Summary
यहां, हम मक्का मेसोफिल कोशिकाओं में प्लास्मिड के बड़े पुस्तकालयों के परीक्षण के लिए लाखों मक्का प्रोटोप्लास्ट को क्षणिक रूप से स्थानांतरित करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
मक्का मेसोफिल कोशिकाओं के अभिकर्मक में अक्सर प्रोटोप्लास्ट बनाने के लिए पौधे की कोशिका की दीवारों को पचाना और फिर इलेक्ट्रोपोरेशन या पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी) के माध्यम से डीएनए डालना शामिल होता है। पिछले तरीकों को एक बार में हजारों ट्रांसक्रिप्टेड प्रोटोप्लास्ट का उत्पादन करने के लिए विकसित किया गया था। यहां, हम मक्का में लाखों पत्ती मेसोफिल प्रोटोप्लास्ट को अलग करने और स्थानांतरित करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं (ज़ीमेस एल। यह सुव्यवस्थित प्रक्रिया कुछ सामान्य प्रोटोप्लास्टिंग चरणों को हटा देती है, जैसे कि डब्ल्यू 5 में धोना। इसके अतिरिक्त, सेंट्रीफ्यूजेशन, पीईजी-मध्यस्थता अभिकर्मक और इनक्यूबेशन जैसे चरणों को अधिक संख्या में प्रोटोप्लास्ट के साथ काम करने के लिए संशोधित किया गया है। प्लास्मिड संरचनाओं के बड़े पुस्तकालयों को व्यक्त करने की क्षमता जीनोम-स्केल प्रयोगों को सक्षम बनाती है, जैसे कि मक्का में बड़े पैमाने पर समानांतर रिपोर्टर परख।
Introduction
क्षणिक जीन अभिव्यक्ति पौधे जीव विज्ञान में एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, पौधों की कोशिकाओं को स्थानांतरित करना मुश्किल होता है क्योंकि वे एक कोशिका भित्ति से घिरे होते हैं। डीएनए प्रवेश के लिए यह बाधा स्तनधारी या कीट कोशिकाओं जैसे अन्य सामान्य रूप से अध्ययन किए गए सेल प्रकारों में मौजूद नहीं है। पिछले शोध ने प्रोटोप्लास्ट को नियोजित करके इस चुनौती को संबोधित किया: पौधे की कोशिकाएं जिनकी कोशिका भित्ति पच गई है और हटा दी गई है। असंसाधित पत्ती ऊतक के विपरीत, पौधे प्रोटोप्लास्ट निलंबन में काम करना आसान होता है और इलेक्ट्रोपोरेशन या पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी) 1 द्वारा मध्यस्थता की गई अभिकर्मक तकनीकों के लिए उत्तरदायी होता है। कोशिका भित्ति हटाने के बाद भी पादप कोशिकाएं अपनी अधिकांश कार्यक्षमता बनाए रखती हैं। इस प्रकार, प्रोटोप्लास्ट का उपयोग विभिन्न प्रकार के पौधों में जीन और प्रोटीन फ़ंक्शन2,3 का अध्ययन करने के लिए, सिग्नल ट्रांसडक्शन4 को समझने के लिए और पौधे प्रजनन5 के लिए संभावित लक्ष्यों की पहचान करने के लिए किया जाता है। प्रोटोप्लास्ट गेहूं और आलूसहित विभिन्न फसल प्रजातियों में जीनोम संपादन संरचनाओं की स्क्रीनिंग के लिए एक सुविधाजनक वाहन भी हैं। संक्षेप में, प्रोटोप्लास्ट में क्षणिक परख कृषि जैव प्रौद्योगिकी के लिए अपरिहार्य हैं।
मक्का (ज़िया मेस एल) टन भार द्वारा दुनिया की अग्रणी अनाज फसल है; इस प्रकार, यह बुनियादी और अनुप्रयुक्त पादप विज्ञान अनुसंधान8 का एक प्रमुख फोकस है। हालांकि, निकोटियाना टैबाकम9 जैसे मॉडल पौधों के विपरीत, बरकरार मक्का की पत्तियों में क्षणिक ट्रांसजेन अभिव्यक्ति नियमित रूप से नहीं की जाती है। प्रोटोप्लास्टिंग का उपयोग मक्का पत्ती मेसोफिल कोशिकाओं10,11 को प्राप्त करने और स्थानांतरित करने के लिए किया गया है। पिछले तरीकों ने इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करके 75% तक अभिकर्मक क्षमता हासिल की है और दसियों हजार10,15 के पैमाने पर ट्रांसक्रिप्टेड प्रोटोप्लास्ट का उत्पादन किया है।
यह प्रोटोकॉल बताता है कि लाखों मक्का मेसोफिल कोशिकाओं को कैसे प्रोटोप्लास्ट किया जाए और उन्हें पिछले तरीकों की तुलना में दक्षता के साथ स्थानांतरित किया जाए। मुख्य कदम एटिओलाटेड मक्का के पौधे उगाना, पत्ती के ऊतकों की कटाई, पौधे की कोशिका की दीवार को पचाना और पीईजी का उपयोग करके कोशिकाओं में प्लास्मिड डीएनए पहुंचाना है। इस प्रोटोकॉल का मुख्य योगदान कार्यात्मक परख के लिए आवश्यक सेल व्यवहार्यता को बनाए रखते हुए प्रोटोप्लास्ट अभिकर्मक को बढ़ाने की क्षमता है। यह जीनोम-स्केल प्रयोगों के उपयोग को सक्षम बनाता है, जैसे कि बड़े पैमाने पर समानांतर रिपोर्टर परख, जो पूरे मक्का जीनोम में सैकड़ों हजारों क्षेत्रों के कार्य का परीक्षण कर सकते हैं। इस विधि का उपयोग हाल ही में एन्हांसर और प्रमोटर12,13,14 सहित सीआईएस-नियामक डीएनए तत्वों के बड़े पुस्तकालयों की जांच के लिए किया गया है।
Protocol
1. पौधे सामग्री की वृद्धि
- मक्के की गुठली को नल के पानी से दो बार धोएं। गुठली को कमरे के तापमान पर रात भर नल के पानी में भिगोदें।
- अगले दिन, गीले 1: 1 वर्मीक्यूलाइट: पीट मॉस के साथ एक 72 सेल बीज स्टार्टर ट्रे भरें। गुठली को एक बार धो लें और उन्हें प्रति सेल एक कर्नेल के साथ लगाएं।
- 3 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक परिस्थितियों (16 घंटे प्रकाश, 8 घंटे अंधेरे) के तहत बढ़ें।
- 25 डिग्री सेल्सियस पर निरंतर अंधेरे में स्थानांतरित करें, और 9-11 दिनों तक बढ़ें।
2. प्लास्मिड अलगाव
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रासायनिक रूप से सक्षम ई कोलाई को ब्याज के प्लास्मिड (ओं) के साथ बदलें।
- परिवर्तित ई कोलाई को 50 मिलीलीटर तरल एलबी माध्यम में उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाने के साथ उगाएं।
- कमरे के तापमान पर 3,000 x g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करके ई कोलाई को गोली दें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मिडिप्रेप प्लास्मिड डीएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करके प्लास्मिड निकालें।
- माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके प्लास्मिड डीएनए एकाग्रता का अनुमान लगाएं।
नोट: अभिकर्मक के लिए उपयुक्त सामग्री में ≥800 ng / μL की एकाग्रता और ≥1.8 का A260/A280 होना चाहिए।
3. प्रोटोप्लास्ट अलगाव
- 20 एमएल एंजाइम घोल तैयार करें।
- 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 2.18 ग्राम मैनिटोल, 0.30 ग्राम सेल्युलस आर -10, और 0.06 ग्राम मैकेरोजाइम आर -10 जोड़ें। पाउडर को मिलाने के लिए वर्ट करें। विआयनीकृत एच2ओ को 15 एमएल में जोड़ें। 1 एम एमईएस, पीएच 5.7 के 200 μL जोड़ें। मिश्रण करने के लिए भंवर।
- 10 मिनट के लिए घोल को 55 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा करें।
- 1 M CaCl2 के 20 μL, गोजातीय सीरम एल्बुमिन के 0.02 ग्राम, और 1 M β-मर्कैप्टोइथेनॉल के 100 μL जोड़ें।
- विआयनीकृत एच2ओ के साथ 20 एमएल तक भरें। पन्नी से लिपटे 250 एमएल बीकर में डालें।
- मक्के के पौधों को अंधेरे से बाहर निकालें। एक नए रेजर ब्लेड का उपयोग करके उन्हें मिट्टी से कुछ सेंटीमीटर ऊपर काटें। कटे हुए सिरों को पानी में रखें। उपयोग में नहीं होने पर उन्हें कमरे के तापमान पर अंधेरे में रखें।
- प्रत्येक अंकुर की दूसरी और तीसरी पत्तियों का चयन करें, भूरे या क्षतिग्रस्त क्षेत्रों के साथ पत्तियों को बाहर करने का ध्यान रखें। 12-16 पत्तियों का चयन करें। प्रत्येक पत्ते की नोक से ~ 1 सेमी काट लें और फेंक दें। फिर, प्रत्येक पत्ते से 10 सेमी खंड काट लें।
नोट: यदि अधिक ऊतक की आवश्यकता है, तो अतिरिक्त 250 एमएल बीकर में एंजाइम समाधान की अतिरिक्त 20 एमएल मात्रा का उपयोग करें। एंजाइम समाधान की दी गई मात्रा में बहुत अधिक पत्ती सामग्री व्यवहार्यता को कम कर सकती है। - पत्ती के अनुभागों को एक दूसरे के ऊपर बेसल सिरों के साथ एक साथ ढेर करें। बाइंडर क्लिप का उपयोग करके बेसल छोर पर बंडल को एक साथ दबाएं। पत्तियों के बंडल को सफेद कागज के एक टुकड़े पर रखें।
- पत्तियों को बाहर के छोर से ~ 1 सेमी पकड़ें। एक नए रेजर ब्लेड का उपयोग करके, नसों के लंबवत डिस्टल छोर से पत्तियों को पतले (0.5-1 मिमी) स्लाइस में काट लें। सीधे काटने से बचें, बल्कि ऊतक के माध्यम से छोटे, आगे के स्लाइस बनाएं।
- जब भी कागज पर दिखाई देने वाले अवशेष जमा होने लगते हैं तो रेजर ब्लेड को स्वैप करें। दिखाई देने वाले अवशेष एक सुस्त ब्लेड या खराब तकनीक के कारण ऊतक के मैश होने का संकेत देते हैं।
- पत्ती बंडल की लंबाई के ~ 2 सेमी काटने के बाद, तुरंत स्लाइस को एंजाइम समाधान के बीकर में स्थानांतरित करें। सामग्री को सूखने की अनुमति न दें, क्योंकि इससे प्राप्त प्रोटोप्लास्ट की संख्या कम हो जाएगी। सामग्री को गीला करने के लिए एंजाइम समाधान को धीरे से घुमाएं।
- प्रकाश को अवरुद्ध करने के लिए बीकर के ऊपर एक पन्नी ढक्कन रखें। स्लाइसिंग और ट्रांसफरिंग प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि पूरा बंडल बाइंडर क्लिप के करीब न कट जाए।
- एंजाइम समाधान के बीकर को एक घंटी जार में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए परिवेश के दबाव के सापेक्ष -50.8 केपीए और -67.7 केपीए के बीच वैक्यूम-घुसपैठ।
- बीकर को टेबलटॉप शेकर में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 2.5 घंटे के लिए 40 आरपीएम पर हिलाएं। धीरे से हाथ से बीकर घुमाएं। पूरी तरह से पचने पर, एंजाइम समाधान थोड़ा दूधिया दिखाई देगा। यदि समाधान अभी भी स्पष्ट है, तो एक अतिरिक्त घंटे तक 40 आरपीएम पर हिलाना जारी रखें। 3.5 घंटे से अधिक न करें।
- पाचन के दौरान, एक मैनिटोल + एमईएस + एमजीसीएल2 (एमएमजी) समाधान, एक पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी) समाधान और एक इनक्यूबेशन समाधान बनाएं।
- एमएमजी: 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 5.47 ग्राम मैनिटोल, 1 एम एमईएस के 200 μL, पीएच 5.7, और 1 M MgCl2 के 750 μL जोड़ें। घुलने के लिए आसुत एच2ओ भंवर के साथ 50 एमएल तक भरें। बर्फ पर रखें।
- इनक्यूबेशन समाधान: 5.47 ग्राम मैनिटोल, पीएच 5.7 पर 1 एम एमईएस के 200 μL, और 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1 M KCl के 200 μL जोड़ें। घुलने के लिए आसुत एच2ओ भंवर के साथ 50 एमएल तक भरें। बर्फ पर रखें।
- पीईजी समाधान: 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 0.44 ग्राम मैनिटोल, 1.0 ग्राम पीईजी और 1 एम सीएसीएल2 के 400 μL जोड़ें। मिश्रण करने के लिए आसुत एच2ओ भंवर के साथ 4 एमएल तक भरें। पूरी तरह से घुलने तक 30 मिनट के लिए हिलाने के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कमरे के तापमान पर रखें।
- कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 80 आरपीएम पर एंजाइम समाधान को हिलाएं।
- बीकर को बर्फ पर एंजाइम समाधान के साथ रखें। पन्नी कवर को न हटाएं। एंजाइम समाधान में 20 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा एमएमजी जोड़ें। 40 μm सेल स्ट्रेनर के माध्यम से 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में फ़िल्टर करें।
नोट: पीईजी के अतिरिक्त तक निम्नलिखित चरणों के लिए बर्फ पर सभी समाधान रखें। प्रकाश जोखिम को कम करने के लिए प्रोटोप्लास्ट को पन्नी से ढककर रखें। - छानने को 10 मिलीलीटर के बराबर मात्रा में विभाजित करें। प्रत्येक आयतन को एक गोल-नीचे ग्लास सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें, और कमरे के तापमान पर 100 x g पर 4 मिनट के लिए नीचे घुमाएं।
- सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और प्रत्येक ट्यूब में 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा एमएमजी जोड़ें। ट्यूबों को धीरे से घुमाकर और टैप करके छर्रों को फिर से निलंबित करें। नमूनों को एक गोल-नीचे ग्लास सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मिलाएं। 5 एमएल की कुल मात्रा में एमएमजी जोड़ें। कमरे के तापमान पर 100 x g पर 3 मिनट के लिए स्पिन करें।
- 5 एमएल एमएमजी के साथ धोएं, और कमरे के तापमान पर 100 x g पर 3 मिनट के लिए स्पिन करें।
- 5 एमएल एमएमजी के साथ धोने को दोहराएं, और कमरे के तापमान पर 100 x g पर 3 मिनट के लिए स्पिन करें। दूसरे धोने के बाद, देखें कि सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट है या नहीं। यदि बादल छाए रहते हैं, तो तीसरा स्नान करें।
- एमएमजी के 1 एमएल में प्रोटोप्लास्ट को फिर से निलंबित करें। पन्नी के साथ ढीले से कवर करें और बर्फ पर रखें।
- प्रोटोप्लास्ट उपज निर्धारित करें और व्यवहार्यता की जांच करें।
- 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, 4 μL प्रोटोप्लास्ट और 72 μL MMG को एक साथ जोड़ें।
- 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, 20x कार्यशील समाधान बनाने के लिए एमएमजी के 49 μL में 0.5% फ्लोरेसिन डायसेटेट (एफडीए) स्टॉक समाधान का 1 μL जोड़ें। पतला प्रोटोप्लास्ट के साथ ट्यूब में एफडीए वर्किंग सॉल्यूशन के 4 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर अंधेरे में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- एक हेमोसाइटोमीटर पर प्रोटोप्लास्ट मिश्रण के 11 μL लोड करें। एक उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। नेत्रहीन पुष्टि करें कि कोशिकाओं में सेल की दीवारों की कमी है। फिर, प्रोटोप्लास्ट की संख्या की गणना करें। प्राप्त प्रोटोप्लास्ट की कुल संख्या का अनुमान लगाने के लिए इस गिनती का उपयोग करें। फिर, उन प्रोटोप्लास्ट्स की संख्या की गणना करें जो एफडीए के साथ दाग लगने पर यूवी प्रकाश के तहत हरे रंग को उगाते हैं। सफल प्रोटोप्लास्ट अलगाव 70% -90% की व्यवहार्यता उत्पन्न करते हैं।
4. पीईजी-मध्यस्थता अभिकर्मक।
- चरण 3.17 से अनुमानित प्रोटोप्लास्ट एकाग्रता से शुरू करते हुए, ~ 10,000 प्रोटोप्लास्ट / यदि एकाग्रता कम है, तो 100 x g पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, और एमएमजी में ~ 10,000 प्रोटोप्लास्ट / μL की एकाग्रता के लिए पुन: निलंबित करें।
- 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 15 μg डीएनए के साथ ~ 1,000,000 प्रोटोप्लास्ट मिलाएं। एमएमजी के साथ मिश्रण को 114.4 μL तक ऊपर उठाएं, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
- ट्यूब के किनारे टैप करके प्रोटोप्लास्ट को पुन: निलंबित करें। 12% पीईजी के अंतिम वजन / मात्रा तक पहुंचने के लिए प्रोटोप्लास्ट में 25% पीईजी समाधान के 105.6 μL जोड़ें। धीरे-धीरे 5-10 बार उलटकर मिलाएं। पीईजी समाधान में प्रोटोप्लास्ट नाजुक हैं; ट्यूब को हिलाएं नहीं। कमरे के तापमान पर अंधेरे में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: अभिकर्मक को चरण 4.2 और चरण 4.3 में दिए गए वॉल्यूम के गुणकों में बढ़ाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 10 मिलियन प्रोटोप्लास्ट और 150 μg डीएनए को एमएमजी के 1,444 μL में निलंबित किया जा सकता है और 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1,056 μL PEG समाधान के साथ इलाज किया जा सकता है। - इनक्यूबेशन समाधान के 5 संस्करणों के साथ पतला करें। व्युत्क्रम द्वारा धीरे-धीरे मिश्रण करें। कमरे के तापमान पर 100 x g पर 4 मिनट के लिए स्पिन करें।
नोट: यदि स्केलिंग बढ़ रही है, तो प्रोटोप्लास्ट को कई गोल-नीचे ग्लास ट्यूबों में विभाजित करें जिनमें से प्रत्येक में पूर्ण पेलेटिंग सुनिश्चित करने के लिए 10 एमएल से अधिक नहीं है। धुलाई के लिए उपयोग किए जाने वाले इनक्यूबेशन समाधान की मात्रा को आनुपातिक रूप से स्केल करें। - पाइपिंग द्वारा सुपरनैटेंट को हटा दें। 1-5 मिलीलीटर इनक्यूबेशन घोल से धोएं, और कमरे के तापमान पर 100 x g पर 3 मिनट के लिए स्पिन करें।
- इनक्यूबेशन घोल में प्रोटोप्लास्ट को 500-1,000 कोशिकाओं / μL की एकाग्रता के लिए पुन: निलंबित करें।
- कमरे के तापमान पर रात भर (~ 16 घंटे) अंधेरे में प्रोटोप्लास्ट को इनक्यूबेट करें।
5. प्रोटोप्लास्ट रिकवरी और अभिव्यक्ति सत्यापन
- कमरे के तापमान पर 100 x g पर 4 मिनट के लिए प्रोटोप्लास्ट को स्पिन करें। नोट: यदि स्केलिंग की जाती है, तो प्रोटोप्लास्ट को कई गोल-नीचे ग्लास ट्यूबों में विभाजित करें जिनमें प्रत्येक में 10 एमएल से अधिक नहीं होता है।
- इनक्यूबेशन घोल के 1-5 मिलीलीटर से धोएं, और कमरे के तापमान पर 100 x g पर 3 मिनट के लिए स्पिन करें।
- घोल के 1-5 मिलीलीटर में पुन: निलंबित करें, और मिलाएं इनक्यूबेशन।
- यदि प्रोटोप्लास्ट को फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन (जैसे, जीएफपी) के साथ स्थानांतरित किया जाता है, तो अभिकर्मक दक्षता की जांच करने के लिए एक एलिकोट लें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके, पहले ब्राइटफील्ड लाइट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटोप्लास्ट की कुल संख्या की गणना करें। फिर, यूवी प्रकाश के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटोप्लास्ट के अंश की गणना करें।
- कमरे के तापमान पर 100 x g पर 3 मिनट के लिए प्रोटोप्लास्ट को सेंट्रीफ्यूज करें।
नोट: प्रोटोप्लास्ट अब फिनोल और गुआनिडाइन आइसोथियोसाइनेट के साथ आरएनए निष्कर्षण जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए तैयार हैं।
Representative Results
प्रोटोप्लास्ट अलगाव के लिए सबसे उपयुक्त ऊतक 10-11 दिन पुराने रोपाई की दूसरी और तीसरी पत्तियां हैं (चित्रा 1)। इस काम में, हमने 16 पत्ती वर्गों से लगभग 10 मिलियन प्रोटोप्लास्ट प्राप्त किए, जिनमें से प्रत्येक 10 सेमी लंबा था। पृथक प्रोटोप्लास्ट की संख्या पत्ती सामग्री के द्रव्यमान और एंजाइम समाधान में पचने वाले पत्ती स्लाइस की चौड़ाई पर निर्भर करती है।
एक उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत, क्षतिग्रस्त प्रोटोप्लास्ट लगभग गोलाकार दिखाई देते हैं, जिसमें प्लास्टिड सतह को घेरते हैं (चित्रा 2 ए)। अभिकर्मक के लिए आगे बढ़ने से पहले, फ्लोरेसिन डायसेटेट (एफडीए) के साथ प्रोटोप्लास्ट के एक छोटे से एलिकोट को धुंधला करके व्यवहार्यता की जांच की जा सकती है। एफडीए-दाग वाले प्रोटोप्लास्ट जो यूवी प्रकाश के तहत फ्लोरेस करते हैं, उन्हें व्यवहार्य माना जाता है (चित्रा 2 बी, सी)। सभी प्रोटोप्लास्ट जो क्षतिग्रस्त दिखाई देते हैं, वे अभी भी व्यवहार्य नहीं हैं, और कुछ व्यवहार्य प्रोटोप्लास्ट ्स निकासी द्वारा मरने की प्रक्रिया में हो सकते हैं (चित्रा 2 सी)। इन कोशिकाओं में, रिक्तिका सूजन है और अंततः कोशिका झिल्ली से बाहर निकाल दी जाएगी।
चित्र 3 में प्रोटोप्लास्ट को पीजेटी01 के साथ रूपांतरित दिखाया गया है, जो सीडी 3-911 (एबीआरसी) 15 से प्राप्त 4.3 केबी मक्का अभिव्यक्ति प्लास्मिड है। अभिकर्मक के परिणामस्वरूप सी-माइक (चित्रा 3 ए) से सी-टर्मिनल परमाणु स्थानीयकरण संकेत के साथ टैग किए गए एसजीएफपी की अभिव्यक्ति होती है। एसजीएफपी-व्यक्त प्रोटोप्लास्ट का अनुपात हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कई प्रयोगों में मापा गया था। इस विधि द्वारा प्राप्त औसत अभिकर्मक दक्षता रातोंरात इनक्यूबेशन (एन = 9, चित्रा 4, तालिका 1) के बाद 40% थी, जो पहले प्रकाशित विधियों15 के बराबर है। प्रयोगात्मक अनुप्रयोग के आधार पर, यदि प्लास्मिड या प्लास्मिड लाइब्रेरी में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की कमी है, तो अभिकर्मक की पुष्टि करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण शामिल करने की सिफारिश की जाती है।
चित्र 1: अंकुरण के बाद 10 दिनों के लिए अंधेरे में उगाए गए प्रतिनिधि एटिओलाटेड मक्का अंकुर तीर दूसरी और तीसरी पत्तियों को इंगित करते हैं, जो प्रोटोप्लास्टिंग के लिए सबसे उपयुक्त हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: अलगाव के बाद प्रोटोप्लास्ट व्यवहार्यता की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी । (ए) अलगाव के तुरंत बाद प्रोटोप्लास्ट की ब्राइटफील्ड छवि। (बी) एफडीए-दाग वाले प्रोटोप्लास्ट का प्रतिदीप्ति संकेत। (सी) व्यवहार्य प्रोटोप्लास्ट को दर्शाते हुए उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति का ओवरलैप। तीर एक प्रोटोप्लास्ट को खाली करने से गुजरता हुआ दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: एसजीएफपी के साथ स्थानांतरित प्रोटोप्लास्ट की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी । (ए) अभिकर्मक के बाद प्रोटोप्लास्ट की ब्राइटफील्ड छवि। (बी) जीएफपी चैनल में ट्रांसक्रिप्टेड प्रोटोप्लास्ट का प्रतिदीप्ति संकेत। (सी) परिवर्तित प्रोटोप्लास्ट को दिखाते हुए उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति का ओवरलैप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: 16 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद जीएफपी फ्लोरेसेंस दिखाने वाले प्रोटोप्लास्ट का प्रतिशत। स्वतंत्र परीक्षणों के बीच अभिकर्मक दक्षता भिन्न होती है, जिसमें सबसे कम दक्षता लगभग 20% और उच्चतम 50% के करीब होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| इम्तहान | जीएफपी कोशिकाओं की गिनती | कुल कोशिकाओं की गणना | जीएफपी प्रतिशत |
| 1 | 104 | 261 | 39.8 |
| 2 | 148 | 298 | 49.5 |
| 3 | 84 | 258 | 32.6 |
| 4 | 137 | 271 | 50.6 |
| 5 | 127 | 299 | 42.5 |
| 6 | 107 | 235 | 45.5 |
| 7 | 83 | 360 | 23.1 |
| 8 | 134 | 549 | 24.4 |
| 9 | 61 | 201 | 30.3 |
| औसत | 109 | 304 | 36 |
| मानक विचलन | 29 | 102 | 10 |
तालिका 1: प्रतिनिधि प्रोटोप्लास्ट अभिकर्मक दक्षता। लेखकों की प्रयोगशाला में नौ हालिया प्रोटोप्लास्टिंग परीक्षणों से डेटा।
पूरक फ़ाइल 1: pJT01 के अनुक्रम के साथ GenBank-स्वरूपित पाठ फ़ाइल। एक 4.3 केबी एसजीएफपी अभिव्यक्ति प्लास्मिड ट्रांसक्रिप्टेड मक्का प्रोटोप्लास्ट में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
जैसा कि पहले बताया गया है, प्रोटोप्लास्टिंग के लिए उपयोग की जाने वाली संयंत्र सामग्री की गुणवत्ता उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटोप्लास्ट16,17,18 प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। स्वस्थ बेदाग पत्तियों का चयन करना महत्वपूर्ण है। इस काम में लोकप्रिय शोध मक्का कल्टीवेटर बी 73 का उपयोग किया गया था। हमने अन्य किस्मों का परीक्षण नहीं किया है। इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले मक्का के पौधे अंधेरे में उगाए गए थे क्योंकि एटिओलाटेड पत्तियां हरी पत्तियों से प्रोटोप्लास्ट की तुलना में अभिकर्मक के 16 घंटे बाद अधिक व्यवहार्यता के साथ प्रोटोप्लास्ट का उत्पादन करती हैं। उन अनुप्रयोगों के लिए जिन्हें रात भर इनक्यूबेशन की आवश्यकता नहीं होती है, हरी या हरी पत्ती सामग्री का उपयोग करना संभव होगा।
एंजाइमेटिक पाचन से पहले पत्ती सामग्री को पतली स्लाइस में ठीक से काटना एक महत्वपूर्ण कदम है। यह प्रक्रिया मेसोफिल कोशिकाओं को एंजाइम समाधान के संपर्क में आने के लिए सतह क्षेत्र को बढ़ाती है, जिससे बरामद प्रोटोप्लास्ट की संख्या बढ़ जाती है। डिस्टल लीफ टिप्स को त्याग दिया जाता है, और पतले (≤1 मिमी) स्लाइस को नए रेजर ब्लेड से काटा जाता है, जो सुस्त होने पर तुरंत बंद हो जाते हैं। ऊतक की एक निश्चित मात्रा के लिए, पतले स्लाइस अधिक प्रोटोप्लास्ट उत्पन्न करते हैं बशर्ते पत्तियों की क्रशिंग को कम करने के लिए सही तकनीक का उपयोग किया जाए।
प्रोटोप्लास्ट को सही ढंग से धोना भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे सेल की दीवार हटाने से गुजरने के बाद काफी नाजुक होते हैं। पाचन के बाद, सभी समाधानों को बर्फ पर रखा जाता है, और गहरे रंग के विकसित प्रोटोप्लास्ट प्रकाश से सुरक्षित होते हैं। एमएमजी समाधान में धुलाई करके परासरण और पीएच को बफर किया जाता है। कम घने सेलुलर मलबे से प्रोटोप्लास्ट को अलग करने के लिए, सेंट्रीफ्यूजेशन 100 x g पर होता है। 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज किए गए प्रोटोप्लास्ट अलगाव के बाद समान व्यवहार्यता दिखाते हैं लेकिन अगले दिन कम व्यवहार्यता दिखाते हैं, और वे लगभग आधे को भी बदल देते हैं। हम अलगाव के तुरंत बाद एफडीए (फ्लोरेसिन डायसेटेट) के साथ धुंधला करके प्रोटोप्लास्ट की व्यवहार्यता की जांच करने की सलाह देते हैं; सामान्य व्यवहार्यता 70% -90% के बीच होती है। अलगाव के बाद 40% से कम व्यवहार्यता वाले प्रोटोप्लास्ट कुछ ट्रांसफॉर्मेंट्स उत्पन्न करते हैं।
कई प्रोटोप्लास्ट के साथ काम करते समय पेलेटिंग और धोना आसान होता है क्योंकि अभिकर्मक के बाद एक स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली गोली प्राप्त होती है। इस कारण से, अभिकर्मक 1 मिलियन या अधिक प्रोटोप्लास्ट के साथ किया जाता है। प्रोटोकॉल को स्केल करते समय, इनक्यूबेशन चरणों (1.5 एमएल, 15 एमएल, या 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब) के लिए एक उचित आकार के पोत का चयन किया जाना चाहिए, और धोने के चरणों के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधान की मात्रा को तदनुसार बढ़ाया जाना चाहिए। किसी भी मामले में, यह सुनिश्चित करने के लिए ≤10 एमएल एलिकोट में सेंट्रीफ्यूज करना फायदेमंद है कि प्रोटोप्लास्ट सुपरनैटेंट में न रहें। इस प्रोटोकॉल का एक नवाचार डब्ल्यू 5 समाधान में 1 एच इनक्यूबेशन और वॉश स्टेप को हटाना है जो अन्य प्रोटोकॉल14,19 में सूचीबद्ध है, जो हमारे हाथों में अनावश्यक साबित हुआ।
जैसा कि अन्य अध्ययनों में देखा गया है, डीएनए की मात्रा और गुणवत्ता दोनों सफल अभिकर्मक19 के लिए महत्वपूर्ण हैं। 4-6 केबी रेंज में प्लास्मिड के लिए, प्रति 1 मिलियन प्रोटोप्लास्ट में 15 μg डीएनए का उपयोग किया जाता है। खराब गुणवत्ता वाली डीएनए तैयारी के परिणामस्वरूप अभिकर्मक के बाद व्यवहार्यता कम हो सकती है, इसलिए हम बैक्टीरिया से प्लास्मिड को अलग करते समय एक वाणिज्यिक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करने की सलाह देते हैं। तनाव को कम करते हुए प्लास्मिड या प्लास्मिड लाइब्रेरी के प्रतिलेखन की अनुमति देने के लिए रात भर अंधेरे में कमरे के तापमान पर प्रोटोप्लास्ट ्स को इनक्यूबेट किया जाता है। रात भर इनक्यूबेशन के बाद, मूल रूप से संक्रमित प्रोटोप्लास्ट की लगभग आधी संख्या बरामद की जाती है। प्रोटोप्लास्ट को रात भर के इनक्यूबेशन के लिए 500-1,000 कोशिकाओं / μL की एकाग्रता तक पतला किया जाता है। 1,000 कोशिकाओं / μL से अधिक सांद्रता पर रात भर इनक्यूबेट करने के लिए छोड़े गए प्रोटोप्लास्ट में कम वसूली दर और कम व्यवहार्यता होती है। उच्च सांद्रता में, क्षतिग्रस्त और मृत प्रोटोप्लास्ट से मलबे पड़ोसी प्रोटोप्लास्ट की मृत्यु में योगदान कर सकते हैं। रात भर के इनक्यूबेशन के बाद प्रोटोप्लास्ट को धोना इस मलबे को हटाने और अतिरिक्त प्लास्मिड को हटाने दोनों का काम करता है।
इस तरह के प्रोटोकॉल में सीमा है कि सभी पौधों की प्रजातियां या ऊतक प्रकार प्रोटोप्लास्टिंग के लिए उत्तरदायी नहीं हैं। इसके अलावा, जीन अभिव्यक्ति अंतर प्रोटोप्लास्टिंग प्रक्रिया द्वारा प्रेरित किया जा सकता है।
संक्षेप में, हमने मुख्य कृषि फसल जेड मेस से लाखों व्यवहार्य प्रोटोप्लास्ट को अलग करने और स्थानांतरित करने के लिए एक सरल और स्केलेबल प्रोटोकॉल का विस्तार किया है। यह विधि पीईजी का उपयोग करके कई और प्रोटोप्लास्ट को स्थानांतरित कर सकती है, जिसमें परिवर्तन दक्षता लगभग इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित विधियों15 के रूप में अधिक है। ट्रांसफॉर्मेंट्स की अधिक शुद्ध संख्या बड़े पैमाने पर प्रयोगों में सैकड़ों या हजारों संरचनाओं के परीक्षण को सक्षम बनाती है जैसे कि बड़े पैमाने पर समानांतर रिपोर्टर12,13। मक्का में भविष्य के जीनोम-स्केल प्रयोग वैज्ञानिकों को मक्का जीन अभिव्यक्ति और जीन विनियमन को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति देंगे।
Disclosures
लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस काम को नेशनल ह्यूमन जीनोम रिसर्च इंस्टीट्यूट इंटरडिसिप्लिनरी ट्रेनिंग इन जीनोमिक साइंसेज (टी32 प्रशिक्षण अनुदान संख्या एचजी000035 जेटी को) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईजीएमएस 1आर35जीएम139532 से सीक्यू) और नेशनल साइंस फाउंडेशन (रिसर्च-पीजीआर आईओएस -1748843 और प्लांटसिनबायो 2240888 सीक्यू) द्वारा समर्थित किया गया था। हम मक्का के बीज के उपहार के लिए रटगर्स विश्वविद्यालय में एंड्रिया गैलोवाट्टी को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL graduated microcentrifuge tubes | VWR | 490004-444 | |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tube | Corning | 05-527-90 | |
| 250 mL Pyrex glass beaker | Fisher | 50-121-5005 | |
| 40 um nylon mesh cell strainer | Fisher | 22363547 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 14-432-22 | |
| 72 cell propagation tray | T.O. Plastics | 725607C | |
| Aluminum foil | VWR | 89107-732 | |
| Bell jar | Bel-Art | F42022-0000 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-250ML | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2*2H2O) | PhytoTech Labs | C135 | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Cellulase Onozuka R-10 | Duchefa Biochemie | C8001.0010 | |
| D-Mannitol | PhytoTech Labs | M562 | |
| Dissecting scope | Reichert | Microstar IV | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermofischer Scientific | F1303 | Dissolve in acetone at 0.5% weight/volume to make a 1000X stock solution. Protect from light and store at -20 °C. |
| Fluorescence Illumination Systems | Prior | Lumen200 | |
| Fluorescence microscope | Leica | MDG36 | |
| High-capacity centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Macerozyme | Duchefa Biochemie | M8002.0005 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M292-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Maize seeds | B73 | USDA-ARS | https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473 |
| Medium binder clip | Uline | S-24649 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M5287-250G | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Adjust pH to 5.7 using KOH. Protect from light and store at room temperature. |
| Micropipette 20-200 uL | Gilson | F123601G | |
| Nanodrop microvolume spectrophotometer | Thermofischer Scientific | ND-1000 | |
| NEB 5-alpha competent E. coli | New England BioLabs | C2987H | |
| Neubauer hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| No. 9 Single-edge razor blade | Excel | 20009 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-104 | |
| Poly(ethylene) glycol 4,000 | Sigma-Aldrich | 81240-1KG | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Professional Grade Vermiculite | NK Lawn & Garden | G208 | |
| Round-bottom glass centrifuge tube 30 mL | Kimble Chase | 45500-30 | |
| Rubber adapter for Corex centrifuge tubes | Corning | CLS8445AO | |
| Sphagnum peat moss | Premier Horticulture | 0128P | |
| TRIzol Reagent | Thermofischer Scientific | 15596018 | |
| Tygon vacuum tubing | VWR | 76336-844 | |
| Vacuum gauge | Wika | 4269978 |
References
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