Summary
在这里，我们提出了一种基于多重光散射技术的质量评估方法来评估 Indigo Naturalis 的质量。
Abstract
中药材质量控制是中药材研发的重要组成部分。面对中草药现代化、国际化的挑战，迫切需要建立全面有效的中药材质量鉴定程序，迫切需要高效、准确、环保的新型分析和检测技术。
多重光散射是一种尖端的分析方法，可以在不改变样品的性质或状态或使用有机试剂的情况下准确、快速地评估中草药的质量。Indigo Naturalis 被认为是治疗小儿体温过高、牛皮癣、白血病和溃疡性结肠炎的良好药物。在这项研究中，使用多重光散射仪精确记录了在水中添加 Indigo Naturalis 粉末的过程。
通过仪器的定性和定量测量，可以准确捕捉天然靛蓝粉体入水的整体轨迹和下沉行为，建立以样品透射和后向散射光谱图为定性指标，稳定性指标为定量指标的天然靛蓝品质快速评价方法。基于多重光散射的分析技术，为天然靛蓝的质量评价提供了一种快速、准确、绿色、环保的方法，支撑着高品质靛蓝天然靛蓝的开发和转化。
Introduction
在中医药中，在疾病治疗过程中，药物的临床有效性和治疗过程的安全性直接受到中草药质量的影响。利用尖端的识别技术，可以评估中草药的疗效并保证使用者的安全。中草药水质检测法是指将中药浸入水或溶剂中，然后通过观察颜色、大小和形状的变化，快速准确地确定药物的真实性1.
本来是鉴定中药的好选择。然而，传统水质检验方法的缺点是，由于肉眼观察的主观性，鉴别中药真伪的准确性和灵敏度较低2。水测试方法中使用的关键药材之一是 Indigo Naturalis，被认为是治疗小儿体温过高、牛皮癣、白血病和溃疡性结肠炎的有效药物3.正宗的Indigo Naturalis漂浮在水面上，摇晃后水不会变成深蓝色。然而，假的 Indigo Naturalis 有下沉的颗粒，摇晃后水会变成深蓝色4.其原理是由于疏水且易于漂浮的靛蓝、靛蓝和优质天然靛蓝的其他有机成分。相反，由于有机物含量低、石灰含量大、质地较重，一些掺有假靛蓝天然靛蓝的颗粒会很快下沉5.然而，这种方法只是简单的定性鉴定，限制了中草药真伪的快速鉴定，无法揭示靛蓝在水中的变化。
多重光散射技术是一种基于激光穿过样品来测量多角度光信号扫描的技术。入射光在穿透样品或遇到颗粒时会被散射。如果散射光穿透样品，则形成透射光信号;如果样品浓度高，光会被颗粒反射，形成反向散射光信号。光强的变化反映了液体制备中颗粒浓度和粒径的变化6.多重光散射仪可通过多重光散射技术快速准确地分析悬浮液、乳液、泡沫液的乳化、絮凝、析出、破裂等现象，并定量分析上述现象的发生率等特征。
多重光散射技术在颗粒稳定性监测7、红酒澄清8 和牛奶发酵质量控制9 方面显示出显著优势。使用这项技术，Indigo Naturalis 的传统水质测试方法可能是直观、定量和科学的。因此，本研究基于多重光散射技术原理，以样品的Turbiscan稳定性指数（TSI）为质量控制指标，建立了一种对Indigo Naturalis品质的快速评价方法（图1）。
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Protocol
1.测试样品的制备
- 设置四个不同批次的 Indigo Naturalis 草本粉进行测试。依次将每个样品通过第七筛和第九筛，并在第七和第九筛5之间收集样品。
注意：第七个筛子的平均孔径尺寸为 125 μm ± 5.8 μm。第九筛的平均孔径尺寸为75μm±4.1μm。 - 在称量纸上准确称取 0.2 g 样品（Indigo Naturalis 粉末）并将其放在一边。
2. 样品添加
- 搭建一个铁支撑架，并在上面放一个直径为 5 厘米的漏斗的铁环。
- 使用移液管向样品玻璃瓶中加入 20 mL 纯水（底部直径 2.6 厘米，高 6 厘米）。将样品玻璃瓶直接放在漏斗下方，使漏斗的下边缘与瓶口齐平。
注意： 用干净的非研磨性纸巾清洁样品玻璃瓶的外部，并检查玻璃表面是否有可见痕迹。如果有，请更换玻璃瓶。添加液体时注意不要溢出。 - 在距离漏斗下边缘 80 厘米的高度释放样品，使其可以沿着漏斗自由滑入样品瓶中。
3.仪器操作
- 打开Turbiscan实验室仪器并预热30分钟。
- 创建文件。单击顶部菜单中的“创建文件”按钮（或“文件”菜单中的“新建文件”功能）以创建新的空测量文件。定义其名称和保存位置（默认情况下，数据文件夹位于：“C：/users/admin/Formulaction/FAnalyser/Data”。
- 单击顶部菜单中的 显示Turbiscan实验室 温度按钮，将仪器目标温度设置为25°C。
注意： 仪器温度受室温影响，因此要小心调整环境温度。 - 单击顶部菜单中的程序扫描，进入设置分析 程序 。将程序添加到列表中，然后在任务栏中，将 30 秒 作为周期添加，将 21 次扫描 添加到分析序列中。选择此分析程序进行所有后续测量。
- 将准备好的样品瓶移入测量系统。设置程序后，单击 “开始 ”开始测量。
注意： 移动时注意不要摇晃玻璃瓶，只能轻轻移动。 - 数据采集后，点击计算参数列表，自动计算TSI。
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Representative Results
图 2A-D 分别对应于 Indigo Naturalis 的 S1、S2、S3 和 S4。A是优质的Indigo Naturalis，在0-10分钟内在任何高度都显示出相同的透光率，非常稳定。B是常见的天然靛蓝，其透光率随时间变化而略有波动，总体稳定。C和D是假冒伪劣产品。假靛蓝的透射光谱图中可能存在两种情况，即C中的透射光在测量的第一时刻迅速下降，样品瓶底部的透射光明显低于顶部，表明样品瓶内首次发生沉积， 而且沉积速度非常快。然而，D中的透射光在零点时间稳定，然后随着时间的延长而缓慢下降。与C相比，表明样品瓶内沉降缓慢。
图 3A-D 分别对应于 Indigo Naturalis 的 S1、S2、S3 和 S4。从反向散射光的光谱数据可以大致推断出样品数据与透射光一致。没有波动或波动很小（分别为图3A和图3B）表明样品是稳定的。图3C，D可能由于样品的沉淀而变得浑浊，波动增大，导致样品不稳定。
通过将四种 Indigo Naturalis 的透射光谱图（图 2）和反向散射光谱图（图 3）与多光散射仪拍摄的视频（图 4）和补充视频 S1、补充视频 S2、补充视频 S3 和补充视频 S4 的开始和结束快照进行比较，可以快速、粗略地识别 Indigo Naturalis 的真实性。
随着测量时间的延长，优质天然靛蓝的透射光谱图和后向散射光谱图应波动不大或根本没有波动，伪或劣质靛蓝的透射光谱图和后向散射光谱图可能逐渐或急剧下降。补充视频 S1、补充视频 S2、补充视频 S3 和补充视频 S4 也清楚地反映了这一结果。TSI值反映了测量时间内透射光或背散射光与前一次测量相比强度变化的累积，也是整个扫描期间样品体积浓度和粒径的综合变化。通过对比它们在10分钟时的TSI，可以准确区分四种类型的Indigo Naturalis的质量（图5和表1）。TSI值越高，系统越不稳定，样品的变化范围越大，为10。如果扫描期间的 TSI 值为 <10，则样品将被视为稳定。因此，目前的协议显示了一种在多光散射仪器中基于TSI快速识别优质Indigo Naturalis的方法。
图 1：通过多重光散射评估 Indigo Naturalis 质量的原理。 靛蓝和靛红是靛蓝天然靛蓝疏水性强的主要原因。靛蓝和靛红素的含量决定了颗粒的沉降速度。凭借这一特性，多重光散射仪器可以区分不同品质的 Indigo Naturalis。多重光散射仪采用多重光散射技术，其测量探头由一个脉冲近红外光源（λ=880 nm）和两个同步探测器组成。其中之一是透射光检测器，用于接收通过样品瓶的光（入射光为0°）并确定透明样品。另一种是反向散射光检测器，用于接收样品的反向散射光（与入射光成45°），并确定高浓度样品。测量探头每 40 μm 从下到上扫描一次整个样品池，并收集透射光 （T） 和反向散射光 （BS） 数据。通过设置测量时间和扫描时间，对样品进行反复扫描，信号和数据采集由电流电压转换器处理，得到代表样品稳定性特征的图谱。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：四种 Indigo Naturalis 在多重光散射仪中的透射光谱图。A-D 分别对应于 Indigo Naturalis 的 S1、S2、S3 和 S4。（A）优质、稳定的天然靛蓝，在0-10分钟内在任何高度都显示出相同的透光率。 （B）普通靛蓝，其透光率随时间变化而略有波动，总体稳定。（C、D）假冒伪劣产品。（C）样品瓶底部的透射光明显低于顶部的透射光，表明样品瓶内的沉积发生较早，且沉积速度非常快。（D）但是，透射光在零点时间是稳定的，然后随着时间的推移缓慢下降。与C相比，表明样品瓶内沉降缓慢。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：多重光散射仪器中四种 Indigo Naturalis 的反向散射光谱图。A-D 分别对应于 Indigo Naturalis 的 S1、S2、S3 和 S4。从反向散射光的光谱数据可以大致推断出样品数据与透射光一致。（A）无波动，说明样品非常稳定。（B）波动小，说明样品比较稳定。（C、D）浑浊是由于试样的沉降，波动增大，导致试样不稳定。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：四颗 Indigo Naturalis 在多重光散射仪中沉降过程视频的开始和结束快照。A-D 分别对应于 Indigo Naturalis 的 S1、S2、S3 和 S4。在结果中，通过比较0分钟和10分钟的扫描图片，可以看出A（补充视频S1）和B（补充视频S2）在整个过程中非常清晰。C（补充视频 S3）起初是部分浑浊的，最后是完全浑浊的。D（补充视频S4）逐渐从澄清变为浑浊。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：4 种 Indigo Naturalis 的 TSI 从 0 分钟到 10 分钟。 该图显示了TSI随扫描时间的变化曲线。根据TSI曲线的变化，S4的斜率最高，TSI值变化尤为显著。其次，S3的斜率也比较大，TSI值一直在缓慢上升。然而，S1 和 S2 的斜率接近于零，TSI 值变化较小。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 不。 | 靛蓝内容 | 靛蓝素含量 | TSI 为 10 分钟 |
| S1系列 | 9.00% ± 0.38% | 0.60% ± 0.00% | 0.61 ± 0.06 |
| S2型 | 2.07% ± 0.01% | 0.20% ± 0.00% | 2.74 ± 0.14 |
| S3系列 | 1.40% ± 0.02% | 0.00% ± 0.00% | 28.46 ± 3.51 |
| S4系列 | 0.00% ± 0.00% | 0.00% ± 0.00% | 68.75 ± 1.28 |
表 1：4 种 Indigo Naturalis 在 10 分钟时的 TSI （n=3）。 根据Indigo Naturalis的强疏水性，可以推断Indigo Naturalis的靛蓝和靛红素含量决定了它的质量。当靛蓝和靛蓝含量高时，样品几乎完全漂浮在水面上，导致TSI值较小。在10 min时，每批的TSI序列为S4>S3>S2>S1。对于S1和S2，TSI值相当小，这反映样品相对稳定且质量良好。对于S3和S4，TSI值极大，这也反映了样品的不稳定性和质量较差。
补充视频 S1：优质 Indigo Naturalis 在多重光散射仪中的沉降过程的动画视频。 在整个动画视频中，可以看出S1几乎没有变化，说明它相对稳定。 请点击这里下载此文件。
补充视频S2：普通Indigo Naturalis在多重光散射仪中的沉降过程的动画视频。 在整个动画视频中，可以看出S2几乎没有变化，说明它相对稳定。 请点击这里下载此文件。
补充视频S3：假靛蓝在多重光散射仪中的沉降过程的动画视频。 在整个动画视频中，可以看出S3在扫描的第三分钟是浑浊的，表明不稳定。 请点击这里下载此文件。
补充视频S4：假靛蓝在多重光散射仪中的沉降过程的动画视频。 在整个动画视频中，可以看出S4在扫描的第三分钟是浑浊的，表明不稳定。 请点击这里下载此文件。
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Discussion
根据传统中医，靛蓝具有清热解毒、清血、消除斑点、清除火种和阻止抽搐的能力。基于随机双盲对照临床试验11,12,13，Indigo Naturalis 除了传统治疗咳嗽和痰液、出血症状、溃疡肿胀、肝热和癫痫外，还有效治疗牛皮癣、溃疡性结肠炎和急性早幼粒细胞白血病。由于Indigo Naturalis品种繁多，质量差异大，含量检测过程复杂。一方面，天然靛蓝的来源包括 Strobilanthes cusia （Nees） Kuntze、Persicaria tinctoria （Aiton） Spach 和 Isatis tinctoria L.，地理环境和不同的收获时间导致了固有的品质差异14.另一方面，Indigo Naturalis 的制备过程需要浸泡发酵、打石灰靛蓝、水蝇精炼等步骤。然而，这个过程可能会产生不同品质的 Indigo Naturalis，并且 Indigo Naturalis 的含量因批次而异。目前，多项研究表明，Indigo Naturalis的指标成分含量合格率较低。假冒和劣质产品会导致重大质量问题，这使得在临床上使用Indigo Naturalis极为困难15,16,17。因此，Indigo Naturalis开发标准化的质量控制方法迫在眉睫，也是必不可少的。
所述过程中的一个关键步骤是，应尽快将装有样品的玻璃瓶移入样品罐内，同时避免摇晃瓶子。否则，不一致的处理可能会产生误导性的结果。其次，环境温度会影响仪器的设定温度。当室温超过30°C，仪器温度低于室温时，仪器温度会升高。值得注意的是，室温应控制在仪器温度以下。
虽然多重光散射与传统方法相比具有独特的优势，但它也有其局限性。首先，多路光散射不能明确地产生样品的确切内容，而只能识别真实性和大致给定的范围。其次，没有进一步鉴定中草药，目前只与Indigo Naturalis的质量快速评估有关。第三，依靠多种光散射方法和多种光散射仪器远远不能满足当代质量评价研究的标准。
与现有的水体试验方法相比，多重光散射法的意义在于以下几点。首先，它具有很高的灵敏度和可靠性。灵敏度和分辨率远高于肉眼观察。多光散射设备可以捕捉解决方案如何随时间变化，并创建整个过程的动画视频。其次，可以进行定性和定量分析。通过非接触式测量，仪器可以利用样品的光学特性（透射光、背散射光、TSI 和粒径）自动确定样品的稳定性。
我们相信，未来这种方法最终将在中药质量控制领域有所帮助，特别是在真实性评估方面。本研究以Indigo Naturalis为例，支持多重光散射法在中药质量快速评估中的有效性和准确性。因此，随着设备和应用技术的不断进步，多种光散射技术将与其他检测技术相结合，相互补充，对未来中药材的质量控制产生更大的影响。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
本工作感谢国家自然科学基金（第82173976号）、国家重点研发计划（第2018号YFC1707205号）、江西中医药大学创新药物与高能效制药装备国家重点实验室（第2018号）的支持。GZSYS202003）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical balance (1/10,000) | Sartorious, Germany | BSA224S | www.sartorius.com.cn |
| Funnel | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | Diameter 5 cm | www.cdkelongchem.com |
| Indigo Naturalis S1 | Xianyou, Fujian | 20210501 | |
| Indigo Naturalis S2 | Yaan, Sichuan | 20201102 | |
| Indigo Naturalis S3 | Xianyou, Fujian | 20161012 | |
| Indigo Naturalis S4 | Xianyou, Fujian | 20180305 | |
| Iron ring | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | / | www.cdkelongchem.com |
| Iron stand | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | / | www.cdkelongchem.com |
| Mili-Q ultra-pure water meter | Milipore, USA | Mili-Q | www.merckmillipore.com |
| Ninth sieve | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | Average aperture size 75 µm | www.cdkelongchem.com |
| Sample bottle | French Formulaction Company | Bottom diameter 2.6 cm, height 6 cm | www.formulaction.com |
| Seventh sieve | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | Average aperture size 125 µm | www.cdkelongchem.com |
| Turbisoft Lab multiple light scattering instrument | French Formulaction Company | Turbisoft Lab 2.3.1.125 Fanalyser 1.3.5 | www.formulaction.com |
| Weighing paper | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | / | www.cdkelongchem.com |
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