Summary
Her presenterer vi en protokoll med høy gjennomstrømning for å transfeksjonere millioner av maisprotoplaster for testing av store biblioteker av plasmider i maismesofyllceller.
Abstract
Transfeksjonen av maismesofyllceller innebærer ofte å fordøye plantecelleveggene for å lage protoplaster og deretter sette inn DNA via elektroporering eller polyetylenglykol (PEG). Tidligere metoder ble utviklet for å produsere titusenvis av transfekterte protoplaster samtidig. Her beskriver vi en enkel metode for å isolere og transfektere millioner av bladmesofyllprotoplaster i mais (Zea mays L.). Denne strømlinjeformede prosessen fjerner visse vanlige protopvaringstrinn, for eksempel vasking i W5. I tillegg har trinn som sentrifugering, PEG-mediert transfeksjon og inkubasjon blitt modifisert for å arbeide med et større antall protoplaster . Evnen til å uttrykke store biblioteker av plasmidkonstruksjoner muliggjør genomskalaeksperimenter, for eksempel massivt parallelle reporteranalyser i mais.
Introduction
Forbigående genuttrykk er et kraftig verktøy i plantebiologi. Imidlertid er planteceller vanskelige å transfektere fordi de er omgitt av en cellevegg. Denne barrieren for DNA-oppføring er ikke tilstede i andre ofte studerte celletyper som pattedyr eller insektceller. Tidligere forskning adresserte denne utfordringen ved å bruke protoplaster: planteceller hvis cellevegger har blitt fordøyd og fjernet. I motsetning til ubehandlet bladvev er planteprotoplaster enkle å arbeide med i suspensjon og egnet til transfeksjonsteknikker mediert av elektroporering eller polyetylenglykol (PEG)1. Planteceller beholder mye av funksjonaliteten selv etter fjerning av celleveggen. Dermed brukes protoplaster i en rekke planter for å studere gen- og proteinfunksjon2,3, for å forstå signaltransduksjon4, og for å identifisere mulige mål for planteavl5. Protoplaster er også et praktisk kjøretøy for screening av genomredigeringskonstruksjoner i forskjellige avlinger, inkludert hvete og potet 6,7. Kort sagt, forbigående analyser i protoplaster er uunnværlige for landbruksbioteknologi.
Mais (Zea mays L.) er den verdensledende kornavlingen etter tonnasje; Som sådan er det et hovedfokus for grunnleggende og anvendt plantevitenskapelig forskning8. Imidlertid, i motsetning til i modellplanter som Nicotiana tabacum9, utføres ikke forbigående transgenuttrykk i intakte maisblader rutinemessig. Protoplasting har blitt brukt til å skaffe og transfektere maisbladmesofyllceller10,11. Tidligere metoder har oppnådd transfeksjonseffektivitet opptil 75% ved bruk av elektroporering og produsert transfeksjonerte protoplaster i skalaen titusenvis10,15.
Denne protokollen beskriver hvordan man protoplast millioner av maismesofyllceller og transfekterer dem med en effektivitet som kan sammenlignes med tidligere metoder. Hovedtrinnene er å dyrke etiolerte maisplanter, høste bladvevet, fordøye plantecelleveggen og levere plasmid-DNA inn i cellene ved hjelp av PEG. Hovedbidraget til denne protokollen er evnen til å skalere opp protoplasttransfeksjon samtidig som cellens levedyktighet opprettholdes for funksjonelle analyser. Dette muliggjør bruk av genomskalaeksperimenter, for eksempel massivt parallelle reporteranalyser, som kan teste funksjonen til hundretusener av regioner i hele maisgenomet. Denne metoden har nylig blitt brukt til å undersøke store biblioteker av cis-regulatoriske DNA-elementer, inkludert forsterkere og promotorer12,13,14.
Protocol
1. Vekst av plantematerialet
- Skyll maiskjerner to ganger med vann fra springen. Bløtlegg kjernene i vann fra springen over natten ved romtemperatur.
- Neste dag fyller du et 72-cellers frøstartbrett med fuktet 1:1 vermikulitt:torvmose. Skyll kjernene en gang og plant dem ned en kjerne per celle.
- Dyrk under lange dagsforhold (16 timer lys, 8 timer mørkt) ved 25 °C i 3 dager.
- Overfør til konstant mørke ved 25 °C, og vokse i 9-11 dager.
2. Plasmid isolasjon
- Transformer kommersielt kjemisk kompetent E. coli med plasmidet (e) av interesse i henhold til produsentens instruksjoner.
- Dyrk den transformerte E. coli i 50 ml flytende LB-medium med passende antibiotika over natten ved 37 °C med risting.
- Pellet E. coli ved sentrifugering i 10 min ved 3000 x g ved romtemperatur. Ekstraher plasmidene ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig midiprep plasmid DNA-isolasjonssett.
- Estimere plasmid-DNA-konsentrasjonen ved hjelp av et mikrovolumspektrofotometer.
MERK: Materiale egnet for transfeksjon bør ha en konsentrasjon på ≥800 ng / μL og en A260 / A280 på ≥1,8.
3. Protoplast-isolasjon
- Forbered 20 ml enzymoppløsning.
- Tilsett 2,18 g mannitol, 0,30 g cellulase R-10 og 0,06 g macerozyme R-10 til et 50 ml sentrifugerør. Inverter for å blande pulverene. Tilsett avionisertH2Otil 15 ml. Tilsett 200 μL av 1 M MES, pH 5,7. Vortex å blande.
- Varm oppløsningen ved 55 °C i 10 minutter. Avkjøles i romtemperatur i 10 min.
- Tilsett 20 μL 1 M CaCl2,0,02 g bovint serumalbumin og 100 μL 1 M β-merkaptoetanol.
- Fyll til 20 ml med avionisert H2O. Hell i et folieinnpakket 250 ml beger.
- Ta maisplantene ut av mørket. Klipp dem noen centimeter over jorden ved hjelp av et nytt barberblad. Plasser kuttendene i vann. Oppbevar dem i mørket ved romtemperatur når de ikke er i bruk.
- Velg det andre og tredje bladet av hver frøplante, pass på å utelukke blader med brune eller skadede områder. Velg 12-16 blader. Klipp ~1 cm av tuppen av hvert blad og kast. Klipp deretter en 10 cm seksjon fra hvert blad.
MERK: Hvis det er behov for mer vev, bruk ytterligere 20 ml volum enzymoppløsning i ytterligere 250 ml beger. For mye bladmateriale i en gitt mengde enzymløsning kan redusere levedyktigheten. - Stable bladseksjonene oppå hverandre med basalendene sammen. Klem bunten sammen i basalenden ved hjelp av en bindeklips. Legg bunten med blader på et stykke hvitt papir.
- Ta tak i bladene ~ 1 cm fra den distale enden. Bruk et nytt barberblad til å skjære bladene fra den distale enden vinkelrett på venene i tynne (0,5-1 mm) skiver. Unngå å hakke rett ned, men lag heller korte, fremre skiver gjennom vevet.
- Bytt barberbladene når synlige rester begynner å bli avsatt på papiret. Synlige rester indikerer mosing av vevet på grunn av et kjedelig blad eller dårlig teknikk.
- Etter å ha kuttet ~ 2 cm av lengden på bladbunten, overfør straks skivene til begeret av enzymoppløsning. Ikke la materialet tørke ut, da dette vil redusere antall protoplaster som er oppnådd. Roter enzymoppløsningen forsiktig for å fukte materialet.
- Legg et folielokk over begeret for å blokkere lyset. Gjenta slicing og overføringsprosessen til hele bunten er kuttet nær bindeklipsen.
- Overfør begeret av enzymoppløsning til en klokkekrukke. Vakuuminfiltrat mellom -50,8 kPa og -67,7 kPa i forhold til omgivelsestrykk i 3 minutter ved romtemperatur.
- Overfør begeret til en bordplater. Rist ved 40 o / min i 2,5 timer ved romtemperatur. Virvle begeret forsiktig for hånd. Når den er fullstendig fordøyd, vil enzymoppløsningen virke litt melkeaktig. Hvis oppløsningen fortsatt er klar, fortsett å riste ved 40 RPM i opptil en ekstra time. Må ikke overstige 3,5 timer.
- Under fordøyelsen, lage en mannitol + MES + MgCl2 (MMG) løsning, en polyetylenglykol (PEG) løsning, og en inkubasjonsløsning.
- MMG: Tilsett 5,47 g mannitol, 200 μL 1 M MES, pH 5,7 og 750 μL 1 MMgCl2 til et 50 ml sentrifugerør. Fyll til 50 ml med destillert H2O. Vortex for å oppløse. Plasser på is.
- Inkubasjonsløsning: Tilsett 5,47 g mannitol, 200 μL 1 M MES ved pH 5,7 og 200 μL 1 M KCl til et 50 ml sentrifugerør. Fyll til 50 ml med destillert H2O. Vortex for å oppløse. Plasser på is.
- PEG-løsning: Tilsett 0,44 g mannitol, 1,0 g PEG og 400 μL 1 MCaCl2 til et 15 ml sentrifugerør. Fyll til 4 ml med destillert H2O. Vortex for å blande. Inkuber ved 37 °C under omristing i 30 minutter til den er helt oppløst. Oppbevares ved romtemperatur.
- Rist enzymoppløsningen ved 80 o / min i 10 minutter ved romtemperatur.
- Legg begeret med enzymoppløsningen på is. Ikke fjern foliebelegget. Tilsett 20 ml iskald MMG til enzymoppløsningen. Filtrer gjennom en 40 μm cellesil inn i et 50 ml sentrifugerør.
MERK: Hold alle løsningene på is for følgende trinn til tillegg av PEG. Hold protoplaster dekket med folie for å minimere lyseksponering. - Del filtratet i like store volumer på 10 ml hver. Hell hvert volum i et rundbunns glasssentrifugerør, og spinn ned i 4 minutter ved 100 x g ved romtemperatur.
- Kast supernatanten og tilsett 1 ml iskald MMG til hver tube. Resuspender pellets ved å forsiktig virvle og banke på rørene. Kombiner prøvene i et enkelt rundbunns glasssentrifugerør. Legg MMG til et totalt volum på 5 ml. Spinn ned i 3 min ved 100 x g ved romtemperatur.
- Vask med 5 ml MMG, og sentrifugeres i 3 minutter ved 100 x g ved romtemperatur.
- Gjenta vasken med 5 ml MMG, og senk den i 3 minutter ved 100 x g ved romtemperatur. Etter å ha spinnet ned den andre vasken, observer om supernatanten er klar. Hvis det forblir overskyet, utfør en tredje vask.
- Resuspender protoplaster i 1 ml MMG. Dekk løst med folie og hold på is.
- Bestem protoplastutbyttet og kontroller levedyktigheten.
- I et 1,5 ml mikrosentrifugerør tilsettes 4 μL protoplaster og 72 μL MMG.
- I et 1,5 ml mikrosentrifugerør, tilsett 1 μL 0,5% fluoresceindiacetat (FDA) stamløsning til 49 μL MMG for å lage en 20x arbeidsløsning. Tilsett 4 μL FDA-arbeidsløsning til røret med de fortynnede protoplastene. Inkuber i 5 minutter i mørket ved romtemperatur.
- Legg 11 μL av protoplastblandingen på et hemocytometer. Plasser under et lysmikroskop. Bekreft visuelt at cellene mangler cellevegger. Deretter teller antall protoplaster . Bruk denne tellingen til å estimere totalt antall protoplaster oppnådd. Deretter teller antall protoplaster som fluorescerer grønt under UV-lys når de er farget med FDA. Vellykket protoplastisolasjon gir en levedyktighet på 70%-90%.
4. PEG-mediert transfeksjon
- Start med den estimerte protoplastkonsentrasjonen fra trinn 3.17, juster til ~10 000 protoplaster/μL. Hvis konsentrasjonen er lav, sentrifuge i 3 minutter ved 100 x g, og resuspendere i MMG til en konsentrasjon på ~ 10.000 protoplaster / μL.
- Bland ~1,000,000 protoplaster med 15 μg DNA i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Fyll opp blandingen med MMG til 114,4 μL, og rug på is i 30 minutter.
- Suspender protoplastene ved å tappe på siden av røret. Tilsett 105,6 μL 25% PEG-løsning til protoplaster for å nå en endelig vekt / volum på 12% PEG. Bland forsiktig ved å invertere 5-10 ganger. Protoplaster i PEG-løsning er skjøre; Ikke rist røret. Inkuber i 10 minutter i mørket ved romtemperatur.
MERK: Transfeksjonen kan skaleres opp i multipler av volumene gitt i trinn 4.2 og trinn 4.3. For eksempel kan 10 millioner protoplaster og 150 μg DNA suspenderes i 1,444 μL MMG og behandles med 1,056 μL PEG-løsning i et 50 ml sentrifugerør. - Fortynn med 5 volumer inkubasjonsløsning. Bland forsiktig ved inversjon. Spinn ned i 4 min ved 100 x g ved romtemperatur.
MERK: Ved oppskalering, del protoplaster i flere rundbunns glassrør som inneholder ikke mer enn 10 ml hver for å sikre fullstendig pelletering. Skaler proporsjonalt opp inkubasjonsløsningsvolumet som brukes til vask. - Fjern supernatanten ved pipettering. Vask med 1-5 ml inkubasjonsløsning, og drypp ned i 3 minutter ved 100 x g ved romtemperatur.
- Resuspendere protoplaster i inkubasjonsløsningen til en konsentrasjon på 500-1000 celler / μL.
- Inkuber protoplaster i mørket over natten (~ 16 timer) ved romtemperatur.
5. Protoplastgjenoppretting og uttrykksverifisering
- Spinn ned protoplaster i 4 min ved 100 x g ved romtemperatur. MERK: Ved oppskalering, del protoplaster i flere rundbunns glassrør som ikke inneholder mer enn 10 ml hver.
- Vask med 1-5 ml inkubasjonsløsning, og drypp ned i 3 minutter ved 100 x g ved romtemperatur.
- Resuspendere, og kombinere i 1-5 ml inkubasjonsløsning.
- Hvis protoplaster transfekteres med et fluorescerende reportergen (f.eks. GFP), ta en alikot for å kontrollere transfeksjonseffektiviteten. Ved hjelp av et hemocytometer teller du først totalt antall protoplaster ved hjelp av lysfeltmikroskopi. Deretter teller fraksjonen av fluorescerende protoplaster under UV-lys.
- Sentrifuge protoplaster i 3 min ved 100 x g ved romtemperatur.
MERK: Protoplaster er nå klare for nedstrøms applikasjoner som RNA-ekstraksjon med fenol og guanidinisotiocyanat.
Representative Results
Vevet som egner seg best for protoplastisolering er det andre og tredje bladet av 10-11 dager gamle frøplanter (figur 1). I dette arbeidet oppnådde vi ca. 10 millioner protoplaster fra 16 bladseksjoner, som hver var 10 cm lange. Antall isolerte protoplaster er avhengig av massen av bladmaterialet og bredden på bladskivene som fordøyes i enzymoppløsningen.
Under et lysmikroskop vises ubeskadigede protoplaster omtrent sfæriske, med plastider som flekker overflaten (figur 2A). Før du går videre til transfeksjon, kan levedyktigheten kontrolleres ved å fargelegge en liten alikot av protoplaster med fluoresceindiacetat (FDA). FDA-fargede protoplaster som fluorescerer under UV-lys anses å være levedyktige (figur 2B, C). Ikke alle protoplaster som virker uskadet er fortsatt levedyktige, og noen levedyktige protoplaster kan være i ferd med å dø ved evakuering (figur 2C). I disse cellene er vakuolen hevelse og vil til slutt bli kastet ut fra cellemembranen.
Figur 3 viser protoplaster transformert med pJT01, et 4,3 kb maisuttrykksplasmid avledet fra CD3-911 (ABRC)15. Transfeksjon resulterer i uttrykket av sGFP merket med et C-terminal nukleært lokaliseringssignal fra c-Myc (figur 3A). Andelen sGFP-uttrykkende protoplaster ble målt over flere eksperimenter ved hjelp av et hemocytometer. Median transfeksjonseffektivitet oppnådd ved denne metoden var 40 % etter inkubasjon over natten (n = 9, figur 4, tabell 1), som er sammenlignbar med tidligere publiserte metoder15. Avhengig av eksperimentell applikasjon, hvis plasmid- eller plasmidbiblioteket mangler en fluorescerende reporter, anbefales det å inkludere en positiv kontroll for å bekrefte transfeksjon.
Figur 1: Representativ etiolert maisplante dyrket i mørke i 10 dager etter spiring. Pilene indikerer det andre og tredje bladet, som er best egnet for protoplasting. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fluorescensmikroskopi av protoplast-levedyktighet etter isolering. (A) Brightfield-bilde av protoplaster umiddelbart etter isolering. (B) Fluorescenssignalet til FDA-fargede protoplaster . (C) Overlapping av lysfelt og fluorescens som viser levedyktige protoplaster. Pilen viser en protoplast som gjennomgår evakuering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fluorescensmikroskopi av protoplaster transfeksjonert med sGFP . (A) Brightfield-bilde av protoplaster etter transfeksjon. (B) Fluorescenssignalet til de transfektede protoplaster i GFP-kanalen. (C) Overlapping av lysfelt og fluorescens som viser de transformerte protoplastene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Prosentandel av protoplaster som viser GFP-fluorescens etter 16 timers inkubasjon. Transfeksjonseffektiviteten varierte mellom uavhengige studier, med lavest effektivitet rundt 20 % og høyest nær 50 %. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Rettergang | GFP-celler telt | Totalt antall celler telt | GFP prosent |
| 1 | 104 | 261 | 39.8 |
| 2 | 148 | 298 | 49.5 |
| 3 | 84 | 258 | 32.6 |
| 4 | 137 | 271 | 50.6 |
| 5 | 127 | 299 | 42.5 |
| 6 | 107 | 235 | 45.5 |
| 7 | 83 | 360 | 23.1 |
| 8 | 134 | 549 | 24.4 |
| 9 | 61 | 201 | 30.3 |
| Bety | 109 | 304 | 36 |
| Standardavvik | 29 | 102 | 10 |
Tabell 1: Representativ protoplasttransfeksjonseffektivitet. Data fra ni nylige protoplastingsforsøk i forfatternes laboratorium.
Tilleggsfil 1: GenBank-formatert tekstfil med sekvensen pJT01. Et 4,3 kb sGFP-ekspresjonsplasmid fungerer som en positiv kontroll i transfekterte maisprotoplaster . Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Som rapportert tidligere er kvaliteten på plantematerialet som brukes til protoplasting avgjørende for å oppnå protoplaster av høy kvalitet16,17,18. Det er viktig å velge sunne, plettfrie blader. Dette arbeidet brukte den populære forskningen maiskultivar B73. Vi har ikke testet andre sorter. Maisplantene som ble brukt til denne protokollen ble dyrket i mørke fordi etiolerte blader produserer protoplaster med større levedyktighet 16 timer etter transfeksjon sammenlignet med protoplaster fra grønne blader. For applikasjoner som ikke krever inkubasjon over natten, vil det være mulig å bruke grønt eller grønt bladmateriale.
Et kritisk trinn er å kutte bladmaterialet riktig i tynne skiver før enzymatisk fordøyelse. Denne prosessen øker overflaten for mesofyllcellene som skal eksponeres for enzymoppløsningen, noe som øker antall gjenvunnede protoplaster . De distale bladspissene kastes, og tynne (≤1 mm) skiver kuttes med nye barberblad, som byttes ut umiddelbart når de begynner å bli kjedelige. For en gitt mengde vev gir tynnere skiver flere protoplaster forutsatt at riktig teknikk brukes for å minimere knusing av bladene.
Det er også viktig å vaske protoplastene riktig, da de er ganske delikate etter å ha gjennomgått fjerning av celleveggen. Etter fordøyelsen holdes alle løsningene på is, og de mørkvoksne protoplaster er beskyttet mot lys. Osmolariteten og pH bufres ved å utføre vaskene i MMG-oppløsning. For å isolere protoplaster fra de mindre tette cellulære ruskene, foregår sentrifugering ved 100 x g. Protoplaster sentrifugert ved 200 x g viser tilsvarende levedyktighet etter isolering, men lavere levedyktighet dagen etter, og de transformerer omtrent halvparten også. Vi anbefaler å sjekke levedyktigheten til protoplaster ved farging med FDA (fluoresceindiacetat) umiddelbart etter isolasjon; Den normale levedyktigheten varierer mellom 70% -90%. Protoplaster med levedyktighet lavere enn 40% etter isolasjon gir få transformanter.
Pelleting og vasking er lettere når du arbeider med mange protoplaster fordi en tydelig synlig pellet oppnås etter transfeksjon. Av denne grunn utføres transfeksjon med 1 million eller flere protoplaster. Ved oppskalering av protokollen bør det velges en beholder av passende størrelse for inkubasjonstrinnene (1,5 ml, 15 ml eller 50 ml sentrifugerør), og volumet av oppløsningen som brukes til vasketrinnene bør skaleres tilsvarende. I alle fall er det fordelaktig å sentrifugere i ≤10 ml alikoter for å sikre at protoplaster ikke forblir i supernatanten. En innovasjon i denne protokollen er fjerning av 1 h inkubasjons- og vasketrinn i W5-løsningen som er oppført i andre protokoller14,19, noe som viste seg å være unødvendig i våre hender.
Som sett i andre studier er mengden og kvaliteten på DNA begge kritiske for vellykket transfeksjon19. For plasmider i 4-6 kb-området brukes 15 μg DNA per 1 million protoplaster. DNA-preparater av dårlig kvalitet kan resultere i redusert levedyktighet etter transfeksjon, så vi anbefaler å bruke et kommersielt DNA-ekstraksjonssett når du isolerer plasmider fra bakterier. Inkubering av protoplaster over natten gjøres ved romtemperatur i mørket for å tillate transkripsjon av plasmid- eller plasmidbiblioteket samtidig som stress minimeres. Etter inkubasjon over natten gjenvinnes omtrent halvparten av opprinnelig transfekterte protoplaster . Protoplaster fortynnes til en konsentrasjon på 500-1000 celler / μL for inkubasjon over natten. Protoplaster igjen for å inkubere over natten ved konsentrasjoner høyere enn 1000 celler / μL har lavere utvinningsgrad og lavere levedyktighet. Ved høyere konsentrasjoner kan rusk fra skadede og døde protoplaster bidra til døden til nærliggende protoplaster . Vasking av protoplaster etter inkubasjon over natten tjener både til å fjerne dette rusket og fjerne overflødig plasmid.
Protokoller som disse har den begrensningen at ikke alle plantearter eller vevstyper er mottagelige for protoplasting. Videre kan forskjeller i genuttrykk induseres av protoplastingsprosessen.
Oppsummert har vi detaljert en enkel og skalerbar protokoll for å isolere og transfektere millioner av levedyktige protoplaster fra stiftjordbruksavlingen Z. mays. Denne metoden kan transfektere mange flere protoplaster ved hjelp av PEG, med en transformasjonseffektivitet nesten like høy som elektroporasjonsbaserte metoder15. Det større netto antallet transformanter muliggjør testing av hundrevis eller tusenvis av konstruksjoner i store eksperimenter som massivt parallelle reporteranalyser12,13. Fremtidige genomskalaeksperimenter i mais vil tillate forskere å bedre forstå maisgenuttrykk og genregulering.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Human Genome Research Institute Interdisciplinary Training in Genomic Sciences (T32 opplæringsstipend nr. HG000035 til JT) og National Institute of Health (NIGMS 1R35GM139532 til CQ) og av National Science Foundation (RESEARCH-PGR IOS-1748843 og PlantSynBio 2240888 til CQ). Vi takker Andrea Gallovatti ved Rutgers University for gaven av maisfrøene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL graduated microcentrifuge tubes | VWR | 490004-444 | |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tube | Corning | 05-527-90 | |
| 250 mL Pyrex glass beaker | Fisher | 50-121-5005 | |
| 40 um nylon mesh cell strainer | Fisher | 22363547 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 14-432-22 | |
| 72 cell propagation tray | T.O. Plastics | 725607C | |
| Aluminum foil | VWR | 89107-732 | |
| Bell jar | Bel-Art | F42022-0000 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-250ML | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2*2H2O) | PhytoTech Labs | C135 | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Cellulase Onozuka R-10 | Duchefa Biochemie | C8001.0010 | |
| D-Mannitol | PhytoTech Labs | M562 | |
| Dissecting scope | Reichert | Microstar IV | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermofischer Scientific | F1303 | Dissolve in acetone at 0.5% weight/volume to make a 1000X stock solution. Protect from light and store at -20 °C. |
| Fluorescence Illumination Systems | Prior | Lumen200 | |
| Fluorescence microscope | Leica | MDG36 | |
| High-capacity centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Macerozyme | Duchefa Biochemie | M8002.0005 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M292-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Maize seeds | B73 | USDA-ARS | https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473 |
| Medium binder clip | Uline | S-24649 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M5287-250G | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Adjust pH to 5.7 using KOH. Protect from light and store at room temperature. |
| Micropipette 20-200 uL | Gilson | F123601G | |
| Nanodrop microvolume spectrophotometer | Thermofischer Scientific | ND-1000 | |
| NEB 5-alpha competent E. coli | New England BioLabs | C2987H | |
| Neubauer hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| No. 9 Single-edge razor blade | Excel | 20009 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-104 | |
| Poly(ethylene) glycol 4,000 | Sigma-Aldrich | 81240-1KG | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Professional Grade Vermiculite | NK Lawn & Garden | G208 | |
| Round-bottom glass centrifuge tube 30 mL | Kimble Chase | 45500-30 | |
| Rubber adapter for Corex centrifuge tubes | Corning | CLS8445AO | |
| Sphagnum peat moss | Premier Horticulture | 0128P | |
| TRIzol Reagent | Thermofischer Scientific | 15596018 | |
| Tygon vacuum tubing | VWR | 76336-844 | |
| Vacuum gauge | Wika | 4269978 |
References
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: A useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Wang, S., Tiwari, S. B., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. AUXIN RESPONSE FACTOR7 restores the expression of auxin-responsive genes in mutant Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts. The Plant Cell. 17 (7), 1979-1993 (2005).
- Hirner, A., et al. Arabidopsis LHT1 is a high-affinity transporter for cellular amino acid uptake in both root epidermis and leaf mesophyll. The Plant Cell. 18 (8), 1931-1946 (2006).
- Hwang, I., Sheen, J. Two-component circuitry in Arabidopsis cytokinin signal transduction. Nature. 413 (6854), 383-389 (2001).
- Tan, M. -L. M. C., Rietveld, E. M., van Marrewijk, G. A. M., Kool, A. J. Regeneration of leaf mesophyll protoplasts of tomato cultivars (L. esculentum): Factors important for efficient protoplast culture and plant regeneration. Plant Cell Reports. 6 (3), 172-175 (1987).
- Brandt, K. M., Gunn, H., Moretti, N., Zemetra, R. S. A streamlined protocol for wheat (Triticum aestivum) protoplast isolation and transformation with CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes. Frontiers in Plant Science. 11, 769 (2020).
- Nadakuduti, S. S., et al. Evaluation of methods to assess in vivo activity of engineered genome-editing nucleases in protoplasts. Frontiers in Plant Science. 10, 110 (2019).
- OECD, Food and Agriculture Organization of the United Nations.
- Gallois, P., Marinho, P. Leaf disk transformation using Agrobacterium tumefaciens-expression of heterologous genes in tobacco. Plant Gene Transfer and Expression Protocols. 49, 39-48 (1995).
- Schäffner, A. R., Sheen, J. Maize rbcS promoter activity depends on sequence elements not found in dicot rbcS promoters. The Plant Cell. 3 (9), 997-1012 (1991).
- Sheen, J. Molecular mechanisms underlying the differential expression of maize pyruvate, orthophosphate dikinase genes. The Plant Cell. 3 (3), 225-245 (1991).
- Jores, T., et al. Identification of plant enhancers and their constituent elements by STARR-seq in tobacco leaves. The Plant Cell. 32 (7), 2120-2131 (2020).
- Jores, T., et al. Synthetic promoter designs enabled by a comprehensive analysis of plant core promoters. Nature Plants. 7 (6), 842-855 (2021).
- Ricci, W. A., et al. Widespread long-range cis-regulatory elements in the maize genome. Nature Plants. 5 (12), 1237-1249 (2019).
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiology. 127 (4), 1466-1475 (2001).
- Jeon, J. M., et al. Efficient transient expression and transformation of PEG-mediated gene uptake into mesophyll protoplasts of pepper (Capsicum annuum L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 88 (2), 225-232 (2007).
- Pindel, A. Optimization of isolation conditions of Cymbidium protoplasts. Folia Horticulturae. 19, 79-88 (2007).
- Ren, R., et al. Highly efficient leaf base protoplast isolation and transient expression systems for orchids and other important monocot crops. Frontiers in Plant Science. 12, 626015 (2021).
- Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nature Protocols. 2 (7), 1565-1572 (2007).
