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Neuroscience

हाइपोथैलेमिक किसपेप्टिन न्यूरॉन्स पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए एक लक्ष्य के रूप में

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo

Summary

यहां, हम मस्तिष्क स्लाइस पर एक पूरे सेल पैच-क्लैंप करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें किसपेप्टिन न्यूरॉन्स होते हैं, जो गोनाडोट्रोफिन-रिलीजिंग हार्मोन (जीएनआरएच) कोशिकाओं के प्राथमिक मॉड्यूलेटर हैं। किसपेप्टिन न्यूरॉन गतिविधि के बारे में ज्ञान जोड़कर, इस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल टूल ने पिछले 20 वर्षों में न्यूरोएंडोक्रिनोलॉजी क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रगति के आधार के रूप में कार्य किया है।

Abstract

हाइपोथैलेमिक-पिट्यूटरी-गोनाडल (एचपीजी) अक्ष और प्रजनन क्षमता की परिपक्वता के लिए किसपेप्टिन आवश्यक हैं। हाइपोथैलेमिक किसपेप्टिन न्यूरॉन्स एंटेरोवेंट्रल पेरिवेंट्रिकुलर न्यूक्लियस और रोस्ट्रल पेरिवेंट्रिकुलर न्यूक्लियस में स्थित हैं, साथ ही हाइपोथैलेमस के आर्क्यूट न्यूक्लियस, अन्य कोशिकाओं के बीच गोनाडोट्रोफिन-रिलीजिंग हार्मोन (जीएनआरएच) न्यूरॉन्स को प्रोजेक्ट करते हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि किसपेप्टिन सिग्नलिंग Kiss1 रिसेप्टर (Kiss1r) के माध्यम से होता है, अंततः रोमांचक GNRH न्यूरॉन गतिविधि। मनुष्यों और प्रयोगात्मक पशु मॉडल में, किसपेप्टिन जीएनआरएच स्राव को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त हैं और परिणामस्वरूप, ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन (एलएच) और कूप उत्तेजक हार्मोन (एफएसएच) रिलीज करते हैं। चूंकि किसपेप्टिन प्रजनन कार्यों में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं, इसलिए शोधकर्ता यह आकलन करने के लिए काम कर रहे हैं कि हाइपोथैलेमिक किसपेप्टिन न्यूरॉन्स की आंतरिक गतिविधि प्रजनन से संबंधित कार्यों में कैसे योगदान देती है और इन गुणों को बदलने में सक्षम प्राथमिक न्यूरोट्रांसमीटर / न्यूरोमोड्यूलेटर की पहचान करती है। पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक कृंतक कोशिकाओं में किसपेप्टिन न्यूरॉन गतिविधि की जांच के लिए एक मूल्यवान उपकरण बन गई है। यह प्रयोगात्मक तकनीक शोधकर्ताओं को सहज उत्तेजक और निरोधात्मक आयनिक धाराओं, आराम करने वाली झिल्ली क्षमता, कार्रवाई संभावित फायरिंग और कोशिका झिल्ली के अन्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों को रिकॉर्ड करने और मापने की अनुमति देती है। वर्तमान अध्ययन में, पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक के महत्वपूर्ण पहलुओं, जिसे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल माप के रूप में जाना जाता है जो हाइपोथैलेमिक किसपेप्टिन न्यूरॉन्स को परिभाषित करता है, और तकनीक के बारे में प्रासंगिक मुद्दों की चर्चा की जाती है।

Introduction

हॉजकिन और हक्सले ने कई वैज्ञानिक अध्ययनों में वर्णित कार्रवाई क्षमता का पहला इंट्रासेल्युलर रिकॉर्ड बनाया। यह रिकॉर्डिंग स्क्वीड अक्षतंतु पर की गई थी, जिसका एक बड़ा व्यास (~ 500 μm) है, जिससे अक्षतंतु के अंदर एक माइक्रोइलेक्ट्रोड रखा जा सकता है। इस काम ने वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए महान संभावनाएं प्रदान कीं, बाद में वोल्टेज-क्लैंप मोड के निर्माण में समापन हुआ, जिसका उपयोग कार्रवाई संभावित पीढ़ी 1,2,3,4,5,6,7,8 के आयनिक आधार का अध्ययन करने के लिए किया गया था। वर्षों से, तकनीक में सुधार किया गया है, और यह वैज्ञानिक अनुसंधान 6,9 में व्यापक रूप से लागू हो गया है। पैच-क्लैंप तकनीक का आविष्कार, जो 1970 के दशक के उत्तरार्ध में इरविन नेहर और बर्ट सकमैन द्वारा शुरू किए गए अध्ययनों के माध्यम से हुआ था, ने शोधकर्ताओं को केवल एक इलेक्ट्रोड 9,10,11,12 का उपयोग करके लगभग हर प्रकार के सेल में एकल आयन चैनल और इंट्रासेल्युलर झिल्ली क्षमता या धाराओं को रिकॉर्ड करने की अनुमति दी।. पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग को विभिन्न प्रकार के ऊतक ों की तैयारी पर बनाया जा सकता है, जैसे कि सुसंस्कृत कोशिकाएं या ऊतक स्लाइस, या तो वोल्टेज-क्लैंप मोड में (उदाहरण के लिए, वोल्टेज-निर्भर धाराओं और सिनैप्टिक धाराओं की रिकॉर्डिंग की अनुमति देने वाले सेट वोल्टेज पर कोशिका झिल्ली को पकड़ना) या वर्तमान-क्लैंप मोड (उदाहरण के लिए, आयन धाराओं द्वारा प्रेरित झिल्ली क्षमता में परिवर्तन की रिकॉर्डिंग की अनुमति देना), एक्शन पोटेंशिअल, और पोस्टसिनेप्टिक संभावित आवृत्ति)।

पैच-क्लैंप तकनीक के उपयोग ने कई उल्लेखनीय खोजों को संभव बना दिया। वास्तव में, हाइपोथैलेमिक किसपेप्टिन न्यूरॉन्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों पर सेमिनल निष्कर्ष एंटेरोवेंट्रल पेरिवेंट्रिकुलर और रोस्ट्रल पेरिवेंट्रिकुलर नाभिक (एवीपीवी / पीईएन किसपेप्टिन) में स्थित हैं, जिसे तीसरे वेंट्रिकल (आरपी 3 वी) के रोस्ट्रल पेरिवेंट्रिकुलर क्षेत्र और हाइपोथैलेमस (एआरएचकिसपेप्टिन) के आर्क्यूट न्यूक्लियस के रूप में भी जाना जाताहै। विशेष रुचि के हैं। 2010 में, ड्यूक्रेट एट अल ने एक अन्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल टूल, लूज-सेल पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग करके चूहों में एवीपीवी / पीईएनकिसपेप्टिनन्यूरॉन्स की पहली रिकॉर्डिंग का प्रदर्शन किया। इन अध्ययनों ने एवीपीवी / पीईएनकिसपेप्टिन न्यूरॉन्स का एक विद्युत विवरण प्रदान किया और प्रदर्शित किया कि उनके फायरिंग पैटर्न कठिन चक्र-निर्भरहैं। 2011 में, किउ एट अल ने यह प्रदर्शित करने के लिए पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग किया कि एआरएचकिसपेप्टिन न्यूरॉन्स अंतर्जात पेसमेकरधाराओं को व्यक्त करते हैं। इसके बाद, गॉट्स एट अल ने दिखाया कि किसपेप्टिन न्यूरॉन्स सहज गतिविधि का प्रदर्शन करते हैं और एच-टाइप (पेसमेकर) और टी-टाइप कैल्शियम धाराओं दोनों को व्यक्त करते हैं, यह सुझाव देते हुए कि एआरएचकिसपेप्टिन न्यूरॉन्स अन्य केंद्रीय तंत्रिका तंत्र पेसमेकर न्यूरॉन्स18 के साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुण साझा करते हैं। इसके अतिरिक्त, यह प्रदर्शित किया गया है कि एआरएच किसपेप्टिन न्यूरॉन्स यौन रूप से विकृत फायरिंग दर प्रदर्शित करते हैं और एवीपीवी / पेनकिसपेप्टिन न्यूरॉन्स एटीपी-संवेदनशील पोटेशियम चैनलों (के एटीपी) 19,20 से प्रभावित एक द्विमोडल विश्राम झिल्ली क्षमता (आरएमपी) प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, यह स्थापित किया गया था कि गोनाडल स्टेरॉयड चूहों19,20,21 में किसपेप्टिन न्यूरॉन्स की सहज विद्युत गतिविधि को सकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं। किसपेप्टिन न्यूरॉन्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों का अध्ययन करने वाले पहले कार्यों का उल्लेख 16,17,18,19,20 किया गया है। तब से, कई अध्ययनों ने यह प्रदर्शित करने के लिए पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग किया है कि कौन से कारक / न्यूरोमोड्यूलेटर किसपेप्टिन न्यूरॉन्स की विद्युत गतिविधि को संशोधित करने के लिए पर्याप्त हैं (चित्रा 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30।, 31,32.

प्रजनन के लिए आवश्यक न्यूरॉन्स के अध्ययन के लिए इस तकनीक के महत्व को देखते हुए, यहां कवर नहीं किए गए अन्य सेल प्रकारों के बीच, यह लेख पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक के विकास के लिए बुनियादी चरणों का वर्णन करता है, जैसे कि समाधान तैयार करना, मस्तिष्क को विच्छेदित करना और काटना, और रिकॉर्डिंग के लिए कोशिका झिल्ली की सील करना। इसके अलावा, तकनीक के बारे में प्रासंगिक मुद्दों पर चर्चा की जाती है, जैसे कि इसके फायदे, तकनीकी सीमाएं और महत्वपूर्ण चर जिन्हें इष्टतम प्रयोगात्मक प्रदर्शन के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को साओ पाउलो विश्वविद्यालय में जैव चिकित्सा विज्ञान पशु नैतिकता समिति के संस्थान द्वारा अनुमोदित किया गया था और ब्राजील के कॉलेज ऑफ एनिमल एक्सपेरिमेंटेशन द्वारा अपनाए गए नैतिक दिशानिर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था।

1. समाधान की तैयारी

  1. आंतरिक समाधान की तैयारी
    नोट: आंतरिक समाधान पैच-क्लैंप माइक्रोपिपेट को भरता है और सेल के इंटीरियर से संपर्क करेगा ( चित्रा 2 में एक उदाहरण देखें)। आंतरिक समाधान33 मापी जाने वाली गतिविधि के प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
    1. अपने प्रयोगात्मक उद्देश्य और उपयुक्त रिकॉर्ड प्रकार पर विचार करते हुए आंतरिक समाधान चुनें। वर्तमान-क्लैंप मोड में झिल्ली क्षमता रिकॉर्ड करने के लिए, 120 mM K-ग्लूकोनेट, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 3 mM KOH, 10 mM KCl, और 4 mM (Mg)-ATP से बने आंतरिक समाधान का उपयोग करें। सभी लवणों को वांछित अंतिम मात्रा के अनुसार तौलें, जैसा कि तालिका 1 में दिया गया है।
    2. समाधान की अंतिम मात्रा के 90% तक पहुंचने के लिए पर्याप्त विआयनीकृत पानी का उपयोग करें। यह मात्रा पीएच और परासरण को समायोजित करने के लिए पर्याप्त स्थान सुनिश्चित करेगी।
    3. सभी अवयवों को अच्छी तरह से जोड़ने और मिश्रण करने के बाद, पीएच मीटर का उपयोग करके 5 एम कोएच के साथ पीएच को 7.2-7.3 तक समायोजित करें। ऑस्मोलरिटी की जांच करने के लिए एक ऑस्मोमीटर का उपयोग करें, जो लगभग 275-280 एमओएसएम होना चाहिए (यदि आवश्यक हो, तो केवल नीचे समायोजित करें)।
    4. आंतरिक समाधान पहले से तैयार करें और 8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रयोग के दिन एटीपी जोड़ें। एटीपी युक्त आंतरिक समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस (1 एमएल एलिकोट) पर 3-4 महीनों के लिए स्टोर करें।
  2. स्लाइसिंग घोल की तैयारी
    1. 238 एमएम सुक्रोज, 2.5 एमएम केसीएल, 26 एमएम एनएएचसीओ3, 1.0 एमएम एनएएच 2 पीओ4, 10 एमएम ग्लूकोज, 1.0 एमएम सीएसीएल 2, और 5.0 एमएम एमजीसीएल2युक्त स्लाइसिंग घोल तैयार करें। वांछित अंतिम मात्रा के अनुसार सभी लवणों का वजन करें, जैसा कि तालिका 2 में दिखाया गया है। तैयार किए जाने वाले इस समाधान की सटीक मात्रा कटिंग चैंबर के आकार पर निर्भर करेगी।
    2. विआयनीकृत पानी में सभी लवणों को मिलाते समय, कार्बोजेन (95% ओ 2 और 5% सीओ2) के साथ लगातार संतृप्त करें। स्लाइसिंग समाधान को कार्बोजेन की आपूर्ति करने के लिए कार्बोजेन सिलेंडर में पॉलीथीन टयूबिंग (1.57 मिमी बाहरी व्यास [ओडी] x 1.14 मिमी आंतरिक व्यास [आईडी]) संलग्न करें। स्लाइसिंग समाधान वाले बीकर के अंदर ट्यूब के खुले छोर को पकड़ें।
    3. सभी अवयवों को अच्छी तरह से मिलाने के बाद, पीएच मीटर का उपयोग करके 10% नाइट्रिक एसिड के साथ पीएच को 7.3 तक समायोजित करें। परासरण ता की जांच करने के लिए एक ऑस्मोमीटर का उपयोग करें, जो 290-295 mOsm होना चाहिए (समायोजित, यदि आवश्यक हो, केवल नीचे)। बाद में, घोल को 0-2 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  3. रिकॉर्डिंग के लिए एसीएसएफ समाधान तैयार करें
    1. 124 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH 2 PO 4, 1.2 mM MgSO4, 5 mM ग्लूकोज, और 2.5 mM CaCl2युक्त रिकॉर्डिंग के लिए कृत्रिम मस्तिष्कमेरु स्पाइनल फ्लूइड (ACSF) समाधान तैयार करें। तालिका 3 में दिए गए वांछित अंतिम आयतन के अनुसार सभी लवणों का वजन करें।
    2. विआयनीकृत पानी में सभी लवणों को मिलाते समय, कार्बोजेन (95% ओ 2 और 5% सीओ 2) के साथ लगातार संतृप्त होते हैं, जैसा कि चरण 1.2.2 में वर्णित है।
    3. सभी अवयवों को जोड़ने और मिश्रण करने के बाद, पीएच मीटर का उपयोग करके पीएच को 7.3 (10% नाइट्रिक एसिड का उपयोग किया जा सकता है) में समायोजित करें। परासरण ता की जांच करने के लिए एक ऑस्मोमीटर का उपयोग करें, जो 290-300 mOsm होना चाहिए। बाद में, एसीएसएफ को बीकर में डालें और 30 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में बनाए रखें।

2. मस्तिष्क विच्छेदन और टुकड़े करना

नोट: चूंकि विभिन्न मस्तिष्क संरचनाओं को अलग-अलग विमानों (कोरोनल, धन, या क्षैतिज स्लाइस) में काटने की आवश्यकता हो सकती है, स्लाइस प्राप्त करने के लिए सटीक दृष्टिकोण रुचि के मस्तिष्क क्षेत्र पर निर्भर करता है। आमतौर पर, एवीपीवी / पीईएन और एआरएच में किस1-व्यक्त कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए (यहां एवीपीवी / पीईएन किसपेप्टिन न्यूरॉन्स और एआरएचकिसपेप्टिन न्यूरॉन्स के रूपमें दर्शाया गया है; चित्रा 2 ए, बी), कोरोनल मस्तिष्क स्लाइस (200-300 μm) आमतौर पर 17,19,20,21,34 बनाए जाते हैं। एवीपीवी / पेन किसपेप्टिन न्यूरॉन्स ब्रेग्मा से लगभग 0.5 से -0.22 मिमी स्थित होते हैं, जबकि एआरएचकिसपेप्टिन न्यूरॉन्स -1.22 से -2.70 मिमी पर होते हैं। नाभिक स्थान को स्टीरियोटैक्सिक माउस मस्तिष्क एटलस35 या एलन माउस मस्तिष्क संदर्भ एटलस (http://mouse.brain-map.org/) का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। जीएफपी महिला (डायस्ट्रस-स्टेज) और नर चूहों36 का उपयोग इस अध्ययन में किया गया था।

  1. मस्तिष्क को हटाना
    1. विच्छेदन साइट और मस्तिष्क को निकालने के लिए आवश्यक उपकरण तैयार करें: डिकैपिटेशन कैंची, आईरिस कैंची, कैस्ट्रोविएजो घुमावदार कैंची, ओस्टियोटोम, चिमटी, स्पैटुला, फिल्टर पेपर, पेट्री डिश, रेजर ब्लेड और साइनोएक्रिलेट गोंद।
    2. स्लाइस बनाने से पहले, उस बेंच को तैयार करें जिस पर विच्छेदन किया जाएगा, क्योंकि बाद की सभी प्रक्रियाओं को जल्दी से किया जाना चाहिए। वाइब्रेटोम जैसे स्लाइसिंग डिवाइस तक पहुंच सुनिश्चित करें।
    3. ऊतक को काटने से पहले मस्तिष्क के स्लाइस को बनाए रखने के लिए एक रिकॉर्डिंग कक्ष तैयार करें। एक वाणिज्यिक ब्रांड (सामग्री की तालिका) से एक रिकॉर्डिंग कक्ष, 24 मिमी x 15 मिमी x 2 मिमी (एल एक्स डब्ल्यू एक्स एच) के स्नान आयाम प्राप्त करें या एक इन-हाउस बनाएं।
      नोट: एक इन-हाउस रिकवरी चैंबर निम्नानुसार बनाया जा सकता है: 24-वेल प्लेट को काट लें ताकि नौ कुएं उपलब्ध हों। नौ कुओं के आधार पर एक नायलॉन स्क्रीन को गोंद दें। कुएं की प्लेट के शेष भाग के साथ, एक आधार बनाएं ताकि नायलॉन का निचला हिस्सा मुक्त हो। इस अनुकूलित आधार को एसीएसएफ (पूरक चित्रा 1) युक्त 500 एमएल बीकर के अंदर रखा जा सकता है।
    4. सब कुछ तैयार करने के बाद, 4% -5% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके इनहेल्ड एनेस्थेटिक के साथ जानवर को एनेस्थेटाइज करें। संज्ञाहरण नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार होना चाहिए। जानवर के स्थिर होने के तुरंत बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए पूंछ और पंजे की चुटकी परीक्षण करें कि जानवर को गहराई से एनेस्थेटाइज किया गया है।
    5. चूहों को जल्दी से हटा दें, जबकि हृदय अभी भी सेल व्यवहार्यता को बढ़ाने के लिए सक्रिय है। सिर काटने के बाद मस्तिष्क को जल्दी से काट लें।
    6. सर्जिकल कैंची से, जानवर की खोपड़ी के शीर्ष पर त्वचा में एक चीरा बनाएं, पुच्छल से रोस्ट्रल तक, और जानवर के सिर से खोपड़ी को हटा दें। इसके बाद, आईरिस कैंची के साथ इंटरपेराइटल प्लेट को काट लें और ओसीसीपिटल हड्डी को हटा दें। पार्श्विका हड्डी के नीचे ओस्टियोटोम को स्लाइड करें और धीरे से इसे बाहर खींचें जब तक कि मस्तिष्क उजागर न हो जाए।
    7. मस्तिष्क को उजागर करने के बाद, सिर को उल्टा घुमाएं, प्रत्येक तरफ ट्राइजेमिनल तंत्रिका की कल्पना करने के लिए धीरे से मस्तिष्क को नीचे करें, फिर कैस्ट्रोविएजो घुमावदार कैंची का उपयोग करके ट्राइजेमिनल तंत्रिका को काट दें। हाइपोथैलेमस की कल्पना करने के बाद, ऑप्टिक तंत्रिका की पहचान करें और इसे धीरे से काटें।
      नोट: ऑप्टिक तंत्रिका को काटते समय सावधान रहें, क्योंकि इसे खींचने से एवीपीवी / पीईएन नाभिक युक्त आसन्न हाइपोथैलेमिक क्षेत्र फट जाएगा।
    8. फ्रंटल लोब के सबसे पूर्ववर्ती हिस्से को काटें और मस्तिष्क को पूरी तरह से हटा दें। स्लाइस प्राप्त करने तक तुरंत मस्तिष्क को स्लाइसिंग समाधान में डुबोएं।
  2. मस्तिष्क के नमूने का टुकड़ा।
    1. अतिरिक्त घोल को सुखाने के लिए मस्तिष्क को फिल्टर पेपर (पेट्री डिश पर समर्थित) पर रखें। फिर, एक तेज काटने वाले रेजर ब्लेड के साथ, मस्तिष्क को सेरिबैलम के साथ बाकी ऊतक से अलग करने वाला एक कोरोनल कट करें।
    2. इसके बाद, मस्तिष्क के पुच्छल हिस्से को वाइब्रेटोम के आधार पर गोंद दें और स्लाइसिंग डिवाइस के कक्ष को 0-2 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने वाले स्लाइसिंग / एसीएसएफ समाधान से भरें। प्रक्रिया के दौरान, स्लाइसिंग समाधान को ठंडा रखने के लिए वाइब्रेटोम कक्ष के चारों ओर सूखी बर्फ पैक करें।
    3. रेजर ब्लेड को वाइब्रेटोम में डालें और डिवाइस के उपयुक्त कटिंग पैरामीटर सेट करें: गति = 3, आवृत्ति = 9, और फ़ीड = 250 μm। ऊतक-स्लाइसिंग प्रक्रिया के दौरान स्लाइस को रिकवरी चैंबर (चरण 2.1.3 में वर्णित) में स्थानांतरित करने के लिए एक ऐक्रेलिक ट्रांसफर पिपेट (सिलिकॉन टेट से जुड़े उल्टे पाश्चर ग्लास पिपेट) का उपयोग करें। स्लाइस अधिग्रहण के बाद ऊतक वसूली के लिए 60 मिनट प्रतीक्षा करें।

3. रिकॉर्डिंग के लिए सेल सीलिंग

  1. सुनिश्चित करें कि रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले उपकरण के सभी टुकड़े (माइक्रोस्कोप, एम्पलीफायर, डिजिटाइज़र, माइक्रोमैनिपुलेटर और अन्य) चालू हैं।
  2. रिकॉर्डिंग के लिए एसीएसएफ समाधान के साथ माइक्रोस्कोप से जुड़े एक वाणिज्यिक ब्रांड (सामग्री की तालिका) से रिकॉर्डिंग कक्ष भरें। 2 एमएल / मिनट की दर से एसीएसएफ को लगातार पंप करने के लिए छिड़काव पंप का उपयोग करें।
  3. रुचि के एक मस्तिष्क टुकड़ा (एक समय में एक) को रिकॉर्डिंग कक्ष में स्थानांतरित करें। हाइपोथैलेमिक स्लाइस को कक्ष में स्थानांतरित करने के लिए एक ऐक्रेलिक ट्रांसफर पिपेट (सिलिकॉन टेट से जुड़े उल्टे पाश्चर ग्लास पिपेट) का उपयोग करें। स्लाइस को पकड़ने के लिए एक स्लाइस एंकर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करें ताकि यह एसीएसएफ छिड़काव के दौरान स्थानांतरित न हो।
  4. माइक्रोस्कोप से जुड़े रिकॉर्डिंग कक्ष के केंद्र में एक टुकड़ा रखें। माइक्रोस्कोप के तहत वांछित क्षेत्र के अच्छे दृश्य की अनुमति देने और रिकॉर्डिंग माइक्रोपिपेट की सही पहुंच के लिए स्लाइस की स्थिति महत्वपूर्ण है।
  5. स्लाइस की स्थिति और रुचि के क्षेत्र का पता लगाने में सहायता के लिए विसर्जन माइक्रोस्कोप के कम-शक्ति उद्देश्य लेंस (10x या 20x) का उपयोग करें।
  6. रुचि के क्षेत्र का पता लगाने के बाद, उद्देश्य लेंस को उच्च-शक्ति लेंस (63x) पर स्विच करें और ऊतक स्तर पर ध्यान केंद्रित करें, मस्तिष्क स्लाइस20 की सतह पर किसपेप्टिन कोशिकाओं का पता लगाने के लिए लक्ष्य क्षेत्र में अंतर्जात फ्लोरोसेंट प्रोटीन और कोशिकाओं के आकार का अवलोकन करें।
  7. जब कोई संभावित लक्ष्य कक्ष स्थित हो, तो उसे कंप्यूटर स्क्रीन पर माउस कर्सर से या रुचि के क्षेत्र पर वर्ग की तरह एक प्रारूप खींचकर चिह्नित करें। कंप्यूटर स्क्रीन मार्क सेल को रिकॉर्डिंग माइक्रोपिपेट की स्थिति का मार्गदर्शन करने में मदद करता है।
  8. लक्ष्य सेल के सटीक स्थान का निर्धारण करने के बाद, उद्देश्य को उठाएं और आंतरिक समाधान से भरे रिकॉर्डिंग माइक्रोपिपेट को पेश करें। इलेक्ट्रोड धारक में माइक्रोपिपेट रखते समय, सुनिश्चित करें कि आंतरिक समाधान चांदी इलेक्ट्रोड के संपर्क में है।
    नोट: इलेक्ट्रोड धारक पर माइक्रोपिपेट तैयारी, प्लेसमेंट और स्थिति के लिए, कृपया33 देखें।
  9. एसीएसएफ समाधान में माइक्रोपिपेट को डुबोने से पहले सकारात्मक दबाव लागू करें, मलबे को माइक्रोपिपेट में प्रवेश करने से रोकने के लिए, पॉलीथीन टयूबिंग (≈130 सेमी लंबा) के माध्यम से माइक्रोपिपेट धारक से जुड़े 1-3 एमएल हवा से भरे सिरिंज का उपयोग करें; लगभग 100-200 μL हवा लागू करें।
  10. माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके, उद्देश्य के केंद्र के नीचे माइक्रोपिपेट का मार्गदर्शन करें। एक्स-वाई-जेड अक्ष पर माइक्रोपिपेट को रुचि के सेल की ओर मार्गदर्शन करने के लिए माइक्रोमैनिपुलेटर पर बटन ले जाएं।
  11. माइक्रोपिपेट की नोक को देखने के लिए फोकस को समायोजित करें और स्लाइस के करीब फोकस लाएं, लेकिन बहुत करीब नहीं। माइक्रोमैनिपुलेटर की गति को कम करें और धीरे-धीरे माइक्रोपिपेट को फोकस के तल तक कम करें। सुनिश्चित करें कि माइक्रोपिपेट टिप अचानक स्लाइस में प्रवेश नहीं करता है, बल्कि धीरे-धीरे उतरता है जब तक कि यह सेल / लक्ष्य क्षेत्र की सतह को नहीं छूता है।
  12. पहुंच पथ से किसी भी मलबे को साफ करने के लिए माइक्रोपिपेट धारक से जुड़े 1-3 एमएल हवा से भरे सिरिंज के साथ हल्के सकारात्मक दबाव (≈100 μL) लागू करें।
  13. लक्ष्य सेल पर ध्यान केंद्रित करें और माइक्रोपिपेट को लक्ष्य सेल के करीब लाने के लिए धीरे-धीरे एक्स-वाई-जेड अक्ष पर माइक्रोमैनिपुलेटर को स्थानांतरित करें। माइक्रोपिपेट को कोशिका में स्पर्श करते समय, माइक्रोपिपेट टिप के माध्यम से लागू दबाव के कारण एक डिंपल देखा जाएगा (चित्रा 2 सी)।
  14. डिंपल बनाने के बाद, माइक्रोपिपेट की कोशिका से निकटता के कारण, माइक्रोपिपेट धारक से जुड़ी ट्यूब के माध्यम से मुंह (1-2 एस) द्वारा कमजोर, संक्षिप्त चूषण लागू करें ताकि माइक्रोपिपेट से सेल के बीच सील उत्पन्न हो सके (गिगाओहम सील या गिगासेल >1 जी; चित्रा 2 डी)। सील बनाने के लिए, सॉफ़्टवेयर पर वोल्टेज-क्लैंप मोड का उपयोग करें। सील गठन विवरण के लिए, कृपया33 देखें।
  15. यदि सील स्थिर रहती है (गीगाहम सील यांत्रिक रूप से स्थिर और शोर हस्तक्षेप के बिना होनी चाहिए, लगभग 1 मिनट के लिए अवलोकन द्वारा निर्धारित की जानी चाहिए), तो रुचि के सेल की निकटतम शारीरिक विश्राम क्षमता पर होल्डिंग वोल्टेज सेट करें। किसपेप्टिन हाइपोथैलेमिक न्यूरॉन्स के लिए, -50 एमवी की सिफारिश की जाती है।
  16. प्लाज्मा झिल्ली को तोड़ने के लिए कोशिका में सील किए गए माइक्रोपिपेट के साथ मुंह (नकारात्मक दबाव) द्वारा संक्षिप्त चूषण लागू करें (चित्रा 2 ई)। पर्याप्त संपूर्ण कोशिका विन्यास तब प्राप्त किया जाता है जब चूषण पर्याप्त बल के साथ किया जाता है ताकि टूटी हुई झिल्ली माइक्रोपिपेट को बंद न करे और झिल्ली या यहां तक कि कोशिका के एक बड़े हिस्से को आकर्षित न करे।
  17. उपयोग किए गए सिस्टम सेटिंग्स मैनुअल की जाँच करें। श्रृंखला प्रतिरोध (एसआर) और पूरे सेल धारिता (डब्ल्यूसीसी) की डिजिटल जांच और गणना करने के लिए सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
  18. वोल्टेज-क्लैंप मोड पर, कोशिका झिल्ली को तोड़ने के बाद, पूरे सेल विकल्प को सक्षम करें, और पूरे सेल टैब का उल्लेख करते हुए ऑटो कमांड पर क्लिक करें। सेल के एसआर और डब्ल्यूसीसी स्वचालित रूप से गणना की जाएगी और सॉफ्टवेयर द्वारा तुरंत प्रदर्शित की जाएगी। सामग्री तालिका33 में उल्लिखित एम्पलीफायर के साथ झिल्ली परीक्षण करके इन मापदंडों की भी जांच की जा सकती है।
  19. सेल व्यवहार्यता मापदंडों की जांच करना सुनिश्चित करें। किसपेप्टिन न्यूरॉन्स के लिए, जांचें कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल माप हैं: एसआर < 25 मीटर की मात्रा, इनपुट प्रतिरोध > 0.3 जी, और 30 पीए (व्यक्तिगत अवलोकन और संदर्भ21) < वर्तमान पूर्ण मूल्य धारण करना। पीईएन किसपेप्टिन या एआरएचकिसपेप्टिन न्यूरॉन्स के डब्ल्यूसीसी का औसत मूल्य गोनैड-बरकरार चूहों 20 में ≈10-12 पीएच है।
  20. प्रयोगों के दौरान एसआर और सेल स्थिर-राज्य धारिता की निगरानी करें। सुनिश्चित करें कि एसआर रिकॉर्डिंग के दौरान 20% से अधिक नहीं बदलता है और झिल्ली धारिता स्थिर है।
  21. सॉफ़्टवेयर सेटिंग्स की जाँच करें। प्रयोग के प्रकार के अनुसार रिकॉर्डिंग के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल बनाएं। सामग्री की तालिका में उल्लिखित उपकरणों के साथ, वर्तमान-क्लैंप मोड में झिल्ली क्षमता रिकॉर्ड करने के लिए, कम-पास 2-4 kHz पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल संकेतों को फ़िल्टर करें और एक सॉफ्टवेयर में ऑफ़लाइन परिणामों का विश्लेषण करें (सॉफ्टवेयर जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
  22. एक बार जब पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन को ठीक से प्राप्त किया जाता है, तो वोल्टेज-क्लैंप मोड (चित्रा 2 जी) में सिनैप्टिक धाराओं को मापें। वर्तमान-क्लैंप मोड (चित्रा 2 एच) में विश्राम झिल्ली क्षमता (आरएमपी) और प्रेरित आरएमपी विविधताओं में परिवर्तन रिकॉर्ड करें। आरएमपी में परिवर्तन, जैसे कि कोशिका झिल्ली का विध्रुवण, स्नान के लिए एक ज्ञात दवा / न्यूरोट्रांसमीटर (चरण 3.2 में वर्णित) को प्रशासित करके प्रेरित किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है।
    नोट: वर्तमान-क्लैंप मोड में, वांछित वोल्टेज पर झिल्ली वोल्टेज को पकड़ने के लिए सकारात्मक या नकारात्मक प्रवाह इंजेक्ट किया जा सकता है। किसपेप्टिन न्यूरॉन्स के लिए, हम आमतौर पर झिल्ली क्षमता की सहज भिन्नता को रिकॉर्ड करने के लिए शून्य वर्तमान इंजेक्शन (आई = 0) सेट करते हैं।

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Representative Results

हाइपोथैलेमिक किसपेप्टिन न्यूरॉन्स की गतिविधि पर मानव पुनः संयोजक विकास हार्मोन (एचजीएच) के संभावित प्रभावों का अध्ययन करने के लिए, हमने मस्तिष्क स्लाइस में पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का प्रदर्शन किया और मूल्यांकन किया कि क्या यह हार्मोन एवीपीवी / पीईएन किसपेप्टिन और एआरएचकिसपेप्टिन न्यूरॉन्स की गतिविधि में तीव्र परिवर्तन का कारण बनता है। जीएफपी महिला (डायस्ट्रस-स्टेज) और नर चूहों36 का उपयोग इस अध्ययन में किया गया था। प्रयोगों के लिए गोनैड-बरकरार जानवरों का चयन किया गया था, क्योंकि उनके हाइपोथैलेमिक किसपेप्टिन न्यूरॉन्स के गुण सेक्स स्टेरॉयड के स्तर19,20 के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। जबकि लिंगों के बीच अंतर का मूल्यांकन करना वर्तमान अध्ययन के दायरे से परे था, हम अधिक जानकारी के लिए पाठक को क्रॉफ्ट एट अल और फ्राज़ो एट अल .19,20 का संदर्भ देते हैं। आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवर, जैसे चूहे और चूहे, इस प्रकार के प्रयोग के लिए रोमांचक उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्योंकि एक विशिष्ट जीन या चयनात्मक-प्रेरित पृथक्करण व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को जीएफपी जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन द्वारा पहचाना जा सकता है। आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उपयोग किसपेप्टिन न्यूरॉन गतिविधि को समझने में एक सफलता का प्रतिनिधित्व करता है।

रिकॉर्ड किए गए न्यूरॉन्स (12 जानवरों में से 26 कोशिकाएं) न्यूरोएनाटोमिकल विशेषताओं35 और अंतर्जात जीएफपी20 की अभिव्यक्ति के अनुसार निर्धारित किए गए थे। वर्तमान-क्लैंप मोड में, न्यूरॉन्स को पूरे सेल पैच-क्लैंप कॉन्फ़िगरेशन में आई = 0 के तहत दर्ज किया गया था। एवीपीवी / पीईएनकिसपेप्टिन न्यूरॉन्स (नौ जानवरों से 12 कोशिकाएं) ने -59.0 एमवी ± 3.0 एमवी (रेंज: -75 एमवी से -46 एमवी), 0.9 ± 0.1 जीक्यू का इनपुट प्रतिरोध, 12.3 पीएच ± 1.6 पीएफ का डब्ल्यूसीसी और 19.4 ± 1.9 मीटर का एसआर प्रदर्शित किया। दर्ज किए गए न्यूरॉन्स में, 12 एवीपीवी / पीईएनकिसपेप्टिन कोशिकाओं में से तीन ने आराम पर एक्शन पोटेंशिअल (एपी) के सहज निर्वहन दिखाए (0.1 हर्ट्ज ± 0.06 हर्ट्ज; सहज रूप से सक्रिय कोशिकाओं का औसत आरएमपी -50.7 एमवी ± 2.7 एमवी) था। एआरएचकिसपेप्टिन न्यूरॉन्स (12 जानवरों से 14 कोशिकाएं) का औसत आरएमपी -50.0 एमवी ± 1.5 एमवी (रेंज: -62 एमवी से -39 एमवी) था, औसत इनपुट प्रतिरोध 1.7 ± 0.1 जीक्यू था, डब्ल्यूसीसी 9.2 पीएच ± 0.7 पीएफ था, और एसआर 16.9 ± 1.7 मीटर था। अधिकांश एआरएचकिसपेप्टिन न्यूरॉन्स क्विसेंट थे, जबकि 14 में से चार कोशिकाओं ने आराम पर सहज एपी दिखाया (0.9 हर्ट्ज ± 0.5 हर्ट्ज; सहज रूप से सक्रिय कोशिकाओं का औसत आरएमपी -52.7 एमवी ± 1.4 एमवी)।

स्नान के लिए एचजीएच (20 μg / g) के प्रशासन ने कई रिकॉर्ड किए गए न्यूरॉन्स के आरएमपी के एक महत्वपूर्ण हाइपरपोलराइजेशन को प्रेरित किया, 12 एवीपीवी / पीईएन किसपेप्टिन न्यूरॉन्स में से पांच (9 चूहों से ≈55% कोशिकाएं), और 14 में से नौ एआरएच किसपेप्टिन न्यूरॉन्स (12 चूहों से ≈65% कोशिकाएं, पी = 0.0006, फिशर का सटीक परीक्षण; चित्र 3)। एवीपीवी / पीईएन किसपेप्टिन और एआरएचकिसपेप्टिन हाइपरपोलराइज्ड न्यूरॉन्स ने अनुत्तरदायी कोशिकाओं की तुलनामें आरएमपी को काफी बदल दिया (चित्रा 3 बी, ई; मान-व्हिटनी परीक्षण)। आरएमपी पर प्रभाव (चित्रा 3 सी, एफ; एनोवा और टुकी के पोस्ट-टेस्ट के दोहराए गए उपाय) के बाद एवीपीवी / पीईएनकिसपेप्टिन पर पूरे सेल इनपुट प्रतिरोध (आईआर) में उल्लेखनीय कमी आई (एचजीएच आवेदन के दौरान 0.9 ± 0.1 जीक्यू से 0.7 ± 0.1 जीक्यू, पी = 0.02; चित्रा 3 डी), और एआरएचकिसपेप्टिन पर (एचजीएच आवेदन के दौरान 1.7 ± 0.1 जीक्यू से 1.0 ± 0.1 जी, पी < 0.0001; एनोवा और टुकी के पोस्ट-टेस्ट को दोहराया गया; चित्र 3G) न्यूरॉन्स। इसके अतिरिक्त, एचजीएच-हाइपरपोलराइज्ड न्यूरॉन्स के सहज एपी (एफएपी) की आवृत्ति कोशिकाओं की दोनों आबादी में कम हो गई (एवीपीवी / पीईएनकिसपेप्टिन में 0.1 हर्ट्ज ± 0.0 हर्ट्ज ± 0.0 हर्ट्ज और एआरएचकिसपेप्टिन न्यूरॉन्स में 0.0 हर्ट्ज ± 0.2 हर्ट्ज ± 0.1 हर्ट्ज)। हालांकि, इस कमी की सीमा सांख्यिकीय महत्व के स्तर तक पहुंचने में विफल रही (पी > 0.05, मैन-व्हिटनी परीक्षण)। एचजीएच वॉशआउट के बाद, आरएमपी और आईआर को बेसलाइन (चित्रा 3 ए, सी, डी, एफ, जी) में बहाल किया गया था। शेष किसपेप्टिन न्यूरॉन्स एचजीएच प्रशासन के प्रति अनुत्तरदायी थे।

हमने पहले दिखाया है कि पीजीएच हाइपोथैलेमिक किसपेप्टिन न्यूरॉन गतिविधि पर कोई प्रभाव नहीं डालता है (कृपया सिल्वेरा एट अल 25 देखें; चित्रा 3 एच)। ध्यान दें, यह ज्ञात है कि एचजीएच जीएच रिसेप्टर्स37,38 के अलावा प्रोलैक्टिन (पीआरएल) रिसेप्टर्स को सक्रिय कर सकता है। इसके अलावा, पीआरएल अप्रत्यक्ष रूपसे चूहों में एवीपीवी / पीईएनकिसपेप्टिन न्यूरॉन्स के केवल ≈20% को विध्रुवीकृत करता है। इसके विपरीत, पीआरएल एआरएचकिसपेप्टिन कोशिकाओं24 के तेजी से सिनैप्टिक ट्रांसमिशन को संशोधित नहीं करता है। इसलिए, यहां रिपोर्ट किए गए एचजीएच-प्रेरित हाइपरपोलराइजेशन प्रभाव निरर्थक प्रतीत होते हैं। देखे गए अंतर दवा एकाग्रता, प्रजातियों के अंतर (मानव बनाम माउस), या यहां तक कि इस्तेमाल की गई दवाओं की संरचना में लवण की उपस्थिति जैसे चर पर निर्भर हो सकते हैं, जैसा कि पहले बताया गयाथा।

Figure 1
चित्रा 1: किसपेप्टिन न्यूरॉन्स की गतिविधि के ज्ञान में पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक के योगदान को सारांशित करने वाला योजनाबद्ध आरेख। किसपेप्टिन न्यूरॉन्स (हरे रंग में दिखाए गए) एंटेरोवेंट्रल पेरिवेंट्रिकुलर और रोस्ट्रल पेरिवेंट्रिकुलर नाभिक (एवीपीवी / पीईएन) और हाइपोथैलेमस (एआरएच) के आर्क्यूट नाभिक में स्थित हैं। एवीपीवी / पीईएन किसपेप्टिन और एआरएचकिसपेप्टिन कोशिकाएंप्रीप्टिक क्षेत्र (पीओए) में स्थित गोनाडोट्रोफिन-रिलीजिंग हार्मोन (जीएनआरएच) न्यूरॉन्स के सोमा और उनके टर्मिनलों को औसत प्रतिष्ठा (एमई) पर सीधे कनेक्शन भेजती हैं, जिसके परिणामस्वरूप हाइपोथैलेमस-पिट्यूटरी-एक्सिस (एचपीजी) का मॉड्यूलेशन होता है। विभिन्न न्यूरोमोड्यूलेटर, जैसे हार्मोन, को एवीपीवी / पीईएनकिसपेप्टिन और एआरएच किसपेप्टिन न्यूरॉन्स की गतिविधि को अलग-अलग संशोधित करने के लिए दिखाया गया है। आराम करने वाली झिल्ली क्षमता पर संभावित प्रभाव पूरे सेल पथ-क्लैंप तकनीक और वर्तमान-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि अनुरेखण द्वारा योजनाबद्ध रूप से प्रदर्शित किए जाते हैं। लाल रंग इंगित करता है कि एक विशिष्ट न्यूरोट्रांसमीटर आराम झिल्ली क्षमता (आरएमपी) 17,22,24,26,28,29,30,31,32 के विध्रुवण को प्रेरित करता है; नीला रंग आरएमपी 24,25,26,27,30 पर कोई प्रभाव नहीं दर्शाता है। धराशायी रेखा आरएमपी को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक द्वारा रुचि के सेल की सीलिंग प्राप्त करने के लिए बुनियादी कदम। (ए, बी) मस्तिष्क स्लाइस (250 μm) के प्रतिनिधि फोटोमाइक्रोग्राफ जिसमें एंटेरोवेंट्रल पेरिवेंट्रिकुलर न्यूक्लियस (एवीपीवी) और हाइपोथैलेमस (एआरएच) के आर्क्यूट न्यूक्लियस में किसपेप्टिन कोशिकाएं होती हैं। किसपेप्टिन न्यूरॉन्स की पहचान हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) अभिव्यक्ति द्वारा की गई थी। (सी) फोटोमाइक्रोग्राफ एक माइक्रोपिपेट (इलेक्ट्रोलाइट समाधान [आंतरिक समाधान] युक्त) का प्रदर्शन करता है जो सील करने के लिए प्लाज्मा झिल्ली में एक डिंपल बनाने के लिए कोशिका के करीब पर्याप्त है। (D, E) कोशिका झिल्ली को माइक्रोपिपेट (डी) में सील करने के लिए हल्के नकारात्मक दबाव (हेडस्टेज और माइक्रोपिपेट से जुड़ी ट्यूब पर किया गया मुंह चूषण) की आवश्यकता होती है। प्लाज्मा झिल्ली टूटने (ई) को प्रेरित करने के लिए नकारात्मक दबाव (हल्के और संक्षिप्त) का दूसरा अनुप्रयोग आवश्यक है। (एफ) सेल गतिविधि का पंजीकरण पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले यांत्रिक सेटअप द्वारा किया जाता है। प्लाज्मा झिल्ली को तोड़ने के बाद, पैच किए गए सेल में आयनिक चैनलों के माध्यम से बहने वाली धाराओं को एक अत्यधिक संवेदनशील एम्पलीफायर से जुड़े इलेक्ट्रोड द्वारा दर्ज किया जा सकता है। एक फीडबैक रेसिस्टर वोल्टेज-क्लैंप (जी) या करंट-क्लैंप (एच) रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक करंट उत्पन्न करता है। संक्षेप: 3 वी = तीसरा वेंट्रिकल; एमई = औसत प्रतिष्ठा। स्केल सलाखों: A = 130 μm, B = 145 μm, C = 20 μm, D = 15 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: दवा विशिष्टता का परीक्षण। (ए) प्रतिनिधि वर्तमान-क्लैंप रिकॉर्डिंग यह दर्शाती है कि मानव पुनः संयोजक विकास हार्मोन (एचजीएच) ने हाइपोथैलेमस (एआरएच किसपेप्टिन) के आर्क्यूट नाभिक में स्थितकिसपेप्टिन न्यूरॉन्स की विश्राम झिल्ली क्षमता (आरएमपी) के हाइपरपोलराइजेशन को प्रेरित किया। (B-G) बार ग्राफ ़ एंटेरोवेंट्रल पेरिवेंट्रिकुलर और रोस्ट्रल पेरिवेंट्रिकुलर नाभिक (एवीपीवी / पीईएन किसपेप्टिन) (बी-डी) या एआरएच (ई-जी) में स्थित एचजीएच-उत्तरदायी किसपेप्टिन न्यूरॉन्स के विश्राम झिल्ली क्षमता (आरएमपी) (बी, सी, ई, एफ) और औसत इनपुट प्रतिरोध (आईआर) (डी, जी) में औसत परिवर्तन का प्रदर्शन करते हैं।). प्रतिनिधि वर्तमान-क्लैंप रिकॉर्डिंग से पता चलता है कि पोर्सिन विकास हार्मोन (पीजीएच) ने एआरएचकिसपेप्टिन न्यूरॉन्स के आरएमपी पर कोई प्रभाव नहीं डाला, जैसा कि पहले25 (एच) बताया गया था। उपयोग किए जाने वाले महत्व परीक्षण (बी) और (ई) के लिए मान-व्हिटनी परीक्षण हैं, और एनोवा और ट्यूकी के पोस्ट-टेस्ट (सी, डी, एफ, जी) के लिए दोहराए गए उपाय हैं। धराशायी रेखा आरएमपी को इंगित करती है। * पी = 0.02; ** पी = 0.004, ***पी = 0.0003; पी < 0.0001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

आंतरिक समाधान (100 एमएल)
नमक FW (g/mol) एकाग्रता वजन (जी)
के-ग्लूकोनेट 234.2 120 mM 2.81
NaCl 58.4 1.0 mM 0.006
KCl 74.5 10 mM 0.074
HEPES 238.3 10 mM 0.24
EGTA 380.3 5.0 mM 0.19
CaCl2 147.0 1.0 mM 0.015
MgCl2 203.0 1.0 mM 0.02
KOH 56.11 3.0 mM 0.017
एटीपी 507.18 4.0 mM 0.20
pH = 7.3 / परासरण ता = 275 - 280 mOsm

तालिका 1: आंतरिक समाधान की तैयारी के लिए अभिकर्मक। तालिका में आणविक भार (एफडब्ल्यू), वांछित सांद्रता, और 100 एमएल समाधान की तैयारी के लिए लवण का गणना वजन शामिल है।

एसीएसएफ/स्लाइसिंग समाधान (250 एमएल)
नमक परिवार कल्याण एकाग्रता वजन (जी)
शर्करा 342.3 238 mM 18.5
केसीएल 74.5 2.5 mM 0.046
NaHCO3 84.0 26 mM 0.546
NaH2PO4 120.0 1.0 mM 0.03
MgCl2 203.0 5 mM 0.254
डी-ग्लूकोज 180.2 10 mM 0.450
CaCl2 147.0 1.0 mM 0.037
pH = 7.3 / परासरण ता = 290 - 295 mOsm

तालिका 2: स्लाइसिंग समाधान तैयार करने के लिए अभिकर्मक। तालिका में आणविक भार (एफडब्ल्यू), वांछित सांद्रता, और 250 एमएल समाधान की तैयारी के लिए लवण का गणना वजन शामिल है। कटा हुआ होने वाले इस घोल में मस्तिष्क डूब जाता है।

रिकॉर्डिंग के लिए एसीएसएफ (1 एल)
नमक परिवार कल्याण एकाग्रता वजन (जी)
NaCl 58.4 135 mM 7.88
केसीएल 74.5 3.5 mM 0.261
NaHCO3 84.0 26 mM 2,184
NaH2PO4 120.0 1.25 mM 0.150
MgSO4 246.5 1.2 mM 0.296
डी-ग्लूकोज 180.2 10 mM 1,802
CaCl2 147.0 1.0 mM 0.148
pH = 7.3 / परासरण ता = 290-300 mOsm

तालिका 3: रिकॉर्डिंग के लिए एसीएसएफ तैयार करने के लिए अभिकर्मक। तालिका में आणविक भार (एफडब्ल्यू), वांछित सांद्रता और 1 एल समाधान की तैयारी के लिए लवण का गणना वजन शामिल है।

पूरक चित्र 1: इन-हाउस बने रिकवरी चैंबर का उदाहरण। (ए, बी) एक इन-हाउस रिकवरी चैंबर निम्नानुसार बनाया जा सकता है: 24-वेल प्लेट को काटें ताकि नौ कुएं उपलब्ध हों। नौ कुओं के आधार पर एक नायलॉन स्क्रीन को गोंद दें। कुएं की प्लेट के शेष भाग के साथ, एक आधार बनाएं ताकि नायलॉन का निचला हिस्सा मुक्त हो। (सी) इस अनुकूलित आधार को कृत्रिम मस्तिष्कमेरु रीढ़ की हड्डी के तरल पदार्थ (एसीएसएफ) युक्त 500 एमएल बीकर के अंदर रखा जा सकता है जो लगातार कार्बोजेन (95% ओ 2 और 5% सीओ 2) से संतृप्त होता है। (डी) पुनर्प्राप्ति कक्ष रखने वाले बीकर को प्रयोग के दौरान पानी के स्नान में रखा जाता है। (E, F) एक ऐक्रेलिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग मस्तिष्क स्लाइस को रिकवरी चैंबर में स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक के विकास का वैज्ञानिक समुदाय पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा, जिसे वैज्ञानिक अनुसंधान विकसित करने और कई खोजों को सक्षम करने के लिए सर्वोपरि महत्व माना जा रहा है। विज्ञान पर इसका प्रभाव 1991 में चिकित्सा में नोबेल पुरस्कार में समाप्त होने के लिए पर्याप्त था, क्योंकि इस खोज ने शारीरिक और रोग संबंधी स्थितियों के तहत आयन चैनल कैसे कार्य करते हैं, साथ ही चिकित्सीय एजेंटों 11,39,40,41 के लिए संभावित लक्ष्यों की पहचान की बेहतर समझ के लिए दरवाजा खोला।. चिकित्सा के क्षेत्र में, इस तकनीक का उपयोग करके किए गए उत्कृष्ट निष्कर्षों में से एक यह था कि नैदानिक रूप से उपयोग किए जाने वाले कई पदार्थ आयन चैनलों (जैसे, स्थानीय एनेस्थेटिक्स, एंटीरैडमिक्स, एंटीडायबिटिक्स और मांसपेशियों को आराम देने वाले) के साथ सीधे बातचीत करते हैं। इसलिए, इसकी प्रयोज्यता नैदानिक संस्थानों और बुनियादी अनुसंधान विभागों में स्पष्ट है। यह लेख हाइपोथैलेमिक किसपेप्टिन न्यूरॉन्स युक्त मस्तिष्क स्लाइस पर पूरे सेल पैच-क्लैंप प्रयोगों को करने के लिए बुनियादी तैयारी के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। हम बुनियादी चरणों को रेखांकित करते हैं और उल्लेखनीय मापदंडों को उजागर करते हैं जिन्हें ऊतक प्राप्त करने और पैच-क्लैंप तकनीक के लिए समाधान तैयार करने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए। हालांकि, यह लेख इस तकनीक की जटिलता और प्रत्येक प्रकार की रिकॉर्डिंग में शामिल तंत्र, विशेष रूप से विश्लेषण का पूरी तरह से वर्णन नहीं कर सकता है। आगे सैद्धांतिक सीखने के लिए, पैच-क्लैंप तकनीक पर कुछ पुस्तकों और समीक्षाओं की सिफारिश की जाती है 10,43,44,45,46।

पैच-क्लैंप विधि में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक समाधान का एक विशिष्ट उद्देश्य है; इसलिए, इसकी विशिष्ट रचनाओं और मानदंडों को तैयारी के दौरान सख्ती से अपनाया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, आंतरिक समाधान की संरचना को प्रयोग के लक्ष्य के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए, क्योंकि यह मापा जाने वाले वर्तमान के प्रकार के आधार पर भिन्न होता है। यहां उल्लिखित क्लोराइड-आधारित समाधान, जिसमें सीएल- (15 एमएम) सेल साइटोप्लाज्म47 की शारीरिक एकाग्रता की नकल करता है, का उपयोग सक्रिय और निष्क्रिय न्यूरोनल गुणों या सिनैप्टिक इनपुट की प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। यह जोर देना महत्वपूर्ण है कि आंतरिक समाधान में क्लोराइड सामग्री सेल रिकॉर्डिंग के लिए इष्टतम स्तर पर क्लोराइड संतुलन क्षमता रखती है (उल्लिखित समाधानईसीएल में, यह लगभग -59 एमवी है)। इंट्रासेल्युलर क्लोराइड एकाग्रता का अनुमान जीएबीए-प्रेरित धारा (ईजीएबीए) के लिए रिवर्सल क्षमता का मूल्यांकन करके लगाया जा सकता है, यह मानते हुए कि जीएबीएए रिसेप्टर के माध्यम से सभी वर्तमान सीएल -21,48 द्वारा किए जाते हैं। हाइपोथैलेमिक किसपेप्टिन न्यूरॉन्स के अध्ययन के लिए, किसी को यह विचार करना चाहिए कि एआरएच किसपेप्टिन के लिए इंट्रासेल्युलर सीएल-एकाग्रता एवीपीवी / पीईएनकिसपेप्टिन कोशिकाओं21 की तुलनामें अधिक है। एक प्रयोग की योजना बनाते समय इस विशेषता पर विचार किया जाना चाहिए। आंतरिक समाधान की परासरणता रिकॉर्डिंग के लिए एसीएसएफ की तुलना में कम से कम 5% कम होने की सिफारिश की जाती है ताकि संभावित सूजन और / यासेल कमजोर होने के कारण सील के नुकसान से बचा जा सके। यदि एक इंट्रासेल्युलर यौगिक को जोड़ने की आवश्यकता है जिसे आंतरिक समाधान में सेल मार्कर के रूप में आगे इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे कि बायोसाइटिन या इंट्रासेल्युलर डाई (जैसे, एलेक्सा फ्लुर 594), के + स्तर को कम किया जा सकता है ताकि परासरण ता को लगातार 20,47,49,50 बनाए रखा जा सके।

एक उचित स्लाइसिंग समाधान के साथ स्लाइसिंग के दौरान तेजी से मस्तिष्क विच्छेदन करना और कम तापमान (0-2 डिग्री सेल्सियस) बनाए रखना महत्वपूर्ण है। स्लाइसिंग समाधान सेल के प्रकार और / या मस्तिष्क क्षेत्र का मूल्यांकन33,47 के अनुसार भिन्न हो सकते हैं। मस्तिष्क स्लाइस (यानी, स्लाइसिंग समाधान) प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एसीएसएफ समाधान में आमतौर पर रिकॉर्डिंग के लिए एसीएसएफ से एक अलग संरचना होती है (तुलना के लिए, तालिका 2 और तालिका 3 देखें)। न्यूरॉन्स की उत्तेजना को संशोधित करने के लिए केशन (सीए 2 + और एमजी2 +) सांद्रता को समायोजित किया जा सकता है, जो फायरिंग थ्रेशोल्ड और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज47 को भी प्रभावित कर सकता है। कम सीए 2 + और उच्च एमजी2 + मीडिया का व्यापक रूप से संभावित एक्साइटोटॉक्सिक प्रक्रियाओं को कम करने के लिए उपयोग किया जाता है (अधिक जानकारी के लिए,51 देखें)। इसके अलावा, कम सीए 2 + और उच्च एमजी2 + मीडिया हाइपोथैलेमिक न्यूरॉन गतिविधि52 को उत्तेजित कर सकते हैं। रिकॉर्डिंग के लिए एसीएसएफ के बारे में, कुछ विशेषताएं समान हैं। बफर सिस्टम NaHCO3 पर आधारित है, उच्च NaCl सांद्रता (आमतौर पर >100 mM) और कम KCl सांद्रता (आमतौर पर <5 mM), Ca 2+ और Mg2+ (2: 1 अक्सर उपयोग किया जाता है) की सापेक्ष सांद्रता आमतौर पर लगभग 2 mM होती है, और ग्लूकोज का स्तर 1 से 10 mM47 तक हो सकता है। समाधानों की परासरणता, पीएच, या तापमान परिवर्तन (डिजिटल रूप से 30-32 डिग्री सेल्सियस के बीच नियंत्रित) की विविधताओं के अलावा, यह उजागर करना महत्वपूर्ण है कि प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के दौरान अन्य मुद्दे हो सकते हैं जो प्रयोग में काफी हस्तक्षेप करते हैं। रिकॉर्डिंग के दौरान इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल माप स्थिर होना चाहिए, और किसी भी बदलाव में एक महत्वपूर्ण रीडिंग होनी चाहिए। उदाहरण के लिए, एसआर परिवर्तन पूरे सेल मोड में सेलुलर पहुंच के लिए खाते हैं और मापा धाराओं और क्षमताओं पर काफी परिणाम होते हैं। इसके अलावा, इस बात पर जोर देना महत्वपूर्ण है कि पैच-क्लैंप पद्धति से संबंधित एक प्रासंगिक सीमा जिस पर विचार किया जाना चाहिए, वह अत्यधिक चूषण / दबाव प्रोटोकॉल द्वारा सेल की यांत्रिक अतिउत्तेजना है जो रूपात्मक औरकार्यात्मक परिवर्तनों को प्रेरित कर सकती है। इस पूर्वाग्रह को अक्सर प्रोटोकॉल में नियंत्रित करना मुश्किल होता है जहां चूषण एक उपकरण के बजाय मुंह से किया जाता है जो लागू चूषण तीव्रता को ठीक से नियंत्रित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, ऊतक से संबंधित मुद्दे, जो कोशिका मृत्यु दर के उच्च प्रतिशत के साथ समाप्त होते हैं, अपर्याप्त विच्छेदन, हाइपोक्सिया, या माउस की स्वास्थ्य स्थिति के कारण हो सकते हैं जो एक शोधकर्ता अवलोकन द्वारा पहचान नहीं सकता है।

पूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक का मुख्य लाभ विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन्स को ठीक से रिकॉर्ड करने की क्षमता है। इस तकनीक ने आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों के निर्माण से काफी लाभ उठाया है। हमारा समूह आम तौर पर एक माउस मॉडल के साथ काम करता है जो Kiss1 जीन प्रमोटर या किसी अन्य के तहत hrGFP को व्यक्त करता है जो Kiss1 जीन प्रमोटर के तहत Cre-recombinase और Cre-सशर्त अभिव्यक्ति के तहत जीएफपी को व्यक्त करता है। हालांकि, आजकल 23,26,36 के कई मान्य पशु मॉडल हैं। इसके अलावा, रक्त-मस्तिष्क बाधा की अनुपस्थिति और तथ्य यह है कि बाह्य और इंट्रासेल्युलर वातावरण को आसानी से नियंत्रित और हेरफेर किया जा सकता है, इस विधि के फायदे का प्रतिनिधित्व करता है; हालांकि, वे आवश्यक रूप से एक शारीरिक स्थिति का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। विवो तैयारी की तुलना में इस तकनीक की सीमाओं के बीच, या साइटोप्लाज्मिक आयनिक एकाग्रता को संरक्षित करने के उद्देश्य से अन्य रिकॉर्डिंग प्रकार, जैसे कि ऑन-सेल या छिद्रित-पैच रिकॉर्डिंग, यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन की आक्रामकता साइटोप्लाज्म सामग्रीके डायलिसिस का कारण बनती है। डायलिसिस कुछ घटनाओं को विकसित करने या व्यक्त करने के लिए आवश्यक आणविक पहलुओं की रुकावट का कारण बन सकता है। स्लाइस से रिकॉर्डिंग करके, यह याद रखने की आवश्यकता है कि अधिकांश न्यूरॉन्स के अनुमान ों को वर्गीकृत किया गया है। इस प्रकार, यह मूल्यांकन करना तकनीक के दायरे से बाहर है कि यह व्यवधान देखे गए प्रभावों या शारीरिक स्थिति को कितना प्रभावित करता है। जैसा कि उल्लेख किया गया है, 200-300 μm के कोरोनल मस्तिष्क स्लाइस आमतौर पर हाइपोथैलेमिक किसपेप्टिन न्यूरॉन्स 17,19,20,21,34 की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए किए जाते हैं। विशिष्ट एवीपीवी / पीईएन या एआरएच कनेक्टिविटी55 को बनाए रखने वाले किसपेप्टिन कोशिकाओं और विभिन्न स्लाइस कोणों का अध्ययन करने के लिए एक मोटे मस्तिष्क स्लाइस अनुभाग का उपयोग करने की सीमा को आगे की जांच की आवश्यकता है। इसके अलावा, एक न्यूरॉन के आरएमपी पर एक हार्मोन / दवा, सिंथेटिक या नहीं, के प्रभाव का परीक्षण करके, कई अध्ययन दवा ईसी50 (यदि यह ज्ञात है) या प्रकाशित आंकड़ों पर आधारित हैं जो प्रदर्शित करते हैं कि एक विशिष्ट एकाग्रता फायरिंग दर को सक्रिय करने या [सीए2 +] आई स्तरों को बदलने में प्रभावी है। हालांकि, प्रयोगों में उपयोग की जाने वाली दवा की संरचना / विशिष्टता के बारे में पता होना चाहिए, क्योंकि यह संभव है कि अन्य समान दवाओं की तुलना में शुद्ध सिंथेटिक दवाओं केविरोधी प्रभाव हो सकते हैं। जैसा कि पहले25 में दिखाया गया था, जबकि शुद्ध पीजीएच हाइपोथैलेमिक किसपेप्टिन न्यूरॉन गतिविधि पर कोई प्रभाव नहीं डालता है, एचजीएच ने विवादास्पद डेटा का उत्पादन किया (चित्रा 3 देखें)। इसी तरह के परिणाम प्रदर्शित किए गए थे जब एआरएच पर इंसुलिनप्रभाव का आकलन किया गया था। इसलिए, एक प्रयोग की योजना बनाते समय और प्राप्त परिणामों की व्याख्या करते समय दवा-विशिष्टता पर विचार किया जाना चाहिए।

पैच-क्लैंप तकनीक न्यूरॉन विद्युत गतिविधि के बारे में डेटा प्राप्त करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है और कई न्यूरोनल आबादी के ज्ञान में महत्वपूर्ण योगदान दिया है, जैसे कि किसपेप्टिन न्यूरॉन्स। यहां दिए गए अधिकांश विवरण आमतौर पर हाइपोथैलेमिक न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किए जाते हैं, जैसा कि हमने पहले 25,50,56,57,58,59,60 की रिपोर्ट की है। महत्वपूर्ण रूप से, किसपेप्टिन न्यूरॉन्स के अलावा अन्य न्यूरोनल आबादी को रिकॉर्ड करने के लिए, किसी को इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल माप ों को जानना या निर्धारित करना चाहिए जो सेल प्रकारों की पहचान करने में मदद कर सकते हैं, जैसे सेल कैपेसिटेंस, एसआर, इनपुट प्रतिरोध, सेल फायरिंग पैटर्न और अन्य पैरामीटर। ये गुण विभिन्न मस्तिष्क कोशिकाओं, मस्तिष्क नाभिक, और शारीरिक या प्रेरित स्थितियों के बीच भिन्न होते हैं, जैसे कि परिसंचारी सेक्स स्टेरॉयड स्तर 16,19,20,21,61, जो परिणामों के महत्वपूर्ण विश्लेषण में काफी हद तक हस्तक्षेप कर सकता है। इसके अलावा, इस तकनीक के साथ काम करने के लिए ऊतक तैयारी में शामिल संभावित चर और उनके संबंधित फायदे और सीमाओं को समझना आवश्यक है। यहां वर्णित सभी चरणों को विवेकपूर्ण ढंग से आयोजित किया जाना चाहिए, क्योंकि प्रोटोकॉल में शामिल चर में कोई भी बदलाव परिणामों में भारी हस्तक्षेप कर सकता है।

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Disclosures

हितों के टकराव की घोषणा नहीं की जाएगी।

Acknowledgments

इस अध्ययन को साओ पाउलो रिसर्च फाउंडेशन [एफएपीईएसपी अनुदान संख्या: 2021/11551-4 (जेएनएस), 2015/20198-5 (टीटीजेड), 2019/21707/1 (आरएफ); और कोर्डेनाको डी एपरफेइकोमेंटो डी पेस्सोअल डी निवेल सुपीरियर (सीएपीएस) - वित्त कोड 001 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP Sigma Aldrich/various A9187
CaCl2 Sigma Aldrich/various C7902
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich/various G7021
EGTA Sigma Aldrich/various O3777
HEPES Sigma Aldrich/various H3375
KCL Sigma Aldrich/various P5405
K-gluconate Sigma Aldrich/various G4500
KOH Sigma Aldrich/various P5958
MgCl2 Sigma Aldrich/various M9272
MgSO4 Sigma Aldrich/various 230391
NaCl Sigma Aldrich/various S5886
NaH2PO4  Sigma Aldrich/various S5011
NaHCO3 Sigma Aldrich/various S5761
nitric acid Sigma Aldrich/various 225711 CAUTION
Sucrose Sigma Aldrich/various S1888
Equipments
Air table TMC 63-534
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Computer various -
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM Molecular Devices DD1440
Digital peristaltic pump Ismatec ISM833C 
Faraday cage TMC 81-333-03
Imaging Camera Leica DFC 365 FX
Micromanipulator Sutter Instruments Roe-200
Micropipette Puller Narishige PC-10
Microscope Leica DM6000 FS
Osteotome Bonther equipamentos & Tecnologia/various 128
Recovery chamber Warner Instruments/Harvard apparatus - can be made in-house
Recording chamber Warner Instruments 640277
Spatula Fisher Scientific /various FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome  Leica VT1000 S
Water Bath  Fisher Scientific /various Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software Molecular Devices - Commander Software
LAS X wide field system Leica - Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B Molecular Devices MULTICLAMP 700B Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS Molecular Devices Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm Warner Instruments 64-1309
Curved hemostatic forcep various -
cyanoacrylate glue LOCTITE/various -
Decapitation scissors various -
Filter paper various -
Glass capillaries (micropipette) World Precision Instruments, Inc TW150F-4
Iris scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 65-66
Pasteur glass pipette  Sigma Aldrich/various CLS7095B9-1000EA
Petri dish various -
Polyethylene tubing  Warner Instruments 64-0756
Razor blade for brain dissection TED PELLA TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome TED PELLA TEDP-121-9
Scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 71-72, 48,49; 
silicone teat various -
Slice Anchor  Warner Instruments 64-0246
Syringe filters Merck Millipore Ltda SLGVR13SL Millex-GV 0.22 μm
Tweezers Bonther equipamentos & Tecnologia/various 131, 1518

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Silva, J. d. N., Zampieri, T. T.,… More

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T., Vieira, H. R., Frazao, R. Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (193), e64989, doi:10.3791/64989 (2023).

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