Selecteer het gereedschap Recht en teken een rechte lijn van 1 cm langs de liniaal in de wondafbeeldingen.
- Klik op de opdracht Schaal instellen in het menu Analyseren en stel de bekende afstand in op 1.
- Selecteer het gereedschap Selecties uit de vrije hand en schets de omtrek van de wond op de afbeelding.
- Klik op de opdracht Meten in het menu Analyseren en lees de gebiedswaarde nadat het resultaat verschijnt.
5. Hematoxyline en eosine (H &E) kleuring
- Verwijder het huidweefsel van het fixeermiddel, snijd het in dunne delen met een scalpel in een zuurkast en plaats het in een uitdrogingscassette.
- Doe de uitdrogingscassette in een uitdrogingsmachine en droog de weefsels in de volgende stappen: 75% alcohol gedurende 4 uur; 85% alcohol gedurende 2 uur; 90% alcohol gedurende 2 uur; 95% alcohol gedurende 1 uur; watervrije ethanol I en II gedurende elk 30 minuten; alcohol benzeen gedurende 5-10 min; xyleen I en II gedurende elk 5-10 minuten; en was I, II en III gedurende elk 1 uur.
- Sluit de weefsels in was in. Laat afkoelen op −20° op een vriestafel en corrigeer het wasblok netjes.
- Snijd de wasblokken in de lengterichting met behulp van een paraffinesectiemachine in secties van 3 μm dik.
- Week de sectie achtereenvolgens in xyleen I en II gedurende elk 20 minuten, watervrije ethanol I en II gedurende elk 5 minuten en kraanwater gedurende 5 minuten.
- Overspoel de weefsels met hematoxylinekleuring gedurende 3-5 minuten, 0,5% waterige zoutzuuroplossingdifferentiatie, 0,5% waterige ammoniakoplossing terug naar blauw en spoel af met water.
- Droog de weefselsecties uit met 85% en 95% alcohol. Overspoel de weefsels met eosinekleuringsoplossing gedurende 5 minuten.
OPMERKING: Normaal gesproken duurt eosinekleuring 30 s tot 2 minuten en de tijd kan worden aangepast aan de kleuringsresultaten en vereisten. - Droog de secties achtereenvolgens uit met de volgende oplossingen: watervrij ethanol I, watervrij ethanol II, watervrij ethanol III, xyleen I en xyleen II, elk gedurende 5 minuten. Bedek ten slotte de glasplaten met neutrale balsem.
- Onderzoek de H &E-gekleurde weefsels onder de microscoop op 40x, 20x en 10x en maak foto's om representatieve afbeeldingen van elke dia te behouden.
6. CD31 immunofluorescentie kleuring
- Week de weefselsecties in xyleen I en II gedurende 15 minuten elk, watervrije ethanol I en II gedurende 5 minuten elk, 85% alcohol gedurende 5 minuten en 75% alcohol gedurende 5 minuten, en spoel af met gedestilleerd water.
- Antigeen reparatie
- Voeg een geschikte citroenzuurbuffer van 10 mM van pH 6,0 toe aan een magnetroncontainer, verwarm het tot koken op hoog en plaats het glas erin.
- Kook gedurende 8 minuten op een middelhoog vuur, stop gedurende 8 minuten en kook vervolgens opnieuw op een middelhoog vuur gedurende 7 minuten.
- Laat de dia's afkoelen, plaats ze in PBS (pH 7,4) en was ze drie keer gedurende 5 minuten elk met een ontkleuringsschudder.
- Voeg 5% geitenserum druppelsgewijs toe in de cirkel en incubeer gedurende 30 min.
- Schud de sluitingsoplossing (5% geitenserum) voorzichtig af en voeg konijn anti-CD31-antilichaam (verdund met PBS in een verhouding van 1:200) druppelsgewijs toe aan de secties. Plaats de secties in een natte doos en incubeer een nacht bij 4°C.
- Was de dia's drie keer met PBS (pH 7,4) op een ontkleuringsschudder gedurende elk 5 minuten. Schud de secties lichtjes om ze te drogen en bedek ze vervolgens met een cirkelvormige druppel FITC-gelabelde geit anti-konijn IgG. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 50 minuten in het donker.
- Was de dia's drie keer met PBS (pH 7,4) op een ontkleuringsschudder gedurende elk 5 minuten. Droog de secties aan de lucht met licht schudden en voeg DAPI-kleuringsoplossing toe. Incubeer de secties in het donker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Teken na het drogen van de secties cirkels rond het weefsel met de PepPen (om het verlies van antilichamen te voorkomen), voeg een autofluorescentie-blusmiddel (0,3% Sudan Black B) toe aan de cirkels gedurende 5 minuten en spoel ze vervolgens gedurende 10 minuten onder stromend water.
- Was de dia's drie keer met PBS (pH 7,4) op een ontkleuringsschudder gedurende elk 5 minuten. Schud de secties lichtjes en sluit ze af met een antifade montagemedium.
- Observeer en fotografeer de secties onder een fluorescentiemicroscoop op 40x, 20x en 10x.
OPMERKING: De DAPI UV-excitatiegolflengte is 330-380 nm en de emissiegolflengte is 420 nm (blauw licht). De FITC-excitatiegolflengte is 465-495 nm en de emissiegolflengte is 515-555 nm (groen licht).
7. Statistische analyse
- Verzamel en analyseer de gegevens met behulp van SPSS.
- Rapporteer de gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie.
- Gebruik een onafhankelijke t-test om de verschillen tussen de diabetische en normale groepen te analyseren.
- Stel de statistische significantie in op **p < 0,01 en *p < 0,05.
Representative Results
In totaal kregen 10 SD-ratten een enkele STZ intraperitoneale injectie om het T1DM-model te induceren. Eén rat stierf vroegtijdig (10%), maar diabetes werd geïnduceerd bij alle ratten (100%). Na 3 dagen STZ-injectie waren de bloedglucosespiegels van alle ratten hoger dan 16,7 mmol / L en stabiliseerden de bloedglucosespiegels 5 weken na inductie (figuur 3A). Het gewicht van de diabetische groep nam geleidelijk toe na de STZ-injectie, maar nam af in week 3 en nam vervolgens langzaam weer toe vanaf week 4 (figuur 3B). Daarentegen nam het gewicht van ratten in de normale groep gestaag toe en hun gemiddelde gewicht 3 dagen na diabetesinductie was hoger dan dat van de diabetische groep (figuur 3B). De diabetische ratten vertoonden allemaal typische symptomen van dorst, polyurie en gewichtsverlies, vergelijkbaar met de bevindingen van Hao et al.17.
Op dag 7 en dag 14 na de verwonding bleek uit de macroscopische analyse dat re-epithelisatie meer uitgesproken was bij ratten in de normale groep dan in de diabetische groep (figuur 4A). Uit de kwantitatieve resultaten bleek dat het wondgenezingspercentage significant lager was in de diabetische groep dan in de normale groep op dag 7 en dag 14 (p < 0,01). Op dag 14 zouden de wondgenezingspercentages echter ook boven de 90% kunnen liggen in de diabetische groep (p < 0,05, figuur 4B). Dit suggereert dat het T1DM-wondmodel wordt gekenmerkt door een slechte sluiting, maar niet in de mate van de chronische niet-genezing die wordt gezien bij menselijke diabetische wonden.
H &E-kleuring op dag 14 van wondgenezing onthulde een onvolledige wondepidermis, langzame proliferatie van keratinocyten en vertraagde re-epithelisatie in de diabetische groep in vergelijking met de normale groep. De diabetische wonden vertoonden gedeeltelijk verlies van de haarzakjes en talgklieren. Ook waren er minder zichtbare haarvaten (figuur 5).
Diabetes veroorzaakt endotheelceldisfunctie, glycosylering van de extracellulaire matrixeiwitten en vasculaire denervatie18. Deze complicaties resulteren in een lager dan normale wondangiogenese bij diabetische wonden18. Angiogenese is noodzakelijk voor wondgenezing en wondangiogenese wordt vaak geanalyseerd door CD31-immunostaining (figuur 6A)19,20. Op basis van de gemiddelde optische dichtheid (AOD) van CD31-expressie was angiogenese op de wondplaats significant hoger in de normale dan in de diabetische groep (p < 0,01, figuur 6B).
Figuur 1: Foto van ratten geïmmobiliseerd door fixators. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Diagram van de wondlocatie van de rat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bloedglucosewaarden en gewichten van de experimentele ratten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Huidwonden van volledige dikte (20 mm in diameter) op de ruggen van de experimentele ratten. (A) Het macroscopische uiterlijk van de wonden op dag 0, dag 7 en dag 14. De wondmorfologiebeelden op dag 0, dag 7 en dag 14 zijn vastgelegd met een digitale camera. (B) Het wondgebied werd gemeten met behulp van ImageJ-software en werd gebruikt om de wondgenezingssnelheid te berekenen. Het wondgenezingspercentage (%) werd als volgt berekend: (initieel wondgebied − wondgebied op het aangegeven tijdstip)/initieel wondgebied × 100. De waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 14). De statistische significantie werd vastgesteld op ** p < 0,01 en * p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve histopathologische H&E-beelden op dag 14 na wondvorming. De blauwe pijlen geven haarvaten aan. De rode pijlen tonen de proliferatie van keratinocyten. Linkerschaal: één balk = 200 μm; Rechter schaal: één balk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Immunofluorescentie kleuringsanalyse voor de expressie van CD31. CD31-niveaus werden gebruikt om de toestand van angiogenese te bepalen. (A) Representatieve beelden van CD31 immunofluorescentiekleuring in de diabetische en normale groepen. De geïntegreerde optische dichtheid (IOD) waarde en het pixeloppervlak (AREA) voor elk huidmonster werden berekend met Image-Pro Plus 6.0-software. De gemiddelde optische dichtheid (AOD) waarde (AOD = IOD/AREA) werd ook afgeleid. De AOD-waarde was recht evenredig met de positieve expressie van CD31. (B) Kwantitatieve vergelijking van CD31 positieve expressie in de diabetische en normale groepen. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. ** p < 0,01. Schaal: één bar = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Dit protocol verduidelijkt de betwiste bewerkingen in T1DM-wondmodellering. Zorgen over de STZ-injectieprotocollen, T1DM-inductiesuccescriteria, bloedglucosestabilisatietijd en wondlocatie en -grootte zijn in dit werk aangepakt. Verder zijn de pathologische kenmerken en meetbare parameters voor T1DM wondgenezingsbeoordeling verduidelijkt.
De ratten vastten gedurende 18 uur vóór de STZ-injectie om de competitieve binding van glucose of zijn analogen aan β-cellen te vermijden, wat de werkzaamheid van STZ zou kunnen beïnvloeden. De meest gebruikte methode om T1DM te induceren is een enkele hoge dosis STZ, die de bloedglucose verhoogt door de eilandjes te beschadigen en de insulinesecretie te verminderen21. Pre-experimentele studies toonden aan dat de optimale STZ-dosis voor een hoog slagingspercentage en een laag sterftecijfer 55 mg / kg was, wat lager is dan de optimale doses gerapporteerd in eerdere studies22,23,24. In dit protocol werd T1DM geïnduceerd met behulp van een enkele intraperitoneale injectie van 55 mg/kg STZ.
De bloedglucosewaarden waren allemaal hoger dan 16,7 mmol / L 3 dagen na de STZ-injectie. Een bloedglucosespiegel hoger dan 16,7 mmol / L op dag 7 na STZ-injectie is echter het aanbevolen criterium voor succesvolle T1DM-modellering, omdat de mate van eilandjesschade varieert tussen ratten en een geschikte verlenging van de diagnostische tijd de vals-negatieve snelheid kan verminderen. Bovendien stabiliseerden de bloedglucoseschommelingen 5 weken na de STZ-injectie en de ratten werden geleidelijk zwaarder in deze periode, in overeenstemming met eerdere bevindingen25,26. Dit geeft aan dat de bloedglucosespiegel in het T1DM-model gedurende ten minste 6 weken moet worden gestabiliseerd en dat een toename van het rattengewicht na 6 weken de sterftecijfers tijdens de wondmodellering vermindert. Vandaar dat dit protocol wondmodellering 8 weken na de STZ-injectie uitvoerde.
Het sluitingspercentage van de wond op dag 7 en dag 14 na verwonding was significant lager bij diabetici dan bij de normale wondgroep, wat wijst op langzame genezing. Bovendien waren wondherepithelisatie en angiogenese significant lager bij diabetici dan bij de normale groep. Dit toont aan dat het T1DM-wondmodel een langzamere wondgenezing en vertraagde re-epithelisatie vertoont dan bij normale ratten, wat verband kan houden met de pathologische veranderingen van verminderde wondangiogenese. Op dag 14 was het T1DM-wondgenezingspercentage echter ook boven de 90%, wat verschilt van het chronische niet-genezende kenmerk van menselijke diabetische wonden. Dit kan zijn omdat de fysiologische mechanismen van knaagdieren voor wondgenezing verschillen van die van mensen27. Bijgevolg is de beste wonddiameter ten minste 20 mm, wat groot genoeg is om tijd te geven om de werkzaamheid van een interventie in een diabetisch wondonderzoek te beoordelen. De wondlocatie moet de scapula en de wervelkolom vermijden, omdat continue beweging op deze twee plaatsen de wondgenezing kan verstoren.
Kortom, de constructie van het T1DM-wondmodel met behulp van de methode van dit protocol is effectief. Het protocol repliceert enkele van de kenmerken van chronische diabetische wonden, zoals langzamere wondgenezing, vertraagde re-epithelisatie en verminderde angiogenese in vergelijking met normale rattenwonden. Het is echter onbekend of het model andere chronische fenotypen van diabetische wonden kan repliceren. Bovendien beschrijft dit protocol de meest fundamentele en meest gebruikte methode, die geen rekening houdt met het probleem van huidcontractie bij ratten. Toekomstig onderzoek kan het gebruik van wondspalken in dit protocol opnemen of aanvullende modellen van chronische diabetische wonden verkennen, wat in de toekomst een belangrijke uitdaging voor onderzoekers zal zijn.
Disclosures
Alle auteurs verklaren dat dit manuscript geen belangenconflicten kent.
Acknowledgments
Deze studie werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82104877).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade mounting medium | Southern Biotechnology Associates, Inc. | 0100-01 | |
| AutoFluo Quencher | Servicebio Technology co., Ltd. | G1221 | |
| Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific Inc. | Varistain™ Gemini ES | |
| CD31 | Servicebio Technology co., Ltd. | GB11063-2 | |
| Citrate antigen retrieval solution | Servicebio Technology co., Ltd. | G1201 | |
| Cover glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 10212432C | |
| DAPI | Servicebio Technology co., Ltd. | G1012 | |
| Decolorization shaker | Scilogex | S1010E | |
| Depilatory cream | Guangzhou Ruixin Biotechnology Co., Ltd. | — | |
| Dimethyl benzene | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 64-17-5 | |
| Drug oscillator | Shenzhen Jiashi Technology Co., Ltd. | VM-370 | |
| Electric razor | Shanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd. | FC5908 | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | JB-P5 | |
| Ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 1330-20-7 | |
| Fitc-labeled goat anti-rabbit IgG | Servicebio Technology co., Ltd. | GB22303 | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific Inc. | 16210064 | |
| Hematoxylin and eosin staining solution | Beijing Regan Biotechnology Co., Ltd. | DH0020 | |
| Image J software | National Institutes of Health | — | |
| Microwave oven | Midea Group Co., Ltd. | M1-L213B | |
| Mini centrifuge | Scilogex | D1008 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Portable blood glucose meter | Sinocare Inc. | GA-3 | |
| Rapid tissue processor | Thermo Fisher Scientific Inc. | STP420 ES | |
| Rat fixator | Globalebio (Beijing) Technology co., Ltd | GEGD-Q10G1 | |
| Slicing machine | Thermo Fisher Scientific Inc. | HM325 | |
| Slides glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 80312-3181 | |
| sodium citrate buffer | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | c1013 | |
| Streptozotocin | Sigma | 57654595 |
References
- Zimmet, P., Alberti, K. G., Shaw, J. Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature. 414 (6865), 782-787 (2001).
- Grennan, D.
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 265sr6 (2014).
- Patel, S., Srivastava, S., Singh, M. R., Singh, D. Mechanistic insight into diabetic wounds: Pathogenesis, molecular targets and treatment strategies to pace wound healing. Biomedicine & Pharmacotherapy. 112, 108615 (2019).
- Deeds, M. C., et al. Single dose streptozotocin-induced diabetes: Considerations for study design in islet transplantation models. Laboratory Animals. 45 (3), 131-140 (2011).
- Chao, P. C., et al. Investigation of insulin resistance in the popularly used four rat models of type-2 diabetes. Biomedicine & Pharmacotherapy. 101, 155-161 (2018).
- Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols. 1 (4), e78 (2021).
- Wu, J., Yan, L. J. Streptozotocin-induced type 1 diabetes in rodents as a model for studying mitochondrial mechanisms of diabetic β cell glucotoxicity. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 8, 181-188 (2015).
- Yang, J., Chen, Z., Pan, D., Li, H., Shen, J. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-derived exosomes combined pluronic F127 hydrogel promote chronic diabetic wound healing and complete skin regeneration. International Journal of Nanomedicine. 15, 5911-5926 (2020).
- Zhu, Y., Wang, Y., Jia, Y., Xu, J., Chai, Y. Roxadustat promotes angiogenesis through HIF-1α/VEGF/VEGFR2 signaling and accelerates cutaneous wound healing in diabetic rats. Wound Repair and Regeneration. 27 (4), 324-334 (2019).
- Shao, Z., et al. Wound microenvironment self-adaptive hydrogel with efficient angiogenesis for promoting diabetic wound healing. Bioactive Materials. 20, 561-573 (2022).
- Asfour, H. Z., et al. Enhanced healing efficacy of an optimized gabapentin-melittin nanoconjugate gel-loaded formulation in excised wounds of diabetic rats. Drug Delivery. 29 (1), 1892-1902 (2022).
- Wei, L., et al. Mesenchymal stem cells promote wound healing and effects on expression of matrix metalloproteinases-8 and 9 in the wound tissue of diabetic rats. Stem Cells and Development. 32 (1-2), 25-31 (2022).
- Pastar, I., et al. Preclinical models for wound-healing studies. In Skin Tissue Models., edited by. , Academic Press. Cambridge, MA. 223-253 (2018).
- Yang, R. H., et al. Epidermal stem cells (ESCs) accelerate diabetic wound healing via the Notch signalling pathway. Bioscience Reports. 36 (4), e00364 (2016).
- Suliman Maashi, M., Felemban, S. G., Almasmoum, H. A., Jarahian, M. Nicaraven-loaded electrospun wound dressings promote diabetic wound healing via proangiogenic and immunomodulatory functions: A preclinical investigation. Drug Delivery and Translational Research. 13 (1), 222-236 (2023).
- Hao, M., Ding, C., Sun, S., Peng, X., Liu, W. Chitosan/sodium alginate/velvet antler blood peptides hydrogel promotes diabetic wound healing via regulating angiogenesis, inflammatory response and skin flora. Journal of Inflammation Research. 15, 4921-4938 (2022).
- Kolluru, G. K., Bir, S. C., Kevil, C. G. Endothelial dysfunction and diabetes: Effects on angiogenesis, vascular remodeling, and wound healing. International Journal of Vascular Medicine. 2012, 918267 (2012).
- Okonkwo, U. A., DiPietro, L. A.
- Yi, C., et al. Targeted inhibition of endothelial calpain delays wound healing by reducing inflammation and angiogenesis. Cell Death & Disease. 11 (7), 533 (2020).
- Goodson 3rd, W. H., Hung, T. K. Studies of wound healing in experimental diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 22 (3), 221-227 (1977).
- Luippold, G., Klein, T., Mark, M., Empagliflozin Grempler, R. a novel potent and selective SGLT-2 inhibitor, improves glycaemic control alone and in combination with insulin in streptozotocin-induced diabetic rats, a model of type 1 diabetes mellitus. Diabetes, Obesity & Metabolism. 14 (7), 601-607 (2012).
- Sayed, N., et al. Effect of dapagliflozin alone and in combination with insulin in a rat model of type 1 diabetes. The Journal of Veterinary Medical Science. 82 (4), 467-474 (2020).
- Han, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells implantation accelerates cutaneous wound healing in diabetic rats via the Wnt signaling pathway. European Journal of Medical Research. 24 (1), 10 (2019).
- Ansell, D. M., Marsh, C., Walker, L., Hardman, M. J., Holden, K. Evaluating STZ-induced impaired wound healing in rats. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 994-997 (2018).
- Liu, Y., et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells not only ameliorate blood glucose but also protect vascular endothelium from diabetic damage through a paracrine mechanism mediated by MAPK/ERK signaling. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 258 (2022).
- Zindle, J. K., Wolinsky, E., Bogie, K. M. A review of animal models from 2015 to 2020 for preclinical chronic wounds relevant to human health. Journal of Tissue Viability. 30 (3), 291-300 (2021).
