Summary
Hier presenteren we een high-throughput protocol om miljoenen maïsprotoplasten tijdelijk te transfecteren voor het testen van grote bibliotheken van plasmiden in maïsmesofylcellen.
Abstract
De transfectie van maïsmesofylcellen omvat vaak het verteren van de celwanden van de plant om protoplasten te maken en vervolgens DNA in te brengen via elektroporatie of polyethyleenglycol (PEG). Eerdere methoden werden ontwikkeld om tienduizenden getransfecteerde protoplasten tegelijk te produceren. Hier beschrijven we een eenvoudige methode om miljoenen bladmesophylprotoplasten in maïs (Zea mays L.) te isoleren en te transfecteren. Dit gestroomlijnde proces verwijdert bepaalde veel voorkomende protoplastingstappen, zoals wassen in W5. Bovendien zijn stappen zoals centrifugeren, PEG-gemedieerde transfectie en incubatie aangepast om met een groter aantal protoplasten te werken. Het vermogen om grote bibliotheken van plasmideconstructen tot expressie te brengen, maakt experimenten op genoomschaal mogelijk, zoals massaal parallelle reporter-assays in maïs.
Introduction
Voorbijgaande genexpressie is een krachtig hulpmiddel in de plantenbiologie. Plantencellen zijn echter moeilijk te transfecteren omdat ze omgeven zijn door een celwand. Deze barrière voor DNA-invoer is niet aanwezig in andere vaak bestudeerde celtypen zoals zoogdier- of insectencellen. Eerder onderzoek pakte deze uitdaging aan door gebruik te maken van protoplasten: plantencellen waarvan de celwanden zijn verteerd en verwijderd. In tegenstelling tot onbewerkt bladweefsel zijn plantaardige protoplasten gemakkelijk om mee te werken in suspensie en vatbaar voor transfectietechnieken gemedieerd door elektroporatie of polyethyleenglycol (PEG)1. Plantencellen behouden veel van hun functionaliteit, zelfs na verwijdering van de celwand. Zo worden protoplasten in verschillende planten gebruikt om gen- en eiwitfunctie 2,3 te bestuderen, signaaltransductie4 te begrijpen en mogelijke doelen voor plantenveredeling te identificeren5. Protoplasten zijn ook een handig vehikel voor het screenen van genoombewerkingsconstructies in diverse gewassoorten, waaronder tarwe en aardappel 6,7. Kortom, transiënte assays in protoplasten zijn onmisbaar voor de landbouwbiotechnologie.
Maïs (Zea mays L.) is 's werelds grootste graanoogst in tonnage; Als zodanig is het een belangrijke focus van fundamenteel en toegepast plantenwetenschappelijk onderzoek8. In tegenstelling tot modelplanten zoals Nicotiana tabacum9 wordt transgene expressie in intacte maïsbladeren echter niet routinematig uitgevoerd. Protoplasting is gebruikt voor het verkrijgen en transfecteren van maïsblad mesofylcellen10,11. Eerdere methoden hebben transfectie-efficiënties tot 75% bereikt met behulp van elektroporatie en produceerden getransfecteerde protoplasten op de schaal van tienduizenden10,15.
Dit protocol beschrijft hoe miljoenen maïsmesofylcellen kunnen worden geprotoplast en getransfecteerd met een efficiëntie die vergelijkbaar is met eerdere methoden. De belangrijkste stappen zijn het kweken van geëtioleerde maïszaailingen, het oogsten van het bladweefsel, het verteren van de celwand van de plant en het leveren van plasmide-DNA in de cellen met behulp van PEG. De belangrijkste bijdrage van dit protocol is de mogelijkheid om protoplasttransfectie op te schalen met behoud van de levensvatbaarheid van de cellen die nodig zijn voor functionele assays. Dit maakt het gebruik van experimenten op genoomschaal mogelijk, zoals massaal parallelle reporter-assays, die de functie van honderdduizenden regio's in het maïsgenoom kunnen testen. Deze methode is onlangs gebruikt om grote bibliotheken van cis-regulerende DNA-elementen te onderzoeken, waaronder versterkers en promotors 12,13,14.
Protocol
1. Groei van het plantmateriaal
- Spoel de maïskorrels twee keer af met leidingwater. Week de pitten een nacht in leidingwater op kamertemperatuur.
- Vul de volgende dag een startbak met 72 cellen met bevochtigd 1:1 vermiculiet:veenmos. Spoel de pitten een keer af en plant ze met de dop naar beneden, één pit per cel.
- Kweek onder langdurige dagomstandigheden (16 uur licht, 8 uur donker) bij 25 °C gedurende 3 dagen.
- Overbrengen naar constante duisternis bij 25 °C en 9-11 dagen groeien.
2. Plasmide isolatie
- Transformeer commercieel chemisch competente E. coli met de plasmide (en) van belang volgens de instructies van de fabrikant.
- Kweek de getransformeerde E. coli in 50 ml vloeibaar LB-medium met geschikte antibiotica gedurende een nacht bij 37 °C met schudden.
- Pelleteer de E. coli door gedurende 10 minuten te centrifugeren bij 3.000 x g bij kamertemperatuur. Extraheer de plasmiden met behulp van een in de handel verkrijgbare midiprep plasmide DNA-isolatiekit.
- Schat de plasmide-DNA-concentratie met behulp van een microvolumespectrofotometer.
OPMERKING: Materiaal dat geschikt is voor transfectie moet een concentratie hebben van ≥800 ng/μL en een A260/A280 van ≥1,8.
3. Protoplast isolatie
- Bereid 20 ml enzymoplossing.
- Voeg 2,18 g mannitol, 0,30 g cellulase R-10 en 0,06 g macerozym R-10 toe aan een centrifugebuis van 50 ml. Keer om om de poeders te mengen. Voeg gedeïoniseerd H2O toe aan 15 ml. Voeg 200 μL 1 M MES, pH 5,7 toe. Vortex om te mixen.
- Verwarm de oplossing gedurende 10 minuten op 55 °C. Laat 10 minuten afkoelen op kamertemperatuur.
- Voeg 20 μL 1 M CaCl2, 0,02 g runderserumalbumine en 100 μL 1 M β-mercaptoethanol toe.
- Vul tot 20 ml met gedeïoniseerd H2O. Giet in een in folie verpakt bekerglas van 250 ml.
- Haal de maïszaailingen uit het donker. Knip ze een paar centimeter boven de grond met een nieuw scheermesje. Plaats de afgesneden uiteinden in water. Bewaar ze in het donker bij kamertemperatuur terwijl ze niet in gebruik zijn.
- Selecteer de tweede en derde bladeren van elke zaailing en zorg ervoor dat bladeren met bruine of beschadigde gebieden worden uitgesloten. Selecteer 12-16 bladeren. Snijd ~1 cm van de punt van elk blad af en gooi weg. Snijd vervolgens een sectie van 10 cm van elk blad.
OPMERKING: Als er meer weefsel nodig is, gebruik dan een extra volume van 20 ml enzymoplossing in een extra bekerglas van 250 ml. Te veel bladmateriaal in een bepaalde hoeveelheid enzymoplossing kan de levensvatbaarheid verminderen. - Stapel de bladdelen op elkaar met de basale uiteinden op elkaar. Klem de bundel aan het basale uiteinde aan elkaar met behulp van een bindclip. Leg de bundel bladeren op een stuk wit papier.
- Pak de bladeren ~1 cm van het distale uiteinde vast. Snijd met een nieuw scheermesje de bladeren van het distale uiteinde loodrecht op de nerven in dunne (0,5-1 mm) plakjes. Vermijd recht naar beneden hakken, maar maak korte, voorwaartse plakjes door het weefsel.
- Verwissel de scheermesjes wanneer er zichtbare resten op het papier beginnen te worden afgezet. Zichtbaar residu duidt op pureren van het weefsel als gevolg van een dof mes of een slechte techniek.
- Na het snijden van ~ 2 cm van de lengte van de bladbundel, breng de plakjes onmiddellijk over in het bekerglas van enzymoplossing. Laat het materiaal niet uitdrogen, omdat dit het aantal verkregen protoplasten zal verminderen. Draai de enzymoplossing voorzichtig rond om het materiaal nat te maken.
- Plaats een foliedeksel over het bekerglas om het licht te blokkeren. Herhaal het snij- en overdrachtsproces totdat de hele bundel dicht bij de bindclip is gesneden.
- Breng het bekerglas enzymoplossing over in een stolp. Vacuüm-infiltreer tussen −50,8 kPa en −67,7 kPa ten opzichte van de omgevingsdruk gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Breng het bekerglas over op een tafelbladschudder. Schud bij 40 RPM gedurende 2,5 uur bij kamertemperatuur. Draai het bekerglas voorzichtig met de hand. Wanneer volledig verteerd, zal de enzymoplossing er enigszins melkachtig uitzien. Als de oplossing nog steeds helder is, blijft u nog maximaal een uur schudden bij 40 RPM. Niet langer dan 3,5 uur.
- Maak tijdens de spijsvertering een mannitol + MES + MgCl2 (MMG) -oplossing, een polyethyleenglycol (PEG) -oplossing en een incubatieoplossing.
- MMG: Voeg 5,47 g mannitol, 200 μL 1 M MES, pH 5,7 en 750 μL 1 M MgCl2 toe aan een centrifugebuis van 50 ml. Vul tot 50 ml met gedestilleerd H2O. Vortex om op te lossen. Plaats op ijs.
- Incubatieoplossing: Voeg 5,47 g mannitol, 200 μl 1 M MES bij pH 5,7 en 200 μl 1 M KCl toe aan een centrifugebuis van 50 ml. Vul tot 50 ml met gedestilleerd H2O. Vortex om op te lossen. Plaats op ijs.
- PEG-oplossing: Voeg 0,44 g mannitol, 1,0 g PEG en 400 μl 1 M CaCl2 toe aan een centrifugebuis van 15 ml. Vul tot 4 ml met gedestilleerd H2O. Vortex om te mengen. Incubeer bij 37 °C met schudden gedurende 30 minuten tot het volledig is opgelost. Bewaren bij kamertemperatuur.
- Schud de enzymoplossing bij 80 RPM gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Leg het bekerglas met de enzymoplossing op ijs. Verwijder de foliebedekking niet. Voeg 20 ml ijskoude MMG toe aan de enzymoplossing. Filtreer door een celzeef van 40 μm in een centrifugebuis van 50 ml.
OPMERKING: Houd alle oplossingen op ijs voor de volgende stappen tot de toevoeging van de PEG. Houd de protoplasten bedekt met folie om blootstelling aan licht te minimaliseren. - Splits het filtraat in gelijke volumes van elk 10 ml. Giet elk volume in een glazen centrifugebuis met ronde bodem en draai gedurende 4 minuten bij 100 x g bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatant weg en voeg 1 ml ijskoude MMG toe aan elke buis. Resuspensie van de pellets door de buizen voorzichtig rond te draaien en te tikken. Combineer de monsters in een enkele glazen centrifugebuis met ronde bodem. Voeg MMG toe aan een totaal volume van 5 ml. Draai 3 minuten terug op 100 x g bij kamertemperatuur.
- Wassen met 5 ml MMG en 3 minuten laten draaien op 100 x g bij kamertemperatuur.
- Herhaal de was met 5 ml MMG en draai gedurende 3 minuten op 100 x g bij kamertemperatuur. Na het draaien van de tweede wasbeurt, observeer of het supernatant helder is. Als het bewolkt blijft, voer dan een derde wasbeurt uit.
- Resuspendeer de protoplasten in 1 ml MMG. Dek losjes af met folie en houd op ijs.
- Bepaal de protoplastopbrengst en controleer de levensvatbaarheid.
- Voeg in een microcentrifugebuis van 1,5 ml 4 μl protoplasten en 72 μl MMG bij elkaar op.
- Voeg in een microcentrifugebuis van 1,5 ml 1 μL 0,5% fluoresceïnediacetaat (FDA) stockoplossing toe aan 49 μL MMG om een 20x werkende oplossing te maken. Voeg 4 μL FDA-werkoplossing toe aan de buis met de verdunde protoplasten. Incubeer gedurende 5 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
- Laad 11 μL van het protoplastmengsel op een hemocytometer. Plaats onder een brightfield lichtmicroscoop. Bevestig visueel dat de cellen geen celwanden hebben. Tel vervolgens het aantal protoplasten. Gebruik deze telling om het totale aantal verkregen protoplasten te schatten. Tel vervolgens het aantal protoplasten dat groen fluoresceert onder UV-licht wanneer het wordt gekleurd met de FDA. Succesvolle protoplastisolaties leveren een levensvatbaarheid op van 70%-90%.
4. PEG-gemedieerde transfectie
- Begin met de geschatte protoplastconcentratie uit stap 3.17 en pas aan tot ~10.000 protoplasten/μL. Als de concentratie laag is, centrifugeer dan gedurende 3 minuten bij 100 x g en resuspensie in MMG tot een concentratie van ~ 10.000 protoplasten / μL.
- Meng ~ 1.000.000 protoplasten met 15 μg DNA in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Vul het mengsel aan met MMG tot 114,4 μL en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
- Resuspendeer de protoplasten door op de zijkant van de buis te tikken. Voeg 105,6 μL 25% PEG-oplossing toe aan de protoplasten om een eindgewicht/volume van 12% PEG te bereiken. Meng voorzichtig door 5-10 keer om te keren. Protoplasten in PEG-oplossing zijn kwetsbaar; Schud de buis niet. Incubeer gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De transfectie kan worden opgeschaald in veelvouden van de volumes die in stap 4.2 en stap 4.3 worden gegeven. Zo kunnen bijvoorbeeld 10 miljoen protoplasten en 150 μg DNA worden gesuspendeerd in 1.444 μL MMG en worden behandeld met 1.056 μL PEG-oplossing in een centrifugebuis van 50 ml. - Verdun met 5 volumes incubatieoplossing. Meng voorzichtig door inversie. Draai 4 minuten terug op 100 x g bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Als u opschaalt, splitst u de protoplasten in meerdere glazen buizen met ronde bodem die elk niet meer dan 10 ml bevatten om volledige pelletering te garanderen. Schaal het volume van de incubatieoplossing dat wordt gebruikt voor het wassen proportioneel op. - Verwijder het supernatant door pipetteren. Wassen met 1-5 ml incubatieoplossing en gedurende 3 minuten draaien op 100 x g bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer de protoplasten in de incubatieoplossing tot een concentratie van 500-1.000 cellen/μL.
- Incubeer de protoplasten in het donker 's nachts (~16 uur) bij kamertemperatuur.
5. Protoplast herstel en expressie verificatie
- Draai de protoplasten 4 minuten op 100 x g bij kamertemperatuur. OPMERKING: Als u opschaalt, splitst u de protoplasten in meerdere glazen buizen met ronde bodem die elk niet meer dan 10 ml bevatten.
- Wassen met 1-5 ml incubatieoplossing en gedurende 3 minuten draaien op 100 x g bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer en combineer in 1-5 ml incubatieoplossing.
- Als de protoplasten worden getransfecteerd met een fluorescerend reportergen (bijv. GFP), neem dan een aliquot om de transfectie-efficiëntie te controleren. Tel met behulp van een hemocytometer eerst het totale aantal protoplasten met behulp van brightfield-lichtmicroscopie. Tel vervolgens de fractie fluorescerende protoplasten onder UV-licht.
- Centrifugeer de protoplasten gedurende 3 minuten op 100 x g bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De protoplasten zijn nu klaar voor downstream-toepassingen zoals RNA-extractie met fenol en guanidine-isothiocyanaat.
Representative Results
Het weefsel dat het meest geschikt is voor protoplastisolatie zijn de tweede en derde bladeren van 10-11 dagen oude zaailingen (figuur 1). In dit werk verkregen we ongeveer 10 miljoen protoplasten uit 16 bladsecties, die elk 10 cm lang waren. Het aantal geïsoleerde protoplasten is afhankelijk van de massa van het bladmateriaal en de breedte van de bladplakken die in de enzymoplossing worden verteerd.
Onder een helderveldlichtmicroscoop verschijnen onbeschadigde protoplasten ruwweg bolvormig, met plastiden die het oppervlak bespikkelen (figuur 2A). Alvorens over te gaan tot transfectie, kan de levensvatbaarheid worden gecontroleerd door een klein aliquot protoplasten te kleuren met fluoresceïnediacetaat (FDA). FDA-gekleurde protoplasten die fluoresceren onder UV-licht worden als levensvatbaar beschouwd (figuur 2B, C). Niet alle protoplasten die onbeschadigd lijken, zijn nog steeds levensvatbaar en sommige levensvatbare protoplasten kunnen sterven door evacuolatie (figuur 2C). In deze cellen zwelt de vacuole op en zal uiteindelijk uit het celmembraan worden geworpen.
Figuur 3 toont protoplasten getransformeerd met pJT01, een maïsexpressieplasmide van 4,3 kb afgeleid van CD3-911 (ABRC)15. Transfectie resulteert in de expressie van sGFP gelabeld met een C-terminal nucleair lokalisatiesignaal van c-Myc (Figuur 3A). Het aandeel sGFP-tot expressie brengende protoplasten werd gemeten over meerdere experimenten met behulp van een hemocytometer. De mediane transfectie-efficiëntie die met deze methode werd bereikt, was 40% na nachtelijke incubatie (n = 9, figuur 4, tabel 1), wat vergelijkbaar is met eerder gepubliceerde methoden15. Afhankelijk van de experimentele toepassing, als de plasmide- of plasmidebibliotheek geen fluorescerende reporter heeft, wordt aanbevolen om een positieve controle op te nemen om transfectie te bevestigen.
Figuur 1: Representatieve etiolatiemaïszaailing gekweekt in het donker gedurende 10 dagen na ontkieming. De pijlen geven het tweede en derde blad aan, die het meest geschikt zijn voor protoplasting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fluorescentiemicroscopie van de levensvatbaarheid van protoplasten na isolatie. (A) Brightfield-beeld van protoplasten onmiddellijk na isolatie. (B) Het fluorescentiesignaal van de fda-gekleurde protoplasten. (C) Overlapping van brightfield en fluorescentie met de levensvatbare protoplasten. De pijl toont een protoplast die evacuolatie ondergaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Fluorescentiemicroscopie van protoplasten getransfecteerd met sGFP. (A) Brightfieldbeeld van protoplasten na transfectie. (B) Het fluorescentiesignaal van de getransfecteerde protoplasten in het GFP-kanaal. (C) Overlapping van lichtveld en fluorescentie van de getransformeerde protoplasten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Percentage protoplasten met GFP-fluorescentie na 16 uur incubatie. De transfectie-efficiëntie varieerde tussen onafhankelijke onderzoeken, met de laagste efficiëntie rond 20% en de hoogste in de buurt van 50%. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Proces | GFP-cellen geteld | Totaal aantal getelde cellen | GFP-percentage |
| 1 | 104 | 261 | 39.8 |
| 2 | 148 | 298 | 49.5 |
| 3 | 84 | 258 | 32.6 |
| 4 | 137 | 271 | 50.6 |
| 5 | 127 | 299 | 42.5 |
| 6 | 107 | 235 | 45.5 |
| 7 | 83 | 360 | 23.1 |
| 8 | 134 | 549 | 24.4 |
| 9 | 61 | 201 | 30.3 |
| Bedoelen | 109 | 304 | 36 |
| Standaarddeviatie | 29 | 102 | 10 |
Tabel 1: Representatieve protoplasttransfectie-efficiëntie. Gegevens van negen recente protoplasting-onderzoeken in het laboratorium van de auteurs.
Aanvullend bestand 1: GenBank-geformatteerd tekstbestand met de volgorde van pJT01. Een 4,3 kb sGFP-expressieplasmide dient als positieve controle in getransfecteerde maïsprotoplasten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Zoals eerder gemeld, is de kwaliteit van het plantaardige materiaal dat wordt gebruikt voor protoplasting essentieel voor het verkrijgen van hoogwaardige protoplasten16,17,18. Het is cruciaal om gezonde onbevlekte bladeren te selecteren. Hierbij werd gebruik gemaakt van het populaire onderzoek maïs cultivar B73. We hebben geen andere cultivars getest. De maïszaailingen die voor dit protocol werden gebruikt, werden in het donker gekweekt omdat geëtioleerde bladeren 16 uur na transfectie protoplasten produceren met een grotere levensvatbaarheid in vergelijking met protoplasten van groene bladeren. Voor toepassingen die geen nachtelijke incubatie vereisen, zou het gebruik van groen of vergroenend bladmateriaal mogelijk zijn.
Een cruciale stap is het goed snijden van het bladmateriaal in dunne plakjes voor enzymatische vertering. Dit proces vergroot het oppervlak voor de mesofylcellen om te worden blootgesteld aan de enzymoplossing, waardoor het aantal teruggewonnen protoplasten toeneemt. De distale bladpunten worden weggegooid en dunne (≤1 mm) plakjes worden gesneden met nieuwe scheermesjes, die onmiddellijk worden uitgeschakeld wanneer ze dof beginnen te worden. Voor een bepaalde hoeveelheid weefsel leveren dunnere plakjes meer protoplasten op, mits de juiste techniek wordt gebruikt om het verpletteren van de bladeren te minimaliseren.
Het correct wassen van de protoplasten is ook belangrijk, omdat ze vrij delicaat zijn na het verwijderen van de celwand. Na de spijsvertering worden alle oplossingen op ijs bewaard en worden de donkergekweekte protoplasten beschermd tegen licht. De osmolariteit en pH worden gebufferd door de wasbeurten in MMG-oplossing uit te voeren. Om de protoplasten te isoleren van het minder dichte celafval, vindt centrifugatie plaats bij 100 x g. Protoplasten gecentrifugeerd bij 200 x g vertonen een vergelijkbare levensvatbaarheid na isolatie, maar lagere levensvatbaarheid de volgende dag, en ze transformeren ook ongeveer de helft. We raden aan om de levensvatbaarheid van de protoplasten te controleren door te kleuren met FDA (fluoresceïnediacetaat) onmiddellijk na isolatie; De normale levensvatbaarheid varieert tussen 70% -90%. Protoplasten met een levensvatbaarheid van minder dan 40% na isolatie leveren weinig transformanten op.
Pelleteren en wassen zijn gemakkelijker bij het werken met veel protoplasten omdat er na transfectie een duidelijk zichtbare pellet wordt verkregen. Om deze reden wordt transfectie uitgevoerd met 1 miljoen of meer protoplasten. Bij het opschalen van het protocol moet een vat van de juiste grootte worden geselecteerd voor de incubatiestappen (1,5 ml, 15 ml of 50 ml centrifugebuis) en moet het volume van de oplossing dat wordt gebruikt voor de wasstappen dienovereenkomstig worden geschaald. In ieder geval is het gunstig om te centrifugeren in ≤10 ml aliquots om ervoor te zorgen dat de protoplasten niet in het supernatant achterblijven. Een innovatie van dit protocol is het verwijderen van de 1 uur incubatie- en wasstap in W5-oplossing die wordt vermeld in andere protocollen14,19, die in onze handen onnodig bleken.
Zoals in andere studies te zien is, zijn de hoeveelheid en kwaliteit van DNA beide van cruciaal belang voor een succesvolle transfectie19. Voor plasmiden in het bereik van 4-6 kb wordt 15 μg DNA gebruikt per 1 miljoen protoplasten. DNA-preparaten van slechte kwaliteit kunnen leiden tot verminderde levensvatbaarheid na transfectie, dus we raden aan een commerciële DNA-extractiekit te gebruiken bij het isoleren van plasmiden van bacteriën. Het incuberen van de protoplasten gebeurt 's nachts bij kamertemperatuur in het donker om de transcriptie van de plasmide- of plasmidebibliotheek mogelijk te maken en tegelijkertijd stress te minimaliseren. Na nachtelijke incubatie wordt ongeveer de helft van het aantal oorspronkelijk getransfecteerde protoplasten teruggevonden. Protoplasten worden verdund tot een concentratie van 500-1.000 cellen/μL voor nachtelijke incubatie. Protoplasten die 's nachts moeten worden geïncubeerd bij concentraties hoger dan 1.000 cellen / μL hebben lagere herstelpercentages en een lagere levensvatbaarheid. Bij hogere concentraties kan puin van beschadigde en dode protoplasten bijdragen aan de dood van naburige protoplasten. Het wassen van de protoplasten na nachtelijke incubatie dient zowel om dit vuil te verwijderen als om het overtollige plasmide te verwijderen.
Protocollen als deze hebben de beperking dat niet alle plantensoorten of weefselsoorten vatbaar zijn voor protoplasting. Bovendien kunnen genexpressieverschillen worden geïnduceerd door het protoplastische proces.
Samenvattend hebben we een eenvoudig en schaalbaar protocol beschreven om miljoenen levensvatbare protoplasten te isoleren en transfecteren uit het basislandbouwgewas Z. mays. Deze methode kan veel meer protoplasten transfecteren met behulp van PEG, met een transformatie-efficiëntie die bijna net zo hoog is als op elektroporatie gebaseerde methoden15. Het grotere netto aantal transformanten maakt het mogelijk om honderden of duizenden constructies te testen in grootschalige experimenten zoals massively-parallel reporter assays12,13. Toekomstige experimenten op genoomschaal in maïs zullen wetenschappers in staat stellen om de genexpressie en genregulatie van maïs beter te begrijpen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Human Genome Research Institute Interdisciplinary Training in Genomic Sciences (T32 training grant no. HG000035 to J.T.) en het National Institute of Health (NIGMS 1R35GM139532 to C.Q.) en door de National Science Foundation (RESEARCH-PGR IOS-1748843 en PlantSynBio 2240888 to CQ). We bedanken Andrea Gallovatti van Rutgers University voor de gift van de maïszaden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL graduated microcentrifuge tubes | VWR | 490004-444 | |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tube | Corning | 05-527-90 | |
| 250 mL Pyrex glass beaker | Fisher | 50-121-5005 | |
| 40 um nylon mesh cell strainer | Fisher | 22363547 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 14-432-22 | |
| 72 cell propagation tray | T.O. Plastics | 725607C | |
| Aluminum foil | VWR | 89107-732 | |
| Bell jar | Bel-Art | F42022-0000 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-250ML | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2*2H2O) | PhytoTech Labs | C135 | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Cellulase Onozuka R-10 | Duchefa Biochemie | C8001.0010 | |
| D-Mannitol | PhytoTech Labs | M562 | |
| Dissecting scope | Reichert | Microstar IV | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermofischer Scientific | F1303 | Dissolve in acetone at 0.5% weight/volume to make a 1000X stock solution. Protect from light and store at -20 °C. |
| Fluorescence Illumination Systems | Prior | Lumen200 | |
| Fluorescence microscope | Leica | MDG36 | |
| High-capacity centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Macerozyme | Duchefa Biochemie | M8002.0005 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M292-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Maize seeds | B73 | USDA-ARS | https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473 |
| Medium binder clip | Uline | S-24649 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M5287-250G | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Adjust pH to 5.7 using KOH. Protect from light and store at room temperature. |
| Micropipette 20-200 uL | Gilson | F123601G | |
| Nanodrop microvolume spectrophotometer | Thermofischer Scientific | ND-1000 | |
| NEB 5-alpha competent E. coli | New England BioLabs | C2987H | |
| Neubauer hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| No. 9 Single-edge razor blade | Excel | 20009 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-104 | |
| Poly(ethylene) glycol 4,000 | Sigma-Aldrich | 81240-1KG | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Professional Grade Vermiculite | NK Lawn & Garden | G208 | |
| Round-bottom glass centrifuge tube 30 mL | Kimble Chase | 45500-30 | |
| Rubber adapter for Corex centrifuge tubes | Corning | CLS8445AO | |
| Sphagnum peat moss | Premier Horticulture | 0128P | |
| TRIzol Reagent | Thermofischer Scientific | 15596018 | |
| Tygon vacuum tubing | VWR | 76336-844 | |
| Vacuum gauge | Wika | 4269978 |
References
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: A useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Wang, S., Tiwari, S. B., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. AUXIN RESPONSE FACTOR7 restores the expression of auxin-responsive genes in mutant Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts. The Plant Cell. 17 (7), 1979-1993 (2005).
- Hirner, A., et al. Arabidopsis LHT1 is a high-affinity transporter for cellular amino acid uptake in both root epidermis and leaf mesophyll. The Plant Cell. 18 (8), 1931-1946 (2006).
- Hwang, I., Sheen, J. Two-component circuitry in Arabidopsis cytokinin signal transduction. Nature. 413 (6854), 383-389 (2001).
- Tan, M. -L. M. C., Rietveld, E. M., van Marrewijk, G. A. M., Kool, A. J. Regeneration of leaf mesophyll protoplasts of tomato cultivars (L. esculentum): Factors important for efficient protoplast culture and plant regeneration. Plant Cell Reports. 6 (3), 172-175 (1987).
- Brandt, K. M., Gunn, H., Moretti, N., Zemetra, R. S. A streamlined protocol for wheat (Triticum aestivum) protoplast isolation and transformation with CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes. Frontiers in Plant Science. 11, 769 (2020).
- Nadakuduti, S. S., et al. Evaluation of methods to assess in vivo activity of engineered genome-editing nucleases in protoplasts. Frontiers in Plant Science. 10, 110 (2019).
- OECD, Food and Agriculture Organization of the United Nations.
- Gallois, P., Marinho, P. Leaf disk transformation using Agrobacterium tumefaciens-expression of heterologous genes in tobacco. Plant Gene Transfer and Expression Protocols. 49, 39-48 (1995).
- Schäffner, A. R., Sheen, J. Maize rbcS promoter activity depends on sequence elements not found in dicot rbcS promoters. The Plant Cell. 3 (9), 997-1012 (1991).
- Sheen, J. Molecular mechanisms underlying the differential expression of maize pyruvate, orthophosphate dikinase genes. The Plant Cell. 3 (3), 225-245 (1991).
- Jores, T., et al. Identification of plant enhancers and their constituent elements by STARR-seq in tobacco leaves. The Plant Cell. 32 (7), 2120-2131 (2020).
- Jores, T., et al. Synthetic promoter designs enabled by a comprehensive analysis of plant core promoters. Nature Plants. 7 (6), 842-855 (2021).
- Ricci, W. A., et al. Widespread long-range cis-regulatory elements in the maize genome. Nature Plants. 5 (12), 1237-1249 (2019).
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiology. 127 (4), 1466-1475 (2001).
- Jeon, J. M., et al. Efficient transient expression and transformation of PEG-mediated gene uptake into mesophyll protoplasts of pepper (Capsicum annuum L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 88 (2), 225-232 (2007).
- Pindel, A. Optimization of isolation conditions of Cymbidium protoplasts. Folia Horticulturae. 19, 79-88 (2007).
- Ren, R., et al. Highly efficient leaf base protoplast isolation and transient expression systems for orchids and other important monocot crops. Frontiers in Plant Science. 12, 626015 (2021).
- Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nature Protocols. 2 (7), 1565-1572 (2007).
