Summary
Bu yazıda, tendon eksplantları içindeki yerel 2D doku suşlarını ölçmek için açık kaynaklı bir dijital görüntü korelasyon algoritması açıklanmaktadır. Tekniğin doğruluğu birden fazla teknik kullanılarak doğrulanmıştır ve halkın kullanımına açıktır.
Abstract
Tendon hücrelerinin in situ olarak deneyimlediği suşları ve bu suşların doku yeniden şekillenmesini nasıl etkilediğini anlamaya yönelik önemli bilimsel ilgi vardır. Bu ilgiye dayanarak, yükleme sırasında tendon eksplantları içindeki yerel doku suşlarını ölçmek için çeşitli analitik teknikler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bazı durumlarda, bu tekniklerin doğruluğu ve duyarlılığı bildirilmemiştir ve algoritmaların hiçbiri kamuya açık değildir. Bu, tendon eksplantlarında lokal doku suşlarının daha yaygın ölçümünü zorlaştırmıştır. Bu nedenle, bu makalenin amacı, tendon eksplantlarındaki lokal doku suşlarını ölçmek için kolayca bulunabilen ve kullanımı kolay olan doğrulanmış bir analiz aracı oluşturmaktır. Spesifik olarak, halka açık bir artırılmış Lagrangian dijital görüntü korelasyonu (ALDIC) algoritması, tek eksenli gerilim altında fare Aşil tendonları içindeki hücre çekirdeklerinin yer değiştirmelerini izleyerek 2D suşları ölçmek için uyarlanmıştır. Ek olarak, hesaplanan suşların doğruluğu, dijital olarak dönüştürülmüş görüntüleri analiz ederek ve suşları bağımsız bir teknikten (yani, fotobeyazlatılmış çizgiler) belirlenen değerlerle karşılaştırarak doğrulandı. Son olarak, hesaplanan yer değiştirme alanını kullanarak referans görüntüsünü yeniden yapılandırmak için algoritmaya bir teknik dahil edilmiştir; bu, bilinen gerinim değerlerinin veya ikincil bir ölçüm tekniğinin yokluğunda algoritmanın doğruluğunu değerlendirmek için kullanılabilir. Algoritma, 0,00015 hassasiyetle 0,1'e kadar olan gerinimleri ölçebilir. Yeniden yapılandırılmış bir referans görüntüsünü gerçek referans görüntüyle karşılaştırma tekniği, hatalı verilere sahip örnekleri başarıyla tanımladı ve iyi verilere sahip örneklerde, yer değiştirme alanının yaklaşık% 85'inin doğru olduğunu gösterdi. Son olarak, fare Aşil tendonlarında ölçülen suşlar önceki literatürle tutarlıydı. Bu nedenle, bu algoritma tendonlardaki lokal doku suşlarını doğru bir şekilde ölçmek için oldukça kullanışlı ve uyarlanabilir bir araçtır.
Introduction
Tendonlar, mekanik yüklemeye yanıt olarak adapte olan ve dejenere olan mekanosensitif dokulardır 1,2,3,4. Mekanik uyaranların tendon hücresi biyolojisinde oynadığı rol nedeniyle, tendon hücrelerinin yükleme sırasında doğal doku ortamında yaşadığı suşları anlamaya büyük ilgi vardır. Tendonlardaki lokal doku suşlarını ölçmek için çeşitli deneysel ve analitik teknikler geliştirilmiştir. Bunlar arasında benek desenleri veya fotobeyazlatılmış çizgiler (PBL'ler) kullanılarak yüzey suşlarının 2D/3D dijital görüntü korelasyonu (DIC) analizleri 5,6,7,8, doku içindeki bireysel çekirdeklerin merkezcil-sentroid uzaklığındaki değişikliklerin ölçülmesi 9,10 ve düzlem dışı hareketi ve 3D deformasyonları dikkate alan yeni bir tam alan 3D DIC yöntemi 11 . Bununla birlikte, bu tekniklerin doğruluğu ve duyarlılığı sadece birkaç vakada bildirilmiştir ve bu tekniklerin hiçbiri kamuya açık hale getirilmemiştir, bu da bu tekniklerin yaygın olarak benimsenmesini ve kullanılmasını zorlaştırmaktadır.
Bu çalışmanın amacı, tendon eksplantlarındaki lokal doku suşlarını ölçmek için kolayca bulunabilen ve kullanımı kolay olan doğrulanmış bir analiz aracı oluşturmaktı. Seçilen yöntem, Yang ve Bhattacharya12 tarafından geliştirilen MATLAB'da yazılmış, halka açık bir artırılmış Lagrangian dijital görüntü korelasyonu (ALDIC) algoritmasına dayanmaktadır. Bu algoritma, tendon örneklerini analiz etmek için uyarlanmış ve dijital olarak dönüştürülmüş görüntülere uygulanarak ve gerçek tendon örneklerinde ölçülen suşları fotobeyazlatılmış çizgilerden elde edilen sonuçlarla karşılaştırarak doğrulanmıştır. Ayrıca, algoritmada, bilinen gerinim değerleri veya ikincil bir ölçüm tekniği olmasa bile, hesaplanan yer değiştirme alanının doğruluğunu doğrulamak için ek işlevler uygulanmıştır. Bu nedenle, bu algoritma tendonlardaki yerel 2D doku suşlarını doğru bir şekilde ölçmek için oldukça kullanışlı ve uyarlanabilir bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Pennsylvania Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Doku hazırlığı
- Bu protokol için, Aşil tendonlarını 2-4 aylık erkek C57BL / 6 farelerinden toplayın.
NOT: Farelerden veya diğer küçük hayvanlardan farklı tendonlar veya bağlar da kullanılabilir.- Plantaris tendonunu ve çevresindeki bağ dokusunu açığa çıkarmak için Aşil tendonuna yüzeysel olarak cilde bir kesi yapın. Ardından, cerrahi bir bıçak kullanarak bunları çıkarın.
- Açıkta kalan soleus ve gastroknemius kaslarını arka bacaktan ayırın ve cerrahi bıçakla Aşil tendonundan dikkatlice kazıyın.
- Kalkaneusu ayağın geri kalanından döner bir alet üzerinde bir kesme tekerleği bağlantısı ile ayırın.
- Dokuyu, oda sıcaklığında dönen bir karıştırıcı üzerinde 20 dakika boyunca 5-(4,6-diklorotriazizinil) aminofloresein (DTAF) ve 0,1 M sodyum bikarbonat tamponundan oluşan 5 μg / mL'lik bir çözeltinin 1,5 mL'sinde sabitleyin. Bu çözelti dokudaki proteinleri (örneğin, hücre dışı matris) boyar.
NOT: Bu 20 dakikalık süre zarfında, adım 1.3 tamamlanmalıdır. - Çekirdekleri boyamak için fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1:1.000 DRAQ5 çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi homojenize etmek için bir vorteks karıştırıcı kullanın.
- Adım 1.2'deki 20 dakikalık inkübasyon süresinden sonra, dokuyu DTAF çözeltisinden DRAQ5 çözeltisine aktarın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karanlık bir alanda inkübe edin.
2. Tendon yükleme ve görüntü alma
NOT: Bu protokol, konfokal mikroskop üzerine monte edilebilen bir çekme cihazı gerektirir. Bu çalışma için Peterson ve Szczesny13 tarafından tanımlanan mikrotensil cihaz kullanılmıştır.
- Tendonu çekme yükleme cihazının çenelerine yerleştirin. Çeneleri yükleme cihazına monte etmeden önce, kalkaneus bağlantısı ile ters kavrama arasındaki mesafeyi ölçmek için dijital kaliperler kullanın. Bu mesafe tendon ölçer uzunluğudur.
- Alternatif olarak, tendonu yerleştirmeden önce çeneleri yükleme cihazına monte edin ve sıfır deplasmanlı motor konumunu tanımlamak için temas halinde itin. Tendonu yerleştirdikten sonra motorların yer değiştirmesi, potansiyel olarak daha doğru bir kavrama-kavrama göstergesi uzunluğu sağlayabilir.
- Çeneleri, doku hidrasyonunu korumak için PBS içeren yükleme cihazına monte edin. Tendonu, mikroskop görüntülerinin x ekseni veya y ekseni ile mümkün olan en iyi şekilde hizalayın, böylece algoritmanın x-gerinim ve y-gerinim çıkışları tendon eksenlerine karşılık gelir.
NOT: Bu çalışmada tendonlar x ekseni ile hizalanmıştır. Tendonu görüntü eksenleriyle mükemmel bir şekilde hizalamak mümkün değilse, algoritmanın x-gerinim ve y-gerinim çıkışları, standart gerinim dönüşüm denklemleri14 kullanılarak tendonun uzunlamasına / dik eksenleriyle hizalanacak şekilde dönüştürülebilir. - Tendonu 1 g gerginlikle önceden yükleyin ve istenirse, numuneyi ön koşullandırmak için döngüsel yükleme uygulayın. Bu protokolde, çalışmanın amacı, doku materyali özelliklerini ölçmek yerine ölçülen lokal doku suşlarını doğrulamak olduğu için ön koşullandırma kullanılmamıştır. Yükleme geçmişine bağlı olan makro ölçekli malzeme özelliklerinin ölçülmesine ilgi varsa, ön koşullandırma önerilir. Ön koşullandırma ve kurtarmanın ardından, 1 g'lık bir ön yükü yeniden uygulayın.
- İstenirse, dokunun orta bölgesinde 80 μm aralıklarla yerleştirilmiş dört çizgiden oluşan bir dizi fotobleach (daha fazla ayrıntı için Peterson ve Szczesny13'e bakınız).
NOT: Fotobeyazlatılmış çizgiler, ALDIC algoritmasının ölçümlerini doğrulamak için kullanılmıştır ve ALDIC'nin kendisini gerçekleştirmek için gerekli değildir. Çizgilerin sayısı ve aralığı ayarlanabilir ve örneklemde çizginin netliğini azaltacak herhangi bir yapıttan kaçınmak için çizgilerin konumu seçilmelidir. - Fotobeyazlatma prosedürünü, çenelerin yakınındaki dokunun sol ve sağ uçlarında tekrarlayın.
- Konfokal mikroskobu kullanarak, DTAF ve DRAQ5 floresansının hacimsel görüntülerini (x,y: 1,25 μm/piksel, z:2,5 μm/piksel) 1 g ön yükte elde edin.
- %0,5/sn ila %2 gerinimde bir gerinim rampası gerçekleştirin. Gerinim hızının ve artımlı gerinim büyüklüğünün ayarlanabileceğini unutmayın.
- Dokunun strese girmesine izin verin 10 dakika boyunca gevşeyin.
NOT: Gerilim gevşeme süresi, görüntü yakalama sırasında numune yaklaşık yarı statik bir yük altında olacak şekilde seçilmelidir. Stres gevşeme süresinin kabul edilebilir olup olmadığını belirlemek için, stres gevşemesinin son dakikasında kuvvet-zaman eğrisinin eğimini belirleyin (Ek Şekil 1) ve bu eğimi toplam görüntüleme süresi ile çarpın. Bu çalışmada, en büyük gerinim artışında uygulanan kuvvet hiçbir zaman% 5'ten fazla değişmedi. - Deformasyondan sonra dokunun başka bir hacimsel görüntüsünü alın.
- İstenen son gerinime ulaşılana kadar 2.7-2.9 arasındaki adımları yineleyin. Bu yazıda %12 nihai gerinim değeri seçilmiştir.
3. Görüntü işleme
- DRAQ5 (nükleer) kanalının her hacimsel görüntüsünün maksimum z projeksiyonlarını oluşturmak için ImageJ veya Fiji'yi kullanın. Bu, ALDIC için 2D benekli görüntüler olarak hizmet edecektir.
- Maksimum yoğunluktaki z projeksiyonlarını .tiff dosyaları olarak kaydedin ve bunları aşağıdaki adlandırma kuralına göre adlandırın.
- Görüntü adının ilk karakteri olarak bir sayı kullanın.
- Sayının, gerinim analizi sırasında görüntülerin dikkate alınacağı sıraya karşılık gelmesini sağlayın. Örneğin, ilk görüntü bir, ikinci görüntü iki ile başlamalıdır. Farklı sayılar seçilebilir, ancak sırayla artmaları gerekir. Örnek bir adlandırma kuralı aşağıdaki gibidir: "0_Experiment1_MaxZProjection".
- Yeniden adlandırılan tüm maksimum yoğunluklu z projeksiyonlarını bir klasöre kaydedin.
4. Fotobeyazlatılmış hat analiz kodu kurulumu ve uygulaması
NOT: Bu adımlar yalnızca fotobeyazlatılmış çizgiler kullanarak ALDIC algoritmasının doğruluğunu onaylamak isteniyorsa gereklidir. Kod, yerel doku suşunu, fotobeyazlatılmış çizgi kümesi içindeki her fotobeyazlatılmış çizgi arasındaki mesafedeki ortalama normalleştirilmiş değişim olarak hesaplar. Bu çalışmada, ortalama lokal değerlerin ortalaması daha sonra her örnek için tek bir ortalama lokal doku suşu değeri belirlemek için tüm fotobeyazlatılmış çizgi setlerinde (yani merkez ve sol / sağ uçlarda) ortalamaya alınmıştır. Bu değer daha sonra ALDIC algoritmasının doğruluğunu tahmin etmek için kullanıldı.
- GitHub'dan "PBL Kodu" klasörünü indirin (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) ve tüm içeriği MATLAB'daki çalışma dizinine taşıyın.
- "Micro_Mech_Template" MATLAB komut dosyasını açın.
- Çalıştır'a basın ve hacimsel görüntüleri içeren görüntü dosyalarından birini seçin. Hacimsel görüntüler aşağıdaki dosya türlerinden herhangi biri olabilir: .lsm, .tiff, .nd2.
- Yazılım, klasördeki tüm görüntüleri otomatik olarak yükleyecek ve referans hacimsel görüntünün yansıtılan bir görüntüsünü görüntüleyecektir. İstendiğinde, örneğin sol ve sağ uçlarını izleyen çok noktalı çizgiler oluşturmak için sol tıklayın . Bir satırı sonlandırmak için sağ tıklayın . Giriş işlendikten sonra, kenarlar doğruysa, sonucu kabul etmek için Tamam düğmesine basın.
- İstendiğinde referans çizgisi olarak örnek boyunca rastgele bir çapraz çizgi çizin.
- Oluşturulan fotobeyazlatılmış çizgilerin sayısını girin ve fotobeyazlatılmış çizgileri çok noktalı çizgilerle izleyin.
- Sonuç kabul edilebilirse, kabul edin. Sonuç hatalıysa, ayarlayın ve yeniden işleyin.
- Tüm görüntüler için adım 4.2'yi yineleyin ve izlenen çizgilerin tüm görüntülerini tek bir klasöre taşıyın.
- "Micro_Mech_Strain" komut dosyasını açın.
- Kodu yürütmek için Çalıştır'a basın ve fotobeyazlatılmış çizgilerin izlendiği kaydedilmiş görüntülerden birini seçin.
- Görüntü seçildikten sonra Tamam tuşuna basarak seçilen eşlik eden görüntülerin doğru olduğunu onaylayın.
5. Dijital olarak dönüştürülmüş görüntüler oluşturma
NOT: Bu adımlar yalnızca dijital olarak dönüştürülmüş görüntüler kullanarak ALDIC algoritmasının doğruluğunu onaylamak isteniyorsa gereklidir. Bu görüntüler, referans görüntüyü yapay olarak dönüştürerek bilinen büyüklükte homojen 2B gerinim alanlarını simüle eder.
- GitHub'dan (Digital_strain) "https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc.m" kodunu indirin.
- Kodu açın ve çalıştırın.
- İstendiğinde, uygulanan maksimum gerinim, uygulanan gerinim artışı ve Poisson oranı için istenen değerleri girin. Tamam'a basın.
NOT: Bu deney için, uygulanan maksimum gerinim 0.1 (% 10), uygulanan gerinim artışı 0.02 (% 2) idi ve tendon çekme testi15,16'nın deneysel verileriyle tutarlı olan 1 Poisson oranı kullanıldı. Kod, dijital olarak dönüştürülmüş görüntüleri oluşturmak için gömülü MATLAB işlev çarpıtma işaretini ve giriş değerlerini (örneğin, gerinim artışları, Poisson oranı) kullanır. - İstendiğinde, deforme olmamış referans görüntüsünü seçin.
- Her gerinim artışı için, referans görüntünün ve dönüştürülen görüntünün bir bindirmesi görüntülenir. Dönüştürülen görüntü, X'in gerinim artışı olduğu "DigitallyTransformedX%Strain" başlığı altındaki dizine kaydedilir.
6. Gerinim hesaplama ve doğrulama kodu yükleme ve uygulama
- GitHub'dan "Gerinim Hesaplama ve Doğrulama Kodu" klasörünü indirin (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) ve tüm içeriği MATLAB çalışma dizinine taşıyın
- Yang ve Bhattacharya12'ye göre bir mex C/C++ derleyicisi kurun. Adımlar aşağıda özetlenmiştir.
- MATLAB Komut Penceresi'ne "mex -setup" yazıp Enter tuşuna basarak bir mex C/C++ derleyicisinin yüklü olup olmadığını görmek için MATLAB'ı denetleyin.
- Derleyicinin desteklenmediğini veya mevcut olmadığını belirten bir hata görüntülenirse, adım 6.3 ve adım 6.4'e geçin.
- Hata yoksa, adım 6.5'e geçin
- Bir mex C/C++ derleyicisi indirmek için "https:/tdm-gcc.tdragon.net/" adresine gidin ve TDM-gcc derleyicisini seçin.
- İndirilen derleyiciyi bilinen bir konuma yükleyin.
- MATLAB komut penceresine dönün ve şunu yazın: " setenv("MW_MINGW64_LOC","[Yükleme yolunuzu buraya yazın]")". Örneğin, bu "setenv("MW_MINGW64_LOC","C:\TDM-GCC-64")" olabilir. Bu komut başarıyla yürütülürse, mex derleyicisi düzgün yüklenir.
- "main_aldic.m" işlev komut dosyasını girin ve adım 6.5'te yürütülen komutla eşleşmesi için satır 22'yi değiştirin.
- "Strain_calc_and_validate" komut dosyasını açın.
- Görüntü analizini başlatmak için Çalıştır'a basın.
- İstendiğinde, ALDIC parametrelerinin değerlerini istediğiniz gibi değiştirin.
NOT: Pencere boyutu, alt küme boyutunun 0,25 ila 1 katı olmalıdır. Parametre seçenekleri hakkında daha fazla bilgi için, çevrimiçi kullanım kılavuzuna bakın: (https://www.researchgate.net/publication/344796296_Augmented_Lagrangian_Digital
_Image_Correlation_AL-DIC_Code_Manual).- Bu çalışmada aşağıdaki değerler kullanılmıştır:
Alt Küme Boyutu (piksel): 20
Pencere Boyutu (piksel): 10
ALDIC çözme yöntemi: Sonlu Fark (1)
Paralel hesaplama kullanılmadı (1)
İlk tahmini hesaplama yöntemi: Görüntü piramidine dayalı çoklu ızgara araması (0)
- Bu çalışmada aşağıdaki değerler kullanılmıştır:
- İstendiğinde, algoritmanın istenen değişken koleksiyonu (ör. x-gerinimi, y-gerinimi, kesme gerinimi, bozuk bölgeler vb.) için ortalama değeri, standart sapmayı ve 2B haritaları otomatik olarak kaydetmesini sağlamak üzere "Evet" onay kutusunu seçin. Hangi değişkenlerin kaydedileceğini seçin ve Tamam'a basın.
- İstendiğinde, parametreleri istediğiniz gibi değiştirin.
- Bu deneyde aşağıdaki değerler kullanılmıştır:
Gerinimi hesaplamak için çevre noktalar (numP): 12
Kötü bölge tanımlaması için korelasyon katsayısı (corr_threshold): 0.5
Hatalı bölge analizi için alt bölge boyutu (piksel) (Alt boyut): 32
- Bu deneyde aşağıdaki değerler kullanılmıştır:
- İstendiğinde, yeniden adlandırılan max-intensity z-projeksiyonlarını içeren klasörü seçin. Yazılımın, deforme olmuş görüntülerin gerinim alanlarını belirlemek için otomatik olarak artımlı ALDIC gerçekleştirdiğini unutmayın. Yani, her deforme olmuş görüntü, bir sonraki deforme olmuş görüntü için yeni "referans" görüntüsü olarak hizmet eder. Bu, sonuçların doğruluğunu artırır (Ek Şekil 2), her deforme olmuş görüntünün orijinal (% 0 gerinim) referans görüntüsüyle karşılaştırıldığı kümülatif ALDIC performansına kıyasla. Kümülatif bir analiz gerçekleştirmek için görüntüleri yükleyin, ancak yalnızca orijinal referans görüntüsünü ve ilgilendiğiniz deforme olmuş görüntüyü seçin.
NOT: Normal suş λ - 1 olarak hesaplanır, burada λ doku gerilmesidir. Doku gerilmesi, sırasıyla x-yönü ve y-yönü için N = [1 0]T veya [0 1]T ve C = F T F'ye
göre hesaplanır; burada F, ALDIC algoritması tarafından her veri noktası çıktısını çevreleyen "numP" noktaları kullanılarak hesaplanan deformasyon gradyanıdır. Kesme gerinimi , burada 
olarak hesaplanır
. - İstendiğinde, suşların ölçülmesi için ilgilenilen bölgeyi tanımlamak üzere dört noktalı bir çokgen oluşturmak için sol tıklayın. Sol üst köşedeki noktayla başlayın ve sonraki noktaları saat yönünde atayın.
NOT: MATLAB çalışma alanına kaydedilen "Depolama" değişkeni, ortalama x-gerinimi, x-gerinimi standart sapması, ortalama y-gerinimi, y-gerinimi standart sapması, ortalama kesme gerinimi, kesme gerinimi standart sapması ve kötü bölgelerin yüzdesi için tüm değerleri içerir. Kötü bölgeler, adım 6.13'te seçilen ilgi bölgesi içindeki korelasyon katsayısı analizine göre tanımlanır. "NuclearTrackingResults" klasörü (555 ve 556 satırları ayarlanarak yeniden adlandırılabilir) adım 6.10'da belirtilen tüm grafikleri depolar. Bu klasör ayrıca, adım 6.10'da belirtilen tüm araçları ve standart sapmaları depolayan "Sonuçlar" adlı bir elektronik tablo dosyası içerir.
göre hesaplanır; burada F, ALDIC algoritması tarafından her veri noktası çıktısını çevreleyen "numP" noktaları kullanılarak hesaplanan deformasyon gradyanıdır. Kesme gerinimi , burada 
olarak hesaplanır
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gerçek doku örneklerinde gerinim alanlarını analiz etmeden önce, ALDIC protokolü ilk olarak fare Aşil tendonları içindeki çekirdeklerin dijital olarak gerilmiş / dönüştürülmüş görüntüleri kullanılarak doğrulandı. Spesifik olarak, görüntüler dijital olarak %2, %4, %6, %8 ve %10 gerinim x yönünde homojen gerinimler üretmek üzere dönüştürüldü ve simüle edilmiş Poisson oranı 115,16 idi. ALDIC algoritmasının doğruluğu daha sonra ortalama hesaplanan gerinim değerleri bilinen dijital suşlarla karşılaştırılarak değerlendirildi. Ek olarak, gerinim alanlarının heterojenliğini belirlemek için gerinim değerlerinin standart sapması değerlendirildi. ALDIC tarafından hesaplanan gerinimler (artımlı analiz kullanılarak) ile dijital olarak dönüştürülmüş görüntülere uygulanan gerçek gerinimler arasındaki fark Şekil 1'de gösterilmiştir. ALDIC yazılımı tarafından hesaplanan x-yönündeki ortalama gerinim, uygulanan gerçek gerinimin sürekli olarak hafife alınmasıydı (Şekil 1A) ve hatanın büyüklüğü daha büyük uygulanan gerinim ile arttı. Bununla birlikte, tüm gerinim artışları için büyüklük her zaman 0,00015'ten azdı. Y yönündeki gerinimin de hafif bir hafife alınması söz konusudur (Şekil 1C). X-suşu ve y-suşu için hesaplanan suşların tam ilgi bölgesi içindeki standart sapması da daha büyük uygulanan suşlarla artmıştır, ancak büyüklük de çok küçüktü (<0.002) (Şekil 1B, D). Bu hatalar, kümülatif analiz kullanıldığında önemli ölçüde daha büyüktü (Ek Şekil 2).
Şekil 1: Dijital olarak gerilmiş görüntülerle algoritma karşılaştırması ve doğrulama . (A) X yönünde ölçülen ALDIC gerinim verileri, dijital dönüşümler tarafından öngörülen gerçek gerinimden sürekli olarak daha düşüktü ve hata, daha büyük uygulanan gerinimle kademeli olarak arttı. (B) Gerinim değerlerinin x yönündeki standart sapması da daha fazla uygulanan dijital gerinimlerle artmıştır. (C) Y yönünde ölçülen ALDIC gerinim verileri, dijital dönüşümler tarafından öngörülen gerçek gerinimden tutarlı bir şekilde daha düşüktü. (D) Gerinim değerlerinin y yönündeki standart sapması, daha fazla uygulanan gerinim ile artmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Gerçek doku örnekleri üzerinde gerinim analizi yaparken, ALDIC algoritmasının doğruluğunu doğrudan değerlendirmek mümkün değildir. Yine de, yer değiştirme alanının doğruluğunu tahmin etmek için bir teknik geliştirilmiştir. Özellikle, deforme olmuş görüntü, hesaplanan yer değiştirme alanına dayalı olarak referans görüntünün bir tahminine geri döndürüldü. Daha sonra, çarpıtılmış/yeniden yapılandırılmış referans görüntüsünün gerçek referans görüntüyle ne kadar iyi eşleştiğini belirlemek için normalleştirilmiş bir çapraz korelasyon katsayısı kullanılmıştır. Normalleştirilmiş çapraz korelasyon değerinin 0,5'ten küçük olduğu tüm alt bölgeler (32 piksel x 32 piksel), yer değiştirme alanının muhtemelen yanlış olduğu "kötü bölge" olarak kabul edildi. Bu analiz, artımlı ve kümülatif analiz tekniklerinin performansı arasında anlamlı bir fark olduğunu tespit etmiştir. Spesifik olarak, kötü bölgelerin sayısı, uygulanan %6'lık gerinimden sonra kümülatif yöntemle artmaya başlamış (Şekil 2A), oysa artımlı analiz için dijital olarak dönüştürülmüş bölgelerin herhangi birinde çok az sayıda (%1) kötü bölge gözlenmiştir. Bu doğruluk değerlendirme tekniği test edilen dört fare Aşil tendonuna uygulanırken (Ek Şekil 3), üç örnek için ortalama kötü bölge sayısının görüntünün% 25'inden az olduğu belirlenmiştir. Bununla birlikte, dört örnekten birinde (Deney 2), görüntünün neredeyse yarısı maksimum gerinim artışında kötü olarak tanımlanmıştır (Şekil 2B). Deney 2'de bulunan kötü bölgelerin sayısı, diğer üç numunenin ortalamasından dörtten fazla standart sapma ile değişmiştir. Bu, Deney 2'deki ALDIC verilerinin bir aykırı değeri temsil ettiğinin belirlenmesini sağladı ve bu nedenle, bu veriler, sonuçların daha ileri analizinden çıkarıldı.
Şekil 2: Kötü bölge analizi ile geçersiz gerinim hesaplamalarına sahip alanların başarılı bir şekilde tanımlanması. (A) Kümülatif yöntem kullanılarak analiz edilen dijital olarak dönüştürülmüş görüntülerdeki kötü bölgelerin miktarı, uygulanan gerinimin ardından% 6 oranında tutarlı bir şekilde artarken, artımlı miktar% 1'de kalmıştır. (B) Tüm tendon örnekleri için kötü bölgelerin miktarı, daha büyük gerinim artışlarında istikrarlı bir şekilde artmıştır. Deney 2 bir aykırı değer olarak kabul edildi ve bu nedenle ortalama ve standart sapma çubuklarına dahil edilmedi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek olarak, test edilen fare Aşil tendonlarındaki yerel çekme gerinimleri, ALDIC algoritmasının doğruluğunu belirlemek için ikinci bir yöntem olarak fotobeyazlatılmış çizgiler (PBL'ler) kullanılarak ölçülmüştür. ALDIC tarafından hesaplanan x-yönlü suşlar, PBL'lerden belirlenenlerden daha büyük olma eğilimindeydi, ancak fark genellikle 0.005 suş içerisindeydi (Şekil 3A). Bu hata büyüklüğü, belirli bir örneklemdeki farklı PBL'lerde gözlenen standart sapmaya benzerdi (Şekil 3B).
Şekil 3: ALDIC gerinim hesaplamalarının fotobeyazlatılmış çizgi verileriyle karşılaştırılarak doğrulanması. (A) ALDIC gerinim değerleri ile PBL gerinim değerleri arasındaki fark, 0,005 değeri civarında, tüm gerinim artışları için nispeten sabit kalmıştır. (B) PBL verilerinin tüm numunelerde ortalaması alınan standart sapma yaklaşık 0,005'te nispeten sabit kalmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
ALDIC algoritmasının doğruluğu değerlendirildikten sonra, gerilme yükü altında fare Aşil tendonlarındaki yerel suşların büyüklükleri ve uzamsal dağılımları belirlenmiştir (Şekil 4, Şekil 5 ve Şekil 6). Suşların, her numunedeki "bozuk bölgelerden" yer değiştirme verilerini içermediğini unutmayın. X-yönlü gerilme suşları her üç örnekte de tutarlıydı ve uygulanan doku suşlarından önemli ölçüde daha düşüktü (Şekil 4A). Ek olarak, 2B görüntüdeki standart sapmanın her zaman ortalama gerinim değerinden daha büyük olduğu göz önüne alındığında, x-yönü gerinimi nispeten heterojendi. Buna karşılık, y-yönlü suşlar için üç örnek arasında anlamlı tutarsızlık vardı; bir örnek pozitif ortalama değerler sergiledi, bir örnek negatif ortalama değerler sergiledi ve bir örnek y yönünde sıfır gerinim sergiledi (Şekil 4B). Ek olarak, belirli bir numune içindeki y yönü suşlarının standart sapması, x yönlü suşların standart sapmasından daha büyüktü. Son olarak, kesme gerinimi tüm gerinim artışlarında nispeten düşüktü (Şekil 4C).
Şekil 4: Fare Aşil tendonlarının mikro ölçekli suşları . (A) X yönündeki ortalama gerinim, uygulanan doku suşunun altında kaldı, ancak her gerinim artışıyla arttı. (B) Y yönündeki ortalama gerinim, tüm artışlar için yaklaşık sıfırdı, ancak standart sapma yüksekti. (C) Ortalama kesme gerinimi, gerinim artışları boyunca istikrarlı bir şekilde artmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: X-suşlarının, y-suşlarının ve kesme suşlarının uzamsal dağılımı. İlgilenilen tendon bölgesi boyunca (A) x-suşlarının, (B) y-suşlarının ve (C) kesme suşlarının temsili haritaları Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Maksimum anapara, minimum asıl ve maksimum kesme gerinimlerinin uzamsal dağılımları. İlgilenilen tendon bölgesi boyunca (A) maksimum ana suşların, (B) minimum ana suşların ve (C) maksimum kesme suşlarının temsili haritaları. Beyaz çizgiler maksimum ve minimum ana gerilimlerin yönlerini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Görüntüleme sırasında yarıstatik durumun tanımlanması. Stres gevşeme periyodunun son dakikasındaki kuvvet-zaman eğrisinin eğimi (kırmızı çizgi), görüntüleme sırasında kuvvetteki genel değişimi yaklaşık olarak tahmin etmek için kullanılabilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Artımlı ve kümülatif analiz tekniklerinin karşılaştırılması. (A) Dijital olarak dönüştürülmüş görüntülerde ölçülen ve gerçek x-yönü gerinimleri arasındaki fark, kümülatif yöntemle% 4 gerinimin üzerindeki artımlı yöntemle karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha büyüktü. (B) X-gerinim değerlerinin standart sapması da, kümülatif yöntemle% 4 gerinimin üzerinde anlamlı derecede daha büyüktü. (C) Dijital olarak dönüştürülmüş görüntülerde ölçülen ve gerçek y-suşları arasındaki fark, kümülatif yöntemle% 8 gerinimin üzerinde önemli ölçüde daha büyüktü. (D) Y-gerinim değerlerinin standart sapması, kümülatif yöntemle% 4 gerinimin üzerinde anlamlı derecede daha büyüktü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 3: Her deney için kötü bölge görselleştirme ve niceleme. Kötü bölgeler, yeniden yapılandırılmış referans görüntüde, gerçek referans görüntünün aynı bölgesiyle eşleşmeyen (0,5 korelasyon katsayısının altında) yerel alanlar olarak tanımlanmıştır. İlgilenilen bir bölgede tanımlanan her kötü bölge (beyaz renkle özetlenmiş) mavi bir kutuyla işaretlenir. İlgilenilen bölgedeki kötü bölgelerin yüzdesi, her resmin üzerinde parantez içinde gösterilir. Bu görüntülerin, %12 uygulanan gerinimde deforme olmuş görüntüden yeniden oluşturulduğunu unutmayın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalenin amacı, çekme yükü altındaki tendonlardaki 2D gerinim alanlarını ölçmek için açık kaynaklı, doğrulanmış bir yöntem sunmaktı. Yazılımın temeli, halka açık bir ALDIC algoritması12'ye dayanıyordu. Bu algoritma, artımlı (kümülatife karşı) gerinim analizinin ek işlevselliği ile daha büyük bir MATLAB koduna gömülmüştür. Bu uyarlanmış algoritma daha sonra tendonların çekme testine uygulandı ve doğruluğu iki farklı teknikle değerlendirildi (yani, dijital olarak dönüştürülmüş görüntüler ve fotobeyazlatılmış çizgiler kullanılarak gerinim ölçümü). Ek olarak, gerçek gerinim değerleri hakkında bilgi gerektirmeden herhangi bir numunedeki ALDIC ölçümlerinin doğruluğunu değerlendirmek için bir yetenek eklenmiştir.
Dijital olarak dönüştürülmüş görüntülerin analizi, algoritmanın çok az hatayla% 10'a kadar olan suşları doğru bir şekilde ölçebildiğini gösterdi; bu, tendon örneklerindeki suşların düşük büyüklükleri nedeniyle gerçek fare Aşil tendonlarının çekme testinden değerlendirilemedi. Bununla birlikte, ALDIC tarafından fare Aşil tendonlarında hesaplanan suşların fotobeyazlatılmış çizgiler kullanılarak ölçülen suşlarla karşılaştırılması, ALDIC tekniğinin hatasının fotobeyazlatılmış çizgilerin kendilerinin ölçüm varyasyonu içinde olduğunu göstermiştir. Son doğrulama olarak, ALDIC algoritması tarafından hesaplanan tam 2B yer değiştirme alanlarının doğruluğu, referans görüntünün deforme olmuş görüntüden yeniden yapılandırılması ve yeniden yapılandırmanın gerçek referans görüntüyle karşılaştırılmasıyla değerlendirilmiştir. Dijital olarak dönüştürülmüş görüntülerde, özellikle kümülatif ALDIC analizi için daha fazla uygulanan gerinimlerle kötü bölgelerin sayısında ve gerinim hatasında bir artış olmuştur (Şekil 2 ve Ek Şekil 2). Artımlı teknik, görüntü çiftleri arasındaki yer değiştirme farklılıklarını en aza indirmek için referans görüntüyü her ara görüntüyle yeniden tanımladığı için bu bekleniyordu. Tendon dokusunun yapısı ve yüklenmesi homojen olmadığından (dijital olarak dönüştürülmüş görüntülerin aksine) gerçek tendon örneklerinde kötü bölgelerin sayısı daha da yüksekti. Yine de, ortalama olarak, yeniden oluşturulan görüntünün sadece% 15'i gerçek referans görüntüyle eşleşmedi. Bununla birlikte, bir örneklemde (Deney 2) çok sayıda hatalı bölge (~% 45) vardı. Bu numunenin neden düzgün işlenemediği belirsiz olsa da, yeniden yapılandırılmış referans görüntüsünün bu analizi, bu numuneden elde edilen verilerin güvenilir olmadığının tanınmasını sağladığı için değerliydi. Toplamda, bu deneyler, bu açık kaynaklı algoritmanın, tendon eksplantlarındaki doku suşlarını doğru bir şekilde ölçmek için güvenle kullanılabileceğini göstermektedir.
Bu deneyler ayrıca fare Aşil tendonlarının mekanik davranışı hakkında değerli bilgiler sağlamıştır. Spesifik olarak,% 12'lik uygulanan bir doku suşunda, doku örneği içindeki ortalama uzunlamasına (x yönünde) suş sadece% 2 idi. Bu gerinim zayıflamasının bir kısmı, makro ölçekli doku suşlarının, muhtemelen miyotendinöz kavşağın kavrama arayüzünde önemli gerinim konsantrasyonları içeren, dokunun kavrama-kavrama uzunluğundaki değişikliklerden hesaplanmasından kaynaklanıyordu. Yine de, bu,tendonlardaki 10,17,18 mikro ölçekli suşların diğer çalışmalarıyla tutarlıdır. Ayrıca,% 12'lik suş yaklaşık 5 MPa yüklemeye karşılık geldi ve bu da muhtemelen in vivo19'daki maksimum fizyolojik yüklerle karşılaştırılabilir. Bu, fare Aşil tendonlarındaki hücrelerin% 2'nin üzerinde gerilme suşları yaşamadığını göstermektedir. Enine (y-yönü) suşu, hem pozitif hem de negatif değerlerle numuneler arasında daha değişkendi. Bu, tendon örneklerinin pozitif ve negatif Poisson oranları sergilediğini ve bunun Aşil tendonları20'nin önceki testleriyle tutarlı olduğunu göstermektedir. Tek eksenli gerilim için beklendiği gibi, kesme geriniminin büyüklüğü genellikle düşüktü (ortalama <4 °). Bununla birlikte, tüm gerilme ve kesme suşları için, ilgili bölgedeki standart sapma her zaman ortalama gerinim değerinden daha büyüktü ve bu da büyük derecede gerinim heterojenliği olduğunu gösterdi. Ayrıca, bu heterojenlik, muhtemelen doku yapısının heterojenliğinin yanı sıra daha büyük yer değiştirmeler ve yer değiştirme alanlarından kaynaklanan ALDIC hesaplamalarındaki artan hata nedeniyle daha büyük uygulanan suşlarla artmıştır. Bu, bireysel tendon hücrelerinin yaşadığı suşların doku içinde oldukça değişken olduğunu göstermektedir.
ALDIC algoritmasının başarılı bir şekilde doğrulanmasına rağmen, tendon eksplantları içindeki suşları analiz etmek için kullanımında bazı sınırlamalar vardır. Birincil sınırlama, algoritmanın yalnızca bir 3B nesnenin 2B analizini gerçekleştirebilmesidir. Daha titiz bir yaklaşım, tendonların dijital olarak dönüştürülmüş görüntüleri üzerinde gerçekleştirilen tam bir dijital hacim korelasyonu (DVC)yapmak olacaktır 11. Bununla birlikte, bunun gerçek tendon örnekleri üzerinde gerçekleştirilmesi genellikle zordur, çünkü görüntüler sadece 100 μm derinliğe kadar çözülebilir çekirdekler içerir. Bu, numunelerin iç hacminin hacimsel görüntülerde dokuya sahip olmadığı anlamına gelir ve DVC'yi güvenilmez hale getirir. Bu nedenle, bu çalışmadaki görüntüler, tüm çekirdekleri yapay olarak tek bir görüntü düzlemine zorlayan 2D maksimum projeksiyonlara daraltıldı. Bu, gerinim analizinde bazı hatalara neden olabilir ve düzlem dışı yer değiştirmelerin ölçülmesini önleyebilirken, doğrulama sonuçları tekniğin hala doğru olduğunu göstermektedir. Ek bir sınırlama, suşların bir stres gevşeme periyodunun sonunda hesaplanması ve dinamik döngüsel yükleme sırasında hesaplanamamasıdır. Gerinim analizi için kullanılan hacimsel görüntüleri elde etmek için sınırlı bir görüntüleme süresi olduğundan bu sorun kaçınılmazdı. Bu sınırlamalara rağmen, dört tendon örneğinden üçünün doğru gerinim verileri ürettiği göz önüne alındığında, analizin başarısı nispeten sağlamdı. Bu nedenle, bu algoritma tendon eksplantlarındaki gerinim alanlarını ölçmek isteyen araştırmacılar için yararlı bir araç olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21 AR079095) ve Ulusal Bilim Vakfı (2142627) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-DTAF (5-(4,6-Dichlorotriazinyl) Aminofluorescein), single isomer | ThermoFisher | D16 | |
| Calipers | Mitutoyo | 500-196-30 | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R HD | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Coning | 6775 | |
| DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) | ThermoFisher | 62554 | |
| MATLAB | MathWorks | R2022b | |
| Tensile Loading Device | N/A | N/A | Tensile loading device described in Peterson et al, 2020. (ref 13) |
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher | 88881001 |
References
- Devkota, A. C. Distributing a fixed amount of cyclic loading to tendon explants over longer periods induces greater cellular and mechanical responses. Journal of Orthopaedic Research. 11 (4), 1609-1612 (2007).
- Sun, H. B., et al. Cycle-dependent matrix remodeling gene expression response in fatigue-loaded rat patellar tendons. Journal of Orthopaedic Research. 28 (10), 1380-1386 (2010).
- Shepherd, J. H., Screen, H. R. C.
- Paschall, L., Pedaprolu, K., Carrozzi, S., Dhawan, A., Szczesny, S. Mechanical stimulation as both the cause and the cure of tendon and ligament injuries. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , Springer. Cham, Switzerland. 359-386 (2022).
- Andarawis-Puri, N., Ricchetti, E. T., Soslowsky, L. J. Rotator cuff tendon strain correlates with tear propagation. Journal of Biomechanics. 42 (2), 158-163 (2009).
- Cheng, V. W. T., Screen, H. R. C.
- Luyckx, T., et al. Digital image correlation as a tool for three-dimensional strain analysis in human tendon tissue. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 7 (2014).
- Duncan, N. A., Bruehlmann, S. B., Hunter, C. J., Shao, X., Kelly, E. J. In situ cell-matrix mechanics in tendon fascicles and seeded collagen gels: Implications for the multiscale design of biomaterials. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering. 17 (1), 39-47 (2014).
- Arnoczky, S. P., Lavagnino, M., Whallon, J. H., Hoonjan, A. In situ cell nucleus deformation in tendons under tensile load; A morphological analysis using confocal laser microscopy. Journal of Orthopaedic Research. 20 (1), 29-35 (2002).
- Screen, H. R. C., Bader, D. L., Lee, D. A., Shelton, J. C.
- Fung, A. K., Paredes, J. J., Andarawis-Puri, N. Novel image analysis methods for quantification of in situ 3-D tendon cell and matrix strain. Journal of Biomechanics. 67, 184-189 (2018).
- Yang, J., Bhattacharya, K. Augmented Lagrangian digital image correlation. Experimental Mechanics. 59 (2), 187-205 (2019).
- Peterson, B. E., Szczesny, S. E. Dependence of tendon multiscale mechanics on sample gauge length is consistent with discontinuous collagen fibrils. Acta Biomaterialia. 117, 302-309 (2020).
- Humphrey, J. D., O'Rourke, S. L. An Introduction to Biomechanics. , Springer. New York, NY. (2015).
- Reese, S. P., Weiss, J. A. Tendon fascicles exhibit a linear correlation between Poisson's ratio and force during uniaxial stress relaxation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (3), 34501 (2013).
- Ahmadzadeh, H., Freedman, B. R., Connizzo, B. K., Soslowsky, L. J., Shenoy, V. B. Micromechanical poroelastic finite element and shear-lag models of tendon predict large strain dependent Poisson's ratios and fluid expulsion under tensile loading. Acta Biomaterialia. 22, 83-91 (2015).
- Szczesny, S. E., Elliott, D. M. Interfibrillar shear stress is the loading mechanism of collagen fibrils in tendon. Acta Biomaterialia. 10 (6), 2582-2590 (2014).
- Han, W. M., et al. Macro- to microscale strain transfer in fibrous tissues is heterogeneous and tissue-specific. Biophysical Journal. 105 (3), 807-817 (2013).
- Pedaprolu, K., Szczesny, S. E. A novel, open-source, low-cost bioreactor for load-controlled cyclic loading of tendon explants. Journal of Biomechanical Engineering. 144 (8), 084505 (2022).
- Gatt, R., et al. Negative Poisson's ratios in tendons: An unexpected mechanical response. Acta Biomaterialia. 24, 201-208 (2015).
