Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Гипоталамические кисспептиновые нейроны как мишень для записи цельноклеточных пластырей

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo

Summary

Здесь мы представляем протокол для выполнения цельноклеточного пластыря на срезах мозга, содержащих нейроны кисспептина, первичный модулятор клеток гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ). Добавляя знания об активности кисспептиновых нейронов, этот электрофизиологический инструмент послужил основой для значительных достижений в области нейроэндокринологии за последние 20 лет.

Abstract

Кисспептины необходимы для созревания оси гипоталамо-гипофиз-гонад (HPG) и фертильности. Нейроны гипоталамического кисспептина, расположенные в передневентральном перивентрикулярном ядре и ростральном перивентрикулярном ядре, а также дугообразное ядро гипоталамуса, проецируются на нейроны гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) и другие клетки. Предыдущие исследования показали, что передача сигналов кисспептина происходит через рецептор Kiss1 (Kiss1r), в конечном итоге возбуждая активность нейронов ГнРГ. У людей и экспериментальных животных кисспептины достаточны для индукции секреции ГнРГ и, следовательно, высвобождения лютеинизирующего гормона (ЛГ) и гормона-стимулятора фолликулов (ФСГ). Поскольку кисспептины играют важную роль в репродуктивных функциях, исследователи работают над тем, чтобы оценить, как внутренняя активность нейронов гипоталамуса кисспептина способствует действиям, связанным с размножением, и определить первичные нейротрансмиттеры / нейромодуляторы, способные изменять эти свойства. Метод цельноклеточного пластыря стал ценным инструментом для исследования активности нейронов кисспептина в клетках грызунов. Этот экспериментальный метод позволяет исследователям регистрировать и измерять спонтанные возбуждающие и тормозные ионные токи, мембранный потенциал покоя, возбуждение потенциала действия и другие электрофизиологические свойства клеточных мембран. В настоящем исследовании рассматриваются важнейшие аспекты метода цельноклеточного пластыря, известные как электрофизиологические измерения, определяющие гипоталамические кисспептиновые нейроны, и обсуждение соответствующих вопросов о методе.

Introduction

Ходжкин и Хаксли сделали первую внутриклеточную запись потенциала действия, описанного в нескольких научных исследованиях. Эта запись была выполнена на аксоне кальмара, который имеет большой диаметр (~ 500 мкм), что позволяет поместить микроэлектрод внутрь аксона. Эта работа предоставила большие возможности для научных исследований, которые впоследствии завершились созданием режима напряжения-зажима, который был использован для изучения ионной основы генерации потенциала действия 1,2,3,4,5,6,7,8. С годами методика совершенствовалась, и она стала широко применяться в научныхисследованиях6,9. Изобретение метода патч-зажима, которое произошло в конце 1970-х годов благодаря исследованиям, инициированным Эрвином Неером и Бертом Сакманном, позволило исследователям регистрировать одиночные ионные каналы и внутриклеточные мембранные потенциалы или токи практически в каждом типе клеток, используя только один электрод 9,10,11,12. Запись с помощью патч-зажима может быть выполнена на различных тканевых препаратах, таких как культивируемые клетки или срезы тканей, либо в режиме зажима напряжения (удерживая клеточную мембрану при заданном напряжении, позволяющем записывать, например, зависимые от напряжения токи и синаптические токи), либо в режиме токового зажима (позволяя регистрировать, например, изменения мембранного потенциала покоя, индуцированные ионными токами, потенциалы действия и частота постсинаптических потенциалов).

Использование техники патч-зажима сделало возможным несколько заметных открытий. Действительно, основополагающие данные об электрофизиологических свойствах нейронов кисспептина гипоталамуса, расположенных в передневентральных перивентрикулярных и ростральных перивентрикулярных ядрах (AVPV / PeNKisspeptin), также известных как ростральная перивентрикулярная область третьего желудочка (RP3V), и дугообразное ядро гипоталамуса (АРГкисспептин)13,14,15 представляют особый интерес. В 2010 году Ducret et al. выполнили первые записи нейронов AVPV / PeNKisspeptinу мышей, используя другой электрофизиологический инструмент, метод зажима свободных клеток. Эти исследования предоставили электрическое описание нейроновкисспептина AVPV / PeN и продемонстрировали, что их паттерны возбуждения зависят от эстрального цикла16. В 2011 году Qiu et al. использовали технику зажима всей клетки, чтобы продемонстрировать, что нейроныАРГ кисспептина экспрессируют эндогенные токи кардиостимулятора17. Впоследствии Gottsch et al. показали, что кисспептиновые нейроны проявляют спонтанную активность и экспрессируют кальциевые токи как h-типа (кардиостимулятор), так и T-типа, предполагая, что нейроныАРГ кисспептина разделяют электрофизиологические свойства с другими нейронами кардиостимулятора центральной нервной системы18. Кроме того, было продемонстрировано, что нейроныАРГ кисспептина демонстрируют половую диморфную скорость возбуждения и что нейроны AVPV / PeNKisspeptin проявляют бимодальный мембранный потенциал покоя (RMP), на который влияют чувствительные к АТФ калиевые каналы (KATP)19,20. Кроме того, было установлено, что гонадные стероиды положительно влияют на спонтанную электрическую активность нейронов кисспептина у мышей 19,20,21. Упоминаются первые работы, изучающие электрофизиологические свойства кисспептиновых нейронов 16,17,18,19,20. С тех пор во многих исследованиях использовался метод цельноклеточного пластыря, чтобы продемонстрировать, какие факторы/нейромодуляторы достаточны для модуляции электрической активности нейронов кисспептина (рис. 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

Учитывая важность этого метода для изучения нейронов, необходимых для размножения, среди других типов клеток, не рассмотренных здесь, в этой статье описываются основные этапы разработки метода патч-зажима целых клеток, такие как приготовление растворов, рассечение и разрезание мозга, а также выполнение уплотнения клеточной мембраны для записей. Кроме того, обсуждаются соответствующие вопросы о методе, такие как его преимущества, технические ограничения и важные переменные, которые необходимо контролировать для оптимальной экспериментальной работы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике животных Института биомедицинских наук при Университете Сан-Паулу и выполнялись в соответствии с этическими принципами, принятыми Бразильским колледжем экспериментов на животных.

1. Приготовление растворов

  1. Приготовление внутреннего раствора
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренний раствор заполняет микропипетку с пластырем и контактирует с внутренней частью клетки (см. пример на рисунке 2). Внутренние решения могут варьироваться в зависимости от типа измеряемой активности33.
    1. Выбирайте внутреннее решение с учетом его экспериментального назначения и соответствующего типа записи. Для регистрации мембранного потенциала в режиме токового зажима используют внутренний раствор, состоящий из 120 мМ K-глюконата, 1 мМ NaCl, 5 мМ EGTA, 10 мМ HEPES, 1 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2, 3 мМ KOH, 10 мМ KCl и 4 мМ (Mg)-АТФ. Взвесьте все соли в соответствии с желаемым конечным объемом, как указано в таблице 1.
    2. Используйте достаточное количество деионизированной воды, чтобы достичь 90% конечного объема раствора. Этот объем обеспечит достаточно места для регулировки pH и осмолярности.
    3. После добавления и тщательного перемешивания всех ингредиентов отрегулируйте рН до 7,2-7,3 с помощью 5 М КОН с помощью рН-метра. Используйте осмометр для проверки осмолярности, которая должна составлять около 275-280 мОсм (при необходимости отрегулируйте только в меньшую сторону).
    4. Заранее приготовьте внутренний раствор и храните при температуре 8 °C. Добавьте АТФ в день эксперимента. Храните АТФ-содержащий внутренний раствор при -20 °C (1 мл аликвот) в течение 3-4 месяцев.
  2. Приготовление раствора для нарезки
    1. Приготовьте раствор для нарезки, содержащий 238 мМ сахарозы, 2,5 мМ KCl, 26 мМ NaHCO3, 1,0 мМ 2 PO4, 10 мМ глюкозы, 1,0 мМCaCl2 и 5,0 мМ MgCl2. Взвесьте все соли в соответствии с желаемым конечным объемом, как показано в таблице 2. Точный объем этого раствора, который необходимо приготовить, будет зависеть от размера режущей камеры.
    2. Смешивая все соли в деионизированной воде, постоянно насыщайте карбогеном (95% О2 и 5%СО2). Прикрепите полиэтиленовую трубку (наружный диаметр 1,57 мм [OD] x внутренний диаметр 1,14 мм [ID]) к цилиндру с карбогеном, чтобы подать карбоген в раствор для нарезки. Держите открытый конец трубки внутри стакана, содержащего раствор для нарезки.
    3. Хорошо перемешав все ингредиенты, отрегулируйте рН до 7,3 с 10% азотной кислотой с помощью рН-метра. Используйте осмометр для проверки осмолярности, которая должна составлять 290-295 мОсм (при необходимости отрегулируйте только в меньшую сторону). После этого охладите раствор до 0-2 °C.
  3. Подготовьте раствор aCSF для записей
    1. Приготовьте раствор искусственной спинномозговой жидкости (aCSF) для записи, содержащий 124 мМ NaCl, 2,8 мМ KCl, 26 мМ NaHCO3, 1,25 мМ 2 PO 4, 1,2 мМ MgSO4, 5 мМ глюкозы и 2,5 мМ CaCl2. Взвесьте все соли в соответствии с желаемым конечным объемом, приведенным в таблице 3.
    2. Смешивая все соли в деионизированной воде, постоянно насыщайте их карбогеном (95% О2 и 5%СО2), как описано в шаге 1.2.2.
    3. После добавления и смешивания всех ингредиентов отрегулируйте рН до 7,3 (можно использовать 10% азотную кислоту) с помощью рН-метра. Используйте осмометр для проверки осмолярности, которая должна составлять 290-300 мОсм. После этого налейте aCSF в стакан и выдержите на водяной бане при температуре 30 °C.

2. Вскрытие и нарезка мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку различные структуры мозга могут потребовать разрезания в разных плоскостях (корональный, сагиттальный или горизонтальный срезы), точный подход к получению срезов зависит от интересующей области мозга. Как правило, для изучения клеток, экспрессирующих Kiss1, в нейронах AVPV/PeN и ARH (здесь обозначаются как нейроны AVPV/PeNKisspeptin и нейроныАРГ кисспептина; Рисунок 2А, Б), корональные срезы мозга (200-300 мкм) обычно составляют 17,19,20,21,34. Нейроны кисспептина AVPV / PeN расположены примерно от 0,5 до -0,22 мм от брегмы, тогда как нейроныкисспептина ARH находятся на расстоянии от -1,22 до -2,70 мм. Расположение ядер можно определить с помощью стереотаксического атласа мозга мыши35 или эталонного атласа мозга мыши Аллена (http://mouse.brain-map.org/). В этом исследовании использовались взрослые самки Kiss1-Cre / GFP (стадия диэструса) и самцымышей 36.

  1. Удаление мозга
    1. Подготовьте место вскрытия и инструменты, необходимые для извлечения мозга: обезглавливающие ножницы, ножницы для радужной оболочки глаза, изогнутые ножницы Кастровьехо, остеотом, пинцет, шпатель, фильтровальная бумага, чашка Петри, лезвие бритвы и цианоакрилатный клей.
    2. Перед тем, как сделать срезы, подготовьте скамейку, на которой будет производиться вскрытие, так как все последующие процедуры необходимо выполнять быстро. Убедитесь, что у вас есть доступ к устройству для нарезки, например вибратому.
    3. Подготовьте записывающую камеру для поддержания срезов мозга перед разрезанием ткани. Приобретите записывающую камеру размером 24 мм x 15 мм x 2 мм (Д x Ш x В) у коммерческого бренда (Table of Materials) или изготовьте ее самостоятельно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Собственная камера восстановления может быть изготовлена следующим образом: разрежьте плиту на 24 лунки так, чтобы было доступно девять скважин. Приклейте капроновый экран к основанию девяти лунок. Из остатка колодезной пластины сделайте основание так, чтобы нижняя часть капрона была свободна. Это адаптированное основание может быть помещено в стакан объемом 500 мл, содержащий aCSF (дополнительный рисунок 1).
    4. После того, как все приготовлено, обезболите животное ингаляционным анестетиком, используя 4%-5% изофлурана. Анестезия должна проводиться в соответствии с протоколом, утвержденным этическим комитетом. Вскоре после того, как животное станет неподвижным, проведите тесты на ущипывание хвоста и лап, чтобы убедиться, что животное глубоко обезболито.
    5. Быстро обезглавливайте мышей, пока сердце все еще активно, чтобы повысить жизнеспособность клеток. Быстро собирают мозг после обезглавливания.
    6. Хирургическими ножницами сделайте разрез на коже в верхней части черепа животного, от каудального до рострального, и снимите кожу головы с головы животного. Далее разрежьте ножницами радужной оболочки межтеменную пластинку вдоль сагиттального шва и удалите затылочную кость. Проденьте остеотом под теменную кость и осторожно вытащите его, пока мозг не обнажится.
    7. Обнажив мозг, переверните голову вверх ногами, осторожно опустите мозг, чтобы визуализировать тройничный нерв с каждой стороны, затем разрежьте тройничный нерв с помощью изогнутых ножниц Кастровьехо. Визуализировав гипоталамус, определите зрительный нерв и аккуратно разрежьте его.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при разрезании зрительного нерва, так как его вытягивание разорвет соседнюю область гипоталамуса, содержащую ядро AVPV / PeN.
    8. Отрежьте самую переднюю часть лобной доли и удалите мозг полностью. Немедленно погрузите мозг в раствор для нарезки до получения срезов.
  2. Нарезка образцов мозга
    1. Поместите мозг на фильтровальную бумагу (поддерживаемую чашкой Петри), чтобы высушить излишки раствора. Затем острым режущим лезвием бритвы выполните коронковый разрез, отделяющий ствол мозга с мозжечком от остальной ткани.
    2. Затем приклейте каудальную часть мозга к основанию вибратома и заполните камеру нарезочного устройства раствором для нарезки / ликвора, охлажденным до 0-2 ° C. Во время процедуры уплотните сухой лед вокруг вибратомной камеры, чтобы раствор для нарезки оставался холодным.
    3. Вставьте лезвие бритвы в вибратом и установите соответствующие параметры резки устройства: скорость = 3, частота = 9 и подача = 250 мкм. Используйте акриловую пипетку для переноса (перевернутую стеклянную пипетку Пастера, прикрепленную к силиконовой соске) для переноса срезов в камеру восстановления (описанную на шаге 2.1.3) во время процедуры нарезки ткани. Подождите 60 минут для восстановления тканей после получения среза.

3. Герметизация ячеек для записи

  1. Перед началом записи убедитесь, что все элементы оборудования (микроскоп, усилитель, дигитайзер, микроманипулятор и другие) включены.
  2. Заполните записывающую камеру коммерческой марки (Таблица материалов), прикрепленную к микроскопу, раствором aCSF для записей. Используйте перфузионный насос для постоянной перфузии aCSF со скоростью 2 мл / мин.
  3. Перенесите интересующий срез мозга (по одному) в записывающую камеру. Используйте акриловую пипетку для переноса (перевернутую стеклянную пипетку Пастера, прикрепленную к силиконовому соску), чтобы перенести ломтики гипоталамуса в камеру. Используйте якорь среза (Таблица материалов), чтобы удерживать срез, чтобы он не двигался во время перфузии aCSF.
  4. Поместите срез в центр записывающей камеры, прикрепленной к микроскопу. Положение среза имеет решающее значение для хорошего обзора нужной области под микроскопом и для идеального охвата записывающей микропипетки.
  5. Используйте маломощную линзу объектива иммерсионного микроскопа (10-кратную или 20-кратную), чтобы помочь расположить срез и определить интересующую область.
  6. После определения интересующей области переключите линзу объектива на мощную линзу (63x) и сфокусируйтесь на тканевом уровне, наблюдая за эндогенным флуоресцентным белком и формами клеток в целевой области, чтобы найти клетки кисспептина на поверхности срезамозга 20.
  7. Когда возможная целевая ячейка будет найдена, отметьте ее на экране компьютера с помощью курсора мыши или нарисовав формат, например квадрат, над интересующей областью. Метка экрана компьютера помогает направлять положение записывающей микропипетки к клетке.
  8. После определения точного местоположения клетки-мишени поднимите объектив и введите записывающую микропипетку, заполненную внутренним раствором. При помещении микропипетки в электрододержатель убедитесь, что внутренний раствор соприкасается с серебряным электродом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки, размещения и размещения микропипетки на электрододержателе см.33.
  9. Перед погружением микропипетки в раствор ликвора приложите положительное давление, чтобы предотвратить попадание мусора в микропипетку, используя заполненный воздухом шприц объемом 1-3 мл, соединенный с держателем микропипетки через полиэтиленовую трубку (≈на 130 см длиннее); нанесите около 100-200 мкл воздуха.
  10. Используя микроманипулятор, направьте микропипетку ниже центра объектива. Перемещайте кнопки на микроманипуляторе, чтобы направить микропипетку по оси X-Y-Z к интересующей ячейке.
  11. Отрегулируйте фокус так, чтобы увидеть кончик микропипетки, и поднесите фокус ближе, но не слишком близко к срезу. Уменьшите скорость микроманипулятора и медленно опустите микропипетку в плоскость фокуса. Убедитесь, что наконечник микропипетки не проникает резко в срез, а медленно опускается до тех пор, пока не коснется поверхности клетки/области-мишени.
  12. Приложите легкое положительное давление (≈100 мкл) с помощью шприца, наполненного воздухом объемом 1-3 мл, прикрепленного к держателю микропипетки, чтобы очистить путь подхода от мусора.
  13. Сфокусируйтесь на клетке-мишени и медленно переместите микроманипулятор по оси X-Y-Z, чтобы приблизить микропипетку к клетке-мишени. При прикосновении микропипетки к клетке будет наблюдаться ямочка, вызванная давлением, приложенным через наконечник микропипетки (рис. 2C).
  14. После формирования ямочки, из-за близости микропипетки к клетке, подайте слабое, короткое всасывание через рот (1-2 с) через трубку, соединенную с держателем микропипетки, чтобы создать уплотнение между микропипеткой и клеткой (гигаомное уплотнение или гигаомное уплотнение >1 ГОм; Рисунок 2D). Для формирования уплотнения используйте режим зажима напряжения в программном обеспечении. Для получения подробной информации о формировании печати, пожалуйста, обратитесь к33.
  15. Если уплотнение остается стабильным (гигаомное уплотнение должно быть механически стабильным и без шумовых помех, определяемых наблюдением в течение примерно 1 мин), установите удерживающее напряжение на ближайшем физиологическом потенциале покоя интересующей ячейки. Для кисспептиновых нейронов гипоталамуса рекомендуется -50 мВ.
  16. Нанесите короткое отсасывание внутрь (отрицательное давление) с микропипеткой, запечатанной в клетке, чтобы разорвать плазматическую мембрану (рис. 2E). Адекватная цельноклеточная конфигурация достигается, когда всасывание выполняется с достаточной силой, чтобы разорванная мембрана не закупоривала микропипетку и не притягивала значительную часть мембраны или даже клетку.
  17. Проверьте используемые системные настройки. Используйте программное обеспечение (см. Таблицу материалов) для цифровой проверки и расчета последовательного сопротивления (SR) и емкости целого элемента (wcc).
  18. В режиме зажима напряжения после разрыва клеточной мембраны включите опцию «Вся ячейка» и нажмите на команду «Авто», относящуюся ко вкладке всей ячейки. SR и wcc ячейки будут автоматически рассчитаны и мгновенно отображены программным обеспечением. Эти параметры также можно проверить, выполнив испытание мембраны с усилителем, упомянутым в таблице материалов33.
  19. Обязательно проверьте параметры жизнеспособности клеток. Для нейронов кисспептина убедитесь, что электрофизиологические измерения составляют: SR < 25 мОм, входное сопротивление > 0,3 ГОм и абсолютное значение удерживаемого тока < 30 пА (личные наблюдения и ссылка21). Среднее значение wcc нейронов AVPV / PeN Kisspeptin илиARH kisspeptin составляет ≈ 10-12 pF у мышей с интактными гонадами20.
  20. Контролируйте SR и стационарную емкость ячейки во время экспериментов. Убедитесь, что SR не изменяется более чем на 20% во время записи и что емкость мембраны стабильна.
  21. Проверьте настройки программного обеспечения. Создайте специальные протоколы для записей в соответствии с типом эксперимента. Для регистрации мембранного потенциала в режиме токового зажима с помощью оборудования, указанного в Таблице материалов, фильтруйте электрофизиологические сигналы нижних частот на частоте 2-4 кГц и анализируйте результаты в автономном режиме в программном обеспечении (информацию о программном обеспечении см. в Таблице материалов).
  22. После того, как конфигурация целой ячейки будет достигнута должным образом, измерьте синаптические токи в режиме зажима напряжения (рис. 2G). Регистрируйте изменения мембранного потенциала покоя (RMP) и индуцированные вариации RMP в режиме токового зажима (рис. 2H). Изменения в RMP, такие как деполяризация клеточной мембраны, могут быть вызваны введением известного лекарственного средства/нейротрансмиттера в ванну (описано на шаге 3.2), как показано на рисунке 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В режиме токового зажима можно вводить положительный или отрицательный ток для поддержания напряжения мембраны на желаемом напряжении. Для нейронов кисспептина мы обычно устанавливаем инжекцию нулевого тока (I = 0) для регистрации спонтанного изменения мембранного потенциала.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для изучения возможного влияния человеческого рекомбинантного гормона роста (hGH) на активность гипоталамических кисспептиновых нейронов мы провели запись цельноклеточного пластыря в срезах мозга и оценили, вызывает ли этот гормон острые изменения активности нейронов AVPV/PeN Kisspeptin и ARHkisspeptin. В этом исследовании использовались взрослые самки Kiss1-Cre / GFP (стадия диэструса) и самцымышей 36. Для экспериментов были отобраны интактные гонадные животные, так как свойства их гипоталамических кисспептиновых нейронов могут варьироваться в зависимости от уровня половых стероидов19,20. Несмотря на то, что оценка различий между полами выходит за рамки настоящего исследования, мы отсылаем читателя к Croft et al. и Frazão et al.19,20 для получения дополнительной информации. Генетически модифицированные животные, такие как мыши и крысы, представляют собой захватывающие инструменты для этого типа эксперимента, поскольку клетки, экспрессирующие определенный ген или селективно-индуцированную абляцию, могут быть идентифицированы флуоресцентным белком, таким как GFP, среди прочего23,26,36. Использование генетически модифицированных мышей представляет собой прорыв в понимании активности нейронов кисспептина.

Зарегистрированные нейроны (26 клеток из 12 животных) определяли по нейроанатомическим признакам35 и экспрессии эндогенного GFP20. В режиме токового зажима нейроны регистрировались под I = 0 в конфигурации цельноклеточного пластыря-зажима. Нейроны кисспептина AVPV / PeN (12 клеток от девяти животных) показали среднее RMP -59,0 мВ ± 3,0 мВ (диапазон: от -75 мВ до -46 мВ), входное сопротивление 0,9 ± 0,1 ГОм, WCC 12,3 пФ ± 1,6 пФ и SR 19,4 ± 1,9 мОм. Среди зарегистрированных нейронов три из 12 клетоккисспептина AVPV / PeN показали спонтанные разряды потенциалов действия (AP) в состоянии покоя (0,1 Гц ± 0,06 Гц; средний RMP спонтанно активных клеток составлял -50,7 мВ ± 2,7 мВ). Среднее значение RMP нейроновАРГ кисспептина (14 клеток от 12 животных) составило -50,0 мВ ± 1,5 мВ (диапазон: от -62 мВ до -39 мВ), среднее входное сопротивление составило 1,7 ± 0,1 ГОм, WCC составило 9,2 пФ ± 0,7 пФ, а SR - 16,9 ± 1,7 мОм. Большинство нейроновкисспептина АРГ находились в состоянии покоя, в то время как четыре из 14 клеток показали спонтанные АП в состоянии покоя (0,9 Гц ± 0,5 Гц; средний RMP спонтанно активных клеток составлял -52,7 мВ ± 1,4 мВ).

Введение hGH (20 мкг / г) в ванну вызывало значительную гиперполяризацию RMP многих зарегистрированных нейронов, пяти из 12 нейронов AVPV / PeNKisspeptin (≈55% клеток 9 мышей) и девяти из 14 зарегистрированных нейроновАРГ кисспептина (≈65% клеток 12 мышей, p = 0,0006, точный тест Фишера; Рисунок 3). Гиперполяризованные нейроны кисспептина AVPV / PeN икисспептина ARH значительно изменяли RMP по сравнению с невосприимчивыми клетками (рис. 3B, E; Тест Манна-Уитни). Влияние на RMP (рис. 3C, F; повторные измерения ANOVA и Тьюки после теста) сопровождалось значительным снижением входного сопротивления (IR) всей клетки накисспептин AVPV / PeN (0,9 ± 0,1 ГОм до 0,7 ± 0,1 ГОм во время применения hGH, p = 0,02; Рисунок 3D), а также накисспептин АРГ (1,7 ± 0,1 ГОм до 1,0 ± 0,1 ГОм во время применения hGH, p < 0,0001; повторные измерения ANOVA и Тьюки после теста; Рисунок 3G) Нейронов. Кроме того, частота спонтанных AP (fAP) hGH-гиперполяризованных нейронов снижалась в обеих популяциях клеток (0,1 Гц ± 0,06 Гц до 0,0 Гц ± 0,0 Гц в AVPV / PeN кисспептин и 1,0 Гц ± 0,5 Гц до 0,2 Гц ± 0,1 Гц в нейронахАРГ кисспептина). Однако степень этого снижения не достигла уровня статистической значимости (p > 0,05, критерий Манна-Уитни). После вымывания hGH RMP и IR были восстановлены до исходного уровня (рис. 3A, C, D, F, G). Остальные нейроны кисспептина не реагировали на введение гормона роста.

Ранее мы продемонстрировали, что pGH не оказывает влияния на активность нейронов кисспептина гипоталамуса (см. Silveira et al.25; Рисунок 3H). Следует отметить, что известно, что hGH может активировать рецепторы пролактина (PRL) в дополнение к рецепторам GH37,38. Кроме того, PRL косвенно деполяризует только ≈20% нейронов AVPV/PeNKisspeptin у мышей24. Напротив, PRL не модулирует быструю синаптическую передачуклеток кисспептина АРГ 24. Таким образом, гиперполяризационный эффект, вызванный hGH, о котором сообщается здесь, кажется неспецифическим. Наблюдаемые различия могут зависеть от таких переменных, как концентрация наркотиков, видовые различия (человек против мышей) или даже наличие солей в составе используемых лекарств, как сообщалось ранее28.

Figure 1
Рисунок 1: Принципиальная диаграмма, обобщающая вклад метода заплаточного зажима целых клеток в знание активности нейронов кисспептина. Кисспептиновые нейроны (показаны зеленым цветом) расположены в передневентральном, перивентрикулярном и ростральном перивентрикулярных ядрах (AVPV/PeN) и дугообразном ядре гипоталамуса (ARH). Клетки кисспептина AVPV / PeN икисспептина ARH посылают прямые соединения с сомой нейронов гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ), расположенной в преоптической области (POA), и их терминалями на срединном возвышении (ME), кульминацией которой является модуляция оси гипоталамус-гипофиз (HPG). Было показано, что различные нейромодуляторы, такие как гормоны, дифференциально модулируют активность нейронов AVPV / PeNкисспептина иАРГ кисспептина. Возможное влияние на мембранный потенциал покоя схематично показано репрезентативными трассировками, полученными с использованием метода зажима пути целой клетки и записей токового зажима. Красный цвет указывает на то, что специфический нейротрансмиттер индуцирует деполяризацию мембранного потенциала покоя (RMP)17,22,24,26,28,29,30,31,32; синий цвет указывает на отсутствие влияния на RMP 24,25,26,27,30. Пунктирной линией обозначен RMP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Основные шаги для получения герметизации интересующей ячейки методом патч-зажима целых ячеек. (А,Б) Репрезентативные микрофотографии срезов головного мозга (250 мкм), содержащих клетки кисспептина в передневентральном перивентрикулярном ядре (AVPV) и дугообразном ядре гипоталамуса (ARH). Нейроны кисспептина были идентифицированы по экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP). (C) Микрофотография, демонстрирующая микропипетку (содержащую раствор электролита [внутренний раствор]) достаточно близко к клетке, чтобы создать углубление в плазматической мембране для выполнения уплотнения. (Д,Е) Умеренное отрицательное давление (отсасывание ртом, выполняемое на трубке, прикрепленной к головной сцене и микропипетке) требуется для герметизации клеточной мембраны к микропипетке (D). Второе применение отрицательного давления (мягкое и кратковременное) необходимо, чтобы вызвать разрыв плазматической мембраны (E). (F) Регистрация активности клеток осуществляется с помощью механической установки, используемой для экспериментов с патч-зажимом. После разрыва плазматической мембраны токи, протекающие по ионным каналам в патч-ячейке, могут быть зарегистрированы электродом, подключенным к высокочувствительному усилителю. Резистор обратной связи генерирует ток, необходимый для записи с помощью зажима напряжения (G) или токового зажима (H). Сокращения: 3В = третий желудочек; ME = медианное возвышение. Масштабные линейки: A = 130 мкм, B = 145 мкм, C = 20 мкм, D = 15 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Тестирование специфичности препарата. (A) Репрезентативная запись токового зажима, демонстрирующая, что человеческий рекомбинантный гормон роста (hGH) индуцировал гиперполяризацию мембранного потенциала покоя (RMP) нейронов кисспептина, расположенных в дугообразном ядре гипоталамуса (АРГ,кисспептин). (Б-Г) Гистограммы, демонстрирующие среднее изменение мембранного потенциала покоя (RMP) (B, C, E, F) и среднего входного сопротивления (IR) (D, G) чувствительных к hGH нейронов кисспептина, расположенных в передневентральных перивентрикулярных и ростральных перивентрикулярных ядрах (AVPV / PeNKisspeptin) (B-D) или ARH (E-G). Репрезентативная запись токового зажима, демонстрирующая, что гормон роста свиней (pGH) не оказывает влияния на RMP нейроновАРГ кисспептина, о чем сообщалось ранее25 (H). В качестве тестов значимости используются критерий Манна-Уитни для (B) и (E), а также повторные измерения ANOVA и пост-тест Тьюки для (C, D, F, G). Пунктирной линией обозначен RMP. *p = 0,02; **p = 0,004,***p = 0,0003; p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Внутренний раствор (100 мл)
Соль FW (г/моль) Концентрация Вес (г)
К-глюконат 234.2 120 мМ 2.81
NaCl 58.4 1,0 мМ 0.006
KCl 74.5 10 мМ 0.074
ХЕПЕС 238.3 10 мМ 0.24
ЭГТА 380.3 5,0 мМ 0.19
CaCl2 147.0 1,0 мМ 0.015
MgCl2 203.0 1,0 мМ 0.02
КО 56.11 3,0 мМ 0.017
СПС 507.18 4,0 мМ 0.20
рН =7,3 / осмолярность = 275 - 280 мОсм

Таблица 1: Реагенты для приготовления внутреннего раствора. Таблица содержит молекулярную массу (FW), требуемые концентрации и расчетную массу солей для приготовления 100 мл раствора.

aCSF/раствор для нарезки (250 мл)
Соль ФВ Концентрация Вес (г)
Сахароза 342.3 238 мМ 18.5
ККЛ 74.5 2,5 мМ 0.046
NaHCO3 84.0 26 мМ 0.546
2PO4 120.0 1,0 мМ 0.03
MgCl2 203.0 5 мМ 0.254
D-глюкоза 180.2 10 мМ 0.450
CaCl2 147.0 1,0 мМ 0.037
pH = 7,3 / осмолярность = 290 - 295 мОсм

Таблица 2: Реактивы для приготовления раствора для нарезки. Таблица содержит молекулярную массу (FW), требуемые концентрации и расчетную массу солей для приготовления 250 мл раствора. Мозг погружается в этот раствор, который нужно нарезать.

aCSF для записи (1 л)
Соль ФВ Концентрация Вес (г)
NaCl 58.4 135 мМ 7.88
ККЛ 74.5 3,5 мМ 0.261
NaHCO3 84.0 26 мМ 2,184
2PO4 120.0 1,25 мМ 0.150
МгСО4 246.5 1,2 мМ 0.296
D-глюкоза 180.2 10 мМ 1,802
CaCl2 147.0 1,0 мМ 0.148
рН = 7,3 / осмолярность = 290-300 мОсм

Таблица 3: Реагенты для подготовки ликвора к записи. Таблица содержит молекулярную массу (FW), требуемые концентрации и расчетную массу солей для приготовления 1 л раствора.

Дополнительный рисунок 1: Пример камеры восстановления собственного производства. (А,Б) Собственная камера извлечения может быть изготовлена следующим образом: вырежьте плиту на 24 лунки так, чтобы было доступно девять скважин. Приклейте капроновый экран к основанию девяти лунок. Из остатка колодезной пластины сделайте основание так, чтобы нижняя часть капрона была свободна. (C) Это адаптированное основание может быть помещено в стакан объемом 500 мл, содержащий искусственную спинномозговую жидкость (aCSF), постоянно насыщенную карбогеном (95% O2 и 5% CO2). (D) Мензурка, удерживающая камеру восстановления, хранится в водяной бане во время эксперимента. (Е,Ж) Акриловая пипетка для переноса используется для переноса срезов мозга в камеру восстановления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Развитие метода цельноклеточного пластыря оказало значительное влияние на научное сообщество, считаясь чрезвычайно важным для развития научных исследований и создания нескольких открытий. Его влияния на науку было достаточно, чтобы кульминацией стала Нобелевская премия по медицине в 1991 году, поскольку это открытие открыло дверь к лучшему пониманию того, как ионные каналы функционируют в физиологических и патологических условиях, а также к выявлению потенциальных мишеней для терапевтических агентов 11,39,40,41 . В области медицины одним из выдающихся открытий, сделанных с использованием этого метода, было то, что некоторые используемые вещества клинически взаимодействуют непосредственно с ионными каналами (например, местные анестетики, антиаритмические средства, противодиабетические средства и миорелаксанты)42. Поэтому его применимость очевидна в клинических институтах и отделах фундаментальных исследований. В этой статье описывается протокол базовой подготовки для проведения экспериментов с цельноклеточным пластырем на срезах мозга, содержащих гипоталамические кисспептиновые нейроны. Мы выделяем основные этапы и выделяем заметные параметры, которые необходимо контролировать для получения ткани, и готовим растворы для техники пластыря. Однако эта статья не может полностью описать сложность этой техники и механизмы, участвующие в каждом типе записи, особенно анализ. Для дальнейшего теоретического изучения рекомендуются некоторые книги и обзоры по технике пластыря-зажима 10,43,44,45,46.

Каждое решение, используемое в методе пластыря-зажима, имеет определенное назначение; Поэтому его конкретные составы и критерии должны быть строго приняты во время подготовки. Например, состав внутреннего раствора должен быть определен в соответствии с целью эксперимента, так как он изменяется в зависимости от типа измеряемого тока. Упомянутый здесь раствор на основе хлоридов, в котором Cl- (15 мМ) имитирует физиологическую концентрацию цитоплазмы47 клетки, используется для изучения активных и пассивных свойств нейронов или ответов на синаптические входы. Важно подчеркнуть, что содержание хлоридов во внутреннем растворе поддерживает потенциал равновесия хлоридов на оптимальных уровнях для регистрации клеток (в упомянутом растворе ECL оно составляет около -59 мВ). Внутриклеточную концентрацию хлорида можно оценить, оценив реверсивный потенциал ГАМК-индуцированного тока (EGABA), предполагая, что весь ток через рецепторГАМК А переносится Cl-21,48. Для исследования гипоталамических кисспептиновых нейронов необходимо учитывать, что внутриклеточная концентрация Cl- для кисспептина АРГ выше, чем для клетоккисспептина AVPV/PeN21. Эту характеристику необходимо учитывать при планировании эксперимента. Осмолярность внутреннего раствора рекомендуется быть по крайней мере на 5% ниже, чем у aCSF для записей, чтобы избежать потери уплотнения из-за возможного набухания и/или ослабления клеток 33,47. Если есть необходимость добавить внутриклеточное соединение, которое может быть дополнительно использовано в качестве клеточного маркера во внутренний раствор, такое как биоцитин или внутриклеточный краситель (например, Alexa Fluor 594), уровни K+ могут быть снижены, так что осмолярность может постоянно поддерживаться 20,47,49,50.

Выполнение быстрого рассечения мозга и поддержание низкой температуры (0-2 °C) во время нарезки соответствующим раствором для нарезки имеет решающее значение. Растворы для нарезки могут различаться в зависимости от типа оцениваемой клетки и/или области мозга 33,47. Раствор aCSF, используемый для получения срезов мозга (т.е. раствор для среза), обычно имеет другой состав, чем aCSF для записей (для сравнения см. Таблицу 2 и Таблицу 3). Концентрации катионов (Ca 2+ и Mg2+) можно регулировать для изменения возбудимости нейронов, что также может влиять на порог возбуждения и высвобождение нейротрансмиттера47. Среды с низким содержанием Ca 2+ и высоким содержанием Mg2+ широко используются для минимизации возможных эксайтотоксических процессов (для получения дополнительной информации см.51). Кроме того, низкий уровень Ca 2+ и высокий уровень Mg2+ могут стимулировать активность нейронов гипоталамуса52. Что касается aCSF для записей, некоторые характеристики схожи. Буферная система основана на NaHCO3, высокие концентрации NaCl (обычно >100 мМ) и низкие концентрации KCl (обычно <5 мМ), относительные концентрации Ca 2+ и Mg2+ (часто используется 2: 1) обычно составляют около 2 мМ, а уровни глюкозы могут варьироваться от 1 до 10 мМ47. Помимо изменений осмолярности растворов, рН или температуры (с цифровым контролем в пределах 30-32 °C), важно подчеркнуть, что во время экспериментального протокола могут возникнуть другие проблемы, которые существенно мешают эксперименту. Электрофизиологические измерения должны быть стабильными во время записи, а любые изменения должны иметь критические показания. Например, изменения SR учитывают сотовый доступ в режиме целых ячеек и имеют значительные последствия для измеренных токов и потенциалов. Кроме того, важно подчеркнуть, что соответствующим ограничением, связанным с методологией патч-зажима, которое необходимо учитывать, является механическая чрезмерная стимуляция клетки протоколами чрезмерного всасывания/давления, которые могут вызывать морфологические и функциональные изменения53. Это смещение часто трудно контролировать в протоколах, где отсасывание выполняется ртом, а не устройством, которое может точно контролировать интенсивность всасывания. Кроме того, проблемы, связанные с тканями, которые достигают кульминации с высоким процентом гибели клеток, могут возникать из-за неадекватного рассечения, гипоксии или состояния здоровья мыши, которое исследователь не может определить путем наблюдения.

Основным преимуществом метода цельноклеточного пластыря является возможность точной записи нейронов в определенных областях мозга, представляющих интерес. Этот метод получил огромную пользу от создания генетически модифицированных животных. Наша группа обычно работает с мышиной моделью, которая экспрессирует hrGFP под промотором гена Kiss1, или с другой, которая экспрессирует Cre-рекомбиназу под промотором гена Kiss1 и GFP под экспрессией Cre-condition. Тем не менее, в настоящее время существует множество проверенных моделей животных23,26,36. Кроме того, преимущества этого метода представляют отсутствие гематоэнцефалического барьера и тот факт, что внеклеточную и внутриклеточную среду можно легко контролировать и манипулировать; Однако они не обязательно представляют собой физиологическое состояние. Среди ограничений этого метода по сравнению с препаратами in vivo или другими типами записи, направленными на сохранение цитоплазматической ионной концентрации, такими как запись на клетке или с перфорированным пластырем, важно отметить, что инвазивность конфигурации всей клетки вызывает диализ содержимого цитоплазмы54. Диализ может вызвать прерывание молекулярных аспектов, необходимых для развития или выражения некоторых явлений. Записывая срезы, необходимо помнить, что большинство проекций нейронов разделены на части. Таким образом, оценка того, насколько это нарушение влияет на наблюдаемые эффекты или физиологическое состояние, выходит за рамки техники. Как уже упоминалось, корональные срезы мозга размером 200-300 мкм обычно выполняются для изучения активности гипоталамических кисспептиновых нейронов 17,19,20,21,34. Ограничение использования более толстого среза среза мозга для изучения клеток кисспептина и различных углов среза, поддерживающих специфическую связь AVPV/PeN или ARH55, требует дальнейшего изучения. Кроме того, путем тестирования влияния гормона/лекарственного средства, синтетического или нет, на RMP нейрона, несколько исследований основаны на препарате EC50 (если он известен) или на опубликованных данных, которые демонстрируют, что определенная концентрация эффективна для активации скорости возбуждения или изменения уровней [Ca2+]i. Тем не менее, следует знать о составе/специфичности лекарственного средства, которое будет использоваться в экспериментах, поскольку возможно, что очищенные синтетические лекарственные средства, по сравнению с другими аналогичными лекарственными средствами, могут оказывать антагонистическое действие28. Как было показано ранее25, в то время как очищенный pGH не оказывает влияния на активность нейронов гипоталамического кисспептина, hGH дает противоречивые данные (см. рис. 3). Аналогичные результаты были продемонстрированы при оценке влияния инсулина на АРГ28. Поэтому при планировании эксперимента и интерпретации полученных результатов следует учитывать лекарственную специфичность.

Метод патч-зажима является отличным инструментом для получения данных об электрической активности нейронов и внес значительный вклад в изучение нескольких популяций нейронов, таких как нейроны кисспептина. Большинство деталей, представленных здесь, обычно используются для записи нейронов гипоталамуса, как мы сообщали ранее 25,50,56,57,58,59,60. Важно отметить, что для регистрации других популяций нейронов, помимо нейронов кисспептина, необходимо знать или определять электрофизиологические измерения, которые могут помочь идентифицировать типы клеток, такие как емкость клетки, SR, входное сопротивление, характер срабатывания клеток и другие параметры. Эти свойства варьируются между различными клетками мозга, ядрами мозга и физиологическими или индуцированными состояниями, такими как уровни циркулирующих половых стероидов 16,19,20,21,61, которые могут существенно мешать критическому анализу результатов. Кроме того, для работы с этой техникой необходимо понимать возможные переменные, связанные с подготовкой тканей, и связанные с ними преимущества и ограничения. Все описанные здесь шаги должны выполняться разумно, так как любое изменение переменных, участвующих в протоколе, может резко повлиять на результаты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Отсутствие конфликтов интересов, подлежащих декларированию.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Исследовательским фондом Сан-Паулу [номера грантов FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Финансовый кодекс 001» (HRV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP Sigma Aldrich/various A9187
CaCl2 Sigma Aldrich/various C7902
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich/various G7021
EGTA Sigma Aldrich/various O3777
HEPES Sigma Aldrich/various H3375
KCL Sigma Aldrich/various P5405
K-gluconate Sigma Aldrich/various G4500
KOH Sigma Aldrich/various P5958
MgCl2 Sigma Aldrich/various M9272
MgSO4 Sigma Aldrich/various 230391
NaCl Sigma Aldrich/various S5886
NaH2PO4  Sigma Aldrich/various S5011
NaHCO3 Sigma Aldrich/various S5761
nitric acid Sigma Aldrich/various 225711 CAUTION
Sucrose Sigma Aldrich/various S1888
Equipments
Air table TMC 63-534
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Computer various -
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM Molecular Devices DD1440
Digital peristaltic pump Ismatec ISM833C 
Faraday cage TMC 81-333-03
Imaging Camera Leica DFC 365 FX
Micromanipulator Sutter Instruments Roe-200
Micropipette Puller Narishige PC-10
Microscope Leica DM6000 FS
Osteotome Bonther equipamentos & Tecnologia/various 128
Recovery chamber Warner Instruments/Harvard apparatus - can be made in-house
Recording chamber Warner Instruments 640277
Spatula Fisher Scientific /various FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome  Leica VT1000 S
Water Bath  Fisher Scientific /various Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software Molecular Devices - Commander Software
LAS X wide field system Leica - Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B Molecular Devices MULTICLAMP 700B Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS Molecular Devices Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm Warner Instruments 64-1309
Curved hemostatic forcep various -
cyanoacrylate glue LOCTITE/various -
Decapitation scissors various -
Filter paper various -
Glass capillaries (micropipette) World Precision Instruments, Inc TW150F-4
Iris scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 65-66
Pasteur glass pipette  Sigma Aldrich/various CLS7095B9-1000EA
Petri dish various -
Polyethylene tubing  Warner Instruments 64-0756
Razor blade for brain dissection TED PELLA TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome TED PELLA TEDP-121-9
Scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 71-72, 48,49; 
silicone teat various -
Slice Anchor  Warner Instruments 64-0246
Syringe filters Merck Millipore Ltda SLGVR13SL Millex-GV 0.22 μm
Tweezers Bonther equipamentos & Tecnologia/various 131, 1518

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
  2. Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
  3. Gandini, M. A., Sandoval, A., Felix, R. Patch-clamp recording of voltage-sensitive Ca2+ channels. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 329-325 (2014).
  4. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  5. Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
  6. Suk, H. J., Boyden, E. S., van Welie, I. Advances in the automation of whole-cell patch clamp technology. Journal of Neuroscience Methods. 326, 108357 (2019).
  7. Cole, K. S., Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
  8. Bernstein, J. Ueber den zeitlichen Verlauf der negativen Schwankung des Nervenstroms. Pflüger, Archiv für die Gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere. 1 (1), 173-207 (1868).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv. 391 (2), 85-100 (1981).
  10. Hill, C. L., Stephens, G. J. An introduction to patch clamp recording. Methods in Molecular Biology. 2188, 1-19 (2021).
  11. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  12. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  13. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  14. Smith, J. T., Cunningham, M. J., Rissman, E. F., Clifton, D. K., Steiner, R. A. Regulation of Kiss1 gene expression in the brain of the female mouse. Endocrinology. 146 (9), 3686-3692 (2005).
  15. Smith, J. T., et al. Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse. Endocrinology. 146 (7), 2976-2984 (2005).
  16. Ducret, E., Gaidamaka, G., Herbison, A. E. Electrical and morphological characteristics of anteroventral periventricular nucleus kisspeptin and other neurons in the female mouse. Endocrinology. 151 (5), 2223-2232 (2010).
  17. Qiu, J., Fang, Y., Bosch, M. A., Rønnekleiv, O. K., Kelly, M. J. Guinea pig kisspeptin neurons are depolarized by leptin via activation of TRPC channels. Endocrinology. 152 (4), 1503-1514 (2011).
  18. Gottsch, M. L., et al. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse. Endocrinology. 152 (11), 4298-4309 (2011).
  19. de Croft, S., et al. Spontaneous kisspeptin neuron firing in the adult mouse reveals marked sex and brain region differences but no support for a direct role in negative feedback. Endocrinology. 153 (11), 5384-5393 (2012).
  20. Frazão, R., et al. Shift in Kiss1 cell activity requires estrogen receptor alpha. The Journal of Neuroscience. 33 (7), 2807-2820 (2013).
  21. DeFazio, R. A., Elias, C. F., Moenter, S. M. GABAergic transmission to kisspeptin neurons is differentially regulated by time of day and estradiol in female mice. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16296-16308 (2014).
  22. Mansano, N. D. S., et al. Vasoactive intestinal peptide exerts an excitatory effect on hypothalamic kisspeptin neurons during estrogen negative feedback. Molecular and Cellular Endocrinology. 542, 111532 (2022).
  23. Jamieson, B. B., Piet, R. Kisspeptin neuron electrophysiology: Intrinsic properties, hormonal modulation, and regulation of homeostatic circuits. Frontiers in Neuroendocrinology. 66, 101006 (2022).
  24. Silveira, M. A., et al. STAT5 signaling in kisspeptin cells regulates the timing of puberty. Molecular and Cellular Endocrinology. 448, 55-65 (2017).
  25. Silveira, M. A., et al. Acute effects of somatomammotropin hormones on neuronal components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Brain Research. 1714, 210-217 (2019).
  26. Cravo, R. M., et al. Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development. PLoS One. 8 (3), e58698 (2013).
  27. Manfredi-Lozano, M., et al. Defining a novel leptin-melanocortin-kisspeptin pathway involved in the metabolic control of puberty. Molecular Metabolism. 5 (10), 844-857 (2016).
  28. Qiu, J., et al. Insulin excites anorexigenic proopiomelanocortin neurons via activation of canonical transient receptor potential channels. Cell Metabolism. 19 (4), 682-693 (2014).
  29. de Croft, S., Boehm, U., Herbison, A. E. Neurokinin B activates arcuate kisspeptin neurons through multiple tachykinin receptors in the male mouse. Endocrinology. 154 (8), 2750-2760 (2013).
  30. Frazao, R., et al. Estradiol modulates Kiss1 neuronal response to ghrelin. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (6), E606-E614 (2014).
  31. True, C., Verma, S., Grove, K. L., Smith, M. S. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript is a potent stimulator of GnRH and kisspeptin cells and may contribute to negative energy balance-induced reproductive inhibition in females. Endocrinology. 154 (8), 2821-2832 (2013).
  32. Navarro, V. M., et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology. 152 (11), 4265-4275 (2011).
  33. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  34. Gibson, A. G., Jaime, J., Burger, L. L., Moenter, S. M. Prenatal androgen treatment does not alter the firing activity of hypothalamic arcuate kisspeptin neurons in female mice. eNeuro. 8 (5), (2021).
  35. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain. Stereotaxic Coordinates. 2nd edition. , Academic Press. (2001).
  36. Cravo, R. M., et al. Characterization of Kiss1 neurons using transgenic mouse models. Neuroscience. 173, 37-56 (2011).
  37. Emane, M. N., Delouis, C., Kelly, P. A., Djiane, J. Evolution of prolactin and placental lactogen receptors in ewes during pregnancy and lactation. Endocrinology. 118 (2), 695-700 (1986).
  38. Fuh, G., Colosi, P., Wood, W. I., Wells, J. A. Mechanism-based design of prolactin receptor antagonists. The Journal of Biological Chemistry. 268 (8), 5376-5381 (1993).
  39. Barinaga, M. Ion channel research wins physiology Nobel. Science. 254 (5030), 380 (1991).
  40. Colquhoun, D. Neher and Sakmann win Nobel Prize for patch-clamp work. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (12), 449 (1991).
  41. Greger, R. Nobel Prize for Medicine and Physiology 1991. Analysis of the function of single ion channel. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 116 (48), 1849-1851 (1991).
  42. Brau, M. E., Vogel, W., Hempelmann, G. Possible applications of the "patch-clamp" method in anesthesiologic research; comment. Anasthesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin, Schmerztherapie. 31 (9), 537-542 (1996).
  43. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods in Enzymology. 207, 3-14 (1992).
  44. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  45. Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Scientific American. 266 (3), 44-51 (1992).
  46. Sachs, F., Auerbach, A. Single-channel electrophysiology: use of the patch clamp. Methods in Enzymology. 103, 147-176 (1983).
  47. Dallas, M., Bell, D. Patch Clamp Electrophysiology: Methods and Protocols. 1st edition. , (2021).
  48. Robinson, R. A., Stokes, R. H. Electrolyte Solutions. 2nd edition. , Butterworths Scientific. (1959).
  49. de Souza, G. O., et al. Gap junctions regulate the activity of AgRP neurons and diet-induced obesity in male mice. The Journal of Endocrinology. 255 (2), 75-90 (2022).
  50. Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
  51. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  52. Pan, J. T., Li, C. S., Tang, K. C., Lin, J. Y. Low calcium/high magnesium medium increases activities of hypothalamic arcuate and suprachiasmatic neurons in brain tissue slices. Neuroscience Letters. 144 (1-2), 157-160 (1992).
  53. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annual Review of Physiology. 59, 621-631 (1997).
  54. Herbison, A. E., Moenter, S. M. Depolarising and hyperpolarising actions of GABA(A) receptor activation on gonadotrophin-releasing hormone neurones: towards an emerging consensus. Journal of Neuroendocrinology. 23 (7), 557-569 (2011).
  55. Qiu, J., et al. High-frequency stimulation-induced peptide release synchronizes arcuate kisspeptin neurons and excites GnRH neurons. eLife. 5, e16246 (2016).
  56. Chaves, F. M., Mansano, N. S., Frazão, R., Donato, J. Tumor necrosis factor α and interleukin-1β acutely inhibit AgRP neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 8928 (2020).
  57. Chaves, F. M., et al. Effects of the isolated and combined ablation of growth hormone and IGF-1 receptors in somatostatin neurons. Endocrinology. 163 (5), 045 (2022).
  58. Wasinski, F., et al. Growth hormone receptor in dopaminergic neurones regulates stress-induced prolactin release in male mice. Journal of Neuroendocrinology. 33 (3), e12957 (2021).
  59. Furigo, I. C., Ramos-Lobo, A. M., Frazao, R., Donato, J. Brain STAT5 signaling and behavioral control. Molecular and Cellular Endocrinology. 438, 70-76 (2016).
  60. Zampieri, T. T., et al. Postnatal overnutrition induces changes in synaptic transmission to leptin receptor-expressing neurons in the arcuate nucleus of female mice. Nutrients. 12 (8), 2425 (2020).
  61. Furigo, I. C., et al. Growth hormone regulates neuroendocrine responses to weight loss via AgRP neurons. Nature Communication. 10 (1), 662 (2019).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 193 срез мозга записи с токовым зажимом Kiss1 гипоталамус
Гипоталамические кисспептиновые нейроны как мишень для записи цельноклеточных пластырей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T.,… More

Silva, J. d. N., Zampieri, T. T., Vieira, H. R., Frazao, R. Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (193), e64989, doi:10.3791/64989 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter