Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein Hochdurchsatzprotokoll vor, mit dem Millionen von Maisprotoplasten transient transfiziert werden können, um große Bibliotheken von Plasmiden in Mais-Mesophyllzellen zu testen.
Abstract
Bei der Transfektion von Mais-Mesophyllzellen werden häufig die pflanzlichen Zellwände verdaut, um Protoplasten zu bilden, und dann DNA durch Elektroporation oder Polyethylenglykol (PEG) eingefügt. Bisherige Methoden wurden entwickelt, um Zehntausende von transfizierten Protoplasten auf einmal herzustellen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine einfache Methode zur Isolierung und Transfektion von Millionen von Blatt-Mesophyll-Protoplasten in Mais (Zea mays L.). Durch diesen optimierten Prozess entfallen bestimmte gängige Protoplasting-Schritte, wie z. B. das Waschen in W5. Darüber hinaus wurden Schritte wie Zentrifugation, PEG-vermittelte Transfektion und Inkubation modifiziert, um mit einer größeren Anzahl von Protoplasten zu arbeiten. Die Fähigkeit, große Bibliotheken von Plasmidkonstrukten zu exprimieren, ermöglicht Experimente auf Genomebene, wie z. B. massiv parallele Reporter-Assays in Mais.
Introduction
Die transiente Genexpression ist ein mächtiges Werkzeug in der Pflanzenbiologie. Pflanzenzellen sind jedoch schwer zu transfizieren, da sie von einer Zellwand umgeben sind. Diese Barriere für den DNA-Eintritt ist in anderen häufig untersuchten Zelltypen wie Säugetier- oder Insektenzellen nicht vorhanden. Frühere Forschungen haben sich dieser Herausforderung angenommen, indem sie Protoplasten eingesetzt haben: Pflanzenzellen, deren Zellwände verdaut und entfernt wurden. Im Gegensatz zu unverarbeitetem Blattgewebe sind pflanzliche Protoplasten in Suspension leicht zu verarbeiten und eignen sich für Transfektionstechniken, die durch Elektroporation oder Polyethylenglykol (PEG) vermittelt werden1. Pflanzenzellen behalten auch nach der Entfernung der Zellwand einen Großteil ihrer Funktionalität. Daher werden Protoplasten in einer Vielzahl von Pflanzen verwendet, um die Gen- und Proteinfunktion 2,3 zu untersuchen, die Signaltransduktion4 zu verstehen und mögliche Ziele für die Pflanzenzüchtung5 zu identifizieren. Protoplasten sind auch ein geeignetes Vehikel für das Screening von Genom-Editing-Konstrukten in verschiedenen Nutzpflanzenarten wie Weizen und Kartoffeln 6,7. Kurz gesagt, transiente Assays in Protoplasten sind für die landwirtschaftliche Biotechnologie unverzichtbar.
Mais (Zea mays L.) ist die weltweit führende Getreideernte nach Tonnage; Als solches ist es ein Schwerpunkt der grundlagen- und angewandten pflanzenwissenschaftlichen Forschung8. Anders als in Modellpflanzen wie Nicotiana tabacum9 wird die transiente Transgenexpression in intakten Maisblättern jedoch nicht routinemäßig durchgeführt. Protoplasting wurde verwendet, um Mesophyllzellen von Maisblättern zu erhalten und zu transfizieren10,11. Bisherige Methoden haben Transfektionseffizienzen von bis zu 75 % durch Elektroporation erreicht und transfizierte Protoplasten im Maßstab von Zehntausenden hergestellt10,15.
Dieses Protokoll beschreibt, wie Millionen von Mais-Mesophyllzellen protoplastiert und mit einer Effizienz transfiziert werden können, die mit früheren Methoden vergleichbar ist. Die Hauptschritte sind die Züchtung von etiolierten Maiskeimlingen, die Ernte des Blattgewebes, die Verdauung der pflanzlichen Zellwand und die Abgabe von Plasmid-DNA in die Zellen mithilfe von PEG. Der Hauptbeitrag dieses Protokolls ist die Fähigkeit, die Protoplastentransfektion zu skalieren und gleichzeitig die Zellviabilität zu erhalten, die für funktionelle Assays erforderlich ist. Dies ermöglicht den Einsatz von Experimenten auf Genomebene, wie z. B. massiv parallelen Reporter-Assays, mit denen die Funktion von Hunderttausenden von Regionen im gesamten Maisgenom getestet werden kann. Diese Methode wurde kürzlich verwendet, um große Bibliotheken von cis-regulatorischen DNA-Elementen, einschließlich Enhancern und Promotoren, zu untersuchen12,13,14.
Protocol
1. Wachstum des Pflanzenmaterials
- Maiskörner zweimal mit Leitungswasser abspülen. Die Körner über Nacht bei Raumtemperatur in Leitungswasser einweichen.
- Füllen Sie am nächsten Tag eine Starterschale mit 72 Zellen mit benetztem 1:1 Vermiculit:Torfmoos. Spülen Sie die Kerne einmal ab und pflanzen Sie sie mit der Spitze nach unten, ein Kern pro Zelle.
- Anbau unter langtägigen Bedingungen (16 h hell, 8 h dunkel) bei 25 °C für 3 Tage.
- Bei 25 °C in konstante Dunkelheit überführen und 9-11 Tage lang anbauen.
2. Plasmid-Isolierung
- Transformieren Sie handelsübliche chemisch kompetente E. coli mit dem/den interessierenden Plasmid(en) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Die transformierten E. coli werden in 50 ml flüssigem LB-Medium mit geeigneten Antibiotika über Nacht bei 37 °C unter Schütteln gezüchtet.
- Pelletieren Sie die E. coli , indem Sie sie 10 Minuten lang bei 3.000 x g Raumtemperatur zentrifugieren. Extrahieren Sie die Plasmide mit einem handelsüblichen midiprep-Plasmid-DNA-Isolationskit.
- Schätzen Sie die Plasmid-DNA-Konzentration mit einem Mikrovolumen-Spektralphotometer.
HINWEIS: Das für die Transfektion geeignete Material sollte eine Konzentration von ≥800 ng/μl und einen A260/A280-Wert von ≥1,8 aufweisen.
3. Isolierung von Protoplasten
- Bereiten Sie 20 ml Enzymlösung vor.
- Geben Sie 2,18 g Mannitol, 0,30 g Cellulase R-10 und 0,06 g Macerozym R-10 in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Umdrehen, um die Pulver zu mischen. Deionisiertes H2O zu 15 ml hinzufügen. Fügen Sie 200 μl 1 M MES, pH 5,7 hinzu. Wirbel zum Mischen.
- Die Lösung 10 min bei 55 °C erhitzen. 10 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Fügen Sie 20 μl 1 M CaCl2, 0,02 g Rinderserumalbumin und 100 μl 1 M β-Mercaptoethanol hinzu.
- Mit deionisiertemH2Oauf 20 ml füllen. In ein mit Folie umwickeltes 250-ml-Becherglas füllen.
- Nehmen Sie die Maissämlinge aus der Dunkelheit. Schneiden Sie sie mit einer neuen Rasierklinge einige Zentimeter über dem Boden ab. Legen Sie die abgeschnittenen Enden in Wasser. Bewahren Sie sie bei Nichtgebrauch im Dunkeln bei Raumtemperatur auf.
- Wählen Sie das zweite und dritte Blatt jedes Sämlings aus und achten Sie darauf, Blätter mit braunen oder beschädigten Bereichen auszuschließen. Wählen Sie 12-16 Blätter aus. Schneiden Sie ~1 cm von der Spitze jedes Blattes ab und entsorgen Sie es. Schneiden Sie dann von jedem Blatt einen 10 cm langen Abschnitt ab.
Anmerkungen: Wenn mehr Gewebe benötigt wird, verwenden Sie ein zusätzliches Volumen von 20 ml Enzymlösung in einem zusätzlichen 250-ml-Becherglas. Zu viel Blattmaterial in einer bestimmten Menge Enzymlösung kann die Lebensfähigkeit verringern. - Stapeln Sie die Blattabschnitte mit den basalen Enden übereinander. Klemmen Sie das Bündel am basalen Ende mit einer Binderklammer zusammen. Legen Sie das Bündel Blätter auf ein weißes Blatt Papier.
- Fassen Sie die Blätter ~1 cm vom distalen Ende entfernt. Schneiden Sie die Blätter mit einer neuen Rasierklinge vom distalen Ende senkrecht zu den Venen in dünne (0,5-1 mm) Scheiben. Vermeiden Sie es, gerade nach unten zu hacken, sondern machen Sie kurze, nach vorne gerichtete Scheiben durch das Gewebe.
- Tauschen Sie die Rasierklingen immer dann aus, wenn sich sichtbare Rückstände auf dem Papier ablagern. Sichtbare Rückstände deuten auf ein Zerdrücken des Gewebes aufgrund einer stumpfen Klinge oder einer schlechten Technik hin.
- Nachdem Sie ~ 2 cm der Länge des Blattbündels abgeschnitten haben, geben Sie die Scheiben sofort in das Becherglas mit der Enzymlösung. Lassen Sie das Material nicht austrocknen, da dies die Anzahl der erhaltenen Protoplasten reduziert. Schwenken Sie die Enzymlösung vorsichtig, um das Material zu benetzen.
- Legen Sie einen Foliendeckel über das Becherglas, um das Licht zu blockieren. Wiederholen Sie den Schneide- und Transfervorgang, bis das gesamte Bündel in der Nähe der Bindeklammer geschnitten ist.
- Füllen Sie das Becherglas mit der Enzymlösung in eine Glasglocke. Vakuuminfiltrat zwischen −50,8 kPa und −67,7 kPa bezogen auf den Umgebungsdruck für 3 min bei Raumtemperatur.
- Übertragen Sie den Becher in einen Tischschüttler. Bei 40 U/min 2,5 h bei Raumtemperatur schütteln. Schwenken Sie den Becher vorsichtig von Hand. Wenn die Enzymlösung vollständig verdaut ist, erscheint sie leicht milchig. Wenn die Lösung noch klar ist, schütteln Sie bis zu einer weiteren Stunde mit 40 U/min weiter. 3,5 Stunden nicht überschreiten.
- Stellen Sie während des Aufschlusses eine Mannitol + MES + MgCl2 (MMG)-Lösung, eine Polyethylenglykol (PEG)-Lösung und eine Inkubationslösung her.
- MMG: 5,47 g Mannitol, 200 μl 1 M MES, pH 5,7 und 750 μl 1 M MgCl2 in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben. Füllen Sie es auf 50 ml mit destilliertemH2O. Vortex, um es aufzulösen. Auf Eis legen.
- Inkubationslösung: 5,47 g Mannitol, 200 μl 1 M MES bei einem pH-Wert von 5,7 und 200 μl 1 M KCl in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben. Füllen Sie es auf 50 ml mit destilliertemH2O. Vortex, um es aufzulösen. Auf Eis legen.
- PEG-Lösung: 0,44 g Mannitol, 1,0 g PEG und 400 μl 1 M CaCl2 in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben. Füllen Sie auf 4 mL mit destilliertemH2O. Vortex zum Mischen. Bei 37 °C unter Schütteln 30 min inkubieren, bis sie sich vollständig aufgelöst haben. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
- Schütteln Sie die Enzymlösung bei 80 U/min für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
- Stellen Sie das Becherglas mit der Enzymlösung auf Eis. Entfernen Sie nicht die Folienabdeckung. Geben Sie 20 ml eiskaltes MMG in die Enzymlösung. Filtern Sie durch ein 40-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
Anmerkungen: Lassen Sie alle Lösungen für die folgenden Schritte bis zum Hinzufügen des PEG auf Eis. Halten Sie die Protoplasten mit Folie bedeckt, um die Lichteinwirkung zu minimieren. - Teilen Sie das Filtrat in gleiche Volumina von jeweils 10 ml auf. Gießen Sie jedes Volumen in ein Zentrifugenröhrchen aus Glas mit rundem Boden und schleudern Sie es 4 Minuten lang bei 100 x g bei Raumtemperatur herunter.
- Entsorgen Sie den Überstand und geben Sie 1 ml eiskaltes MMG in jedes Röhrchen. Resuspendieren Sie die Pellets, indem Sie die Röhrchen vorsichtig schwenken und klopfen. Kombinieren Sie die Proben in einem einzigen Zentrifugenröhrchen aus Glas mit rundem Boden. Fügen Sie MMG zu einem Gesamtvolumen von 5 ml hinzu. 3 min bei 100 x g Raumtemperatur schleudern.
- Mit 5 ml MMG waschen und 3 Minuten bei 100 x g Raumtemperatur schleudern.
- Wiederholen Sie die Wäsche mit 5 ml MMG und schleudern Sie sie 3 Minuten lang bei 100 x g Raumtemperatur herunter. Beobachten Sie nach dem Herunterschleudern der zweiten Wäsche, ob der Überstand klar ist. Wenn es trüb bleibt, führen Sie eine dritte Wäsche durch.
- Resuspendieren Sie die Protoplasten in 1 ml MMG. Locker mit Folie abdecken und auf Eis aufbewahren.
- Bestimmen Sie die Protoplastenausbeute und prüfen Sie die Lebensfähigkeit.
- In einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen werden 4 μl Protoplasten und 72 μl MMG addiert.
- Geben Sie in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 1 μl 0,5%ige Fluorescein-Diacetat-Stammlösung (FDA) zu 49 μl MMG hinzu, um eine 20-fache Arbeitslösung herzustellen. Geben Sie 4 μl FDA-Arbeitslösung in das Röhrchen mit den verdünnten Protoplasten. 5 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
- Laden Sie 11 μl des Protoplastengemisches auf ein Hämozytometer. Unter ein Hellfeld-Lichtmikroskop stellen. Vergewissern Sie sich visuell, dass den Zellen keine Zellwände fehlen. Zählen Sie dann die Anzahl der Protoplasten. Verwenden Sie diese Zählung, um die Gesamtzahl der erhaltenen Protoplasten zu schätzen. Zählen Sie dann die Anzahl der Protoplasten, die unter UV-Licht grün fluoreszieren, wenn sie mit FDA gefärbt werden. Erfolgreiche Protoplastenisolierungen ergeben eine Viabilität von 70%-90%.
4. PEG-vermittelte Transfektion
- Beginnen Sie mit der geschätzten Protoplastenkonzentration aus Schritt 3.17 und stellen Sie sie auf ~10.000 Protoplasten/μl ein. Wenn die Konzentration niedrig ist, zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 100 x g und resuspendieren Sie sie in MMG auf eine Konzentration von ~10.000 Protoplasten/μl.
- Mischen Sie ~1.000.000 Protoplasten mit 15 μg DNA in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Füllen Sie die Mischung mit MMG auf 114,4 μl auf und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis.
- Resuspendieren Sie die Protoplasten, indem Sie auf die Seite des Schlauchs klopfen. Fügen Sie den Protoplasten 105,6 μl 25%ige PEG-Lösung hinzu, um ein Endgewicht/Volumen von 12% PEG zu erreichen. Vorsichtig mischen, indem Sie 5-10 Mal umdrehen. Protoplasten in PEG-Lösung sind zerbrechlich; Schütteln Sie den Schlauch nicht. 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
HINWEIS: Die Transfektion kann um ein Vielfaches der in den Schritten 4.2 und 4.3 angegebenen Volumina skaliert werden. So können beispielsweise 10 Millionen Protoplasten und 150 μg DNA in 1.444 μL MMG suspendiert und mit 1.056 μL PEG-Lösung in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen behandelt werden. - Mit 5 Volumina Inkubationslösung verdünnen. Vorsichtig durch Umkehren mischen. 4 min bei 100 x g Raumtemperatur schleudern.
Anmerkungen: Wenn Sie nach oben skalieren, teilen Sie die Protoplasten in mehrere Glasröhrchen mit rundem Boden auf, die jeweils nicht mehr als 10 ml enthalten, um eine vollständige Pelletierung zu gewährleisten. Erhöhen Sie das Volumen der Inkubationslösung, das zum Waschen verwendet wird, proportional. - Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren. Mit 1-5 ml Inkubationslösung waschen und 3 Minuten bei 100 x g Raumtemperatur schleudern.
- Resuspendieren Sie die Protoplasten in der Inkubationslösung auf eine Konzentration von 500-1.000 Zellen/μl.
- Inkubieren Sie die Protoplasten im Dunkeln über Nacht (~16 h) bei Raumtemperatur.
5. Protoplasten-Genesung und Expressionsüberprüfung
- Die Protoplasten 4 min bei 100 x g Raumtemperatur herunterschleudern. Anmerkungen: Wenn Sie nach oben skalieren, teilen Sie die Protoplasten in mehrere Glasröhrchen mit rundem Boden auf, die jeweils nicht mehr als 10 ml enthalten.
- Mit 1-5 ml Inkubationslösung waschen und 3 Minuten bei 100 x g Raumtemperatur schleudern.
- Resuspendieren und in 1-5 ml Inkubationslösung mischen.
- Wenn die Protoplasten mit einem fluoreszierenden Reportergen (z. B. GFP) transfiziert werden, nehmen Sie ein Aliquot, um die Transfektionseffizienz zu überprüfen. Zählen Sie zunächst mit einem Hämozytometer die Gesamtzahl der Protoplasten mittels Hellfeldlichtmikroskopie. Zählen Sie dann den Anteil der fluoreszierenden Protoplasten unter UV-Licht.
- Die Protoplasten 3 min bei 100 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
HINWEIS: Die Protoplasten sind nun bereit für nachgelagerte Anwendungen wie die RNA-Extraktion mit Phenol- und Guanidinisothiocyanat.
Representative Results
Das Gewebe, das sich am besten für die Isolierung von Protoplasten eignet, sind die zweiten und dritten Blätter von 10-11 Tage alten Sämlingen (Abbildung 1). In dieser Arbeit erhielten wir etwa 10 Millionen Protoplasten aus 16 Blattabschnitten, von denen jeder 10 cm lang war. Die Anzahl der isolierten Protoplasten ist abhängig von der Masse des Blattmaterials und der Breite der Blattscheiben, die in der Enzymlösung verdaut werden.
Unter einem Hellfeldlichtmikroskop erscheinen unbeschädigte Protoplasten annähernd kugelförmig, wobei Plastiden die Oberfläche sprenkeln (Abbildung 2A). Bevor mit der Transfektion fortgefahren wird, kann die Viabilität durch Färbung eines kleinen Aliquots von Protoplasten mit Fluoresceindiacetat (FDA) überprüft werden. FDA-gefärbte Protoplasten, die unter UV-Licht fluoreszieren, gelten als lebensfähig (Abbildung 2B, C). Nicht alle Protoplasten, die unbeschädigt zu sein scheinen, sind noch lebensfähig, und einige lebensfähige Protoplasten sind möglicherweise dabei, durch Evakuierung zu sterben (Abbildung 2C). In diesen Zellen schwillt die Vakuole an und wird schließlich aus der Zellmembran ausgestoßen.
Abbildung 3 zeigt Protoplasten, die mit pJT01 transformiert wurden, einem 4,3 kb Maisexpressionsplasmid, das von CD3-911 (ABRC)15 abgeleitet ist. Die Transfektion führt zur Expression von sGFP, das mit einem C-terminalen Kernlokalisationssignal von c-Myc markiert ist (Abbildung 3A). Der Anteil der sGFP-exprimierenden Protoplasten wurde über mehrere Experimente mit einem Hämozytometer gemessen. Die mediane Transfektionseffizienz, die mit dieser Methode erreicht wurde, betrug 40 % nach Inkubation über Nacht (n = 9, Abbildung 4, Tabelle 1), was mit zuvor veröffentlichten Methoden vergleichbar ist15. Je nach experimenteller Anwendung wird empfohlen, eine Positivkontrolle einzuschließen, um die Transfektion zu bestätigen, wenn dem Plasmid oder der Plasmidbibliothek ein Fluoreszenzreporter fehlt.
Abbildung 1: Repräsentativer etiolierter Maiskeimling, der nach der Keimung 10 Tage lang im Dunkeln gewachsen ist. Die Pfeile zeigen das zweite und dritte Blatt an, die sich am besten für die Protoplast eignen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Fluoreszenzmikroskopie der Viabilität der Protoplasten nach der Isolierung. (A) Hellfeldaufnahme der Protoplasten unmittelbar nach der Isolierung. (B) Das Fluoreszenzsignal der FDA-gefärbten Protoplasten. (C) Überlappung von Hellfeld und Fluoreszenz mit den lebensfähigen Protoplasten. Der Pfeil zeigt einen Protoplasten, der evakuiert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Fluoreszenzmikroskopie von Protoplasten, die mit sGFP transfiziert wurden . (A) Hellfeldaufnahme von Protoplasten nach Transfektion. (B) Das Fluoreszenzsignal der transfizierten Protoplasten im GFP-Kanal. (C) Überlappung von Hellfeld und Fluoreszenz mit den transformierten Protoplasten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Prozentualer Anteil der Protoplasten mit GFP-Fluoreszenz nach 16 h Inkubation. Die Transfektionseffizienz variierte zwischen den unabhängigen Studien, wobei die niedrigste Effizienz bei 20 % und die höchste bei fast 50 % lag. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Probephase | GFP-Zellen gezählt | Gesamtzahl der gezählten Zellen | GFP-Anteil |
| 1 | 104 | 261 | 39.8 |
| 2 | 148 | 298 | 49.5 |
| 3 | 84 | 258 | 32.6 |
| 4 | 137 | 271 | 50.6 |
| 5 | 127 | 299 | 42.5 |
| 6 | 107 | 235 | 45.5 |
| 7 | 83 | 360 | 23.1 |
| 8 | 134 | 549 | 24.4 |
| 9 | 61 | 201 | 30.3 |
| Bedeuten | 109 | 304 | 36 |
| Standardabweichung | 29 | 102 | 10 |
Tabelle 1: Repräsentative Transfektionseffizienz von Protoplasten. Daten aus neun kürzlich durchgeführten Protoplasting-Studien im Labor der Autoren.
Supplemental File 1: GenBank-formatierte Textdatei mit der Sequenz von pJT01. Ein 4,3 kb sGFP-Expressionsplasmid dient als Positivkontrolle in transfizierten Maisprotoplasten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Wie bereits berichtet, ist die Qualität des Pflanzenmaterials, das für Protoplasting verwendet wird, entscheidend für die Gewinnung hochwertiger Protoplasten16,17,18. Es ist wichtig, gesunde, makellose Blätter auszuwählen. In dieser Arbeit wurde die populäre Forschungsmaissorte B73 verwendet. Andere Sorten haben wir nicht getestet. Die Maiskeimlinge, die für dieses Protokoll verwendet wurden, wurden in der Dunkelheit gezüchtet, da etiolierte Blätter 16 Stunden nach der Transfektion Protoplasten mit größerer Lebensfähigkeit produzieren als Protoplasten aus grünen Blättern. Für Anwendungen, die keine Inkubation über Nacht erfordern, wäre die Verwendung von grünem oder grünem Blattmaterial möglich.
Ein kritischer Schritt ist das richtige Schneiden des Blattmaterials in dünne Scheiben vor der enzymatischen Verdauung. Dieser Prozess vergrößert die Oberfläche, auf der die Mesophyllzellen der Enzymlösung ausgesetzt werden können, was die Anzahl der gewonnenen Protoplasten erhöht. Die distalen Blattspitzen werden verworfen und dünne (≤1 mm) Scheiben mit neuen Rasierklingen geschnitten, die sofort ausgetauscht werden, wenn sie stumpf werden. Für eine bestimmte Menge an Gewebe ergeben dünnere Scheiben mehr Protoplasten, vorausgesetzt, die richtige Technik wird angewendet, um die Quetschung der Blätter zu minimieren.
Wichtig ist auch das richtige Waschen der Protoplasten, da sie nach der Zellwandentfernung sehr empfindlich sind. Nach der Verdauung werden alle Lösungen auf Eis gelegt und die dunkel gewachsenen Protoplasten vor Licht geschützt. Die Osmolarität und der pH-Wert werden gepuffert, indem die Waschvorgänge in MMG-Lösung durchgeführt werden. Um die Protoplasten von den weniger dichten Zelltrümmern zu isolieren, erfolgt die Zentrifugation bei 100 x g. Protoplasten, die bei 200 x g zentrifugiert wurden, zeigen nach der Isolierung eine ähnliche Lebensfähigkeit, aber eine geringere Lebensfähigkeit am nächsten Tag, und sie transformieren sich etwa halb so gut. Wir empfehlen, die Lebensfähigkeit der Protoplasten durch Färbung mit FDA (Fluorescein-Diacetat) unmittelbar nach der Isolierung zu überprüfen; Die normale Lebensfähigkeit liegt zwischen 70 % und 90 %. Protoplasten mit einer Viabilität von weniger als 40% nach Isolation liefern nur wenige Transformanten.
Das Pelletieren und Waschen ist bei der Arbeit mit vielen Protoplasten einfacher, da nach der Transfektion ein deutlich sichtbares Pellet erhalten wird. Aus diesem Grund wird die Transfektion mit 1 Million oder mehr Protoplasten durchgeführt. Bei der Skalierung des Protokolls sollte ein Gefäß geeigneter Größe für die Inkubationsschritte ausgewählt werden (1,5 ml, 15 ml oder 50 ml Zentrifugenröhrchen), und das für die Waschschritte verwendete Lösungsvolumen sollte entsprechend skaliert werden. In jedem Fall ist es von Vorteil, in ≤10-ml-Aliquoten zu zentrifugieren, um sicherzustellen, dass die Protoplasten nicht im Überstand verbleiben. Eine Neuerung dieses Protokolls ist der Wegfall des 1-stündigen Inkubations- und Waschschritts in W5-Lösung, der in anderen Protokollen14,19 aufgeführt ist und sich in unseren Händen als unnötig erwies.
Wie in anderen Studien gezeigt wurde, sind sowohl die Menge als auch die Qualität der DNA entscheidend für eine erfolgreiche Transfektion19. Für Plasmide im Bereich von 4-6 kb werden 15 μg DNA pro 1 Million Protoplasten verwendet. Minderwertige DNA-Präparate können zu einer verminderten Lebensfähigkeit nach der Transfektion führen, daher empfehlen wir die Verwendung eines handelsüblichen DNA-Extraktionskits, wenn Plasmide aus Bakterien isoliert werden. Die Inkubation der Protoplasten über Nacht erfolgt bei Raumtemperatur im Dunkeln, um die Transkription des Plasmids oder der Plasmidbibliothek zu ermöglichen und gleichzeitig den Stress zu minimieren. Nach der Inkubation über Nacht wird etwa die Hälfte der ursprünglich transfizierten Protoplasten gewonnen. Protoplasten werden für die Inkubation über Nacht auf eine Konzentration von 500-1.000 Zellen/μl verdünnt. Protoplasten, die über Nacht in Konzentrationen von mehr als 1.000 Zellen/μl inkubiert werden, haben geringere Wiederfindungsraten und eine geringere Lebensfähigkeit. In höheren Konzentrationen können Trümmer von beschädigten und toten Protoplasten zum Absterben benachbarter Protoplasten beitragen. Das Waschen der Protoplasten nach der Inkubation über Nacht dient sowohl dazu, diese Ablagerungen als auch das überschüssige Plasmid zu entfernen.
Protokolle wie diese haben die Einschränkung, dass nicht alle Pflanzenarten oder Gewebetypen für das Protoplasting geeignet sind. Darüber hinaus können Unterschiede in der Genexpression durch den Protoplasting Prozess induziert werden.
Zusammenfassend haben wir ein einfaches und skalierbares Protokoll zur Isolierung und Transfektion von Millionen lebensfähiger Protoplasten aus dem Grundnahrungsmittel Z. mays detailliert beschrieben. Mit dieser Methode können viel mehr Protoplasten mit PEG transfiziert werden, wobei die Transformationseffizienz fast so hoch ist wie bei elektroporationsbasierten Methoden15. Die größere Nettoanzahl von Transformatoren ermöglicht die Prüfung von Hunderten oder Tausenden von Konstrukten in groß angelegten Experimenten wie massiv-parallelen Reporter-Assays12,13. Zukünftige Experimente auf Genomebene in Mais werden es den Wissenschaftlern ermöglichen, die Genexpression und Genregulation von Mais besser zu verstehen.
Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Human Genome Research Institute Interdisciplinary Training in Genomic Sciences (T32 Training Grant Nr. HG000035 an J.T.) und dem National Institute of Health (NIGMS 1R35GM139532 an C.Q.) sowie von der National Science Foundation (RESEARCH-PGR IOS-1748843 und PlantSynBio 2240888 an CQ) unterstützt. Wir danken Andrea Gallovatti von der Rutgers University für das Geschenk der Maiskörner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL graduated microcentrifuge tubes | VWR | 490004-444 | |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tube | Corning | 05-527-90 | |
| 250 mL Pyrex glass beaker | Fisher | 50-121-5005 | |
| 40 um nylon mesh cell strainer | Fisher | 22363547 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 14-432-22 | |
| 72 cell propagation tray | T.O. Plastics | 725607C | |
| Aluminum foil | VWR | 89107-732 | |
| Bell jar | Bel-Art | F42022-0000 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-250ML | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2*2H2O) | PhytoTech Labs | C135 | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Cellulase Onozuka R-10 | Duchefa Biochemie | C8001.0010 | |
| D-Mannitol | PhytoTech Labs | M562 | |
| Dissecting scope | Reichert | Microstar IV | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermofischer Scientific | F1303 | Dissolve in acetone at 0.5% weight/volume to make a 1000X stock solution. Protect from light and store at -20 °C. |
| Fluorescence Illumination Systems | Prior | Lumen200 | |
| Fluorescence microscope | Leica | MDG36 | |
| High-capacity centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Macerozyme | Duchefa Biochemie | M8002.0005 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M292-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Maize seeds | B73 | USDA-ARS | https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473 |
| Medium binder clip | Uline | S-24649 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M5287-250G | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Adjust pH to 5.7 using KOH. Protect from light and store at room temperature. |
| Micropipette 20-200 uL | Gilson | F123601G | |
| Nanodrop microvolume spectrophotometer | Thermofischer Scientific | ND-1000 | |
| NEB 5-alpha competent E. coli | New England BioLabs | C2987H | |
| Neubauer hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| No. 9 Single-edge razor blade | Excel | 20009 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-104 | |
| Poly(ethylene) glycol 4,000 | Sigma-Aldrich | 81240-1KG | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Professional Grade Vermiculite | NK Lawn & Garden | G208 | |
| Round-bottom glass centrifuge tube 30 mL | Kimble Chase | 45500-30 | |
| Rubber adapter for Corex centrifuge tubes | Corning | CLS8445AO | |
| Sphagnum peat moss | Premier Horticulture | 0128P | |
| TRIzol Reagent | Thermofischer Scientific | 15596018 | |
| Tygon vacuum tubing | VWR | 76336-844 | |
| Vacuum gauge | Wika | 4269978 |
References
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