Summary
Her præsenterer vi en high-throughput protokol til forbigående transfektering af millioner af majsprotoplaster til test af store biblioteker af plasmider i majsmesofylceller.
Abstract
Transfektion af majsmesofylceller involverer ofte fordøjelse af plantecellevæggene for at skabe protoplaster og derefter indsætte DNA via elektroporation eller polyethylenglycol (PEG). Tidligere metoder blev udviklet til at producere titusinder af transfekterede protoplaster på én gang. Her beskriver vi en ligetil metode til at isolere og transfektere millioner af bladmesofylprotoplaster i majs (Zea mays L.). Denne strømlinede proces fjerner visse almindelige prototypetrin, såsom vask i W5. Derudover er trin som centrifugering, PEG-medieret transfektion og inkubation blevet modificeret til at arbejde med et større antal protoplaster. Evnen til at udtrykke store biblioteker af plasmidkonstruktioner muliggør genomskalaeksperimenter, såsom massivt parallelle reporteranalyser i majs.
Introduction
Transient genekspression er et kraftfuldt værktøj i plantebiologi. Imidlertid er planteceller vanskelige at transfektere, fordi de er omgivet af en cellevæg. Denne barriere for DNA-indgang er ikke til stede i andre almindeligt undersøgte celletyper såsom pattedyrs- eller insektceller. Tidligere forskning adresserede denne udfordring ved at anvende protoplaster: planteceller, hvis cellevægge er blevet fordøjet og fjernet. I modsætning til uforarbejdet bladvæv er planteprotoplaster nemme at arbejde med i suspension og modtagelige for transfektionsteknikker medieret af elektroporation eller polyethylenglycol (PEG)1. Planteceller bevarer meget af deres funktionalitet, selv efter fjernelse af cellevæggen. Således anvendes protoplaster i en række planter til at studere gen- og proteinfunktion2,3, til at forstå signaltransduktion4 og til at identificere mulige mål for planteforædling5. Protoplaster er også et praktisk middel til screening af genomredigeringskonstruktioner i forskellige afgrødearter, herunder hvede og kartoffel 6,7. Kort sagt er forbigående assays i protoplaster uundværlige for landbrugsbioteknologi.
Majs (Zea mays L.) er verdens førende kornafgrøde målt i tonnage; Som sådan er det et vigtigt fokus for grundlæggende og anvendt plantevidenskabelig forskning8. I modsætning til modelplanter som Nicotiana tabacum9 udføres forbigående transgenekspression i intakte majsblade imidlertid ikke rutinemæssigt. Protoplasting er blevet anvendt til at opnå og transfektere majsbladmesofylceller10,11. Tidligere metoder har opnået transfektionseffektivitet på op til 75% ved hjælp af elektroporation og produceret transfekterede protoplaster i titusindskalaen10,15.
Denne protokol beskriver, hvordan man protoplasterer millioner af majsmesofylceller og transfekterer dem med en effektivitet, der kan sammenlignes med tidligere metoder. De vigtigste trin er dyrkning af etiolerede majsplanter, høst af bladvævet, fordøjelse af plantecellevæggen og levering af plasmid-DNA i cellerne ved hjælp af PEG. Det vigtigste bidrag fra denne protokol er evnen til at opskalere protoplasttransfektion, samtidig med at den cellelevedygtighed, der kræves til funktionelle assays, opretholdes. Dette muliggør brugen af genomskalaeksperimenter, såsom massivt parallelle reporterassays, der kan teste funktionen af hundredtusinder af regioner i hele majsgenomet. Denne metode er for nylig blevet brugt til at undersøge store biblioteker af cis-regulerende DNA-elementer, herunder forstærkere og promotorer12,13,14.
Protocol
1. Vækst af plantematerialet
- Skyl majskernerne to gange med postevand. Sug kernerne i postevand natten over ved stuetemperatur.
- Næste dag skal du fylde en startbakke med 72 celler frø med fugtet 1: 1 vermiculit: tørvemos. Skyl kernerne en gang og plant dem spidshætten ned, en kerne pr. Celle.
- Voks under langvarige forhold (16 timers lys, 8 timer mørk) ved 25 °C i 3 dage.
- Overfør til konstant mørke ved 25 °C og voks i 9-11 dage.
2. Plasmidisolering
- Omdan kommercielt kemisk kompetente E. coli med det eller de plasmider, der er af interesse, i henhold til producentens anvisninger.
- Den transformerede E. coli dyrkes i 50 ml flydende LB-medium med passende antibiotika natten over ved 37 °C under omrystning.
- Pellet E. coli ved centrifugering i 10 min ved 3.000 x g ved stuetemperatur. Uddrag plasmiderne ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt midiprepplasmid-DNA-isolationssæt.
- Anslå plasmid-DNA-koncentrationen ved hjælp af et mikrovolumenspektrofotometer.
BEMÆRK: Materiale, der er egnet til transfektion, skal have en koncentration på ≥800 ng/μL og en A260/A280 på ≥1,8.
3. Protoplast isolering
- Forbered 20 ml enzymopløsning.
- Tilsæt 2,18 g mannitol, 0,30 g cellulase R-10 og 0,06 g macerozym R-10 til et 50 ml centrifugerør. Inverter for at blande pulverne. Der tilsættes deioniseretH2Otil 15 ml. Der tilsættes 200 μL 1 M MES, pH 5,7. Vortex at blande.
- Opløsningen opvarmes ved 55 °C i 10 min. Afkøles ved stuetemperatur i 10 min.
- Der tilsættes 20 μL 1 M CaCl2, 0,02 g bovin serumalbumin og 100 μL 1 M β-mercaptoethanol.
- Fyld til 20 ml med deioniseret H2O. Hæld i et folieindpakket 250 ml bægerglas.
- Tag majsplanterne ud af mørket. Skær dem et par centimeter over jorden ved hjælp af et nyt barberblad. Placer de afskårne ender i vand. Opbevar dem i mørke ved stuetemperatur, mens de ikke er i brug.
- Vælg det andet og tredje blad af hver frøplante, og pas på at udelukke blade med brune eller beskadigede områder. Vælg 12-16 blade. Skær ~ 1 cm af spidsen af hvert blad og kassér. Skær derefter en 10 cm sektion fra hvert blad.
BEMÆRK: Hvis der er behov for mere væv, skal der anvendes yderligere 20 ml enzymopløsning i et yderligere 250 ml bægerglas. For meget bladmateriale i en given mængde enzymopløsning kan nedsætte levedygtigheden. - Stak bladsektionerne oven på hinanden med de basale ender sammen. Klem bundtet sammen i basalenden ved hjælp af en bindeclips. Placer bundtet af blade på et stykke hvidt papir.
- Tag fat i bladene ~ 1 cm fra den distale ende. Brug et nyt barberblad til at skære bladene fra den distale ende vinkelret på venerne i tynde (0,5-1 mm) skiver. Undgå at hugge lige ned, men lav hellere korte, fremadrettede skiver gennem vævet.
- Skift barberbladene, når synlige rester begynder at blive deponeret på papiret. Synlige rester indikerer mashing af vævet på grund af et kedeligt blad eller dårlig teknik.
- Efter skæring ~ 2 cm af bladbundtets længde overføres skiverne straks til bægerglasset med enzymopløsning. Lad ikke materialet tørre ud, da dette vil reducere antallet af opnåede protoplaster. Drej forsigtigt enzymopløsningen for at våde materialet.
- Anbring et folielåg over bægerglasset for at blokere lyset. Gentag udskærings- og overførselsprocessen, indtil hele bundtet er skåret tæt på bindeclipsen.
- Bægerglasset med enzymopløsning overføres til en klokkeglas. Vakuuminfiltrer mellem -50,8 kPa og -67,7 kPa i forhold til det omgivende tryk i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Overfør bægerglasset til en bordryster. Ryst ved 40 omdr./min. i 2,5 timer ved stuetemperatur. Bægerglasset hvirvles forsigtigt rundt med hånden. Når den er fuldt fordøjet, vises enzymopløsningen lidt mælkeagtig. Hvis opløsningen stadig er klar, skal du fortsætte med at ryste ved 40 omdr./min. i op til en time mere. Overskrid ikke 3,5 timer.
- Under fordøjelsen fremstilles en mannitol + MES +MgCl2 (MMG) opløsning, en polyethylenglycol (PEG) opløsning og en inkubationsopløsning.
- MMG: Der tilsættes 5,47 g mannitol, 200 μL 1 M MES, pH 5,7 og 750 μL 1 MMgCl2 til et 50 ml centrifugeglas. Fyld til 50 ml med destilleretH2O. Vortex for at opløse. Placer på is.
- Inkubationsopløsning: Der tilsættes 5,47 g mannitol, 200 μL 1 M MES ved pH 5,7 og 200 μL 1 M KCl til et 50 ml centrifugeglas. Fyld til 50 ml med destilleretH2O. Vortex for at opløse. Placer på is.
- PEG-opløsning: Tilsæt 0,44 g mannitol, 1,0 g PEG og 400 μL 1 MCaCl2 til et 15 ml centrifugeglas. Fyld til 4 ml med destilleretH2O. Vortex for at blande. Der inkuberes ved 37 °C under omrystning i 30 minutter, indtil den er helt opløst. Opbevares ved stuetemperatur.
- Ryst enzymopløsningen ved 80 RPM i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Bægerglasset med enzymopløsningen anbringes på is. Fjern ikke foliedækslet. Tilsæt 20 ml iskold MMG til enzymopløsningen. Filtrer gennem en 40 μm cellesi ind i et 50 ml centrifugerør.
BEMÆRK: Opbevar alle opløsningerne på is i følgende trin, indtil PEG'en er tilføjet. Hold protoplasterne dækket med folie for at minimere lyseksponering. - Opdel filtratet i lige store mængder på 10 ml hver. Hæld hvert volumen i et rundbundet glascentrifugerør, og drej det ned i 4 minutter ved 100 x g ved stuetemperatur.
- Supernatanten kasseres, og der tilsættes 1 ml iskold MMG til hvert glas. Resuspender pellets ved forsigtigt at hvirvle og banke på rørene. Prøverne kombineres i et enkelt rundbundet glascentrifugerør. Tilføj MMG til et samlet volumen på 5 ml. Spin ned i 3 min ved 100 x g ved stuetemperatur.
- Vask med 5 ml MMG, og drej ned i 3 minutter ved 100 x g ved stuetemperatur.
- Gentag vasken med 5 ml MMG, og drej ned i 3 minutter ved 100 x g ved stuetemperatur. Når du har drejet den anden vask ned, skal du kontrollere, om supernatanten er klar. Hvis det forbliver overskyet, skal du udføre en tredje vask.
- Resuspender protoplasterne i 1 ml MMG. Dæk løst med folie og hold på is.
- Bestem protoplastudbyttet og kontroller levedygtigheden.
- I et 1,5 ml mikrocentrifugerør tilsættes 4 μL protoplaster og 72 μL MMG.
- I et 1,5 ml mikrocentrifugerør tilsættes 1 μL 0,5% fluoresceindiacetatstamopløsning (FDA) til 49 μL MMG for at lave en 20x arbejdsløsning. Tilsæt 4 μL FDA-arbejdsløsning til røret med de fortyndede protoplaster. Inkuber i 5 minutter i mørke ved stuetemperatur.
- Læg 11 μL af protoplastblandingen på et hæmocytometer. Placer under et lysmikroskop. Bekræft visuelt, at cellerne mangler cellevægge. Tæl derefter antallet af protoplaster. Brug denne optælling til at estimere det samlede antal opnåede protoplaster. Tæl derefter antallet af protoplaster, der fluorescerer grønt under UV-lys, når de farves med FDA. Succesfulde protoplastisoleringer giver en levedygtighed på 70% -90%.
4. PEG-medieret transfektion
- Start med den estimerede protoplastkoncentration fra trin 3.17, juster til ~ 10.000 protoplaster / μL. Hvis koncentrationen er lav, centrifugeres i 3 minutter ved 100 x g og resuspenderes i MMG til en koncentration på ~10.000 protoplaster/μL.
- Bland ~1.000.000 protoplaster med 15 μg DNA i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Fyld blandingen op med MMG til 114,4 μL, og inkuber på is i 30 minutter.
- Resuspender protoplasterne ved at banke på siden af røret. Tilsæt 105,6 μL 25% PEG-opløsning til protoplasterne for at nå en endelig vægt / volumen på 12% PEG. Bland forsigtigt ved at vende 5-10 gange. Protoplaster i PEG-opløsning er skrøbelige; Ryst ikke røret. Inkuber i 10 minutter i mørke ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Transfektionen kan skaleres op i multipla af de volumener, der er angivet i trin 4.2 og trin 4.3. For eksempel kan 10 millioner protoplaster og 150 μg DNA suspenderes i 1.444 μL MMG og behandles med 1.056 μL PEG-opløsning i et 50 ml centrifugerør. - Fortynd med 5 volumener inkubationsopløsning. Bland forsigtigt ved inversion. Spin ned i 4 min ved 100 x g ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Hvis du skalerer op, skal du opdele protoplasterne i flere rundbundede glasrør, der ikke indeholder mere end 10 ml hver for at sikre fuldstændig pelletering. Opskaler volumenet af inkubationsopløsningen, der anvendes til vask, forholdsmæssigt. - Supernatanten fjernes ved pipettering. Vask med 1-5 ml inkubationsopløsning, og drej ned i 3 min ved 100 x g ved stuetemperatur.
- Resuspender protoplasterne i inkubationsopløsningen til en koncentration på 500-1.000 celler/μL.
- Inkuber protoplasterne i mørket natten over (~ 16 timer) ved stuetemperatur.
5. Protoplast-genvinding og ekspressionsverifikation
- Drej protoplasterne ned i 4 minutter ved 100 x g ved stuetemperatur. BEMÆRK: Hvis du skalerer op, skal du opdele protoplasterne i flere rundbundede glasrør, der ikke indeholder mere end 10 ml hver.
- Vask med 1-5 ml inkubationsopløsning, og drej ned i 3 min ved 100 x g ved stuetemperatur.
- Resuspender, og kombiner i 1-5 ml inkubationsopløsning.
- Hvis protoplasterne transfekteres med et fluorescerende reportergen (f.eks. GFP), skal du tage en delprøve for at kontrollere transfektionseffektiviteten. Ved hjælp af et hæmocytometer skal du først tælle det samlede antal protoplaster ved hjælp af brightfield lysmikroskopi. Tæl derefter brøkdelen af fluorescerende protoplaster under UV-lys.
- Centrifuger protoplasterne i 3 minutter ved 100 x g ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Protoplasterne er nu klar til downstream-applikationer såsom RNA-ekstraktion med phenol og guanidinisothiocyanat.
Representative Results
Det væv, der er bedst egnet til protoplastisolering, er det andet og tredje blad af 10-11 dage gamle frøplanter (figur 1). I dette arbejde opnåede vi ca. 10 millioner protoplaster fra 16 bladsektioner, som hver var 10 cm lange. Antallet af isolerede protoplaster afhænger af bladmaterialets masse og bredden af bladskiverne, der fordøjes i enzymopløsningen.
Under et lysmikroskop ser ubeskadigede protoplaster nogenlunde sfæriske ud, med plastider, der pletter overfladen (figur 2A). Før du fortsætter med transfektion, kan levedygtigheden kontrolleres ved farvning af en lille prøve protoplaster med fluoresceindiacetat (FDA). FDA-farvede protoplaster, der fluorescerer under UV-lys, betragtes som levedygtige (figur 2B, C). Ikke alle protoplaster, der forekommer ubeskadigede, er stadig levedygtige, og nogle levedygtige protoplaster kan være i færd med at dø ved evakuering (figur 2C). I disse celler er vakuolen hævelse og vil til sidst blive skubbet ud af cellemembranen.
Figur 3 viser protoplaster transformeret med pJT01, et 4,3 kb majsekspressionsplasmid afledt af CD3-911 (ABRC)15. Transfektion resulterer i ekspression af sGFP mærket med et C-terminal nukleart lokaliseringssignal fra c-Myc (figur 3A). Andelen af sGFP-ekspressive protoplaster blev målt over flere eksperimenter ved hjælp af et hæmocytometer. Den mediane transfektionseffektivitet opnået ved denne metode var 40% efter inkubation natten over (n = 9, figur 4, tabel 1), hvilket er sammenligneligt med tidligere publicerede metoder15. Afhængigt af den eksperimentelle anvendelse, hvis plasmid- eller plasmidbiblioteket mangler en fluorescerende reporter, anbefales det at inkludere en positiv kontrol for at bekræfte transfektion.
Figur 1: Repræsentativ ætioleret majsplante dyrket i mørke i 10 dage efter spiring. Pilene angiver det andet og tredje blad, som er bedst egnet til protoplasting. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fluorescensmikroskopi af protoplastens levedygtighed efter isolering . (A) Brightfield-billede af protoplaster umiddelbart efter isolation. (B) Fluorescenssignalet fra de FDA-farvede protoplaster. (C) Overlapning af brightfield og fluorescens, der viser de levedygtige protoplaster. Pilen viser en protoplast, der gennemgår evakuering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fluorescensmikroskopi af protoplaster transfekteret med sGFP . (A) Brightfield-billede af protoplaster efter transfektion. B) Fluorescenssignalet for de transfekterede protoplaster i GFP-kanalen. (C) Overlapning af brightfield og fluorescens, der viser de transformerede protoplaster. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Procentdel protoplaster, der viser GFP-fluorescens efter 16 timers inkubation. Transfektionseffektiviteten varierede mellem uafhængige forsøg, med den laveste effektivitet omkring 20% og den højeste tæt på 50%. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Rettergang | GFP-celler talt | Samlet antal celler optalt | GFP procent |
| 1 | 104 | 261 | 39.8 |
| 2 | 148 | 298 | 49.5 |
| 3 | 84 | 258 | 32.6 |
| 4 | 137 | 271 | 50.6 |
| 5 | 127 | 299 | 42.5 |
| 6 | 107 | 235 | 45.5 |
| 7 | 83 | 360 | 23.1 |
| 8 | 134 | 549 | 24.4 |
| 9 | 61 | 201 | 30.3 |
| Betyde | 109 | 304 | 36 |
| Standardafvigelse | 29 | 102 | 10 |
Tabel 1: Repræsentativ protoplasttransfektionseffektivitet. Data fra ni nylige protoplastingforsøg i forfatternes laboratorium.
Supplerende fil 1: GenBank-formateret tekstfil med sekvensen af pJT01. Et 4,3 kb sGFP-ekspressionsplasmid tjener som en positiv kontrol i transfekterede majsprotoplaster. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Som tidligere rapporteret er kvaliteten af plantemateriale, der anvendes til protoplasting, afgørende for at opnå protoplaster af høj kvalitet16,17,18. Det er afgørende at vælge sunde uplettede blade. Dette arbejde brugte den populære forskning majs sort B73. Vi har ikke testet andre sorter. De majsplanter, der blev brugt til denne protokol, blev dyrket i mørke, fordi etiolerede blade producerer protoplaster med større levedygtighed 16 timer efter transfektion sammenlignet med protoplaster fra grønne blade. For applikationer, der ikke kræver inkubation natten over, vil det være muligt at bruge grønt eller grønt bladmateriale.
Et kritisk trin er korrekt at skære bladmaterialet i tynde skiver før enzymatisk fordøjelse. Denne proces øger overfladearealet for mesofylcellerne, der skal udsættes for enzymopløsningen, hvilket øger antallet af genvundne protoplaster. De distale bladspidser kasseres, og tynde (≤1 mm) skiver skæres med nye barberblade, som straks skiftes ud, når de begynder at blive kedelige. For en given mængde væv giver tyndere skiver flere protoplaster, forudsat at den korrekte teknik anvendes for at minimere knusning af bladene.
Det er også vigtigt at vaske protoplasterne korrekt, da de er ret sarte efter at have gennemgået fjernelse af cellevæg. Efter fordøjelsen holdes alle opløsningerne på is, og de mørkvoksede protoplaster er beskyttet mod lys. Osmolariteten og pH bufferes ved at udføre vaskerne i MMG-opløsning. For at isolere protoplasterne fra det mindre tætte cellulære affald finder centrifugering sted ved 100 x g. Protoplaster centrifugeret ved 200 x g viser lignende levedygtighed efter isolering, men lavere levedygtighed den følgende dag, og de transformerer også ca. halvdelen. Vi anbefaler at kontrollere protoplasternes levedygtighed ved farvning med FDA (fluoresceindiacetat) umiddelbart efter isolering; Den normale levedygtighed ligger mellem 70% -90%. Protoplaster med levedygtighed lavere end 40% efter isolering giver få transformanter.
Pelletering og vask er lettere, når man arbejder med mange protoplaster, fordi der opnås en tydeligt synlig pellet efter transfektion. Af denne grund udføres transfektion med 1 million eller flere protoplaster. Ved opskalering af protokollen skal der vælges en beholder af passende størrelse til inkubationstrinnene (1,5 ml, 15 ml eller 50 ml centrifugeglas), og volumenet af opløsning, der anvendes til vasketrinnene, skal skaleres i overensstemmelse hermed. Under alle omstændigheder er det gavnligt at centrifugere i ≤10 ml alikvoter for at sikre, at protoplasterne ikke forbliver i supernatanten. En nyskabelse i denne protokol er fjernelsen af 1 times inkubations- og vasketrin i W5-opløsning, der er anført i andre protokoller14,19, hvilket viste sig unødvendigt i vores hænder.
Som det ses i andre undersøgelser, er mængden og kvaliteten af DNA begge afgørende for vellykket transfektion19. Til plasmider i området 4-6 kb anvendes 15 μg DNA pr. 1 million protoplaster. DNA-præparater af dårlig kvalitet kan resultere i nedsat levedygtighed efter transfektion, så vi anbefaler at bruge et kommercielt DNA-ekstraktionssæt, når man isolerer plasmider fra bakterier. Inkubation af protoplasterne natten over sker ved stuetemperatur i mørke for at muliggøre transkription af plasmid- eller plasmidbiblioteket, samtidig med at stress minimeres. Efter inkubation natten over genvindes ca. halvdelen af antallet af oprindeligt transfekterede protoplaster. Protoplaster fortyndes til en koncentration på 500-1.000 celler / μL til inkubation natten over. Protoplaster, der efterlades til inkubation natten over i koncentrationer højere end 1.000 celler / μL, har lavere genvindingshastigheder og lavere levedygtighed. Ved højere koncentrationer kan affald fra beskadigede og døde protoplaster bidrage til døden af nærliggende protoplaster. Vask protoplasterne efter inkubation natten over tjener både til at fjerne dette affald og fjerne overskydende plasmid.
Protokoller som disse har den begrænsning, at ikke alle plantearter eller vævstyper er modtagelige for protoplasting. Desuden kan genekspressionsforskelle induceres ved protoplastingprocessen.
Sammenfattende har vi detaljeret en enkel og skalerbar protokol til isolering og transfektering af millioner af levedygtige protoplaster fra basislandbrugsafgrøden Z. mays. Denne metode kan transfektere mange flere protoplaster ved hjælp af PEG med en transformationseffektivitet, der er næsten lige så høj som elektroporationsbaserede metoder15. Det større nettoantal transformanter muliggør test af hundreder eller tusinder af konstruktioner i store eksperimenter såsom massivt parallelle reporteranalyser12,13. Fremtidige genom-skala eksperimenter i majs vil give forskerne mulighed for bedre at forstå majs genekspression og genregulering.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Human Genome Research Institute Interdisciplinary Training in Genomic Sciences (T32 uddannelsesstipendium nr. HG000035 til J.T.) og National Institute of Health (NIGMS 1R35GM139532 til C.Q.) og af National Science Foundation (RESEARCH-PGR IOS-1748843 og PlantSynBio 2240888 til CQ). Vi takker Andrea Gallovatti på Rutgers University for majsfrøets gave.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL graduated microcentrifuge tubes | VWR | 490004-444 | |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tube | Corning | 05-527-90 | |
| 250 mL Pyrex glass beaker | Fisher | 50-121-5005 | |
| 40 um nylon mesh cell strainer | Fisher | 22363547 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 14-432-22 | |
| 72 cell propagation tray | T.O. Plastics | 725607C | |
| Aluminum foil | VWR | 89107-732 | |
| Bell jar | Bel-Art | F42022-0000 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-250ML | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2*2H2O) | PhytoTech Labs | C135 | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Cellulase Onozuka R-10 | Duchefa Biochemie | C8001.0010 | |
| D-Mannitol | PhytoTech Labs | M562 | |
| Dissecting scope | Reichert | Microstar IV | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermofischer Scientific | F1303 | Dissolve in acetone at 0.5% weight/volume to make a 1000X stock solution. Protect from light and store at -20 °C. |
| Fluorescence Illumination Systems | Prior | Lumen200 | |
| Fluorescence microscope | Leica | MDG36 | |
| High-capacity centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Macerozyme | Duchefa Biochemie | M8002.0005 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M292-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Maize seeds | B73 | USDA-ARS | https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473 |
| Medium binder clip | Uline | S-24649 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M5287-250G | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Adjust pH to 5.7 using KOH. Protect from light and store at room temperature. |
| Micropipette 20-200 uL | Gilson | F123601G | |
| Nanodrop microvolume spectrophotometer | Thermofischer Scientific | ND-1000 | |
| NEB 5-alpha competent E. coli | New England BioLabs | C2987H | |
| Neubauer hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| No. 9 Single-edge razor blade | Excel | 20009 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-104 | |
| Poly(ethylene) glycol 4,000 | Sigma-Aldrich | 81240-1KG | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Professional Grade Vermiculite | NK Lawn & Garden | G208 | |
| Round-bottom glass centrifuge tube 30 mL | Kimble Chase | 45500-30 | |
| Rubber adapter for Corex centrifuge tubes | Corning | CLS8445AO | |
| Sphagnum peat moss | Premier Horticulture | 0128P | |
| TRIzol Reagent | Thermofischer Scientific | 15596018 | |
| Tygon vacuum tubing | VWR | 76336-844 | |
| Vacuum gauge | Wika | 4269978 |
References
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: A useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Wang, S., Tiwari, S. B., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. AUXIN RESPONSE FACTOR7 restores the expression of auxin-responsive genes in mutant Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts. The Plant Cell. 17 (7), 1979-1993 (2005).
- Hirner, A., et al. Arabidopsis LHT1 is a high-affinity transporter for cellular amino acid uptake in both root epidermis and leaf mesophyll. The Plant Cell. 18 (8), 1931-1946 (2006).
- Hwang, I., Sheen, J. Two-component circuitry in Arabidopsis cytokinin signal transduction. Nature. 413 (6854), 383-389 (2001).
- Tan, M. -L. M. C., Rietveld, E. M., van Marrewijk, G. A. M., Kool, A. J. Regeneration of leaf mesophyll protoplasts of tomato cultivars (L. esculentum): Factors important for efficient protoplast culture and plant regeneration. Plant Cell Reports. 6 (3), 172-175 (1987).
- Brandt, K. M., Gunn, H., Moretti, N., Zemetra, R. S. A streamlined protocol for wheat (Triticum aestivum) protoplast isolation and transformation with CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes. Frontiers in Plant Science. 11, 769 (2020).
- Nadakuduti, S. S., et al. Evaluation of methods to assess in vivo activity of engineered genome-editing nucleases in protoplasts. Frontiers in Plant Science. 10, 110 (2019).
- OECD, Food and Agriculture Organization of the United Nations.
- Gallois, P., Marinho, P. Leaf disk transformation using Agrobacterium tumefaciens-expression of heterologous genes in tobacco. Plant Gene Transfer and Expression Protocols. 49, 39-48 (1995).
- Schäffner, A. R., Sheen, J. Maize rbcS promoter activity depends on sequence elements not found in dicot rbcS promoters. The Plant Cell. 3 (9), 997-1012 (1991).
- Sheen, J. Molecular mechanisms underlying the differential expression of maize pyruvate, orthophosphate dikinase genes. The Plant Cell. 3 (3), 225-245 (1991).
- Jores, T., et al. Identification of plant enhancers and their constituent elements by STARR-seq in tobacco leaves. The Plant Cell. 32 (7), 2120-2131 (2020).
- Jores, T., et al. Synthetic promoter designs enabled by a comprehensive analysis of plant core promoters. Nature Plants. 7 (6), 842-855 (2021).
- Ricci, W. A., et al. Widespread long-range cis-regulatory elements in the maize genome. Nature Plants. 5 (12), 1237-1249 (2019).
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiology. 127 (4), 1466-1475 (2001).
- Jeon, J. M., et al. Efficient transient expression and transformation of PEG-mediated gene uptake into mesophyll protoplasts of pepper (Capsicum annuum L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 88 (2), 225-232 (2007).
- Pindel, A. Optimization of isolation conditions of Cymbidium protoplasts. Folia Horticulturae. 19, 79-88 (2007).
- Ren, R., et al. Highly efficient leaf base protoplast isolation and transient expression systems for orchids and other important monocot crops. Frontiers in Plant Science. 12, 626015 (2021).
- Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nature Protocols. 2 (7), 1565-1572 (2007).
