Summary
Här beskriver vi en immunofluorescensbaserad metod för att kvantifiera nivåerna av enkelsträngat DNA i celler. Denna effektiva och reproducerbara metod kan användas för att undersöka replikationsstress, ett vanligt inslag i flera äggstockscancerformer. Dessutom är denna analys kompatibel med en automatiserad analyspipeline, vilket ytterligare ökar dess effektivitet.
Abstract
Replikationsstress är ett kännetecken för flera äggstockscancer. Replikationsstress kan uppstå från flera källor, inklusive dubbelsträngsbrott, transkriptionsreplikationskonflikter eller förstärkta onkogener, vilket oundvikligen resulterar i generering av enkelsträngat DNA (ssDNA). Kvantifiering av ssDNA ger därför en möjlighet att bedöma nivån av replikationsstress i olika celltyper och under olika DNA-skadliga tillstånd eller behandlingar. Nya bevis tyder också på att ssDNA kan vara en prediktor för svar på kemoterapeutiska läkemedel som riktar sig mot DNA-reparation. Här beskriver vi en detaljerad immunofluorescensbaserad metod för att kvantifiera ssDNA. Denna metod innefattar märkning av genomet med en tymidinanalog, följt av antikroppsbaserad detektion av analogen vid kromatin under icke-denatureringsförhållanden. Sträckor av ssDNA kan visualiseras som foci under ett fluorescensmikroskop. Antalet och intensiteten hos foci samverkar direkt med nivån av ssDNA närvarande i kärnan. Vi beskriver också en automatiserad pipeline för att kvantifiera ssDNA-signalen. Metoden är snabb och reproducerbar. Dessutom gör enkelheten i denna metod den mottaglig för applikationer med hög genomströmning som läkemedel och genetiska skärmar.
Introduction
Genomiskt DNA utsätts ofta för flera angrepp från olika endogena och exogena källor1. Frekvensen av endogen skada korrelerar direkt med nivåerna av metaboliska biprodukter, såsom reaktiva syreradikaler eller aldehyder, som i sig är högre i flera cancertyper, inklusive äggstockscancer 2,3. Det är absolut nödvändigt att DNA-skador löses effektivt. Annars kan det främja genotoxiska lesioner och följaktligen mutagenes. Cellernas förmåga att reparera genotoxiska lesioner är beroende av funktionaliteten hos felfria DNA-reparationsvägar och effektiv reglering av cellcykelprogression som svar på DNA-skador. Noterbart är att många äggstockscancer har funktionellt inaktiverande mutationer i p53 och har därmed en defekt G1 / S-kontrollpunkt, vilket leder cellerna att initiera DNA-replikation trots närvaron av oreparerade genomiska lesioner 4,5. Graden av DNA-skador i äggstockscancer förvärras ytterligare av observationen att mer än 50% av högkvalitativt seröst äggstockscancer (HGSOC) har defekter i BRCA1- och BRCA2-medierad homolog rekombination, den felfria DNA-reparationsvägen och cirka 20% har amplifiering i genen CCNE1, som för tidigt skjuter G1-celler in i S-fas6 . Tillsammans ökar den höga frekvensen av endogena DNA-skador, defekta kontrollpunkter och felaktiga reparationsvägar exponentiellt ackumuleringen av genomiska lesioner vid äggstockscancer. Dessa lesioner kan fungera som hinder för utvecklingen av kritiska cellulära processer såsom DNA-replikation och transkription. Som diskuteras nedan katalyserar sådana hinder genereringen av enkelsträngat DNA (ssDNA) i celler.
DNA:s dubbelhelix är avgörande för att skydda genomet från flera mutagena processer, såsom spontan depurination och depyrimidination, cytosindeaminasernas aktivitet och oxidativ DNA-skada 1,7. Däremot är ssDNA mycket sårbart för dessa mutationshändelser. Flera processer i celler kan resultera i generering av ssDNA (figur 1). Dessa inkluderar följande:
i) DNA-replikationsmaskineriet avstannar: Detta leder till att DNA-helikasen och polymeraset kopplas bort, vilket lämnar sträckor av ssDNA 8,9.
ii) Stopp av transkriptionsmaskineriet: Ihållande stopp av RNA-polymeras leder till generering av tresträngade hybrid-DNA/RNA-strukturer som kallas R-loopar. R-loopbildning exponerar det förskjutna, icke-transkriberade DNA som en enda sträng10.
(iii) DNA-slutresektion: Initieringen av homologiriktad reparation kräver generering av ett 3'-ssDNA för att katalysera sökandet efter en homolog sekvens11.
(iv) D-loop: Stränginvasion under homolog rekombination kan resultera i förskjutning av den icke-mallkomplementära strängen, vilket resulterar i ssDNA12.
(v) Replikationskopplade luckor: Under DNA-replikation sker eftersläpande strängsyntes på ett diskontinuerligt sätt, varigenom Okazaki-fragment först genereras och sedan ligeras. En fördröjning eller defekt i bearbetningen av Okazaki-fragmenten kan också resultera i ssDNA-bildning. Slutligen, om replikationsgaffeln på en ledande sträng stöter på en stallande lesion, DNA-polymeras och primas, kan PRIMPOL återuppliva syntesen nedströms och lämna ett ssDNA-gap bakom13,14.
Uppenbarligen inträffar de flesta av dessa händelser antingen när DNA-replikationsmaskineriet står inför genomiska lesioner eller under replikationskopplad reparation, vilket tyder på att högre DNA-skador leder till ökade nivåer av ssDNA. Eftersom många av dessa händelser är replikationsassocierade anses bildandet av ssDNA vara markören för "replikationsstress" i cellerna15,16.
Här beskriver vi en analys som kan användas för att tillförlitligt kvantifiera ssDNA i celler. Enkelheten, reproducerbarheten och kostnadsfördelarna med detta tillvägagångssätt gör det möjligt att användas för att bedöma replikations-stressresponsen i celler. Nya studier har visat att nivån av ssDNA också kan vara en prediktor för svar på kemoterapi, såsom hämmare av PARP1/2-enzymer, ATR och Wee1-kinas 17,18,19,20,21. Dessa hämmare eftersträvas i behandlingsregimen för flera HGSOCs22. Därför kan denna analys också vara ett användbart verktyg för att förutsäga kemoterapeutiska svar i äggstockscancerceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Äggstockscancercellinjen, OVCAR3, användes i dessa steg, men detta protokoll är allmänt tillämpligt på flera andra cellinjer, inklusive de som härrör från icke-äggstockskällor. En schematisk bild av protokollet visas i figur 2.
1. Plätering av cellerna
- Gör poly-L-lysinbelagda täckglas.
- Lägg till autoklaverade täckglas med en diameter på 12 mm till ett 50 ml koniskt rör med poly-L-lysinlösning och placera på en vippa i 15 minuter.
- Aspirera lösningen i en vävnadsodlingshuva. Tvätta täckglasen genom att tillsätta sterilt vatten och placera röret som innehåller täckglasen tillbaka på vippan i 5 minuter. Upprepa detta tvättsteg tre gånger.
- Sprid de belagda täckglasen på en steril skål och aspirera eventuellt kvarvarande vatten. Låt täcket torka i vävnadsodlingshuven i 1 timme eller tills inga vattendroppar finns kvar. När den är torr, försegla skålen med parafilm och placera den vid 4 °C.
- Placera ett poly-L-lysinbelagt täckglas i varje brunn på en 24-brunnsplatta. Användningen av polylysintäckglas är avgörande för att förhindra att cellerna lossnar från täckglasen under förextraktionssteget.
- Trypsinisera OVCAR3-celler när de når 70% -80% sammanflöde.
- För att trypsinisera en 10 cm odlingsskål som är 70% -80% sammanflytande, aspirera mediet från plattan och tvätta med 5-7 ml PBS.
- Aspirera PBS, tillsätt 1 ml 0,25% trypsin och placera skålen i en 37 ° C inkubator i 8-10 minuter, eller tills cellerna lyfter från botten av plattan.
- Samla cellerna med 5-10 ml medium och lägg till ett koniskt rör.
- Räkna cellerna manuellt med en hemocytometer med hjälp av standardprocedurer.
- Gör en utspädning av 25 000 celler / ml och tillsätt 1 ml av cellerna på poly-L-lysintäckglas placerade i brunnarna på 24-brunnsplattor. För någon annan cellinje, bestäm ett tal så att cellerna är ca 70% -80% sammanflytande efter tre befolkningsfördubblingar.
- Odla cellerna i odlingsmediet under standardförhållanden.
2. Pulserande celler med IdU
- För att cellerna ska sprida sig ordentligt på täckglasen räcker det med en befolkningsfördubbling. Efter en populationsfördubbling, pulsera cellerna med 10 μM 5-jod-2'-deoxiuridin (IdU) (se Materialtabell om hur man rekonstituerar IdU) för de två efterföljande populationsfördubblingarna.
OBS: Vi har provat olika tymidinanaloger, inklusive bromodeoxyuridin (BrdU), 5-klor-2′-deoxiuridin (CIdU) och IdU. Bland de tre analogerna ger IdU det bästa signal-brusförhållandet. Jämförande bilder av celler pulserade med de tre olika analogerna visas i figur 3. Vi rekommenderar användning av två negativa kontroller: (i) ett pulserat prov utan IdU och (ii) ingen primär antikroppskontroll. Om bildningen av ssDNA behöver bedömas på grund av en given behandling rekommenderar vi att läkemedlet tillsätts efter den första omgången av IdU-fördubbling. - Efter pulserande med IdU i två populationsfördubblingar, skörda cellerna för avbildning.
- Byt ut mediet mot iskall 0,5% PBSTx (PBS + 0,5% Triton X-100) på is i 5 min. Detta förextraktionssteg hjälper till att frigöra cytoplasmatiska och icke-kromatinbundna proteiner, vilket lämnar kromatinbundna proteiner intakta. Vissa cellinjer kan lätt skalas av under förextraktion. I ett sådant scenario kan man använda 0,5% CSK-buffert (10 mM PIPES (pH 6,8), 100 mM NaCl, 300 mM sackaros, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA och 0,5% Triton X-100).
3. Fixering
- Aspirera PBSTx och inkubera i 15 minuter med 3% PFA (Table of Materials) vid rumstemperatur, följt av tre till fyra tvättar med 1x PBS. De fasta cellerna kan hållas vid 4 °C tills ytterligare steg.
VARNING: PFA är mycket giftigt och cancerframkallande. Undvik kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Utför alla steg med PFA i en dragskåp och kassera materialet på rätt sätt.
4. Permeabilisering och blockering
- Efter fixering, permeabilisera cellerna med 0,5% PBSTx på is i 5 minuter. Använd tillräckligt med volym för att täcka hela täckglaset (vanligtvis mellan 500 μl och 1 ml).
- Tvätta cellerna tre till fyra gånger med 0,2% PBST (1X PBS + 0,2% Tween-20) vid rumstemperatur. En ml PBST räcker för att tvätta varje brunn. Utför tvättarna rygg mot rygg utan inkubationer.
- Aspirera PBST och blockera proverna med 5% BSA (Table of Materials) gjord i 1x PBS (blockerande buffert) i 30 minuter vid rumstemperatur.
5. Immunfärgning med IdU-antikroppen
- För immunfärgning, förbered en fuktad kammare (våt pappershandduk på en Tupperware med platt botten). Täck locket på 24-brunnsplattan med parafilm, placera i den fuktade kammaren och lägg ner täckglasen på plattlocket.
- Bered den primära anti-BrdU-antikroppen hos möss (Table of Materials) genom att späda den 1:200 i blockeringsbufferten från steg 4.2.Anti-BrdU-antikroppen har tidigare visats detektera IdU.
- Tillsätt 60 μl utspädning av IDu-antikroppar ovanpå täckglasen. Inkubera täckglasen i 1 timme vid 37 °C.
- Alternativt, använd mindre antikroppslösning om täckglasen vänds på en droppe (20-25 μL) 1:200 antikroppsutspädning pipetterad på parafilm. Detta minskar också sannolikheten för att lösningen torkar ut under inkubationen.
- Efter 1 h inkubation, aspirera den primära antikroppen. Sätt tillbaka täckglasen på en platta med 24 brunnar och tvätta dem fyra gånger med 0,2 % PBST.
- För den sekundära antikroppen, använd samma fuktkammare som beskrivs i steg 5.1. Utspädd antimuskonjugerad sekundär antikropp (materialtabell) i den blockerande bufferten (1:200). Tillsätt 60 μl sekundär antikropp till täckglasen och inkubera vid rumstemperatur i mörker i 1 timme.Denna sekundära antikropp är ljuskänslig.
- Aspirera den sekundära antikroppen. Sätt tillbaka täckglasen på 24-brunnsplattan och tvätta fyra gånger med 0,2% PBST.
- Märk mikroskopglas och montera täckglasen på objektglasen med DAPI-monteringsmedium (Table of Materials). Förvara rutschkanor i mörker vid rumstemperatur i 24 timmar. 24 timmars inkubation rekommenderas om monteringsmediet behöver härdas eller härdas.
OBS: Objektglasen kan sedan förvaras i 4 °C innan de avbildas i ett fluorescensmikroskop. En representativ bild visas i figur 4.
6. Automatiserad kvantifiering av IdU-fokus
OBS: Kraften i denna analys ligger i förmågan att automatisera analysen för snabb och effektiv kvantifiering. Vi presenterar här en automatiserad analyspipeline som kan användas för att kvantifiera IdU-foci i ett givet bildfält. Det är viktigt att alla bilder inom ett givet experiment tas med samma exponeringsinställningar. Annars kommer kvantifieringen inte att vara tillförlitlig. Det kan också vara värdefullt att inkludera en icke-färgad kontroll som en negativ kontroll, åtminstone för första gången detta experiment körs (figur 5). Protokollet nedan är specifikt för NIS General Analysis Software, men samma principer kan också tillämpas med annan kommersiell programvara.
- På fliken Visa går du till Analyskontroller | Analys Explorer. Då öppnas ett nytt sidofönster med namnet Analysis Explorer. Klicka på Skapa ny | Allmän analys 3. Detta öppnar Analysis Explorer flödesschema skapande programvara.
- Gå till fliken Källor och dra kommandot Kanaler från den vänstra menyn till arbetsområdet. De två kanalerna för DAPI- och IdU-fokuserna dyker automatiskt upp som binära rutor (visas i figur 5 som rutor med röda konturer).
- Gå till fliken Förbehandling och dra kommandot Lokal kontrast från den vänstra menyn till arbetsområdet. Anslut den lokala kontrasten till IdU-fokuskanalen. På fliken Segmentering drar du kommandot Tröskelvärde (ett för varje kanal).
- Anslut varje kanal till ett tröskelkommando . Om du vill eliminera kärnor vid kanten av en bild går du till fliken Binär bearbetning , drar kommandot Touching Borders och ansluter till DAPI-tröskeln.
- Sammanfoga data från de två kanalerna med hjälp av kommandot Aggregera underordnade på fliken Mått. Definiera DAPI-kanalen som överordnad (A) och foci-kanalen som underordnad (B). I listrutan i kommandot Aggregera underordnade väljer du alternativet underordnad finns i den överordnade. Detta steg hjälper till att räkna antalet foci (barn) per kärna (förälder).
- Om du vill exportera data i tabellformat klickar du på kommandot Ändra kolumner på fliken Datahantering . I listrutan från kommandot Ändra kolumner väljer du DAPI-ID (detta hjälper till att tilldela ett unikt nummer till varje kärna inom en viss bild) och IdU-antal (detta ger antalet IdU-foci i varje kärna). Om du vill exportera data i CSV-format använder du kommandot Tabell till CSV på fliken Referens . GA3 kan nu sparas med en beskrivande titel.
- För analysen, öppna en bild i programvaran.
- Öppna fliken Analysutforskaren som du gjorde i steg 6.1 och leta reda på den nyligen skapade GA3. Dubbelklicka på GA3-filen, som öppnar ett nytt fönster som heter GA3 Wizard där man kan ställa in tröskeln för DAPI- och IdU-kanalerna.
- Använd skjutreglaget i fönstret för att ställa in lägsta och högsta tröskelvärde för varje kanal och därmed definiera signalen. Ett bra tröskelvärde är där gränserna för varje kärna och IdU-fokus är tydligt definierade. När du är nöjd med tröskelvärden behåller du dessa siffror för att analysera alla filer i ett visst experiment.
- Klicka på knappen Kör för att få antalet IdU-foci/per kärna.
OBS: Programvaran genererar en tabell över foci per kärna, som därefter kan användas för alla grafändamål (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa bilder och kvantifiering av IdU-foci från kärnorna härledda från obehandlade celler och celler behandlade med 0,5 mM hydroxiurea under 24 timmar visas i figur 4. Båda kärnorna är färgade och identifierbara i DAPI-kanalen. Analysen av dessa bilder består av att kvantifiera antalet foci i varje kärna. Antalet foci är proportionellt mot graden av replikeringsstress.
Figur 1: Mekanismer för ssDNA-generering. Schematisk för att visa olika mekanismer genom vilka ssDNA kan genereras i cellen. Detta inkluderar (A) stopp av replikationsmaskineriet, (B) stopp av transkriptionsmaskineriet, vilket resulterar i R-loopar, (C) DNA-ändresektion, (D) bildandet av D-loopar eller (E) replikationskopplade luckor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schematisk IdU-märkning. Cellerna pulseras med IdU i två populationsfördubblingar. Om någon läkemedelsbehandling behövs ska den administreras efter den första populationen som fördubblats i närvaro av IdU. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Jämförelse av foci-signalen som erhållits efter pulsering med IdU, BrdU eller CldU. Representativa bilder av celler pulserade med tre olika tymidinanaloger. DAPI, GFP (som representerar Alexa-488-märkta IdU-fokus) och sammanslagna kanaler visas. Skalstapel: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Ökade IdU-foci i OVCAR3-celler orsakade av replikationsstress . (A) Representativa bilder av IdU och DAPI-färgade kärnor och (B) kvantifiering av de celler som behandlats med 0,5 mM hydroxiurea under 24 timmar. **** p < 0,0001 (Mann-Whitney-test). Skalstapel: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 5: Representativ GA3-pipeline för automatiserad analys. GA3 automatiserad analys kan åstadkommas genom att generera en pipeline för att tröskel kärnorna baserat på DAPI (visas i orange) och IdU foci (visas i gult). Genom att aggregera dessa två tröskelvärden fylls antalet IdU-foci per kärna i. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som nämnts i protokollet är det värdefullt att inkludera några experimentella kontroller för att säkerställa att analysen fungerar. Dessa inkluderar ett prov som inte behandlas med IdU samt ett prov som inte behandlas med någon primär antikropp. Båda negativa kontrollerna bör ge celler som färgas av DAPI men som inte innehåller någon IdU-signal.
Baserat på de experimentella betingelserna och cellinjer som används kan olika antikroppsutspädningar behövas för att erhålla den bästa fluorescerande signalen. För mycket signal kan resultera i en oförmåga att kvantifiera enskilda foci, medan för lite signal kan innebära att experimentella skillnader mellan samplingarna inte kan identifieras. Justering av förextraktions- och permeabiliseringstiderna kan också hjälpa om det finns för mycket bakgrundssignal, vilket kan uppstå från oextraherat nukleoplasmatiskt innehåll.
Eftersom detta protokoll kräver IdU-inkorporering över två befolkningsfördubblingar är det viktigt att ta hänsyn till varje cellinjes fördubblingstid. När man jämför två cellinjer som har olika fördubblingstider är det absolut nödvändigt att justera längden på IdU-pulseringen till varje cellinjes fördubblingstid. Detta kan dock införa en viss grad av variation. Således är tillämpningen av denna analys mest effektiv när man jämför cellinjer med liknande fördubblingstider. Om fördubblingstiderna inte är kända kan detta kräva tidigare experimentell optimering.
Dessutom kan denna analys underskatta mängden ssDNA som finns i cellen vid varje given tidpunkt. ssDNA kan endast identifieras som foci när den motsatta strängen har märkts med IdU. Således, om strängen motsatt ssDNA inte har märkts, kommer den inte att detekteras. Till exempel, om föräldrarnas icke-märkta DNA har lesioner som ger upphov till luckor, kommer dessa lesioner inte att detekteras (figur 2). För en mer känslig analys skulle ett alternativt tillvägagångssätt vara att sondera cellerna för replikationsprotein A (RPA). RPA är ett DNA-bindande protein som företrädesvis täcker ssDNA för att förhindra att det bildar sekundära strukturer och skyddar mot nukleasaktivitet23,24. Under replikationskopplad skada fosforyleras RPA vid serin 33, och därför kan pRPA S33 användas som markör för replikationsstress. Vid kraftig skada fosforyleras pRPA S33 ytterligare på S4/S8 av DNA-PK25. Genom att undersöka olika former av RPA bundna till kromatin kan man därför bedöma olika replikationsstressresponser i celler. Dessa två kompletterande tillvägagångssätt (IdU foci och RPA-färgning) kan utföras parallellt för att validera nivåerna av ssDNA med hjälp av olika metoder.
Denna analys ger en lätt att följa, mycket reproducerbar och effektiv metod för att kvantifiera ssDNA i en given celltyp. Det kan justeras för att möjliggöra tillämpning av olika läkemedelsbehandlingar, olika celltyper och flera analysverktyg. Det är mottagligt för olika automatiserade kvantifieringsmetoder, inklusive NIS-analysprogramvaran. Till skillnad från andra tekniker för att kvantifiera ssDNA, såsom den COMET-baserade analysen, är IdU-fokusanalysen mer genomförbar för applikationer med hög genomströmning.
Denna analys kan användas för en mängd applikationer. En ökad närvaro av ssDNA kan användas som en markör för replikationsstress och för att förutsäga kemoterapisvar vid olika äggstockscancer. Vidare kan amplifiering av onkogener som är kända för att störa replikation eller cellcykelreglering orsaka ackumulering av lesioner som resulterar i ökat ssDNA. Denna analys kan därför också användas för att undersöka effekten som amplifieringen av onkogener har på ackumuleringen av ssDNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
PV stöds av Inaugural Pedal the Cause Grant av Alvin J. Siteman Cancer Center genom The Foundation for Barnes-Jewish Hospital, Pilot Research Grant från Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research, Cancer Research Grant från Mary Kay Ash Foundation och V-Foundation. NR stöds av NIH Cell and Molecular Biology training T32-bidrag till Washington University, St. Louis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
References
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer. Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).
- Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity. Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nature communications. 8, 1093 (2017).
- Kroeger, P. T., Drapkin, R. Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).
- Patch, A. -M., et al. Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer. Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).
- Alexandrov, L. B., et al. The repertoire of mutational signatures in human cancer. Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).
- Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint. Genes & Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).
- Toledo, L. I., et al. ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA. Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).
- Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability. Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).
- Cejka, P., Symington, L. S. DNA end resection: Mechanism and control. Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).
- Kowalczykowski, S. C. An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A.
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: An essential regulator of genome integrity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Xu, H., et al. CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models. Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).
- Konstantinopoulos, P. A., et al. A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer. Nature Communications. 12, 5574 (2021).
- Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase. Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).
- Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).
- da Costa, A. A. B. A., et al. Targeting replication stress in cancer therapy. Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).
- Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: Single-stranded DNA's first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
- Bhat, K. P., Cortez, D. RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).
- Maréchal, A., Zou, L. RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response. Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).
