Summary
Aquí, presentamos un método de evaluación de calidad basado en una técnica de dispersión de luz múltiple para evaluar la calidad de Indigo Naturalis.
Abstract
El control de calidad de la medicina herbal china es un componente crucial de la investigación y el desarrollo de la medicina herbal china. Frente a los desafíos de la modernización e internacionalización de la medicina herbaria china, es urgente establecer procedimientos exhaustivos y efectivos para la identificación de la calidad de la medicina herbaria china, y existe una necesidad urgente de nuevas técnicas analíticas y de prueba que sean eficientes, precisas y respetuosas con el medio ambiente.
La dispersión múltiple de la luz es un método analítico y de vanguardia que puede evaluar con precisión y rapidez la calidad de la medicina herbal china sin alterar la naturaleza o el estado de la muestra ni utilizar reactivos orgánicos. Indigo Naturalis se considera un buen remedio para la hipertermia pediátrica, la psoriasis, la leucemia y la colitis ulcerosa. En este estudio, el proceso de adición de polvo de Indigo Naturalis en agua se registró con precisión utilizando un instrumento de dispersión de luz múltiple.
Las mediciones cualitativas y cuantitativas del instrumento se pueden utilizar para capturar con precisión la trayectoria general y el comportamiento de hundimiento del polvo de Indigo Naturalis en el agua y para establecer un método de evaluación rápida de la calidad de Indigo Naturalis con los espectrogramas de transmisión y retrodispersión de la muestra como indicadores cualitativos y el índice de estabilidad como indicador cuantitativo. La técnica analítica basada en la dispersión múltiple de la luz proporciona un método rápido, preciso, ecológico y respetuoso con el medio ambiente para la evaluación de la calidad de Indigo Naturalis y apoya el desarrollo y la transformación de Indigo Naturalis de alta calidad.
Introduction
En la medicina tradicional china, durante el curso del tratamiento de la enfermedad, la eficacia clínica de los medicamentos y la seguridad del curso del tratamiento se ven directamente afectadas por la calidad de la medicina herbal china. Utilizando tecnología de identificación de vanguardia, se puede evaluar la eficacia de la medicina herbal china y garantizar la seguridad del usuario. El método de prueba de agua de la medicina herbal china se refiere a sumergir las hierbas en agua o solvente, luego determinar de manera rápida y precisa la autenticidad de la medicina observando los cambios en el color, el tamaño yla forma.
Originalmente fue una buena opción para la identificación de la medicina china. Sin embargo, la desventaja del método tradicional de prueba del agua es que la precisión y la sensibilidad para distinguir la autenticidad de la medicina china son bajas debido a la subjetividad de la observación a simple vista2. Uno de los materiales medicinales clave utilizados en el método de análisis del agua es Indigo Naturalis, considerado un remedio eficaz para la hipertermia pediátrica, la psoriasis, la leucemia y la colitis ulcerosa3. El genuino Indigo Naturalis flota en la superficie del agua, y el agua no se vuelve azul oscuro después de agitarse. Sin embargo, el falso Indigo Naturalis tiene partículas que se hunden, y el agua se volverá azul oscuro después de agitar4. Su principio se debe al índigo, la indirubina y otros componentes orgánicos hidrófobos y fácilmente flotantes del índigo natural de alta calidad. Por el contrario, debido a la baja materia orgánica, una gran cantidad de cal y una textura pesada, algunas partículas dopadas con Indigo Naturalis falso se hundirán rápidamente5. Sin embargo, este método es solo una simple identificación cualitativa, y limita la identificación rápida de la autenticidad de la medicina herbal china y no revela los cambios de Indigo Naturalis en el agua.
La tecnología de dispersión de luz múltiple es una tecnología que puede medir el escaneo de señales de luz de múltiples ángulos basado en un láser que pasa a través de la muestra. La luz incidente se dispersará cuando penetre en la muestra o se encuentre con partículas. Si la luz dispersa penetra a través de la muestra, se forma una señal luminosa de transmisión; Si la concentración de la muestra es alta, la luz será reflejada por las partículas, formando una señal luminosa de retrodispersión. Los cambios en la intensidad de la luz reflejan los cambios en la concentración y el tamaño de las partículas en la preparación líquida6. Los instrumentos de dispersión de luz múltiple pueden analizar de manera rápida y precisa fenómenos como la emulsificación, la floculación, la precipitación y la ruptura de la suspensión, la emulsión y el líquido espumoso mediante la tecnología de dispersión de luz múltiple, así como analizar cuantitativamente características como la tasa de ocurrencia de los fenómenos anteriores.
La tecnología de dispersión de luz múltiple ha demostrado beneficios significativos en el monitoreo de la estabilidad de partículas7, la clarificación del vino tinto8 y el control de calidad de la fermentación de la leche9. Con esta tecnología, el método tradicional de análisis de agua de Indigo Naturalis puede ser intuitivo, cuantitativo y científico. Por lo tanto, basado en el principio de la tecnología de dispersión de luz múltiple, este estudio estableció un método de evaluación rápida para la calidad de Indigo Naturalis, tomando el índice de estabilidad de Turbiscan (TSI) de la muestra como índice de control de calidad (Figura 1).
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Protocol
1. Preparación de la muestra de ensayo
- Prepare cuatro lotes diferentes de polvo de hierbas Indigo Naturalis para la prueba. Pasar cada muestra por el séptimo tamiz y el noveno tamiz por turnos y recoger la muestra entre el séptimo y el noveno tamiz5.
NOTA: El tamaño medio de la abertura del séptimo tamiz es de 125 μm ± 5,8 μm. El tamaño medio de la abertura del noveno tamiz es de 75 μm ± 4,1 μm. - Pesar con precisión 0,2 g de la muestra (polvo de Indigo Naturalis) en un papel de pesaje y reservar.
2. Adición de muestras
- Construya un soporte de hierro y coloque un anillo de hierro con un embudo de 5 cm de diámetro.
- Utilice una pipeta para añadir 20 ml de agua pura al frasco de vidrio de muestra (diámetro inferior 2,6 cm, altura 6 cm). Coloque la botella de vidrio de muestra directamente debajo del embudo de modo que el borde inferior del embudo quede al ras con la boca de la botella.
NOTA: Limpie el exterior del vial de vidrio de muestra con una toalla de papel limpia y no abrasiva e inspeccione la superficie del vidrio en busca de marcas visibles. Si los hay, cambia la botella de vidrio. Tenga cuidado de no derramar al agregar líquido. - Suelte la muestra a una altura de 80 cm desde el borde inferior del embudo para que pueda deslizarse libremente a lo largo del embudo hacia el frasco de muestras.
3. Funcionamiento del instrumento
- Encienda el instrumento Turbiscan Lab y caliéntelo durante 30 minutos.
- Cree el archivo. Haga clic en el botón Crear archivo en el menú superior (o en la función Nuevo archivo en el menú Archivo) para crear un nuevo archivo de medición vacío. Defina su nombre y ubicación de guardado (de forma predeterminada, la carpeta de datos se encuentra en: "C:/users/admin/Formulaction/FAnalyser/Data".
- Haga clic en el botón Mostrar temperatura de laboratorio de Turbiscan en el menú superior para establecer la temperatura objetivo del instrumento en 25 °C.
NOTA: La temperatura del instrumento está influenciada por la temperatura ambiente, así que tenga cuidado de ajustar la temperatura ambiente. - Haga clic en Análisis de programa en el menú superior para ingresar al programa de análisis de configuración. Agregue el programa a la lista y, en la barra de tareas, agregue 30 s como ciclo y 21 escaneos a la secuencia de análisis. Seleccione este programa de análisis para todas las mediciones posteriores.
- Mueva el vial de muestra preparado al sistema de medición. Después de configurar el programa, haga clic en Iniciar para iniciar la medición.
NOTA: Tenga cuidado de no agitar la botella de vidrio cuando se mueva y solo muévala ligeramente. - Después de la adquisición de datos, haga clic en la lista de parámetros calculados para calcular automáticamente el TSI.
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Representative Results
Las figuras 2A-D corresponden a S1, S2, S3 y S4 de Indigo Naturalis, respectivamente. A es de Indigo Naturalis de alta calidad, que muestra la misma transmitancia de luz a cualquier altura dentro de 0-10 min, lo cual es muy estable. B es el Indigo Naturalis común, y su transmitancia de luz fluctúa ligeramente con el cambio de tiempo y es generalmente estable. C y D son productos falsos e inferiores. Puede haber dos condiciones en los espectrogramas de transmisión de Indigo Naturalis falso, a saber, la luz de transmisión en C disminuyó rápidamente en el primer momento de la medición, y la luz de transmisión en la parte inferior de la botella de muestra fue significativamente más baja que la de la parte superior, lo que indica que la deposición ocurrió en la botella de muestra por primera vez, Y la deposición fue muy rápida. Sin embargo, la luz de transmisión en D es estable en el tiempo cero y luego disminuye lentamente con la prolongación del tiempo. En comparación con C, indica que hay una sedimentación lenta en el frasco de muestra.
Las figuras 3A-D corresponden a S1, S2, S3 y S4 de Indigo Naturalis, respectivamente. A partir de los datos espectrales de la luz retrodispersada, se puede inferir aproximadamente que los datos de la muestra son consistentes con la luz de transmisión. Ninguna o pequeñas fluctuaciones (Figura 3A y Figura 3B, respectivamente) indican que la muestra es estable. La Figura 3C, D puede ser turbia debido a la sedimentación de la muestra, y la fluctuación aumenta, lo que conduce a la inestabilidad de la muestra.
Al comparar el espectrograma de transmisión (Figura 2) y los espectrogramas de retrodispersión (Figura 3) de los cuatro Indigo Naturalis con las instantáneas de inicio y fin de los videos (Figura 4) y el Video Suplementario S1, el Video Suplementario S2, el Video Suplementario S3 y el Video Suplementario S4 capturados por el instrumento de dispersión de luz múltiple, la autenticidad del Indigo Naturalis se puede identificar de manera rápida y aproximada.
Con la extensión del tiempo de medición, los espectrogramas de transmisión y los espectrogramas de retrodispersión de Indigo Naturalis de alta calidad deberían fluctuar poco o nada, y los espectrogramas de transmisión y los espectrogramas de retrodispersión de Indigo Naturalis pseudo o inferior pueden disminuir gradual o bruscamente. El vídeo complementario S1, el vídeo complementario S2, el vídeo complementario S3 y el vídeo complementario S4 también reflejaron claramente este resultado. Los valores de la TSI reflejan la acumulación de los cambios de intensidad de la luz de transmisión o de la luz de retrodispersión en comparación con la medición anterior durante el tiempo de medición, y también es el cambio integral de la concentración de volumen y el tamaño de partícula de la muestra durante todo el período de exploración. La calidad de los cuatro tipos de Indigo Naturalis se puede distinguir con precisión contrastando su TSI a los 10 min (Figura 5 y Tabla 1). Cuanto mayor sea el valor de TSI, más inestable será el sistema y mayor será el rango de cambio de la muestra10. Si el valor de la TSI es <10 durante el período de exploración, la muestra se considerará estable. Por lo tanto, el protocolo actual muestra un método para la identificación rápida de Indigo Naturalis de buena calidad basado en TSI en un instrumento de dispersión de luz múltiple.
Figura 1: Principio de evaluación de la calidad de Indigo Naturalis por dispersión múltiple de la luz. El índigo y la indirubina son las principales razones de la fuerte hidrofobicidad de Indigo Naturalis. El contenido de índigo e indirubina determina la velocidad de sedimentación de las partículas. Con esta característica, un instrumento de dispersión de luz múltiple puede distinguir diferentes calidades de Indigo Naturalis. El instrumento de dispersión de luz múltiple tiene tecnología de dispersión de luz múltiple y su sonda de medición consta de una fuente de luz infrarroja cercana pulsada (λ = 880 nm) y dos detectores síncronos. Uno de ellos es un detector de luz de transmisión, que se utiliza para recibir la luz que pasa a través de la botella de muestra (0° con la luz incidente) y para determinar la muestra clara. El otro es un detector de luz de retrodispersión, que se utiliza para recibir la luz de retrodispersión de la muestra (45° de la luz incidente) y para determinar la muestra de alta concentración. La sonda de medición escanea toda la celda de muestra de abajo hacia arriba, una vez cada 40 μm, y recopila los datos de la luz de transmisión (T) y la luz de retrodispersión (BS). Al configurar los tiempos de medición y el tiempo de escaneo, la muestra se escaneará repetidamente y la adquisición de señales y datos será procesada por el convertidor de corriente-voltaje para obtener un atlas que represente las características de estabilidad de la muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Espectrogramas de transmisión de cuatro Indigo Naturalis en el instrumento de dispersión de luz múltiple. A-D corresponden a S1, S2, S3 y S4 de Indigo Naturalis, respectivamente. (A) Indigo Naturalis estable y de alta calidad, que muestra la misma transmitancia de luz a cualquier altura dentro de 0-10 min. (B) El Indigo Naturalis común y su transmitancia de luz fluctúan ligeramente con el cambio de tiempo y generalmente son estables. (C, D) Productos falsos e inferiores. (C) La luz de transmisión en la parte inferior de la botella de muestra era significativamente más baja que la de la parte superior, lo que indica que la deposición ocurrió en la botella de muestra en una etapa temprana y la deposición fue muy rápida. (D) Sin embargo, la luz de transmisión es estable en el tiempo cero y luego disminuye lentamente con el tiempo. En comparación con C, indica que hay una sedimentación lenta en el frasco de muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Espectrogramas de retrodispersión de cuatro Indigo Naturalis en el instrumento de dispersión de luz múltiple. A-D corresponden a S1, S2, S3 y S4 de Indigo Naturalis, respectivamente. A partir de los datos espectrales de la luz retrodispersada, se puede inferir aproximadamente que los datos de la muestra son consistentes con la luz de transmisión. (A) Sin fluctuación, lo que indica que la muestra es muy estable. (B) La fluctuación es pequeña, lo que indica que la muestra es relativamente estable. (C, D) La turbidez se debe a la sedimentación de la muestra y la fluctuación aumenta, lo que conduce a la inestabilidad de la muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Instantáneas de inicio y fin de los videos del proceso de sedimentación de cuatro Indigo Naturalis en el instrumento de dispersión de luz múltiple. A-D corresponden a S1, S2, S3 y S4 de Indigo Naturalis, respectivamente. En los resultados, al comparar las imágenes de escaneo de 0 min y 10 min, se puede ver que A (Video Suplementario S1) y B (Video Suplementario S2) son muy claras en todo el proceso. C (Video Suplementario S3) es parcialmente turbio al principio, y luego completamente turbio al final. D (Video Suplementario S4) cambia gradualmente de clarificación a turbidez. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: TSI de cuatro Indigo Naturalis de 0 min a 10 min. El gráfico muestra la curva de TSI con el tiempo de exploración. De acuerdo con la variación de la curva ETI, S4 tiene la pendiente más alta y el valor de TSI cambia de manera particularmente significativa. A continuación, la pendiente de S3 también es relativamente grande y el valor de TSI ha aumentado lentamente. Sin embargo, las pendientes de S1 y S2 son cercanas a cero, y los valores de TSI cambian menos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| No. | Contenido índigo | Contenido de indirubina | TSI de 10 min |
| S1 | 9.00% ± 0.38% | 0.60% ± 0.00% | 0,61 ± 0,06 |
| S2 | 2.07% ± 0.01% | 0.20% ± 0.00% | 2,74 ± 0,14 |
| S3 | 1.40% ± 0.02% | 0.00% ± 0.00% | 28.46 ± 3.51 |
| T4 | 0.00% ± 0.00% | 0.00% ± 0.00% | 68,75 ± 1,28 |
Tabla 1: ETI de cuatro Indigo Naturalis a los 10 min (n=3). De acuerdo con la fuerte hidrofobicidad de Indigo Naturalis, se puede inferir que el contenido de índigo e indirubina de Indigo Naturalis determina su calidad. Cuando el contenido de índigo e indirubina es alto, la muestra flota casi por completo en la superficie del agua, lo que da como resultado valores TSI pequeños. A los 10 minutos, la secuencia TSI de cada lote es S4 > S3 > S2 > S1. Para S1 y S2, el valor TSI es bastante pequeño, lo que refleja que las muestras son relativamente estables y de buena calidad. Para S3 y S4, el valor TSI es extremadamente grande, lo que también refleja la inestabilidad de la muestra y la calidad es inferior.
Video Suplementario S1: Video de animación del proceso de sedimentación de un Indigo Naturalis de buena calidad en el instrumento de dispersión de luz múltiple. En todo el video de animación, se puede ver que S1 está casi sin cambios, lo que indica que es relativamente estable. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Video Suplementario S2: Video de animación del proceso de sedimentación de Indigo Naturalis común en el instrumento de dispersión de luz múltiple. En todo el video de animación, se puede ver que S2 casi no ha cambiado, lo que indica que es relativamente estable. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Video Suplementario S3: Video de animación del proceso de sedimentación de Indigo Naturalis falso en el instrumento de dispersión de luz múltiple. En todo el video de animación, se puede ver que S3 está turbio al tercer minuto de escaneo, lo que indica inestabilidad. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Video Suplementario S4: Video de animación del proceso de asentamiento de Indigo Naturalis falso en el instrumento de dispersión de luz múltiple. En todo el video de animación, se puede ver que S4 está turbio al tercer minuto de escaneo, lo que indica inestabilidad. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Según la medicina tradicional china, Indigo Naturalis tiene el poder de eliminar el calor y la desintoxicación, enfriar la sangre, eliminar manchas, purgar el fuego y detener las convulsiones. Basado en ensayos clínicos controlados aleatorizados doble ciego11,12,13, Indigo Naturalis es eficaz en el tratamiento de la psoriasis, la colitis ulcerosa y la leucemia promielocítica aguda, además de su tratamiento tradicional de la tos y la flema, los síntomas hemorrágicos, las llagas e hinchazones, el calor hepático y la epilepsia. Debido a la variedad de Indigo Naturalis, la diferencia de calidad es grande y el proceso de detección de contenido es complicado. Por un lado, las fuentes de Indigo Naturalis incluyen Strobilanthes cusia (Nees) Kuntze, Persicaria tinctoria (Aiton) Spach, e Isatis tinctoria L., el ambiente geográfico y las diversas épocas de cosecha conducen a las diferencias de calidad inherentes14. Por otro lado, el proceso de preparación de Indigo Naturalis requiere pasos como la fermentación en remojo, el batido de cal del índigo, el refinado de la mosca de agua, etc. Sin embargo, es probable que este proceso produzca diferentes calidades de Indigo Naturalis, y el contenido de Indigo Naturalis varía de un lote a otro. En la actualidad, varios estudios han demostrado que la tasa de calificación del contenido de componentes índice de Indigo Naturalis es baja. Los productos falsos e inferiores causan importantes problemas de calidad, lo que hace que sea extremadamente difícil usar Indigo Naturalis clínicamente15,16,17. Por lo tanto, es urgente e indispensable que Indigo Naturalis desarrolle un método de control de calidad estandarizado.
Un paso clave en el proceso descrito es que la botella de vidrio que contiene la muestra debe moverse dentro del tanque de muestras lo más rápido posible, evitando agitar la botella. De lo contrario, un manejo incoherente puede producir resultados engañosos. En segundo lugar, la temperatura ambiente tendrá un impacto en la temperatura establecida del instrumento. Cuando la temperatura ambiente supera los 30 °C y la temperatura del instrumento es inferior a la temperatura ambiente, la temperatura del instrumento aumentará. Vale la pena señalar que la temperatura ambiente debe controlarse por debajo de la temperatura del instrumento.
Aunque la dispersión múltiple de luz tiene ventajas únicas sobre los métodos tradicionales, también tiene sus limitaciones. En primer lugar, la dispersión de luz multiplexada no puede producir definitivamente el contenido exacto de una muestra, sino que solo puede identificar la autenticidad y un rango aproximadamente dado. En segundo lugar, sin una mayor identificación de la medicina herbaria china, actualmente solo es relevante para la evaluación rápida de la calidad de Indigo Naturalis. En tercer lugar, los criterios de la investigación contemporánea sobre evaluación de la calidad están lejos de cumplirse si se dependen de múltiples metodologías de dispersión de luz y múltiples instrumentos de dispersión de luz.
En comparación con el método de prueba de agua existente, la importancia del método de dispersión de luz múltiple radica en los siguientes puntos. En primer lugar, tiene una alta sensibilidad y fiabilidad. La sensibilidad y la resolución son mucho más altas que las de la observación a simple vista. El dispositivo de dispersión de luz múltiple puede capturar cómo cambia la solución con el tiempo y crear un video animado de todo el proceso. En segundo lugar, puede analizarse cualitativa y cuantitativamente. A través de la medición sin contacto, el instrumento puede determinar automáticamente la estabilidad de la muestra utilizando sus características ópticas (luz de transmisión, luz de retrodispersión, TSI y tamaño de partícula).
En el futuro, creemos que este método eventualmente será útil en el campo del control de calidad de la medicina tradicional china, particularmente en la evaluación de la autenticidad. Este estudio apoyó la validez y precisión del enfoque de dispersión múltiple de luz en la evaluación rápida de la calidad de la medicina china utilizando Indigo Naturalis como ejemplo. En consecuencia, a medida que los equipos y la tecnología de aplicación avancen continuamente, se combinarán múltiples tecnologías de dispersión de luz con otras técnicas de detección para complementarse entre sí, lo que tendrá un mayor impacto en el control de calidad de las hierbas medicinales chinas en el futuro.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
El trabajo desea agradecer el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82173976), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave (No. 2018YFC1707205) y el Laboratorio Estatal Clave de Medicamentos Innovadores y Equipos Farmacéuticos de Alto Ahorro de Energía, Universidad de Medicina Tradicional China de Jiangxi (No. GZSYS202003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical balance (1/10,000) | Sartorious, Germany | BSA224S | www.sartorius.com.cn |
| Funnel | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | Diameter 5 cm | www.cdkelongchem.com |
| Indigo Naturalis S1 | Xianyou, Fujian | 20210501 | |
| Indigo Naturalis S2 | Yaan, Sichuan | 20201102 | |
| Indigo Naturalis S3 | Xianyou, Fujian | 20161012 | |
| Indigo Naturalis S4 | Xianyou, Fujian | 20180305 | |
| Iron ring | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | / | www.cdkelongchem.com |
| Iron stand | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | / | www.cdkelongchem.com |
| Mili-Q ultra-pure water meter | Milipore, USA | Mili-Q | www.merckmillipore.com |
| Ninth sieve | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | Average aperture size 75 µm | www.cdkelongchem.com |
| Sample bottle | French Formulaction Company | Bottom diameter 2.6 cm, height 6 cm | www.formulaction.com |
| Seventh sieve | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | Average aperture size 125 µm | www.cdkelongchem.com |
| Turbisoft Lab multiple light scattering instrument | French Formulaction Company | Turbisoft Lab 2.3.1.125 Fanalyser 1.3.5 | www.formulaction.com |
| Weighing paper | Chengdu Kelong Chemical Co. LTD | / | www.cdkelongchem.com |
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