Summary
Este documento describe un algoritmo de correlación de imágenes digitales de código abierto para medir las tensiones locales de tejido 2D dentro de los explantes de tendones. La precisión de la técnica ha sido validada utilizando múltiples técnicas, y está disponible para uso público.
Abstract
Existe un considerable interés científico en comprender las tensiones que experimentan las células tendinosas in situ y cómo estas cepas influyen en la remodelación de los tejidos. Sobre la base de este interés, se han desarrollado varias técnicas analíticas para medir las tensiones del tejido local dentro de los explantes tendinosos durante la carga. Sin embargo, en varios casos, la precisión y sensibilidad de estas técnicas no se han informado, y ninguno de los algoritmos está disponible públicamente. Esto ha dificultado la medición más generalizada de las tensiones tisulares locales en los explantes de tendones. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue crear una herramienta de análisis validada para medir las tensiones tisulares locales en los explantes tendinosos que esté fácilmente disponible y sea fácil de usar. Específicamente, se adaptó un algoritmo de correlación de imagen digital (ALDIC) de Lagrange aumentada disponible públicamente para medir las tensiones 2D mediante el seguimiento de los desplazamientos de los núcleos celulares dentro de los tendones de Aquiles del ratón bajo tensión uniaxial. Además, la precisión de las cepas calculadas se validó mediante el análisis de imágenes transformadas digitalmente, así como mediante la comparación de las deformaciones con los valores determinados a partir de una técnica independiente (es decir, líneas fotoblanqueadas). Finalmente, se incorporó una técnica al algoritmo para reconstruir la imagen de referencia utilizando el campo de desplazamiento calculado, que se puede utilizar para evaluar la precisión del algoritmo en ausencia de valores de deformación conocidos o una técnica de medición secundaria. El algoritmo es capaz de medir deformaciones de hasta 0,1 con una precisión de 0,00015. La técnica para comparar una imagen de referencia reconstruida con la imagen de referencia real identificó con éxito muestras que tenían datos erróneos e indicó que, en muestras con buenos datos, aproximadamente el 85% del campo de desplazamiento era preciso. Finalmente, las tensiones medidas en tendones de Aquiles de ratón fueron consistentes con la literatura previa. Por lo tanto, este algoritmo es una herramienta muy útil y adaptable para medir con precisión las tensiones tisulares locales en los tendones.
Introduction
Los tendones son tejidos mecanosensibles que se adaptan y degeneran en respuesta a la carga mecánica 1,2,3,4. Debido al papel que desempeñan los estímulos mecánicos en la biología de las células del tendón, existe un gran interés en comprender las tensiones que experimentan las células del tendón en el entorno del tejido nativo durante la carga. Se han desarrollado varias técnicas experimentales y analíticas para medir las tensiones tisulares locales en los tendones. Estos incluyen análisis de correlación de imágenes digitales (DIC) 2D / 3D de deformaciones superficiales utilizando patrones de moteado o líneas fotoblanqueadas (PBL)5,6,7,8, medición de los cambios en la distancia centroide a centroide de núcleos individuales dentro del tejido 9,10, y un método DIC 3D reciente de campo completo que considera el movimiento fuera del plano y las deformaciones 3D 11 . Sin embargo, la exactitud y sensibilidad de estas técnicas se han informado sólo en unos pocos casos, y ninguna de estas técnicas se ha puesto a disposición del público, lo que dificulta la adopción y utilización generalizadas de estas técnicas.
El objetivo de este trabajo fue crear una herramienta de análisis validada para medir las tensiones tisulares locales en los explantes tendinosos que esté fácilmente disponible y sea fácil de usar. El método elegido se basa en un algoritmo de correlación de imágenes digitales (ALDIC) de lagrangiano aumentado disponible públicamente escrito en MATLAB que fue desarrollado por Yang y Bhattacharya12. Este algoritmo se adaptó para analizar muestras de tendones y se validó aplicándolo a imágenes transformadas digitalmente y comparando las deformaciones medidas en muestras de tendones reales con los resultados obtenidos de líneas fotoblanqueadas. Además, se implementó una funcionalidad adicional en el algoritmo para confirmar la precisión del campo de desplazamiento calculado incluso en ausencia de valores de deformación conocidos o una técnica de medición secundaria. Por lo tanto, este algoritmo es una herramienta muy útil y adaptable para medir con precisión las tensiones locales del tejido 2D en los tendones.
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Protocol
Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Pensilvania.
1. Preparación del tejido
- Para este protocolo, recolecte los tendones de Aquiles de ratones machos C57BL / 6 de 2-4 meses de edad.
NOTA: También se pueden usar diferentes tendones o ligamentos de ratones u otros animales pequeños.- Haga una incisión en la piel superficial del tendón de Aquiles para exponer el tendón plantar y el tejido conectivo circundante. Luego, retírelos con una cuchilla quirúrgica.
- Separe los músculos sóleo y gastrocnemio expuestos de la extremidad posterior, y raspe cuidadosamente el tendón de Aquiles con la cuchilla quirúrgica
- Separe el calcáneo del resto del pie con un accesorio de rueda de corte en una herramienta rotativa.
- Teñir el tejido en 1,5 ml de una solución de 5 μg/ml de 5-(4,6-diclorotriazinil) aminofluoresceína (DTAF) y tampón de bicarbonato de sodio 0,1 M durante 20 min en un mezclador giratorio a temperatura ambiente. Esta solución tiñe proteínas (por ejemplo, matriz extracelular) en el tejido.
NOTA: Durante este período de 20 minutos, se debe completar el paso 1.3. - Prepare una solución 1:1.000 de DRAQ5 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para teñir los núcleos. Utilice un mezclador de vórtice para homogeneizar la solución.
- Después del período de incubación de 20 minutos en el paso 1.2, transferir el tejido de la solución DTAF a la solución DRAQ5 e incubar en un espacio oscuro durante 10 minutos a temperatura ambiente.
2. Carga del tendón y adquisición de imágenes
NOTA: Este protocolo requiere un dispositivo de tracción que se puede montar en la parte superior de un microscopio confocal. Para este estudio, se utilizó el dispositivo de microtracción descrito por Peterson y Szczesny13 .
- Coloque el tendón en las empuñaduras del dispositivo de carga de tracción. Antes de montar las empuñaduras en el dispositivo de carga, utilice pinzas digitales para medir la distancia entre el accesorio calcáneo y la empuñadura opuesta. Esta distancia es la longitud del calibre del tendón.
- Alternativamente, monte las empuñaduras en el dispositivo de carga antes de insertar el tendón y empújelas en contacto para definir la posición del motor de desplazamiento cero. El desplazamiento de los motores después de insertar el tendón podría proporcionar una longitud de medidor de agarre a agarre potencialmente más precisa.
- Monte las empuñaduras en el dispositivo de carga, que contiene PBS para mantener la hidratación de los tejidos. Alinee el tendón lo mejor posible con el eje x o el eje y de las imágenes del microscopio para que las salidas de deformación x y deformación del algoritmo se correspondan con los ejes del tendón.
NOTA: En este estudio, los tendones se alinearon con el eje x. Si no es posible alinear perfectamente el tendón con los ejes de imagen, entonces las salidas de deformación x y deformación y del algoritmo se pueden transformar para alinearse con los ejes longitudinales / perpendiculares del tendón utilizando ecuaciones estándar de transformación de deformación14. - Precargue el tendón con 1 g de tensión y, si lo desea, aplique carga cíclica para preacondicionar la muestra. En este protocolo, no se utilizó ningún preacondicionamiento ya que el objetivo del estudio era validar las cepas tisulares locales medidas en lugar de medir las propiedades del material tisular. Si hay interés en medir las propiedades del material a macroescala, que dependen del historial de carga, se recomienda el preacondicionamiento. Después del preacondicionamiento y la recuperación, vuelva a aplicar una precarga de 1 g.
- Si lo desea, fotoblanquee un conjunto de cuatro líneas separadas por 80 μm en la región central del tejido (ver Peterson y Szczesny13 para más detalles).
NOTA: Las líneas fotoblanqueadas se utilizaron para validar las mediciones del algoritmo ALDIC y no son necesarias para realizar el ALDIC en sí. El número y el espaciado de las líneas se pueden ajustar, y la ubicación de las líneas debe elegirse para evitar cualquier artefacto en la muestra que disminuya la claridad de la línea. - Repita el procedimiento de fotoblanqueo en los extremos izquierdo y derecho del tejido cerca de los agarres.
- Usando el microscopio confocal, adquiera imágenes volumétricas (x,y: 1,25 μm/píxel, z: 2,5 μm/píxel) de la fluorescencia DTAF y DRAQ5 a 1 g de precarga.
- Realice una rampa de deformación a 0,5%/s a 2% de deformación. Tenga en cuenta que la velocidad de deformación y la magnitud de deformación incremental se pueden ajustar.
- Permita que el tejido se estrese y se relaje durante 10 minutos.
NOTA: La duración de la relajación del estrés debe elegirse de tal manera que la muestra esté bajo una carga aproximadamente cuasiestática durante la adquisición de la imagen. Para determinar si la duración de la relajación de la tensión es aceptable, determine la pendiente de la curva fuerza-tiempo durante el último minuto de relajación de la tensión (Figura suplementaria 1) y multiplique esta pendiente por la duración total de la imagen. En este estudio, la fuerza aplicada al mayor incremento de deformación nunca cambió en más del 5%. - Tome otra imagen volumétrica del tejido después de la deformación.
- Repita los pasos 2.7-2.9 hasta alcanzar la tensión final deseada. En este trabajo, se eligió un valor final de cepa del 12%.
3. Procesamiento de imágenes
- Utilice ImageJ o Fiji para crear proyecciones z máximas de cada imagen volumétrica del canal DRAQ5 (nuclear). Esto servirá como las imágenes moteadas en 2D para el ALDIC.
- Guarde las proyecciones z de intensidad máxima como archivos .tiff y asígneles un nombre según la siguiente convención de nomenclatura.
- Utilice un número como primer carácter del nombre de la imagen.
- Haga que el número corresponda al orden en que se considerarán las imágenes durante el análisis de deformación. Por ejemplo, la primera imagen debe comenzar con uno, y la segunda imagen debe comenzar con dos. Se pueden elegir diferentes números, pero deben aumentar secuencialmente. Un ejemplo de convención de nomenclatura es el siguiente: "0_Experiment1_MaxZProjection".
- Guarde todas las proyecciones z de intensidad máxima cuyo nombre ha cambiado en una carpeta.
4. Instalación y aplicación del código de análisis de línea fotoblanqueada
NOTA: Estos pasos sólo son necesarios si se desea confirmar la precisión del algoritmo ALDIC utilizando líneas fotoblanqueadas. El código calcula la tensión tisular local como el cambio normalizado promedio en la distancia entre cada línea fotoblanqueada dentro del conjunto de líneas fotoblanqueadas. En este estudio, los valores locales promedio se promediaron en todos los conjuntos de líneas fotoblanqueadas (es decir, en el centro y los extremos izquierdo / derecho) para determinar un solo valor promedio de deformación tisular local para cada muestra. Este valor se utilizó para estimar la precisión del algoritmo ALDIC.
- Descargue la carpeta "PBL Code" de GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) y mueva todo el contenido al directorio de trabajo en MATLAB.
- Abra el script de MATLAB "Micro_Mech_Template.m".
- Pulse Ejecutar y seleccione uno de los archivos de imagen que contienen las imágenes volumétricas. Las imágenes volumétricas pueden ser cualquiera de los siguientes tipos de archivo: .lsm, .tiff, .nd2.
- El software cargará automáticamente todas las imágenes en la carpeta y mostrará una imagen proyectada de la imagen volumétrica de referencia. Cuando se le solicite, haga clic con el botón izquierdo para crear líneas multipunto que tracen los extremos izquierdo y derecho de la muestra. Haga clic con el botón secundario para terminar una línea. Una vez procesada la entrada, si las aristas son correctas, pulse Ok para aceptar el resultado.
- Dibuje una línea diagonal aleatoria a través de la muestra como línea de referencia cuando se le solicite.
- Introduzca el número de líneas fotoblanqueadas creadas y trace las líneas fotoblanqueadas con líneas multipunto.
- Si el resultado es aceptable, acéptalo. Si el resultado es erróneo, ajústelo y vuelva a procesarlo.
- Repita el paso 4.2 para todas las imágenes y mueva todas las imágenes de líneas trazadas a una sola carpeta.
- Abra el script "Micro_Mech_Strain.m".
- Pulse Ejecutar para ejecutar el código y seleccione una de las imágenes guardadas donde se trazan las líneas fotoblanqueadas.
- Confirme que las imágenes que acompañan seleccionadas son correctas una vez seleccionada la imagen pulsando Ok.
5. Creación de imágenes transformadas digitalmente
NOTA: Estos pasos sólo son necesarios si se desea confirmar la precisión del algoritmo ALDIC utilizando imágenes transformadas digitalmente. Estas imágenes simulan campos de deformación 2D homogéneos de una magnitud conocida mediante la transformación artificial de la imagen de referencia.
- Descargue el código "Digital_strain.m" de GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc).
- Abra y ejecute el código.
- Cuando se le solicite, inserte los valores deseados para la deformación máxima aplicada, el incremento de deformación aplicada y la relación de Poisson. Presione Ok.
NOTA: Para este experimento, la deformación máxima aplicada fue de 0,1 (10%), el incremento de deformación aplicado fue de 0,02 (2%) y se utilizó una relación de Poisson de 1, que es consistente con los datos experimentales de la prueba de tracción del tendón15,16. El código utiliza la función imwarp de MATLAB integrada y los valores de entrada (por ejemplo, incrementos de deformación, relación de Poisson) para crear las imágenes transformadas digitalmente. - Cuando se le solicite, seleccione la imagen de referencia sin deformar.
- Para cada incremento de deformación, se muestra una superposición de la imagen de referencia y la imagen transformada. La imagen transformada se guardará en el directorio bajo el título "DigitallyTransformedX%Strain", donde X es el incremento de deformación.
6. Instalación y aplicación del código de validación y cálculo de deformación
- Descargue la carpeta "Código de validación y cálculo de deformación" de GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) y mueva todo el contenido al directorio de trabajo de MATLAB
- Instale un compilador mex C / C ++ de acuerdo con Yang y Bhattacharya12. Los pasos se resumen a continuación.
- Compruebe MATLAB para ver si se ha instalado un compilador mex C/C++ escribiendo "mex -setup" en la ventana de comandos de MATLAB y pulsando Intro.
- Si aparece un error que indica que un compilador no es compatible o no está presente, continúe con los pasos 6.3 y 6.4.
- Si no hay ningún error, continúe con el paso 6.5
- Para descargar un compilador mex C/C++, vaya a "https:/tdm-gcc.tdragon.net/" y elija el compilador TDM-gcc.
- Instale el compilador descargado en una ubicación conocida.
- Vuelva a la ventana de comandos de MATLAB y escriba: "setenv("MW_MINGW64_LOC","[Escriba su ruta de instalación aquí]")". Por ejemplo, podría ser "setenv("MW_MINGW64_LOC","C:\TDM-GCC-64")". Si este comando se ejecuta correctamente, el compilador mex está instalado correctamente.
- Introduzca el script de función "main_aldic.m" y cambie la línea 22 para que coincida con el comando ejecutado en el paso 6.5.
- Abra el script "Strain_calc_and_validate.m".
- Pulse Ejecutar para comenzar el análisis de la imagen.
- Cuando se le solicite, modifique los valores de los parámetros ALDIC como desee.
NOTA: El tamaño de la ventana debe ser de 0,25 a 1 veces el tamaño del subconjunto. Para obtener más información sobre las opciones de parámetros, consulte el manual del usuario en línea: (https://www.researchgate.net/publication/344796296_Augmented_Lagrangian_Digital
_Image_Correlation_AL-DIC_Code_Manual).- En este estudio se utilizaron los siguientes valores:
Tamaño del subconjunto (píxeles): 20
Tamaño de ventana (píxeles): 10
Método para resolver ALDIC: Diferencia finita (1)
No se utilizó la computación paralela (1)
Método para calcular la estimación inicial: búsqueda multigrid basada en pirámide de imagen (0)
- En este estudio se utilizaron los siguientes valores:
- Cuando se le solicite, seleccione la casilla de verificación "Sí" para que el algoritmo guarde automáticamente el valor medio, la desviación estándar y los mapas 2D para la colección deseada de variables (por ejemplo, deformación x, deformación y, deformación cortante, regiones defectuosas, etc.). Seleccione qué variables deben guardarse y pulse Aceptar.
- Cuando se le solicite, modifique los parámetros como desee.
- En este experimento se utilizaron los siguientes valores:
Puntos circundantes para calcular la deformación (numP): 12
Coeficiente de correlación para la identificación de regiones incorrectas (corr_threshold): 0.5
Tamaño de subregión (píxeles) para análisis de región incorrecta (Subtamaño): 32
- En este experimento se utilizaron los siguientes valores:
- Cuando se le solicite, seleccione la carpeta que contiene las proyecciones z de intensidad máxima cuyo nombre ha cambiado. Tenga en cuenta que el software realiza automáticamente ALDIC incremental para determinar los campos de deformación de las imágenes deformadas. Es decir, cada imagen deformada sirve como la nueva imagen de "referencia" para la siguiente imagen deformada. Esto mejora la precisión de los resultados (Figura complementaria 2) en comparación con la realización de ALDIC acumulativo, donde cada imagen deformada se compara con la imagen de referencia original (0% de deformación). Para realizar un análisis acumulativo, cargue las imágenes, pero solo seleccione la imagen de referencia original y la imagen deformada de interés.
NOTA: La deformación normal se calcula como λ - 1, donde λ es el estiramiento del tejido. El estiramiento del tejido se calcula de acuerdo con , donde N = [1 0]T o [0 1]T para la dirección x y la dirección y, respectivamente, y C = F T F, donde F es el gradiente de deformación calculado utilizando puntos "numP" que rodean cada punto de datos de
salida por el algoritmo ALDIC. La deformación cortante se calcula como 
, donde 
. - Cuando se le solicite, haga clic con el botón izquierdo para crear un polígono de cuatro puntos para definir la región de interés para medir las cepas. Comience con el punto en la esquina superior izquierda y asigne los puntos siguientes en el sentido de las agujas del reloj.
NOTA: La variable "Almacenamiento" guardada en el espacio de trabajo de MATLAB contiene todos los valores para la deformación x media, la desviación estándar de deformación x, la deformación y media, la desviación estándar de deformación y, la deformación cortante media, la desviación estándar de deformación cortante y el porcentaje de regiones incorrectas. Las regiones malas se definen de acuerdo con el análisis del coeficiente de correlación dentro de la región de interés seleccionada en el paso 6.13. La carpeta "NuclearTrackingResults" (que se puede cambiar ajustando las líneas 555 y 556) almacena todas las gráficas especificadas en el paso 6.10. Esta carpeta también contiene un archivo de hoja de cálculo con el nombre "Resultados", que almacena todas las medias y desviaciones estándar especificadas en el paso 6.10.
salida por el algoritmo ALDIC. La deformación cortante se calcula como 
, donde 
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Representative Results
Antes de analizar los campos de deformación en muestras de tejido reales, el protocolo ALDIC se validó por primera vez utilizando imágenes tensadas / transformadas digitalmente de núcleos dentro de tendones de Aquiles de ratón. Específicamente, las imágenes se transformaron para producir digitalmente cepas uniformes en la dirección x de 2%, 4%, 6%, 8% y 10% de tensión con una relación de Poisson simulada de 115,16. La precisión del algoritmo ALDIC se evaluó comparando los valores medios de deformación calculados con las cepas digitales conocidas. Además, se evaluó la desviación estándar de los valores de deformación para determinar la heterogeneidad del campo de deformación. La diferencia entre las deformaciones calculadas por ALDIC (utilizando análisis incremental) y las deformaciones reales aplicadas a las imágenes transformadas digitalmente se muestran en la Figura 1. La deformación media en la dirección x calculada por el software ALDIC fue consistentemente una subestimación de la deformación aplicada verdadera (Figura 1A), y la magnitud del error aumentó con una mayor deformación aplicada. Sin embargo, la magnitud siempre fue inferior a 0,00015 para todos los incrementos de deformación. También hubo una ligera subestimación de la tensión en la dirección y (Figura 1C). La desviación estándar de las deformaciones calculadas dentro de toda la región de interés para la deformación x y la deformación y también aumentó con mayores deformaciones aplicadas, pero la magnitud también fue muy pequeña (<0,002) (Figura 1B, D). Estos errores fueron sustancialmente mayores cuando se utilizó el análisis acumulativo (Figura complementaria 2).
Figura 1: Comparación y validación de algoritmos con imágenes forzadas digitalmente . (A) Los datos de deformación ALDIC medidos en la dirección x fueron consistentemente más bajos que la deformación real prescrita por las transformaciones digitales, y el error aumentó progresivamente con una mayor deformación aplicada. (B) La desviación estándar de los valores de deformación en la dirección x también aumentó con mayores deformaciones digitales aplicadas. (C) Los datos de deformación ALDIC medidos en la dirección y fueron consistentemente más bajos que la deformación real prescrita por las transformaciones digitales. (D) La desviación estándar de los valores de deformación en la dirección y aumentó con una mayor deformación aplicada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Al realizar análisis de deformación en muestras de tejido reales, no es posible evaluar directamente la precisión del algoritmo ALDIC. Aún así, se desarrolló una técnica para estimar la precisión del campo de desplazamiento. Específicamente, la imagen deformada se deformó de nuevo en una predicción de la imagen de referencia basada en el campo de desplazamiento calculado. Luego se utilizó un coeficiente de correlación cruzada normalizado para determinar qué tan bien la imagen de referencia deformada / reconstruida coincidía con la imagen de referencia verdadera. Cualquier subregión (32 píxeles x 32 píxeles) en la que el valor de correlación cruzada normalizada fuera inferior a 0,5 se consideró una "región mala" en la que el campo de desplazamiento probablemente era inexacto. Este análisis identificó que había una diferencia significativa entre el desempeño de las técnicas de análisis incremental y acumulativo. Específicamente, el número de regiones malas comenzó a aumentar con el método acumulativo después de la cepa aplicada del 6% (Figura 2A), mientras que se observaron muy pocas (1%) regiones malas en cualquiera de las regiones transformadas digitalmente para el análisis incremental. Al aplicar esta técnica de evaluación de precisión en los cuatro tendones de Aquiles de ratón que se probaron (Figura complementaria 3), se determinó que para tres muestras, el número promedio de regiones malas fue inferior al 25% de la imagen. Sin embargo, en una de las cuatro muestras (Experimento 2), casi la mitad de la imagen se identificó como mala en el incremento de deformación máxima (Figura 2B). El número de regiones malas que estaban presentes en el Experimento 2 varió de la media de las otras tres muestras en más de cuatro desviaciones estándar. Esto permitió determinar que los datos de ALDIC del Experimento 2 representaban un valor atípico y, por lo tanto, estos datos se eliminaron del análisis posterior de los resultados.
Figura 2: Identificación exitosa de áreas con cálculos de deformación no válidos mediante análisis de regiones incorrectas. (A) La cantidad de regiones malas en las imágenes transformadas digitalmente analizadas utilizando el método acumulativo aumentó consistentemente después de una deformación aplicada del 6%, mientras que la cantidad incremental se mantuvo en el 1%. (B) La cantidad de regiones defectuosas para todas las muestras de tendones aumentó constantemente a incrementos de tensión más grandes. El experimento 2 se consideró un valor atípico y, por lo tanto, no se incluye en las barras de media y desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Además, las tensiones de tracción locales en los tendones de Aquiles de ratón probados se midieron utilizando líneas fotoblanqueadas (PBL) como segundo método para determinar la precisión del algoritmo ALDIC. Las deformaciones en dirección x calculadas por ALDIC tendían a ser mayores que las determinadas a partir de las PBL, pero la diferencia fue generalmente dentro de la deformación 0,005 (Figura 3A). Esta magnitud de error fue similar a la desviación estándar observada en los diferentes PBL dentro de una muestra dada (Figura 3B).
Figura 3: Validación de los cálculos de deformación ALDIC en comparación con datos de líneas fotoblanqueadas. (A) La diferencia entre los valores de deformación ALDIC y los valores de deformación PBL se mantuvo relativamente constante para todos los incrementos de deformación, alrededor de un valor de 0,005. (B) La desviación estándar para los datos de PBL promediados en todas las muestras se mantuvo relativamente constante en aproximadamente 0.005. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Después de evaluar la precisión del algoritmo ALDIC, se determinaron las magnitudes y distribuciones espaciales de las cepas locales en los tendones de Aquiles del ratón bajo carga de tracción (Figura 4, Figura 5 y Figura 6). Tenga en cuenta que las cepas no incluyen los datos de desplazamiento de las "regiones malas" dentro de cada muestra. Las deformaciones de tracción en dirección x fueron consistentes en las tres muestras y fueron sustancialmente más bajas que las cepas tisulares aplicadas (Figura 4A). Además, la deformación en dirección x fue relativamente heterogénea, dado que la desviación estándar en la imagen 2D siempre fue mayor que el valor medio de deformación. En contraste, hubo una inconsistencia significativa entre las tres muestras para las deformaciones en dirección y, con una muestra que exhibió valores medios positivos, una muestra que exhibió valores medios negativos y una muestra que exhibió deformación cero en la dirección y (Figura 4B). Además, la desviación estándar de las deformaciones de dirección y dentro de una muestra dada fue mayor que la desviación estándar de las deformaciones de dirección x. Finalmente, la deformación cortante fue relativamente baja en todos los incrementos de deformación (Figura 4C).
Figura 4: Cepas a microescala de tendones de Aquiles de ratón . (A) La tensión media en la dirección x permaneció por debajo de la tensión tisular aplicada, pero aumentó con cada incremento de deformación. (B) La deformación media en la dirección y fue aproximadamente cero para todos los incrementos, pero la desviación estándar fue alta. (C) La deformación media de cizallamiento aumentó constantemente a lo largo de los incrementos de deformación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Distribución espacial de las deformaciones x, y y cizallamiento. Mapas representativos de las (A) deformaciones x, (B) deformaciones y y (C) deformaciones cortantes en toda la región del tendón de interés Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Distribuciones espaciales de deformaciones máximas principales, mínimas principales y máximas. Mapas representativos de (A) deformaciones principales máximas, (B) deformaciones principales mínimas y (C) deformaciones máximas de cizallamiento en toda la región tendinosa de interés. Las líneas blancas indican las direcciones de las tensiones principales máximas y mínimas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Identificación del estado cuasiestático durante la obtención de imágenes. La pendiente de la curva fuerza-tiempo durante el último minuto del período de relajación de la tensión (línea roja) se puede utilizar para aproximar el cambio general de la fuerza durante la obtención de imágenes. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Comparación de técnicas de análisis incremental y acumulativo. (A) La diferencia entre las deformaciones medidas y reales en dirección x en las imágenes transformadas digitalmente fue significativamente mayor con el método acumulativo en comparación con el método incremental por encima del 4% de deformación. (B) La desviación estándar de los valores de deformación x también fue significativamente mayor con el método acumulativo por encima del 4% de deformación. (C) La diferencia entre las deformaciones y medidas y reales en las imágenes transformadas digitalmente fue sustancialmente mayor con el método acumulativo por encima del 8% de deformación. (D) La desviación estándar de los valores de deformación y fue significativamente mayor con el método acumulativo por encima del 4% de deformación. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 3: Visualización y cuantificación de regiones incorrectas para cada experimento. Las regiones malas se definieron como áreas locales dentro de la imagen de referencia reconstruida que no coincidían (por debajo del coeficiente de correlación de 0,5) con la misma región de la imagen de referencia real. Cada región incorrecta identificada dentro de una región de interés (delineada en blanco) está marcada con un cuadro azul. El porcentaje de regiones malas dentro de la región de interés se indica encima de cada imagen entre paréntesis. Tenga en cuenta que estas imágenes se reconstruyen a partir de la imagen deformada al 12% de tensión aplicada. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El objetivo de este trabajo fue proporcionar un método validado de código abierto para medir los campos de deformación 2D en tendones bajo carga de tracción. La base del software se basó en un algoritmo ALDIC disponible públicamente12. Este algoritmo se integró en un código de MATLAB más grande con la funcionalidad añadida de análisis de deformación incremental (frente a acumulativo). Este algoritmo adaptado se aplicó a la prueba de tracción de tendones, y su precisión se evaluó mediante dos técnicas diferentes (es decir, imágenes transformadas digitalmente y medición de deformación utilizando líneas fotoblanqueadas). Además, se agregó la capacidad de evaluar la precisión de las mediciones de ALDIC en cualquier muestra sin requerir el conocimiento de los verdaderos valores de deformación.
El análisis de las imágenes transformadas digitalmente demostró que el algoritmo podía medir con precisión las deformaciones de hasta el 10% con muy poco error, lo que no se pudo evaluar a partir de las pruebas de tracción de los tendones de Aquiles de ratón reales debido a las bajas magnitudes de las tensiones en las muestras de tendones. Sin embargo, la comparación de las deformaciones calculadas en tendones de Aquiles de ratón por ALDIC con las deformaciones medidas utilizando líneas fotoblanqueadas demostró que el error de la técnica ALDIC estaba dentro de la variación de medición de las propias líneas fotoblanqueadas. Como validación final, la precisión de los campos de desplazamiento 2D completos calculados por el algoritmo ALDIC se evaluó reconstruyendo la imagen de referencia a partir de la imagen deformada y comparando la reconstrucción con la imagen de referencia real. En las imágenes transformadas digitalmente, hubo un aumento en el número de regiones malas y error de deformación con mayores deformaciones aplicadas, especialmente para el análisis ALDIC acumulativo (Figura 2 y Figura complementaria 2). Esto era de esperar ya que la técnica incremental redefine la imagen de referencia con cada imagen intermedia para minimizar las diferencias de desplazamiento entre los pares de imágenes. El número de regiones defectuosas fue aún mayor en las muestras reales de tendones, ya que la estructura y la carga del tejido tendinoso no eran homogéneas (a diferencia de las imágenes transformadas digitalmente). Aún así, en promedio, solo alrededor del 15% de la imagen reconstruida no coincidía con la imagen de referencia real. Sin embargo, una muestra (Experimento 2) tenía un gran número de regiones erróneas (~ 45%). Si bien no está claro por qué esta muestra no pudo procesarse adecuadamente, este análisis de la imagen de referencia reconstruida fue valioso porque permitió el reconocimiento de que los datos de esta muestra no eran confiables. En conjunto, estos experimentos demuestran que este algoritmo de código abierto se puede utilizar con confianza para medir con precisión las tensiones tisulares dentro de los explantes de tendones.
Estos experimentos también proporcionaron información valiosa sobre el comportamiento mecánico de los tendones de Aquiles del ratón. Específicamente, a una deformación tisular aplicada del 12%, la deformación longitudinal promedio (dirección x) dentro de la muestra de tejido fue solo del 2%. Parte de esta atenuación de la deformación se debió al hecho de que las cepas tisulares a macroescala se calcularon a partir de los cambios en la longitud de agarre a agarre del tejido, que probablemente incluyeron concentraciones significativas de deformación en la interfaz de agarre de la unión miotendinosa. Aún así, esto es consistente con otros estudios de tensiones a microescala en tendones10,17,18. Además, la deformación del 12% correspondió a aproximadamente 5 MPa de carga, lo que probablemente sea comparable a las cargas fisiológicas máximas in vivo19. Esto sugiere que las células dentro de los tendones de Aquiles del ratón no experimentan tensiones de tracción superiores al 2%. La deformación transversal (dirección y) fue más variable entre las muestras, con valores positivos y negativos. Esto sugiere que las muestras de tendones exhibieron proporciones de Poisson positivas y negativas, lo que es consistente con las pruebas previas de los tendones de Aquiles20. Como se esperaba para la tensión uniaxial, la magnitud de la deformación cortante fue generalmente baja (<4° en promedio). Sin embargo, para todas las deformaciones de tracción y cizallamiento, la desviación estándar en toda la región de interés siempre fue mayor que el valor medio de la deformación, lo que demuestra que hubo un alto grado de heterogeneidad de la deformación. Además, esta heterogeneidad aumentó con mayores deformaciones aplicadas, probablemente debido a la heterogeneidad de la estructura tisular, así como al mayor error dentro de los cálculos de ALDIC resultante de los mayores desplazamientos y campos de desplazamiento. Esto sugiere que las tensiones experimentadas por las células tendinosas individuales son muy variables dentro del tejido.
A pesar de la validación exitosa del algoritmo ALDIC, existen algunas limitaciones en su uso para analizar las tensiones dentro de los explantes tendinosos. La principal limitación es el hecho de que el algoritmo solo puede realizar un análisis 2D de un objeto 3D. Un enfoque más riguroso sería realizar una correlación digital completa del volumen (DVC), que se ha realizado en imágenes transformadas digitalmente de tendones11. Sin embargo, esto es generalmente difícil de realizar en muestras de tendones reales, ya que las imágenes contienen núcleos resolubles a una profundidad de solo 100 μm. Esto significa que el volumen interior de las muestras no tiene textura dentro de las imágenes volumétricas, lo que hace que el DVC no sea confiable. Por lo tanto, las imágenes en este estudio se colapsaron a proyecciones máximas 2D, lo que fuerza artificialmente a todos los núcleos en un solo plano de imagen. Si bien esto puede producir algunos errores en el análisis de deformación y evitar la medición de desplazamientos fuera del plano, los resultados de validación sugieren que la técnica sigue siendo precisa. Una limitación adicional es que las deformaciones se calcularon al final de un período de relajación del estrés y no pudieron calcularse durante la carga cíclica dinámica. Este problema era inevitable ya que había un tiempo de imagen finito para adquirir las imágenes volumétricas utilizadas para el análisis de deformación. A pesar de estas limitaciones, el éxito del análisis fue relativamente sólido, dado que tres de las cuatro muestras de tendones produjeron datos precisos de deformación. Por lo tanto, este algoritmo será una herramienta útil para los investigadores interesados en medir los campos de deformación dentro de los explantes tendinosos.
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Disclosures
Todos los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (R21 AR079095) y la Fundación Nacional de Ciencias (2142627).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-DTAF (5-(4,6-Dichlorotriazinyl) Aminofluorescein), single isomer | ThermoFisher | D16 | |
| Calipers | Mitutoyo | 500-196-30 | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R HD | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Coning | 6775 | |
| DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) | ThermoFisher | 62554 | |
| MATLAB | MathWorks | R2022b | |
| Tensile Loading Device | N/A | N/A | Tensile loading device described in Peterson et al, 2020. (ref 13) |
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher | 88881001 |
References
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