Summary
在这里，我们提出了一种高通量方案，用于瞬时转染数百万个玉米原生质体，用于测试玉米叶肉细胞中的大型质粒库。
Abstract
玉米叶肉细胞的转染通常涉及消化植物细胞壁以产生原生质体，然后通过电穿孔或聚乙二醇（PEG） 插入 DNA。以前的方法被开发为一次产生数万个转染的原生质体。在这里，我们描述了一种在玉米中分离和转染数百万叶叶肉原生质体的简单方法（Zea mays L.）。这种简化的过程消除了某些常见的原生程序，例如在W5中洗涤。此外，离心、PEG介导的转染和孵育等步骤已经过修改，可与更多的原生质体配合使用。表达大型质粒构建体文库的能力使基因组规模的实验成为可能，例如玉米中的大规模平行报告基因测定。
Introduction
瞬时基因表达是植物生物学的有力工具。然而，植物细胞很难转染，因为它们被细胞壁包围。这种DNA进入的屏障在其他常用研究的细胞类型（如哺乳动物或昆虫细胞）中不存在。过去的研究通过使用原生质体来解决这一挑战：细胞壁已被消化和去除的植物细胞。与未加工的叶组织相比，植物原生质体易于悬浮处理，并且适合电穿孔或聚乙二醇（PEG）介导的转染技术1。即使在细胞壁去除后，植物细胞仍保留其大部分功能。因此，原生质体用于多种植物中，以研究基因和蛋白质功能2，3，了解信号转导4，并确定植物育种的可能靶点5。原生质体也是筛选包括小麦和马铃薯在内的各种作物物种的基因组编辑构建体的便捷载体6，7。简而言之，原生质体中的瞬时测定对于农业生物技术是必不可少的。
玉米（Zea mays L.）是世界领先的谷物作物，按吨位计算;因此，它是基础和应用植物科学研究的主要焦点8.然而，与烟草9号等模式植物不同，完整玉米叶片中的瞬时转基因表达不是常规进行的。原生增生已被用于获取和转染玉米叶肉细胞10，11。以前的方法使用电穿孔实现了高达75%的转染效率，并产生了数以万计的转染原生质体10，15。
该协议详细介绍了如何原生质体数百万玉米叶肉细胞并以与以前方法相当的效率转染它们。主要步骤是种植乙二醇玉米幼苗，收获叶组织，消化植物细胞壁，并使用PEG将质粒DNA递送到细胞中。该协议的主要贡献是能够扩大原生质体转染，同时保持功能测定所需的细胞活力。这使得使用基因组规模的实验成为可能，例如大规模平行的报告基因测定，可以测试整个玉米基因组中数十万个区域的功能。该方法最近已被用于研究包括增强子和启动子12，13，14在内的顺式调节DNA元件的大型文库。
Protocol
1. 植物材料的生长
- 用自来水冲洗玉米粒两次。在室温下将内核浸泡在自来水中过夜。
- 第二天，在 72 细胞种子启动器托盘中装满湿润的 1：1 蛭石：泥炭藓。冲洗内核一次，然后将它们盖子向下种植，每个细胞一个内核。
- 在25°C的长日照条件下（16小时光照，8小时黑暗）生长3天。
- 转移到25°C的恒定黑暗中，并生长9-11天。
2. 质粒分离
- 根据制造商的说明，用感兴趣的质粒转化具有商业化学活性的大 肠杆菌 。
- 将转化的大 肠杆菌 在50mL液体LB培养基中与适当的抗生素一起在37°C振荡过夜。
- 通过在室温下以3，000×g离心10分钟来沉淀大肠杆菌。使用市售的midiprep质粒DNA分离试剂盒提取质粒。
- 使用微量分光光度计估计质粒DNA浓度。
注意：适合转染的材料浓度应为≥800 ng/μL，A260/A280应为≥1.8。
3. 原生质体分离
- 准备20 mL酶溶液。
- 将 2.18 g 甘露醇、0.30 g 纤维素酶 R-10 和 0.06 g macerozyme R-10 加入 50 mL 离心管中。倒置以混合粉末。加入去离子H 2O 至 15 mL。加入 200 μL 的 1 M MES，pH 5.7。涡旋混合。
- 将溶液在55°C下加热10分钟。在室温下冷却10分钟。
- 加入 20 μL 1 M CaCl2、0.02 g 牛血清白蛋白和 100 μL 1 M β-巯基乙醇。
- 用去离子 H2O 填充至 20 mL，倒入箔纸包裹的 250 mL 烧杯中。
- 将玉米幼苗从黑暗中取出。使用新的剃须刀片将它们切割在土壤上方几厘米处。将切口末端放入水中。不使用时，将它们在室温下避光保存。
- 选择每个幼苗的第二和第三叶，注意排除棕色或受损区域的叶子。选择 12-16 片叶子。从每片叶子的尖端切下~1厘米并丢弃。然后，从每片叶子上切下 10 厘米的切片。
注意：如果需要更多组织，请在额外的 250 mL 烧杯中使用额外 20 mL 体积的酶溶液。给定量的酶溶液中过多的叶子材料会降低活性。 - 将叶子部分堆叠在一起，基端并在一起。使用活页夹夹在基端将束夹在一起。将叶子束放在一张白纸上。
- 抓住叶子从远端~1厘米。使用新的剃须刀片，将垂直于静脉的远端切成薄片（0.5-1毫米）。避免直接向下切碎，而是在组织上进行短而向前的切片。
- 每当可见残留物开始沉积在纸张上时，更换剃须刀片。可见残留物表明由于刀片钝或技术不佳而导致组织糖化。
- 切割~2厘米的叶束长度后，立即将切片转移到酶溶液的烧杯中。不要让材料变干，因为这会减少获得的原生质体的数量。轻轻旋转酶溶液以润湿材料。
- 在烧杯上盖上盖上以阻挡光线。重复切片和转移过程，直到整个束被切割到靠近活页夹的地方。
- 将酶溶液的烧杯转移到钟形罐中。在室温下，相对于环境压力在-50.8kPa和-67.7kPa之间真空渗透3分钟。
- 将烧杯转移到桌面摇床上。在室温下以40RPM摇动2.5小时。用手轻轻旋转烧杯。当完全消化时，酶溶液会呈现略带乳白色。如果溶液仍然澄清，请继续以 40 RPM 的速度再摇晃一小时。不要超过3.5小时。
- 在消化过程中，制作甘露醇+ MES + MgCl2 （MMG）溶液，聚乙二醇（PEG）溶液和孵育溶液。
- MMG：将 5.47 g 甘露醇、200 μL 1 M MES、pH 5.7 和 750 μL 1 M MgCl2 加入 50 mL 离心管中。用蒸馏的 H2O 填充至 50 mL。 涡旋溶解。放在冰上。
- 孵育溶液：向 50 mL 离心管中加入 5.47 g 甘露醇、pH 5.7 时 200 μL 1 M MES 和 200 μL 1 M KCl。用蒸馏的 H2O 填充至 50 mL。 涡旋溶解。放在冰上。
- PEG 溶液：将 0.44 g 甘露醇、1.0 g PEG 和 400 μL 1 M CaCl2 加入 15 mL 离心管中。用蒸馏的 H2O 填充至 4 mL。 涡旋混合。在37°C振荡孵育30分钟直至完全溶解。在室温下保存。
- 在室温下以80RPM摇动酶溶液10分钟。
- 将装有酶溶液的烧杯放在冰上。请勿取下铝箔覆盖物。向酶溶液中加入 20 mL 冰冷的 MMG。通过 40 μm 细胞过滤器过滤到 50 mL 离心管中。
注意：在冰上保持所有溶液以进行以下步骤，直到添加 PEG。保持原生质体被箔纸覆盖，以尽量减少光照。 - 将滤液分成等体积，每个 10 mL。将每个体积倒入圆底玻璃离心管中，并在室温下以100× g 旋转4分钟。
- 弃去上清液，向每个试管中加入 1 mL 冰冷的 MMG。通过轻轻旋转和敲击试管来重新悬浮颗粒。将样品合并到单个圆底玻璃离心管中。将 MMG 添加到总体积为 5 mL。在室温下以100× g 旋转3分钟。
- 用 5 mL MMG 洗涤，并在室温下以 100 x g 旋转 3 分钟。
- 用 5 mL MMG 重复洗涤，并在室温下以 100 x g 旋转 3 分钟。旋转第二次洗涤后，观察上清液是否澄清。如果仍然浑浊，请进行第三次洗涤。
- 将原生质体重悬于 1 mL MMG 中。用箔纸松散地盖住并保持在冰上。
- 确定原生质体产量并检查活力。
- 在 1.5 mL 微量离心管中，将 4 μL 原生质体和 72 μL MMG 加入在一起。
- 在 1.5 mL 微量离心管中，将 1 μL 0.5% 荧光素二乙酸酯 （FDA） 储备溶液加入 49 μL MMG 中，制成 20x 工作溶液。向装有稀释原生质体的试管中加入 4 μL FDA 工作溶液。在室温下在黑暗中孵育5分钟。
- 将 11 μL 原生质体混合物加载到血细胞计数器上。放在明场光学显微镜下。目视确认细胞缺乏细胞壁。然后，计算原生质体的数量。使用此计数来估计获得的原生质体总数。然后，计算用FDA染色时在紫外线下发出绿色荧光的原生质体的数量。成功的原生质体分离产生70%-90%的活力。
4. PEG介导的转染
- 从步骤 3.17 开始估计的原生质体浓度，调整至 ~10，000 个原生质体/μL。如果浓度低，则以100 x g 离心3分钟，并在MMG中重悬至~10，000原生质体/ μL的浓度。
- 在 1.5 mL 微量离心管中将 ~1，000，000 个原生质体与 15 μg DNA 混合。用MMG将混合物加满至114.4μL，并在冰上孵育30分钟。
- 通过敲击管子的侧面重新悬浮原生质体。向原生质体中加入 105.6 μL 25% PEG 溶液，以达到 12% PEG 的最终重量/体积。倒置 5-10 次轻轻混合。PEG溶液中的原生质体是脆弱的;不要摇晃管子。在室温下在黑暗中孵育10分钟。
注意：转染可以按步骤4.2和步骤4.3中给出的体积的倍数进行放大。例如，可以将 1000 万个原生质体和 150 μg DNA 悬浮在 1，444 μL MMG 中，并在 50 mL 离心管中用 1，056 μL PEG 溶液处理。 - 用5体积的孵育溶液稀释。倒置轻轻混合。在室温下以100×g旋转4分钟。
注意：如果放大，将原生质体分成多个圆底玻璃管，每个玻璃管不超过 10 mL，以确保完全沉淀。按比例增加用于洗涤的孵育溶液体积。 - 通过移液除去上清液。用1-5mL孵育溶液洗涤，并在室温下以100× g 旋转3分钟。
- 将原生质体重悬于孵育溶液中至500-1，000个细胞/μL的浓度。
- 在室温下在黑暗中孵育原生质体过夜（~16小时）。
5. 原生质体恢复和表达验证
- 在室温下以100×g旋转原生质体4分钟。注意：如果放大，将原生质体分成多个圆底玻璃管，每个玻璃管不超过 10 mL。
- 用1-5mL孵育溶液洗涤，并在室温下以100× g 旋转3分钟。
- 重悬，并混合在 1-5 mL 的孵育溶液中。
- 如果原生质体转染了荧光报告基因（例如GFP），则取等分试样以检查转染效率。使用血细胞计数器，首先使用明场光学显微镜计数原生质体的总数。然后，在紫外线下计算荧光原生质体的比例。
- 在室温下以100× g 离心原生质体3分钟。
注意：原生质体现已准备好用于下游应用，例如用苯酚和异硫氰酸胍提取RNA。
Representative Results
最适合原生质体分离的组织是10-11日龄幼苗的第二和第三叶（图1）。在这项工作中，我们从16个叶段获得了大约1000万个原生质体，每个叶子长10厘米。分离的原生质体的数量取决于叶片材料的质量和酶溶液中消化的叶片切片的宽度。
在明场光学显微镜下，未损坏的原生质体大致呈球形，表面有质体斑点（图2A）。在进行转染之前，可以通过用荧光素二乙酸酯（FDA）染色少量原生质体来检查活性。在紫外光下发出荧光的FDA染色原生质体被认为是可行的（图2B，C）。并非所有看起来未受损的原生质体仍然存活，一些可行的原生质体可能正在通过抽真空死亡（图2C）。在这些细胞中，液泡膨胀并最终从细胞膜中排出。
图3显示了用pJT01转化的原生质体，pJT01是源自CD3-911（ABRC）15的4.3 kb玉米表达质粒。转染导致用c-Myc的C端核定位信号标记的sGFP表达（图3A）。使用血细胞计数器在多次实验中测量表达sGFP的原生质体的比例。孵育过夜后，该方法实现的中位转染效率为40%（n = 9， 图4， 表1），与先前发表的方法相当15。根据实验应用，如果质粒或质粒文库缺少荧光报告基因，建议包括阳性对照以确认转染。
图1：发芽后在黑暗中生长10天的代表性玉米幼苗。 箭头表示最适合原生质的第二和第三片叶子。 请点击此处查看此图的大图。
图2：分离后原生质体活力的荧光显微镜。 （A）分离后立即原生质体的明场图像。（B）FDA染色原生质体的荧光信号。（C）明场和荧光的重叠，显示活的原生质体。箭头显示正在疏散的原生质体。 请点击此处查看此图的大图。
图3：转染sGFP原生质体的荧光显微镜 。 （A）转染后原生质体的明场图像。（B）GFP通道中转染原生质体的荧光信号。（C）明场和荧光的重叠，显示转化的原生质体。 请点击此处查看此图的大图。
图4：孵育16小时后显示GFP荧光的原生质体的百分比。 独立试验的转染效率各不相同，最低的效率约为20%，最高接近50%。 请点击此处查看此图的大图。
| 试验 | GFP 细胞计数 | 计数的细胞总数 | GFP 百分比 |
| 1 | 104 | 261 | 39.8 |
| 2 | 148 | 298 | 49.5 |
| 3 | 84 | 258 | 32.6 |
| 4 | 137 | 271 | 50.6 |
| 5 | 127 | 299 | 42.5 |
| 6 | 107 | 235 | 45.5 |
| 7 | 83 | 360 | 23.1 |
| 8 | 134 | 549 | 24.4 |
| 9 | 61 | 201 | 30.3 |
| 意味 着 | 109 | 304 | 36 |
| 标准差 | 29 | 102 | 10 |
表1：代表性原生质体转染效率。 来自作者实验室最近九项原生质持久的试验的数据。
补充文件 1：具有 pJT01 序列的 GenBank 格式的文本文件。 4.3 kb sGFP表达质粒可作为转染玉米原生质体的阳性对照。 请点击此处下载此文件。
Discussion
如前所述，用于原生质体的植物材料的质量对于获得高质量的原生质体至关重要16，17，18。选择健康的无瑕疵叶子至关重要。这项工作使用了流行的研究玉米品种B73。我们没有测试过其他品种。用于该方案的玉米幼苗在黑暗中生长，因为与绿叶原生质体相比，转染后16小时产生的原生质体具有更大的活力。对于不需要过夜孵育的应用，可以使用绿色或绿色叶子材料。
关键步骤是在酶消化之前将叶子材料正确切成薄片。这个过程增加了叶肉细胞暴露于酶溶液的表面积，从而增加了回收原生质体的数量。远端叶尖被丢弃，用新的剃须刀片切割薄片（≤1毫米），当它们开始变钝时立即更换。对于给定数量的组织，如果采用正确的技术来最大程度地减少叶子的压碎，则较薄的切片会产生更多的原生质体。
正确清洗原生质体也很重要，因为它们在进行细胞壁去除后非常脆弱。消化后，将所有溶液保存在冰上，并保护深色生长的原生质体免受光照。通过在MMG溶液中进行洗涤来缓冲渗透压和pH值。为了从密度较低的细胞碎片中分离原生质体，离心以100 x g 进行。以200 x g 离心的原生质体在分离后表现出相似的活力，但第二天的活性较低，并且它们也转化了大约一半。我们建议在分离后立即用FDA（荧光素二乙酸酯）染色来检查原生质体的活力;正常存活率在70%-90%之间。分离后活力低于40%的原生质体产生很少的转化体。
当使用许多原生质体时，颗粒和洗涤更容易，因为在转染后可以获得清晰可见的沉淀。因此，使用100万个或更多的原生质体进行转染。放大方案时，应为孵育步骤选择适当大小的容器（1.5 mL、15 mL或50 mL离心管），并相应地缩放用于洗涤步骤的溶液体积。在任何情况下，以 ≤10 mL 等分试样离心以确保原生质体不会保留在上清液中是有益的。该协议的一项创新是去除了其他协议14，19中列出的W5溶液中的1小时孵育和洗涤步骤，这在我们手中被证明是不必要的。
正如其他研究所示，DNA的数量和质量对于成功转染都至关重要19。对于 4-6 kb 范围内的质粒，每 100 万个原生质体使用 15 μg DNA。劣质DNA制备会导致转染后活力降低，因此我们建议在从细菌中分离质粒时使用商业DNA提取试剂盒。在室温下在黑暗中孵育原生质体过夜，以允许质粒或质粒文库的转录，同时最大限度地减少压力。孵育过夜后，大约一半的原始转染原生质体被回收。将原生质体稀释至500-1，000个细胞/μL的浓度进行过夜孵育。以高于 1，000 个细胞/μL 的浓度孵育过夜的原生质体具有较低的回收率和较低的活力。在较高浓度下，受损和死亡原生质体的碎片可能导致相邻原生质体的死亡。在孵育过夜后洗涤原生质体既可以去除这些碎片，也可以去除多余的质粒。
诸如此类的方案具有局限性，即并非所有植物物种或组织类型都适合原生生物。此外，基因表达差异可能由原生持续过程诱导。
总之，我们详细介绍了一个简单且可扩展的方案，用于从主要农作物Z . mays中分离和转染数百万个可行的原生质体。该方法可以使用PEG转染更多的原生质体，其转化效率几乎与基于电穿孔的方法一样高15。更多的转化体净数量使得能够在大规模实验中测试数百或数千个构建体，例如大规模并行报告基因测定12，13。未来的玉米基因组规模实验将使科学家更好地了解玉米基因表达和基因调控。
Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
这项工作得到了国家人类基因组研究所基因组科学跨学科培训（T32培训资助号HG000035至J.T.）和美国国立卫生研究院（NIGMS 1R35GM139532至C.Q.）以及国家科学基金会（RESEARCH-PGR IOS-1748843和PlantSynBio 2240888至CQ）的支持。我们感谢罗格斯大学的安德里亚·加洛瓦蒂（Andrea Gallovatti）赠送玉米种子。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL graduated microcentrifuge tubes | VWR | 490004-444 | |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tube | Corning | 05-527-90 | |
| 250 mL Pyrex glass beaker | Fisher | 50-121-5005 | |
| 40 um nylon mesh cell strainer | Fisher | 22363547 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 14-432-22 | |
| 72 cell propagation tray | T.O. Plastics | 725607C | |
| Aluminum foil | VWR | 89107-732 | |
| Bell jar | Bel-Art | F42022-0000 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-250ML | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2*2H2O) | PhytoTech Labs | C135 | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Cellulase Onozuka R-10 | Duchefa Biochemie | C8001.0010 | |
| D-Mannitol | PhytoTech Labs | M562 | |
| Dissecting scope | Reichert | Microstar IV | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermofischer Scientific | F1303 | Dissolve in acetone at 0.5% weight/volume to make a 1000X stock solution. Protect from light and store at -20 °C. |
| Fluorescence Illumination Systems | Prior | Lumen200 | |
| Fluorescence microscope | Leica | MDG36 | |
| High-capacity centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Macerozyme | Duchefa Biochemie | M8002.0005 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M292-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Maize seeds | B73 | USDA-ARS | https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473 |
| Medium binder clip | Uline | S-24649 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M5287-250G | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Adjust pH to 5.7 using KOH. Protect from light and store at room temperature. |
| Micropipette 20-200 uL | Gilson | F123601G | |
| Nanodrop microvolume spectrophotometer | Thermofischer Scientific | ND-1000 | |
| NEB 5-alpha competent E. coli | New England BioLabs | C2987H | |
| Neubauer hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| No. 9 Single-edge razor blade | Excel | 20009 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-104 | |
| Poly(ethylene) glycol 4,000 | Sigma-Aldrich | 81240-1KG | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Professional Grade Vermiculite | NK Lawn & Garden | G208 | |
| Round-bottom glass centrifuge tube 30 mL | Kimble Chase | 45500-30 | |
| Rubber adapter for Corex centrifuge tubes | Corning | CLS8445AO | |
| Sphagnum peat moss | Premier Horticulture | 0128P | |
| TRIzol Reagent | Thermofischer Scientific | 15596018 | |
| Tygon vacuum tubing | VWR | 76336-844 | |
| Vacuum gauge | Wika | 4269978 |
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