Summary
ここでは、インディゴナチュラリスの品質を評価するための多重光散乱法による品質評価方法を紹介します。
Abstract
漢方薬の品質管理は、漢方薬の研究開発の重要な要素です。漢方薬の近代化と国際化の課題に直面して、漢方薬の品質識別のための徹底的かつ効果的な手順を確立することが急務であり、効率的で正確で環境に優しい新しい分析および検査技術が緊急に必要とされています。
多重光散乱法は、試料の性質や状態を変えたり、有機試薬を使用したりすることなく、漢方薬の品質を正確かつ迅速に評価できる最先端の分析方法です。Indigo Naturalisは、小児高体温症、乾癬、白血病、潰瘍性大腸炎の優れた治療法と考えられています。本研究では、Indigo Naturalis粉末を水中に添加する過程を、多重光散乱装置を用いて精密に記録しました。
装置の定性的および定量的測定を使用して、Indigo Naturalis粉末の全体的な軌跡と水中への沈下挙動を正確に捉え、サンプルの透過および後方散乱スペクトログラムを定性的指標とし、安定性指数を定量的指標として、Indigo Naturalisの品質を迅速に評価する方法を確立することができます。多重光散乱に基づく分析技術は、Indigo Naturalisの品質評価のための迅速、正確、環境に優しく、環境に優しい方法を提供し、高品質のIndigo Naturalisの開発と変換をサポートします。
Introduction
伝統的な中国医学では、病気の治療の過程で、薬の臨床効果と治療コースの安全性は、漢方薬の品質によって直接影響を受けます。最先端の識別技術を利用して、漢方薬の有効性を評価し、使用者の安全性を保証することができます。漢方薬の水質検査法とは、ハーブを水または溶剤に浸し、色、サイズ、形状の変化を観察することにより、薬の信憑性を迅速かつ正確に判断することを指します1。
もともとは漢方薬の鑑定に適していました。しかし、従来の水質検査法の欠点は、肉眼による観察の主観性のために、漢方薬の真正性を区別する精度と感度が低いことです2。水質検査法で使用される主要な医薬品の1つは、小児の高体温症、乾癬、白血病、および潰瘍性大腸炎の効果的な治療法と考えられているIndigo Naturalisです3。純正のインディゴナチュラリスは水面に浮かび、振っても水が紺色に変色しません。しかし、偽のインディゴナチュラリスには沈む粒子があり、振ると水が濃い青色に変わります4。その原理は、疎水性で浮遊しやすいインディゴ、インディルビン、および高品質のインディゴナチュラリスの他の有機成分によるものです。それどころか、有機物が少なく、石灰が多く、質感が重いため、偽のインディゴナチュラリスをドープした一部の粒子はすぐに沈みます5。しかし、この方法は単なる定性的な同定に過ぎず、漢方薬の真正性の迅速な同定を制限し、水中の藍天然物の変化を明らかにすることができません。
多重光散乱技術とは、試料を通過するレーザーをベースとした多角度光信号走査を測定できる技術です。入射光は、サンプルを透過したり、粒子に遭遇したりすると散乱します。散乱光がサンプルを透過すると、透過光信号が形成されます。サンプル濃度が高い場合、光は粒子によって反射され、後方散乱光信号を形成します。光強度の変化は、液体調製物6における粒子濃度および粒子サイズの変化を反映している。多重光散乱装置は、多重光散乱技術により、懸濁液、乳化液、泡液の乳化、凝集、沈殿、破裂などの現象を迅速かつ正確に解析し、上記の現象の発生率などの特性を定量的に解析することができます。
多重光散乱技術は、粒子安定性モニタリング7、赤ワイン清澄化8、牛乳発酵品質管理9において大きな利点を実証しています。この技術を使用することで、Indigo Naturalisの従来の水質検査方法は、直感的、定量的、科学的になります。そこで、本研究では、多重光散乱技術の原理に基づき、試料のタービスカン安定性指数(TSI)を品質管理の指標とし、Indigo Naturalisの品質を迅速に評価する手法を確立しました(図1)。
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Protocol
1. 試験サンプルの調製
- テスト用に Indigo Naturalis ハーブパウダーの 4 つの異なるバッチをセットアップします。各サンプルを7番目のふるいと9番目のふるいに順番に通し、7番目と9番目のふるい5の間でサンプルを収集します。
注:第7ふるいの平均開口サイズは125μm±5.8μmです。第9篩の平均開口サイズは、75μm±4.1μmである。 - 0.2gのサンプル(Indigo Naturalis粉末)を計量紙に正確に計量し、脇に置いておきます。
2. サンプル添加
- 鉄製の支柱を作り、その上に直径5cmの漏斗が付いた鉄製のリングを置きます。
- ピペットを使用して、サンプルガラスボトル(底の直径2.6cm、高さ6cm)に20mLの純水を加えます。漏斗の下端がボトルの口と同じ高さになるように、漏斗の真下にサンプルガラス瓶を置きます。
注意: サンプルガラスバイアルの外側を清潔で研磨性のないペーパータオルで清掃し、ガラス表面に目に見える跡がないか調べます。ある場合は、ガラス瓶を交換してください。液体を入れるときはこぼさないように注意してください。 - 漏斗の下端から80cmの高さでサンプルを放出し、漏斗に沿ってサンプルボトルに自由にスライドできるようにします。
3. 器械の操作
- Turbiscan Lab機器の電源を入れ、30分間ウォームアップします。
- ファイルを作成します。トップメニューの[ファイルを作成]ボタン(または[ファイル]メニューの[新規ファイル]機能)をクリックして、新しい空の測定ファイルを作成します。その名前と保存場所を定義します(デフォルトでは、データフォルダは「C:/users/admin/Formulaction/FAnalyser/Data」にあります)。
- トップメニューの[ Show Turbiscan Lab Temperature ]ボタンをクリックして、装置の目標温度を25°Cに設定します。
注意: 機器の温度は室温の影響を受けるため、周囲温度の調整には注意してください。 - トップメニューの [プログラムスキャン ]をクリックして、セットアップ分析プログラムに入ります。プログラムをリストに追加し、タスクバーで、 30秒 をサイクルとして、 21回のスキャン を分析シーケンスに追加します。後続のすべての測定には、この解析プログラムを選択します。
- 準備したサンプルバイアルを測定システムに移動します。プログラムの設定後、[ 開始 ]をクリックして測定を開始します。
注意: 移動するときはガラス瓶を振らないように注意し、少しだけ動かしてください。 - データ取得後、計算されたパラメータのリストをクリックすると、TSIが自動的に計算されます。
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Representative Results
図2A-Dは、それぞれIndigo NaturalisのS1、S2、S3、S4に対応する。Aは高品質のインディゴナチュラリスで、0〜10分以内のどの高さでも同じ光透過率を示し、非常に安定しています。Bは一般的なインディゴナチュラリスで、その光透過率は時間の変化によってわずかに変動し、一般的に安定しています。CとDは偽物で粗悪品です。偽のIndigo Naturalisの透過スペクトログラムには、Cの透過光が測定の最初の瞬間に急激に減少し、サンプルボトルの下部の透過光が上部の透過光よりも有意に低く、最初にサンプルボトルに堆積が発生したことを示す2つの条件がある可能性があります。 そして、堆積は非常に速かった。しかし、Dの透過光はゼロ時間では安定しており、時間の延長とともにゆっくりと減少します。Cと比較すると、サンプルボトル内の沈降が遅いことを示しています。
図3A-Dは、それぞれIndigo NaturalisのS1、S2、S3、S4に対応する。後方散乱光のスペクトルデータから、サンプルデータは透過光と一致していると大まかに推測できます。変動がない、または小さい(それぞれ図3Aと図3B)ことは、サンプルが安定していることを示しています。図3C、Dは試料の沈降により濁り、揺らぎが大きくなり、試料が不安定になることがあります。
4台のIndigo Naturalisの透過型スペクトログラム(図2)と後方散乱スペクトログラム(図3)を、複数の光散乱装置で撮影したビデオの開始と終了のスナップショット(図4)およびSupplemental Video S1、Supplemental Video S2、Supplemental Video S3、Supplemental Video S4と比較することで、Indigo Naturalisの真正性を迅速かつ大まかに特定することができます。
測定時間の延長に伴い、高品質のIndigo Naturalisの透過スペクトログラムと後方散乱スペクトログラムはほとんど変動しないか、まったく変動しなくなり、疑似または劣ったIndigo Naturalisの透過スペクトログラムと後方散乱スペクトログラムは徐々にまたは急激に減少する可能性があります。また、補助動画S1、補助動画 S2、補助動画 S3、補助 動画S4 にも、この結果がはっきりと反映されています。TSI値は、測定時間中の前回の測定と比較した透過光または後方散乱光の強度変化の累積を反映しており、スキャン期間全体におけるサンプルの体積濃度と粒子サイズの包括的な変化でもあります。4種類のIndigo Naturalisの品質は、10分でのTSIを対比することで正確に区別できます(図5 および 表1)。TSI値が高いほど、システムは不安定になり、サンプルの変化範囲は10になります。スキャン期間中にTSI値が<10の場合、サンプルは安定していると見なされます。したがって、現在のプロトコルは、複数の光散乱装置におけるTSIに基づく良質のIndigo Naturalisの迅速な同定方法を示しています。
図1:多重光散乱によるIndigo Naturalisの品質評価の原理。 インディゴとインディルビンは、インディゴナチュラリスの強い疎水性の主な理由です。インディゴとインジルビンの含有量は、粒子の沈降速度を決定します。この特性により、複数の光散乱装置は、Indigo Naturalisのさまざまな品質を区別することができます。多重光散乱装置は、多重光散乱技術を採用しており、その測定プローブは、パルス近赤外光源(λ=880nm)と2つの同期検出器で構成されています。そのうちの1つは透過光検出器で、サンプルボトルを通過する光(入射光で0°)を受け取り、透明なサンプルを決定するために使用されます。もう一つは後方散乱光検出器で、試料の後方散乱光(入射光から45°)を受光し、高濃度の試料を測定するために使用されます。測定プローブは、40μmごとにサンプルセル全体を下から上にスキャンし、透過光(T)と後方散乱光(BS)のデータを収集します。測定時間とスキャン時間を設定することにより、サンプルを繰り返しスキャンし、信号とデータの取得を電流電圧変換器で処理して、サンプルの安定性特性を表すアトラスを取得します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:多重光散乱装置における4つのIndigo Naturalisの透過スペクトログラム。A-Dは、それぞれIndigo NaturalisのS1、S2、S3、S4に対応します。(A)高品質で安定したインディゴナチュラリスで、0〜10分以内のどの高さでも同じ光透過率を示します。 (B)一般的なインディゴナチュラリスとその光透過率は、時間の変化とともにわずかに変動し、一般的に安定しています。(C、D)偽物や粗悪品。(C)試料ボトル下部の透過光は上部の透過光よりも有意に低く、試料ボトル内で早期に堆積が起こり、堆積が非常に速かったことが示された。(D)ただし、透過光はゼロ時間では安定しており、その後時間とともにゆっくりと減少します。Cと比較すると、サンプルボトル内の沈降が遅いことを示しています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:多重光散乱装置における4つのIndigo Naturalisの後方散乱スペクトログラム。A-Dは、それぞれIndigo NaturalisのS1、S2、S3、S4に対応します。後方散乱光のスペクトルデータから、サンプルデータは透過光と一致していると大まかに推測できます。(A)揺らぎがなく、サンプルが非常に安定していることを示しています。(B)揺らぎが小さく、サンプルが比較的安定していることを示しています。(C、D)濁りはサンプルの沈降によるものであり、変動が増加し、サンプルの不安定性につながります。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:複数の光散乱装置における4つのIndigo Naturalisの沈降過程のビデオの開始と終了のスナップショット。A-Dは、それぞれIndigo NaturalisのS1、S2、S3、S4に対応します。結果では、0分と10分のスキャン画像を比較することにより、A(補足ビデオS1)とB(補足ビデオS2)がプロセス全体で非常に鮮明であることがわかります。C(補足動画S3)は、最初は部分的に濁り、最後には完全に濁っています。D(補足動画S4)は清澄化から濁りに徐々に変化します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:0分から10分までの4つのIndigo NaturalisのTSI。 グラフは、TSIの曲線とスキャン時間を示しています。TSI曲線の変動に応じて、S4は最も傾きが大きく、TSI値は特に大きく変化します。次に、S3の傾きも比較的大きく、TSI値は緩やかに上昇している。ただし、S1 と S2 の傾きはゼロに近く、TSI 値の変化は小さくなります。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| いいえ。 | インディゴコンテンツ | インディルビン含有量 | 10分のTSI |
| S1の | 9.00% ± 0.38% | 0.60% ± 0.00% | 0.61 ± 0.06 |
| S2の | 2.07% ± 0.01% | 0.20% ± 0.00% | 2.74 ± 0.14 |
| S3の | 1.40% ± 0.02% | 0.00% ± 0.00% | 28.46 ± 3.51 |
| S4の | 0.00% ± 0.00% | 0.00% ± 0.00% | 68.75 ± 1.28 |
表1:10分間の4つのIndigo NaturalisのTSI(n = 3)。 Indigo Naturalisの強い疎水性から、Indigo Naturalisのインディゴとインジルビンの含有量が品質を決定していると推測できます。インディゴとインジルビンの含有量が高いと、サンプルはほぼ完全に水面に浮かび、TSI値が小さくなります。10 分で、各バッチの TSI 配列は S4 > S3 > S2 > S1 です。S1 と S2 では、TSI 値が非常に小さく、サンプルが比較的安定していて品質が良好であることを反映しています。S3とS4では、TSI値が極端に大きく、これもサンプルの不安定性を反映しており、品質が劣ります。
補足動画S1:多重光散乱装置における良質なIndigo Naturalisの沈降過程のアニメーション動画。 アニメーション動画全体では、S1がほぼ変化しておらず、比較的安定していることがわかります。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足動画S2:多重光散乱装置における一般的なIndigo Naturalisの沈降過程のアニメーション動画。 アニメーション動画全体では、S2がほぼ変化していないことが分かり、比較的安定していることが分かります。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足動画S3:多重光散乱装置における偽のIndigo Naturalisの沈降過程のアニメーション動画。 アニメーション動画全体では、スキャン開始から3分目でS3が濁っており、不安定さがうかがえます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足動画S4:多重光散乱装置における偽のIndigo Naturalisの沈降過程のアニメーション動画。 アニメーション動画全体では、スキャン開始から3分目でS4が濁っており、不安定さがうかがえます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
伝統的な中国医学によると、インディゴナチュラリスには、熱を取り除き、解毒し、血液を冷やし、斑点を取り除き、火を浄化し、痙攣を止める力があります。無作為化二重盲検比較試験11,12,13に基づき、Indigo Naturalisは、従来の咳や痰、出血症状、ただれや腫れ、肝臓の熱、てんかんの治療に加えて、乾癬、潰瘍性大腸炎、急性前骨髄球性白血病の治療に有効です。Indigo Naturalisは種類が多いため、品質の差が大きく、コンテンツ検出プロセスが複雑です。一方では、Indigo Naturalisの供給源には、Strobilanthes cusia(Nees)Kuntze、Persicaria tinctoria(Aiton)Spach、およびIsatis tinctoria L.が含まれますが、地理的環境、およびさまざまな収穫時期が固有の品質の違いにつながります14。一方、インディゴナチュラリスの調製プロセスには、発酵の浸漬、石灰叩きのインディゴ、ミズバエの精製などの手順が必要です。ただし、このプロセスでは、さまざまな品質の Indigo Naturalis が生成される可能性が高く、Indigo Naturalis の含有量はバッチごとに異なります。現在、いくつかの研究により、インディゴナチュラリスのインデックス成分含有量の適格率が低いことが示されています。偽物や粗悪品は重大な品質問題を引き起こし、Indigo Naturalisを臨床的に使用することは非常に困難です15,16,17。そのため、Indigo Naturalis社にとって、標準化された品質管理方法の開発は急務であり、不可欠です。
説明されているプロセスの重要なステップは、サンプルの入ったガラス瓶を、ボトルを振らないようにしながら、できるだけ早くサンプルタンク内に移動させることです。そうしないと、一貫性のない処理によって誤解を招く結果が生じる可能性があります。第二に、周囲温度は機器の設定温度に影響を与えます。室温が30°Cを超え、機器の温度が室温よりも低い場合、機器の温度が上昇します。室温は機器の温度より低く制御する必要があることに注意してください。
多重光散乱には、従来の方法に比べて独自の利点がありますが、限界もあります。まず、多重光散乱法では、サンプルの正確な含有量を明確にすることはできず、真正性と大まかに与えられた範囲を識別することしかできません。第二に、漢方薬のさらなる同定がないため、現在のところ、Indigo Naturalisの品質迅速評価にのみ関連しています。第三に、現代の品質評価研究の基準は、複数の光散乱法と複数の光散乱装置に依存しては満たされていません。
既存の水質試験法と比較して、多重光散乱法の意義は以下の点にあります。まず、感度と信頼性が高いことです。肉眼観察よりもはるかに高い感度と解像度です。多重光散乱装置は、溶液が時間の経過とともにどのように変化するかをキャプチャし、プロセス全体のアニメーションビデオを作成できます。第二に、定性的および定量的に分析できます。非接触測定により、光学特性(透過光、後方散乱光、TSI、粒子径)を使用してサンプルの安定性を自動的に決定できます。
将来的には、この手法が漢方薬の品質管理の分野、特に真正性の評価に役立つと考えています。この研究は、Indigo Naturalisを例に、漢方薬の品質の迅速な評価における多重光散乱アプローチの妥当性と精度を裏付けました。その結果、機器や応用技術が進歩するにつれて、複数の光散乱技術が他の検出技術と組み合わされて互いに補完し合い、将来の漢方薬の品質管理に大きな影響を与えるでしょう。
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Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会(第82173976号)、国家重点研究開発プログラム(第2018YFC1707205号)、および江西伝統中医薬大学革新的医薬品および高省エネ製薬機器国家重点実験室(No.GZSYS202003)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical balance (1/10,000) | Sartorious, Germany | BSA224S | www.sartorius.com.cn |
| Funnel | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | Diameter 5 cm | www.cdkelongchem.com |
| Indigo Naturalis S1 | Xianyou, Fujian | 20210501 | |
| Indigo Naturalis S2 | Yaan, Sichuan | 20201102 | |
| Indigo Naturalis S3 | Xianyou, Fujian | 20161012 | |
| Indigo Naturalis S4 | Xianyou, Fujian | 20180305 | |
| Iron ring | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | / | www.cdkelongchem.com |
| Iron stand | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | / | www.cdkelongchem.com |
| Mili-Q ultra-pure water meter | Milipore, USA | Mili-Q | www.merckmillipore.com |
| Ninth sieve | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | Average aperture size 75 µm | www.cdkelongchem.com |
| Sample bottle | French Formulaction Company | Bottom diameter 2.6 cm, height 6 cm | www.formulaction.com |
| Seventh sieve | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | Average aperture size 125 µm | www.cdkelongchem.com |
| Turbisoft Lab multiple light scattering instrument | French Formulaction Company | Turbisoft Lab 2.3.1.125 Fanalyser 1.3.5 | www.formulaction.com |
| Weighing paper | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | / | www.cdkelongchem.com |
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