Summary
Den streptozotocininduserte diabetiske sårmodellen hos mannlige SD-rotter er for tiden den mest brukte modellen for å studere sårheling i type I diabetes mellitus. Denne protokollen beskriver metodene som brukes til å konstruere denne modellen. Den presenterer og adresserer også potensielle utfordringer og undersøker progresjon og angiogene egenskaper av diabetiske sår.
Abstract
En enkelt høy dose streptozotocininjeksjon etterfulgt av fulltykkelse hudeksisjon på dorsum av rotter er en vanlig metode for å konstruere dyremodeller av type 1 diabetiske sår. Feil manipulering kan imidlertid føre til modellustabilitet og høy dødelighet hos rotter. Dessverre er det få eksisterende retningslinjer for type 1 diabetisk sårmodellering, og de mangler detaljer og presenterer ikke spesifikke referansestrategier. Derfor beskriver denne protokollen den komplette prosedyren for å konstruere en type 1 diabetisk sårmodell og analyserer progresjonen og angiogene egenskaper til diabetiske sår. Type 1 diabetisk sårmodellering innebærer følgende trinn: fremstilling av streptozotocininjeksjon, induksjon av type 1 diabetes mellitus og konstruksjon av sårmodellen. Sårområdet ble målt dag 7 og dag 14 etter sår, og rottenes hudvev ble ekstrahert for histopatologisk og immunfluorescensanalyse. Resultatene viste at type 1 diabetes mellitus indusert av 55 mg / kg streptozotocin var assosiert med lavere dødelighet og høy suksessrate. Blodglukosenivået var relativt stabilt etter 5 ukers induksjon. Frekvensen av tilheling av diabetiske sår var signifikant lavere enn for normale sår på dag 7 og dag 14 (p < 0,05), men begge kunne nå mer enn 90 % på dag 14. Sammenliknet med normalgruppen var epidermal laglukning av diabetiske sår dag 14 ufullstendig og hadde forsinket reepitelialisering og signifikant lavere angiogenese (p < 0,01). Type 1 diabetisk sårmodell konstruert basert på denne protokollen har egenskapene til kronisk sårheling, inkludert dårlig lukking, forsinket reepitelisering og redusert angiogenese sammenlignet med normale rottesår.
Introduction
Type 1 diabetes mellitus (T1DM) er en kronisk metabolsk sykdom preget av hyperglykemi og ødeleggelse av bukspyttkjertelen β-celler1. Et T1DM-sår er et kronisk ikke-helbredende sår og den vanligste og ødeleggende komplikasjonen av diabetes hos mennesker 2,3. Dyremodeller er de mest hensiktsmessige prototypene for å studere de patologiske endringene under sårheling og sikkerheten og effekten av potensielle terapeutiske midler4. Sammenlignet med andre typer er mannlige Sprague-Dawley (SD) rotter mer følsomme for streptozotocin (STZ) og viser en lavere relatert dødelighet, noe som gjør dem populære i diabetisk sårforskning 5,6.
Tallrike metoder for å konstruere T1DM sårmodeller har blitt beskrevet. Når det gjelder T1DM-modellen, har studier primært fokusert på effekten av STZ-injeksjonsmetoden på suksessraten for diabetesinduksjon 7,8. Modelleringsprosessen lider imidlertid av den inkonsekvente driften av det samme trinnet. I en studie fastet rotter i 18 timer før STZ-injeksjonen; rotter med blodsukkernivå høyere enn 16,67 mmol / l 1 uke etter STZ-injeksjonen ble ansett som diabetiker, og diabetisk sår ble introdusert etter 3 uker9. Omvendt, i en relatert studie, fastet Zhu et al. rotter i 12 timer før STZ-injeksjonen; rotter med høyere blodsukkernivå enn 16,7 mmol/l 72 timer etter injeksjonen ble ansett som diabetikere, og diabetikersåret ble introdusert etter 4 uker10. Samlet sett er det inkonsekvenser i STZ injeksjonsprotokoller, diabetesdiagnosekriterier og sårintroduksjonstider.
Når det gjelder sårmodellering, blir den fulle tykkelsen på rygghuden i de fleste studier skåret ut for å konstruere T1DM-sår etter vellykket diabetesinduksjon11,12,13. Selv om denne modellen er utsatt for hudkontraktur hos rotter, er den den mest brukte modellen i sårhelingsforskning fordi den er mindre arbeidsintensiv og er billig14,15. Likevel mangler metodestyrt forskning på denne eksisjonsteknikken i full tykkelse. Videre er det ingen enhetlige standarder i eksisterende studier angående sårstørrelse og lokalisasjon12,16. Sårets størrelse og plassering kan indirekte påvirke konsistensen av det eksperimentelle designet og den vitenskapelige gyldigheten av resultatene. Derfor er det et presserende behov for en standardprotokoll for T1DM-induksjon og sårmodellering som referanse for forskere. Målet med denne studien er å visualisere en spesifikk protokoll for T1DM sårmodellering som kan brukes som referanse for T1DM sårstudier.
Protocol
Protokollen ble gjennomført etter Helsinkideklarasjonen, og alle dyreforsøk ble godkjent av styringskomiteen fra Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Record No. 2021-13).
1. Fremstilling av streptozotocininjeksjonen
- Velg 15 SD-hannspesifikke patogenfrie rotter (SPF) i alderen 8 uker og veier 220 g ± 20 g. Ved hjelp av den enkle randomiseringsmetoden deler du rottene inn i en diabetesgruppe (n = 10) og en normalgruppe (n = 5).
- Mål startvekten til rottene, og bestem doseringen av STZ gjennom administrering av 55 mg / kg.
MERK: Basert på pre-eksperimenter, er 55 mg / kg den optimale STZ-dosen. - Vei STZ-pulveret nøyaktig, og legg det i en lystett beholder.
- Tilsett en passende mengde natriumsitratbuffer på 0,1 mol/l (pH 4,5) for å oppløse STZ til en konsentrasjon på 1 %.
MERK: Natriumsitratbufferen må være forkjølt i 2 timer i et kjøleskap på 4 °C før bruk. Fremstillingen av STZ-løsningen må sikre sterilitet. - Rist i 30 s ved hjelp av en stoffoscillator. Legg i en isboks, og sett til side.
MERK: Injeksjonen skal brukes innen 15 minutter.
2. Induksjon av T1DM-modellen
- Før STZ-injeksjonen, rask rottene i 18 timer, og gi fri tilgang til vann.
- Utfør en intraperitoneal injeksjon av 1% STZ-løsning.
- Ta tak i rotten, og blottlegg bukhuden og injeksjonsstedet (skjæringspunktet mellom linjen som forbinder røttene til de to lårene og midtlinjen i magen).
- Desinfiser injeksjonsstedet to ganger med en bomullsdott dynket i 75 % alkohol (én gang med klokken og én gang mot klokken). Plasser rottens hode under magen.
- Stikk nålen parallelt med midtlinjen i abdomen i en vinkel på 45°, og etter gjennomboring av huden, reduser nålvinkelen til 30°, og stikk deretter nålen 2-3 mm. Trekk forsiktig i kanylepluggen, og pass på at det ikke suges blod eller væske inn i sprøyten. Injiser STZ-oppløsningen, trekk ut nålen og stopp blødningen med en bomullspinne.
MERK: Hvis en gul væske trekkes tilbake i sprøyten, kan nålen ha trengt inn i blæren, og hvis en mørkegrønn væske trekkes, kan nålen ha trengt inn i tykktarmen eller caecum. I begge tilfeller skal kanylen fjernes umiddelbart. Dyret skal vurderes av veterinærpersonell.
- Mål de uformelle (ikke-fastende eller fastende) blodsukkernivåene klokken 09:00 på dag 3 og dag 7 etter STZ-induksjon.
MERK: Tiden for tilfeldig blodsukkermåling er fast. I denne protokollen er den fastsatt kl. 09.00. Det er imidlertid ikke den eneste tiden som brukes. Blod samlet fra kaudalvenen ved en nålpunktering er mindre utsatt for vævsvæske enn blod tatt fra en avskåret hale, slik at blodsukkerverdiene er mer nøyaktige.- Immobiliser rotta ved hjelp av en rottefiksering (figur 1).
- Finn plasseringen av kaudalvenen. Desinfiser rottens hale to ganger ved hjelp av en bomullsboll dynket i 75% alkohol.
- Punkter den kaudale venen for å indusere blødning, og måle blodsukkeret ved hjelp av et glukometer. Stopp blødningen med en bomullspinne.
MERK: Et glukosenivå høyere enn 16,7 mmol / l på dag 7 etter STZ-injeksjonen betraktes som T1DM.
- Vei rottene ukentlig, og måle blodsukkernivået og andre parametere, inkludert diett, vanninntak og urinutgang.
- Fôr dyrene normalt i 8 uker etter STZ-induksjon.
3. Konstruksjon av sårmodellen
- Barber rottene med en elektrisk barberhøvel 1 dag før sårmodellering. Et barbert område på 5 cm x 5 cm på dorsumsiden av rotta er generelt ideelt.
- Tørk det barberte området med en varm vanlig saltvann bomullsdott, la den tørke, og påfør deretter hårfjerningskrem i 5 minutter. Rengjør området med gasbind, og vask eventuell rester av hårfjerningskrem med varmt, normalt saltvann.
- Vei rottene, og beregn nødvendig dose Nembutal basert på 35 mg/kg standarden. Oppløs Nembutal ved bruk av vanlig saltoppløsning til en konsentrasjon på 3%. Andre generelle anestetika som ketamin / xylazin eller isofluran kan brukes for denne prosedyren. Vennligst arbeid med institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteer for å sikre hva som er best.
MERK: For å sikre effekt bør oppløsningen tilberedes, og Nembutal pulver og oppløsning skal beskyttes mot lys. - Fast rottene i 12 timer før bedøvelse. Injiser anestesien intraperitonealt. Bruk tetracyklin øyesalve eller et generelt øye smøremiddel for å forhindre tørre øyne etter anestesiadministrasjonen.
MERK: Anestesi ble ansett som moderat når rottens muskler var relativt avslappet, øyebevegelsene forsvant, pusten var regelmessig og responsen på smertefulle stimuli var liten. - Desinfiser rygghuden to ganger ved hjelp av bomullsdotter dynket i jod (en gang med klokken og en gang mot klokken) og 75% alkohol (alternative runder).
- Etter tørking, kutt huden med en 20 mm diameter sirkulær biopsistans.
- Telt huden med steril tang, og bruk deretter steril kirurgisk saks for å fjerne huden i full tykkelse langs stansekuttmerkene. Stopp blødningen med en vanlig saltvann bomullsdott.
MERK: Sårets øvre kant bør være 5-10 mm under nedre skapularkant og 5-10 mm til høyre/venstre for rotteryggen (figur 2). Sårene er symmetriske langs ryggraden når to sår er konstruert. - Bruk vaselingasbind til å dekke sårene, og pakk dem inn med et gasbind og pustende bandasje holdt på plass med gummitape. Injiser karprofen subkutant (5 mg/kg) én gang daglig for å lindre postoperativ smerte. Bytt sårbandasje en gang om dagen (bruk av karprofen for smertelindring).
MERK: Observer rottens bevegelse og respirasjon for eventuelle abnormiteter etter at bandasjen er fullført, og sørg for at den pustende bandasjen er tilstrekkelig stram. - Plasser en linjal under såret, og fotografer såret med et digitalkamera til dag 14. Avlive rottene på dag 14 i henhold til institusjonens retningslinjer for dyrepleie og bruk. Klipp sårhudsvevet 5 mm fra sårkanten. Del vevsprøven i to deler, vask dem med PBS for å fjerne synlige blodflekker, og fest dem deretter med 4% paraformaldehydoppløsning.
4. Beregning av sårområdet med ImageJ programvare
- Klikk på Fil-knappen etter at du har åpnet programvaren, og slipp deretter ned og klikk på Åpne for å åpne sårbildene.
- Velg det rette verktøyet, og tegn en rett linje på 1 cm langs linjalen på sårbildene.
- Klikk på kommandoen Angi skala i Analyser-menyen , og sett den kjente avstanden til 1.
- Velg frihåndsmarkeringsverktøyet , og skisser omrisset av såret på bildet.
- Klikk på Mål-kommandoen i Analyser-menyen , og les Areal-verdien etter at resultatet dukker opp.
5. Hematoksylin og eosin (H &E) farging
- Fjern hudvevet fra fikseringsmiddelet, kutt det i tynne seksjoner med en skalpell i en avtrekkshette, og legg det i en dehydreringskassett.
- Sett dehydreringskassetten i en dehydreringsmaskin, og dehydrer vevet i følgende trinn: 75% alkohol i 4 timer; 85% alkohol i 2 timer; 90% alkohol i 2 timer; 95% alkohol i 1 time; vannfri etanol I og II i 30 minutter hver; alkoholbenzen i 5-10 min; xylen I og II i 5-10 minutter hver; og voks I, II og III i 1 time hver.
- Legg vevet i voks. Avkjøl ved -20° på et frysebord, og korriger voksblokken pent.
- Klipp voksblokkene i lengderetningen ved hjelp av en parafinsnittmaskin i 3 μm tykke seksjoner.
- Bløtlegg seksjonen sekvensielt i xylen I og II i 20 minutter hver, vannfri etanol I og II i 5 minutter hver, og vann fra springen i 5 minutter.
- Oversvømme vevet med hematoksylinflekk i 3-5 minutter, 0,5% vandig saltsyreoppløsningsdifferensiering, 0,5% vandig ammoniakkoppløsning tilbake til blått og skyll med vann.
- Dehydrer vevsseksjonene med 85% og 95% alkohol. Oversvømme vevet med eosinfargeløsning i 5 minutter.
MERK: Normalt tar eosinfarging 30 s til 2 min, og tiden kan justeres i henhold til fargeresultater og krav. - Dehydrer seksjonene sekvensielt med følgende løsninger: vannfri etanol I, vannfri etanol II, vannfri etanol III, xylen I og xylen II, hver i 5 minutter. Til slutt dekker du glasslysbildene med nøytral balsam.
- Undersøk H&E-farget vev under mikroskopet ved 40x, 20x og 10x, og ta bilder for å beholde representative bilder av hvert lysbilde.
6. CD31 immunfluorescensfarging
- Bløtlegg vevsseksjonene i xylen I og II i 15 minutter hver, vannfri etanol I og II i 5 minutter hver, 85 % alkohol i 5 minutter og 75 % alkohol i 5 minutter, og skyll med destillert vann.
- Antigen reparasjon
- Tilsett en passende 10 mM sitronsyrebuffer på pH 6,0 i en mikrobølgeovnbeholder, varm den til koking på høy, og legg deretter glassgliden inn i den.
- Kok i 8 min på middels varme, stopp i 8 min, og kok deretter igjen på middels lav varme i 7 minutter.
- La lysbildene avkjøles, plasser dem i PBS (pH 7,4), og vask dem tre ganger i 5 minutter hver med en avfargingsrister.
- Tilsett 5% geiteserum dråpevis i sirkelen, og rug i 30 min.
- Rist forsiktig av lukningsløsningen (5% geiteserum), og tilsett kaninanti-CD31-antistoff (fortynnet med PBS i forholdet 1:200) dråpevis på seksjonene. Legg seksjonene i en våt boks, og rug over natten ved 4 °C.
- Vask lysbildene tre ganger med PBS (pH 7,4) på en avfargingsrister i 5 minutter hver. Rist seksjonene lett for å tørke dem, og dekk dem deretter med en sirkulær dråpe FITC-merket geitantikanin IgG. Inkuber ved romtemperatur i 50 minutter i mørket.
- Vask lysbildene tre ganger med PBS (pH 7,4) på en avfargingsrister i 5 minutter hver. Lufttørk seksjonene med lett risting, og tilsett DAPI-fargeløsning. Inkuber seksjonene i mørket i 10 min ved romtemperatur.
- Etter tørking av seksjonene, tegn sirkler rundt vevet med PepPen (for å forhindre tap av antistoffer), tilsett et autofluorescensslukkemiddel (0,3% Sudan Black B) i sirklene i 5 minutter, og skyll dem deretter under rennende vann i 10 minutter.
- Vask lysbildene tre ganger med PBS (pH 7,4) på en avfargingsrister i 5 minutter hver. Rist seksjonene litt, og forsegl dem med et antifademonteringsmedium.
- Observer og fotografer seksjonene under et fluorescensmikroskop ved 40x, 20x og 10x.
MERK: DAPI UV-eksitasjonsbølgelengden er 330-380 nm, og emisjonsbølgelengden er 420 nm (blått lys). FITC-eksitasjonsbølgelengden er 465-495 nm, og utslippsbølgelengden er 515-555 nm (grønt lys).
7. Statistisk analyse
- Samle inn og analyser dataene ved hjelp av SPSS.
- Rapporter dataene som gjennomsnitt ± standardavvik.
- Bruk en t-test for uavhengige prøver for å analysere forskjellene mellom diabetes- og normalgruppen.
- Sett den statistiske signifikansen til **p < 0,01 og *p < 0,05.
Representative Results
Totalt 10 SD-rotter fikk en enkelt STZ intraperitoneal injeksjon for å indusere T1DM-modellen. En rotte døde for tidlig (10%), men diabetes ble indusert hos alle rotter (100%). Etter 3 dager med injeksjon med STZ var blodglukosenivået hos alle rottene høyere enn 16,7 mmol/l, og blodglukosenivået stabiliserte seg 5 uker etter induksjon (figur 3A). Vekten av diabetesgruppen økte gradvis etter STZ-injeksjonen, men sank i uke 3 og økte deretter sakte igjen fra uke 4 (figur 3B). Derimot økte vekten av rotter i normalgruppen jevnt, og gjennomsnittsvekten 3 dager etter diabetesinduksjon var høyere enn i diabetesgruppen (figur 3B). Diabetiske rotter viste alle typiske symptomer på tørste, polyuri og vekttap, lik funnene til Hao et al.17.
Dag 7 og dag 14 etter såret viste makroskopisk analyse at reepitelialisering var mer uttalt hos rotter i normalgruppen enn i diabetesgruppen (figur 4A). De kvantitative resultatene viste at sårtilhelingsraten var signifikant lavere i diabetesgruppen enn i normalgruppen dag 7 og dag 14 (p < 0,01). På dag 14 kunne imidlertid sårtilhelingsraten også være over 90 % i diabetesgruppen (p < 0,05, figur 4B). Dette antyder at T1DM sårmodell er preget av dårlig lukking, men ikke i omfanget av kronisk ikke-helbredelse sett i humane diabetiske sår.
H&E-farging dag 14 av sårtilheling viste ufullstendig sårepidermis, langsom proliferasjon av keratinocytter og forsinket reepitelialisering i diabetesgruppen sammenlignet med normalgruppen. Diabetessårene viste delvis tap av hårsekkene og talgkjertlene. Det var også færre synlige kapillærer (figur 5).
Diabetes forårsaker endotelcelledysfunksjon, glykosylering av de ekstracellulære matriksproteinene og vaskulær denervering18. Disse komplikasjonene gir lavere sårangiogenese enn normalt i diabetessår18. Angiogenese er nødvendig for sårtilheling, og sårangiogenese analyseres ofte ved CD31-immunfarging (figur 6A)19,20. Basert på gjennomsnittlig optisk tetthet (AOD) av CD31-ekspresjon var angiogenesen på sårstedet signifikant høyere i normalgruppen enn i diabetesgruppen (p < 0,01, figur 6B).
Figur 1: Bilde av rotter immobilisert av fikseringsmidler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Diagram over plasseringen av rottesåret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Blodsukkernivå og vekt hos forsøksrottene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Hudsår i full tykkelse (20 mm i diameter) på ryggen av forsøksrottene. (A) Sårets makroskopiske utseende på dag 0, dag 7 og dag 14. Sårmorfologibildene dag 0, dag 7 og dag 14 ble tatt med digitalkamera. (B) Sårområdet ble målt ved hjelp av ImageJ-programvare og ble brukt til å beregne sårhelingshastigheten. Sårtilhelingsraten (%) ble beregnet som følger: (initial sårområde − sårområde ved angitt tidspunkt)/initielt sårområde × 100. Verdiene er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 14). Statistisk signifikans ble satt til ** p < 0,01 og * p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Representative histopatologiske H&E-bilder dag 14 etter såretablering. De blå pilene indikerer kapillærene. De røde pilene viser spredning av keratinocytter. Venstre skala: en bar = 200 μm; Høyre skala: en stolpe = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Analyse av immunfluorescensfarging for ekspresjon av CD31. CD31-nivåer ble brukt til å bestemme tilstanden for angiogenese. (A) Representative bilder av CD31 immunfluorescensfarging i diabetiker og normale grupper. Den integrerte verdien for optisk tetthet (IOD) og pikselområdet (AREA) for hver skallprøve ble beregnet med Image-Pro Plus 6.0-programvaren. Den gjennomsnittlige verdien for optisk tetthet (AOD) (AOD = IOD/AREA) ble også avledet. AOD-verdien var direkte proporsjonal med det positive uttrykket for CD31. (B) Kvantitativ sammenligning av CD31-positivt uttrykk i diabetes- og normalgruppene. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. ** p < 0,01. Skala: en bar = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne protokollen klargjør de omstridte operasjonene i T1DM sårmodellering. Bekymringer om STZ injeksjonsprotokoller, T1DM induksjon suksesskriterier, blodsukkerstabiliseringstid og sårplassering og størrelse har blitt adressert i dette arbeidet. Videre er patologiske egenskaper og målbare parametere for T1DM sårhelingsvurdering avklart.
Rottene fastet i 18 timer før STZ-injeksjonen for å unngå konkurransebinding av glukose eller dets analoger til β-celler, noe som kan påvirke effekten av STZ. Den mest brukte metoden for å indusere T1DM er en enkelt høy dose STZ, noe som øker blodsukkeret ved å skade øyene og redusere insulinutskillelsen21. Pre-eksperimentelle studier viste at den optimale STZ-dosen for høy suksessrate og lav dødelighet var 55 mg / kg, noe som er lavere enn de optimale dosene rapportert i tidligere studier22,23,24. I denne protokollen ble T1DM indusert ved bruk av en enkelt intraperitoneal injeksjon med 55 mg/kg STZ.
Blodsukkernivået var alle høyere enn 16,7 mmol / l 3 dager etter STZ-injeksjonen. Imidlertid er et blodsukkernivå høyere enn 16,7 mmol / l på dag 7 etter STZ-injeksjon det anbefalte kriteriet for vellykket T1DM-modellering, fordi omfanget av øyskader varierer blant rotter, og en passende forlengelse av diagnostisk tid kan redusere den falske negative frekvensen. I tillegg stabiliserte blodsukkerfluktuasjonene seg 5 uker etter STZ-injeksjonen, og rottene gikk gradvis opp i vekt i løpet av denne perioden, i samsvar med tidligere funn25,26. Dette indikerer at blodsukkernivået i T1DM-modellen bør stabiliseres i minst 6 uker, og en økning i rottevekt etter 6 uker reduserer dødeligheten under sårmodelleringen. Derfor gjennomførte denne protokollen sårmodellering 8 uker etter STZ-injeksjonen.
Sårlukkingsraten dag 7 og dag 14 etter såret var signifikant lavere hos diabetiker enn i den normale sårgruppen, noe som indikerer langsom tilheling. Videre var sårepitelialisering og angiogenese signifikant lavere hos diabetiker enn i normalgruppen. Dette viser at sårmodellen T1DM viser langsommere sårtilheling og forsinket reepitelisering enn hos normale rotter, noe som kan være relatert til de patologiske endringene ved redusert sårangiogenese. På dag 14 var imidlertid T1DM-sårhelingsraten også over 90 %, noe som er forskjellig fra den kroniske ikke-helbredende karakteristikken for humane diabetiske sår. Dette kan skyldes at gnagernes fysiologiske mekanismer for sårheling skiller seg fra menneskers27. Følgelig er den beste sårdiameteren minst 20 mm, noe som er stort nok til å gi tid til å vurdere en intervensjons effekt i en diabetisk sårstudie. Sårplasseringen bør unngå scapula og ryggrad, da kontinuerlig bevegelse på disse to stedene kan forstyrre sårheling.
Avslutningsvis er konstruksjonen av T1DM-sårmodellen ved hjelp av metoden til denne protokollen effektiv. Protokollen replikerer noen av egenskapene til kroniske diabetiske sår, for eksempel langsommere sårheling, forsinket reepitelisering og redusert angiogenese sammenlignet med normale rottesår. Det er imidlertid ukjent om modellen kan replikere andre kroniske fenotyper av diabetiske sår. Videre beskriver denne protokollen den mest grunnleggende og mest brukte metoden, som ikke tar hensyn til problemet med hudkontraksjon hos rotter. Fremtidig forskning kan inkludere bruk av sårskinner i denne protokollen eller utforske flere modeller av kroniske diabetessår, noe som vil være en betydelig utfordring for forskere i fremtiden.
Disclosures
Alle forfatterne erklærer at dette manuskriptet ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet økonomisk av National Natural Science Foundation of China (82104877).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade mounting medium | Southern Biotechnology Associates, Inc. | 0100-01 | |
| AutoFluo Quencher | Servicebio Technology co., Ltd. | G1221 | |
| Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific Inc. | Varistain™ Gemini ES | |
| CD31 | Servicebio Technology co., Ltd. | GB11063-2 | |
| Citrate antigen retrieval solution | Servicebio Technology co., Ltd. | G1201 | |
| Cover glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 10212432C | |
| DAPI | Servicebio Technology co., Ltd. | G1012 | |
| Decolorization shaker | Scilogex | S1010E | |
| Depilatory cream | Guangzhou Ruixin Biotechnology Co., Ltd. | — | |
| Dimethyl benzene | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 64-17-5 | |
| Drug oscillator | Shenzhen Jiashi Technology Co., Ltd. | VM-370 | |
| Electric razor | Shanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd. | FC5908 | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | JB-P5 | |
| Ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 1330-20-7 | |
| Fitc-labeled goat anti-rabbit IgG | Servicebio Technology co., Ltd. | GB22303 | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific Inc. | 16210064 | |
| Hematoxylin and eosin staining solution | Beijing Regan Biotechnology Co., Ltd. | DH0020 | |
| Image J software | National Institutes of Health | — | |
| Microwave oven | Midea Group Co., Ltd. | M1-L213B | |
| Mini centrifuge | Scilogex | D1008 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Portable blood glucose meter | Sinocare Inc. | GA-3 | |
| Rapid tissue processor | Thermo Fisher Scientific Inc. | STP420 ES | |
| Rat fixator | Globalebio (Beijing) Technology co., Ltd | GEGD-Q10G1 | |
| Slicing machine | Thermo Fisher Scientific Inc. | HM325 | |
| Slides glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 80312-3181 | |
| sodium citrate buffer | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | c1013 | |
| Streptozotocin | Sigma | 57654595 |
References
- Zimmet, P., Alberti, K. G., Shaw, J. Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature. 414 (6865), 782-787 (2001).
- Grennan, D.
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 265sr6 (2014).
- Patel, S., Srivastava, S., Singh, M. R., Singh, D. Mechanistic insight into diabetic wounds: Pathogenesis, molecular targets and treatment strategies to pace wound healing. Biomedicine & Pharmacotherapy. 112, 108615 (2019).
- Deeds, M. C., et al. Single dose streptozotocin-induced diabetes: Considerations for study design in islet transplantation models. Laboratory Animals. 45 (3), 131-140 (2011).
- Chao, P. C., et al. Investigation of insulin resistance in the popularly used four rat models of type-2 diabetes. Biomedicine & Pharmacotherapy. 101, 155-161 (2018).
- Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols. 1 (4), e78 (2021).
- Wu, J., Yan, L. J. Streptozotocin-induced type 1 diabetes in rodents as a model for studying mitochondrial mechanisms of diabetic β cell glucotoxicity. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 8, 181-188 (2015).
- Yang, J., Chen, Z., Pan, D., Li, H., Shen, J. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-derived exosomes combined pluronic F127 hydrogel promote chronic diabetic wound healing and complete skin regeneration. International Journal of Nanomedicine. 15, 5911-5926 (2020).
- Zhu, Y., Wang, Y., Jia, Y., Xu, J., Chai, Y. Roxadustat promotes angiogenesis through HIF-1α/VEGF/VEGFR2 signaling and accelerates cutaneous wound healing in diabetic rats. Wound Repair and Regeneration. 27 (4), 324-334 (2019).
- Shao, Z., et al. Wound microenvironment self-adaptive hydrogel with efficient angiogenesis for promoting diabetic wound healing. Bioactive Materials. 20, 561-573 (2022).
- Asfour, H. Z., et al. Enhanced healing efficacy of an optimized gabapentin-melittin nanoconjugate gel-loaded formulation in excised wounds of diabetic rats. Drug Delivery. 29 (1), 1892-1902 (2022).
- Wei, L., et al. Mesenchymal stem cells promote wound healing and effects on expression of matrix metalloproteinases-8 and 9 in the wound tissue of diabetic rats. Stem Cells and Development. 32 (1-2), 25-31 (2022).
- Pastar, I., et al. Preclinical models for wound-healing studies. In Skin Tissue Models., edited by. , Academic Press. Cambridge, MA. 223-253 (2018).
- Yang, R. H., et al. Epidermal stem cells (ESCs) accelerate diabetic wound healing via the Notch signalling pathway. Bioscience Reports. 36 (4), e00364 (2016).
- Suliman Maashi, M., Felemban, S. G., Almasmoum, H. A., Jarahian, M. Nicaraven-loaded electrospun wound dressings promote diabetic wound healing via proangiogenic and immunomodulatory functions: A preclinical investigation. Drug Delivery and Translational Research. 13 (1), 222-236 (2023).
- Hao, M., Ding, C., Sun, S., Peng, X., Liu, W. Chitosan/sodium alginate/velvet antler blood peptides hydrogel promotes diabetic wound healing via regulating angiogenesis, inflammatory response and skin flora. Journal of Inflammation Research. 15, 4921-4938 (2022).
- Kolluru, G. K., Bir, S. C., Kevil, C. G. Endothelial dysfunction and diabetes: Effects on angiogenesis, vascular remodeling, and wound healing. International Journal of Vascular Medicine. 2012, 918267 (2012).
- Okonkwo, U. A., DiPietro, L. A.
- Yi, C., et al. Targeted inhibition of endothelial calpain delays wound healing by reducing inflammation and angiogenesis. Cell Death & Disease. 11 (7), 533 (2020).
- Goodson 3rd, W. H., Hung, T. K. Studies of wound healing in experimental diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 22 (3), 221-227 (1977).
- Luippold, G., Klein, T., Mark, M., Empagliflozin Grempler, R. a novel potent and selective SGLT-2 inhibitor, improves glycaemic control alone and in combination with insulin in streptozotocin-induced diabetic rats, a model of type 1 diabetes mellitus. Diabetes, Obesity & Metabolism. 14 (7), 601-607 (2012).
- Sayed, N., et al. Effect of dapagliflozin alone and in combination with insulin in a rat model of type 1 diabetes. The Journal of Veterinary Medical Science. 82 (4), 467-474 (2020).
- Han, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells implantation accelerates cutaneous wound healing in diabetic rats via the Wnt signaling pathway. European Journal of Medical Research. 24 (1), 10 (2019).
- Ansell, D. M., Marsh, C., Walker, L., Hardman, M. J., Holden, K. Evaluating STZ-induced impaired wound healing in rats. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 994-997 (2018).
- Liu, Y., et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells not only ameliorate blood glucose but also protect vascular endothelium from diabetic damage through a paracrine mechanism mediated by MAPK/ERK signaling. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 258 (2022).
- Zindle, J. K., Wolinsky, E., Bogie, K. M. A review of animal models from 2015 to 2020 for preclinical chronic wounds relevant to human health. Journal of Tissue Viability. 30 (3), 291-300 (2021).
