Summary
Здесь мы представляем высокопроизводительный протокол для временной трансфектации миллионов протопластов кукурузы для тестирования больших библиотек плазмид в клетках мезофилла кукурузы.
Abstract
Трансфекция клеток мезофилла кукурузы часто включает в себя переваривание клеточных стенок растений для создания протопластов, а затем вставку ДНК с помощью электропорации или полиэтиленгликоля (ПЭГ). Предыдущие методы были разработаны для получения десятков тысяч трансфицированных протопластов одновременно. Здесь мы описываем простой метод выделения и трансфекции миллионов протопластов мезофилла листьев в кукурузе (Zea mays L.). Этот оптимизированный процесс устраняет некоторые распространенные этапы протопления, такие как промывка в W5. Кроме того, такие этапы, как центрифугирование, трансфекция, опосредованная ПЭГ, и инкубация были модифицированы для работы с большим количеством протопластов. Способность экспрессировать большие библиотеки плазмидных конструкций позволяет проводить эксперименты в масштабе генома, такие как массово-параллельные репортерные анализы кукурузы.
Introduction
Транзиторная экспрессия генов является мощным инструментом в биологии растений. Однако растительные клетки трудно трансфицировать, потому что они окружены клеточной стенкой. Этот барьер для проникновения ДНК отсутствует в других широко изучаемых типах клеток, таких как клетки млекопитающих или насекомых. Прошлые исследования решали эту проблему, используя протопласты: растительные клетки, клеточные стенки которых были переварены и удалены. В отличие от необработанной ткани листа, с растительными протопластами легко работать в суспензии и они поддаются методам трансфекции, опосредованным электропорацией или полиэтиленгликолем (ПЭГ)1. Растительные клетки сохраняют большую часть своей функциональности даже после удаления клеточной стенки. Таким образом, протопласты используются у различных растений для изучения функции генов и белков2,3, для понимания сигнальной трансдукции4 и для определения возможных мишеней для селекции растений5. Протопласты также являются удобным средством для скрининга конструкций редактирования генома у различных видов сельскохозяйственных культур, включая пшеницу и картофель 6,7. Короче говоря, переходные анализы протопластов необходимы для сельскохозяйственной биотехнологии.
Кукуруза (Zea mays L.) является ведущей в мире зерновой культурой по тоннажу; Как таковой, он является одним из основных направлений фундаментальных и прикладных исследований в области растениеводства8. Однако, в отличие от модельных растений, таких как Nicotiana tabacum9, транзиторная экспрессия трансгена в неповрежденных листьях кукурузы обычно не выполняется. Протопластинг был использован для получения и трансфицирования клеток мезофилла листьев кукурузы10,11. Предыдущие методы достигали эффективности трансфекции до 75% с помощью электропорации и производили трансфицированные протопласты в масштабе10,15 десятков тысяч.
В этом протоколе подробно описано, как протопластировать миллионы клеток мезофилла кукурузы и трансфицировать их с эффективностью, сравнимой с предыдущими методами. Основными этапами являются выращивание этиолированных проростков кукурузы, сбор ткани листа, переваривание клеточной стенки растений и доставка плазмидной ДНК в клетки с помощью ПЭГ. Ключевым вкладом этого протокола является способность масштабировать трансфекцию протопластов при сохранении жизнеспособности клеток, необходимой для функциональных анализов. Это позволяет использовать эксперименты в масштабе генома, такие как массово-параллельные репортерные анализы, которые могут проверить функцию сотен тысяч областей по всему геному кукурузы. Этот метод недавно был использован для исследования больших библиотек цис-регуляторных элементов ДНК, включая энхансеры и промоторы12,13,14.
Protocol
1. Рост растительного материала
- Дважды промойте зерна кукурузы водопроводной водой. Замочите ядра в водопроводной воде на ночь при комнатной температуре.
- На следующий день заполните стартовый лоток для семян на 72 ячейки смоченным вермикулитом: торфяным мхом в соотношении 1:1. Промойте ядра один раз и посадите их верхушкой вниз, по одному зернышку на ячейку.
- Выращивают в условиях длинного дня (16 ч света, 8 ч темноты) при 25 ° C в течение 3 дней.
- Переносят в постоянную темноту при 25 °C, и выращивают 9-11 дней.
2. Выделение плазмиды
- Трансформируйте коммерческую химически компетентную кишечную палочку с интересующей плазмидой (плазмидами) в соответствии с инструкциями производителя.
- Выращивайте трансформированную кишечную палочку в 50 мл жидкой среды LB с соответствующими антибиотиками в течение ночи при 37 ° C при встряхивании.
- Гранулируйте кишечную палочку центрифугированием в течение 10 мин при 3,000 x g при комнатной температуре. Извлеките плазмиды с помощью коммерчески доступного набора для выделения плазмидной ДНК мидипрепа.
- Оцените концентрацию плазмидной ДНК с помощью микрообъемного спектрофотометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Материал, пригодный для трансфекции, должен иметь концентрацию ≥800 нг/мкл и A260/A280 ≥1,8.
3. Изоляция протопласта
- Приготовьте 20 мл раствора фермента.
- Добавьте 2,18 г маннита, 0,30 г целлюлазы R-10 и 0,06 г мацероцима R-10 в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Переверните, чтобы смешать порошки. Добавьте деионизированный H2O до 15 мл. Добавьте 200 мкл 1 М MES, рН 5,7. Вихрь перемешать.
- Нагревайте раствор при температуре 55 °C в течение 10 мин. Охладить при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Добавьте 20 мкл 1 М CaCl2,0,02 г бычьего сывороточного альбумина и 100 мкл 1 М β-меркаптоэтанола.
- Наполните до 20 мл деионизированным H2O. Вылейте в завернутый фольгой стакан объемом 250 мл.
- Выньте рассаду кукурузы из темноты. Срежьте их на несколько сантиметров над почвой с помощью нового бритвенного лезвия. Поместите срезанные концы в воду. Храните их в темноте при комнатной температуре, пока они не используются.
- Выделите второй и третий листочки каждого саженца, стараясь исключить листья с коричневыми или поврежденными участками. Выберите 12-16 листочков. Отрежьте ~ 1 см от кончика каждого листа и выбросьте. Затем отрежьте по 10 см от каждого листа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется больше ткани, используйте дополнительный объем фермента 20 мл в дополнительном стакане объемом 250 мл. Слишком большое количество листового материала в заданном количестве ферментного раствора может снизить жизнеспособность. - Уложите срезы листьев друг на друга прикорневыми концами вместе. Зажмите пучок на базальном конце с помощью связующего зажима. Положите пучок листьев на лист белой бумаги.
- Возьмитесь за листья на расстоянии ~1 см от дистального конца. С помощью нового лезвия бритвы нарежьте листья от дистального конца перпендикулярно жилкам на тонкие (0,5-1 мм) ломтики. Избегайте резки прямо вниз, а лучше делайте короткие, прямые ломтики через ткань.
- Меняйте бритвенные лезвия всякий раз, когда на бумаге начинают откладываться видимые остатки. Видимый остаток указывает на затирание ткани из-за тупого лезвия или плохой техники.
- Отрезав ~2 см длины листового пучка, оперативно перенесите срезы в стакан ферментного раствора. Не допускайте пересыхания материала, так как это уменьшит количество получаемых протопластов. Аккуратно взбейте раствор фермента, чтобы смочить материал.
- Накройте стакан крышкой из фольги, чтобы блокировать свет. Повторяйте процесс нарезки и переноса до тех пор, пока весь пучок не будет разрезан вплотную к зажиму для связующего.
- Переложите стакан с ферментным раствором в банку-колокольчик. Вакуум-инфильтрат от −50,8 кПа до −67,7 кПа по отношению к давлению окружающей среды в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Перенесите стакан в настольный шейкер. Встряхивайте при 40 об/мин в течение 2,5 ч при комнатной температуре. Аккуратно покрутите стакан вручную. При полном переваривании раствор фермента будет казаться слегка молочным. Если раствор все еще прозрачен, продолжайте встряхивать при 40 об/мин еще до одного часа. Не более 3,5 ч.
- Во время пищеварения сделайте раствор маннита + MES + MgCl2 (MMG), раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) и инкубационный раствор.
- ММГ: Добавьте 5,47 г маннита, 200 мкл 1 М MES, pH 5,7 и 750 мкл 1 M MgCl2 в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Залейте до 50 мл дистиллированным H2O. Vortex для растворения. Выложить на лед.
- Инкубационный раствор: Добавьте 5,47 г маннита, 200 мкл 1 М МЭС при рН 5,7 и 200 мкл 1 М KCl в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Залейте до 50 мл дистиллированным H2O. Vortex для растворения. Выложить на лед.
- Раствор ПЭГ: Добавьте 0,44 г маннита, 1,0 г ПЭГ и 400 мкл 1 М CaCl2в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Залейте до 4 мл дистиллированным H2O. Vortex для перемешивания. Инкубировать при 37 °C при встряхивании в течение 30 мин до полного растворения. Хранить при комнатной температуре.
- Встряхните раствор фермента при 80 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Поместите стакан с раствором фермента на лед. Не снимайте покрытие из фольги. Добавьте 20 мл ледяного ММГ в раствор фермента. Отфильтруйте через сетчатый фильтр 40 мкм в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите все растворы на льду для следующих шагов до добавления PEG. Держите протопласты покрытыми фольгой, чтобы свести к минимуму воздействие света. - Разделите фильтрат на равные объемы по 10 мл каждый. Перелейте каждый объем в стеклянную центрифужную пробирку с круглым дном и открутите в течение 4 минут при 100 x g при комнатной температуре.
- Откажитесь от надосадочной жидкости и добавьте по 1 мл ледяного ММГ в каждую пробирку. Ресуспендируйте гранулы, осторожно взбалтывая и постукивая по трубкам. Объедините образцы в одну стеклянную центрифужную пробирку с круглым дном. Добавьте ММГ к общему объему 5 мл. Отжимайте в течение 3 минут при 100 x g при комнатной температуре.
- Залейте 5 мл MMG и отжимайте в течение 3 минут при 100 x g при комнатной температуре.
- Повторите стирку с 5 мл MMG и отжимайте в течение 3 минут при 100 x g при комнатной температуре. После отжима второй промывки посмотрите, прозрачна ли надосадочная жидкость. Если он остается мутным, выполните третью промывку.
- Ресуспендировать протопласты в 1 мл ММГ. Неплотно накройте фольгой и держите на льду.
- Определите выход протопласта и проверьте жизнеспособность.
- В микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл сложите 4 мкл протопластов и 72 мкл ММГ.
- В микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл добавьте 1 мкл 0,5% раствора флуоресцеина диацетата (FDA) к 49 мкл MMG, чтобы получить 20-кратный рабочий раствор. Добавьте 4 мкл рабочего раствора FDA в пробирку с разбавленными протопластами. Выдерживать 5 мин в темноте при комнатной температуре.
- Загрузите 11 мкл смеси протопластов на гемоцитометр. Поместите под светлопольный световой микроскоп. Визуально подтвердите, что в клетках отсутствуют клеточные стенки. Затем подсчитайте количество протопластов. Используйте этот подсчет, чтобы оценить общее количество полученных протопластов. Затем подсчитайте количество протопластов, которые флуоресцируют зеленым цветом под ультрафиолетовым светом при окрашивании FDA. Успешные выделения протопластов дают жизнеспособность 70-90%.
4. ПЭГ-опосредованная трансфекция
- Начиная с расчетной концентрации протопластов на шаге 3.17, отрегулируйте до ~ 10 000 протопластов / мкл. Если концентрация низкая, центрифугу в течение 3 мин при 100 x g и ресуспендировать в MMG до концентрации ~ 10 000 протопластов / мкл.
- Смешайте ~ 1 000 000 протопластов с 15 мкг ДНК в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Долейте смесь ММГ до 114,4 мкл и выдерживайте на льду в течение 30 мин.
- Ресуспендируйте протопласты, постукивая по боковой части трубки. Добавьте 105,6 мкл 25% раствора ПЭГ к протопластам, чтобы достичь конечного веса/объема 12% ПЭГ. Аккуратно перемешайте, перевернув 5-10 раз. Протопласты в растворе ПЭГ хрупкие; Не встряхивайте тюбик. Выдерживать 10 мин в темноте при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфекция может быть увеличена в объемах, кратных объемам, указанным в шагах 4.2 и 4.3. Например, 10 миллионов протопластов и 150 мкг ДНК можно суспендировать в 1,444 мкл ММГ и обрабатывать 1,056 мкл раствором ПЭГ в центрифужной пробирке объемом 50 мл. - Разбавить 5 объемами инкубационного раствора. Аккуратно перемешайте путем инверсии. Отжимайте в течение 4 минут при 100 x g при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: При увеличении масштаба разделите протопласты на несколько стеклянных трубок с круглым дном, содержащих не более 10 мл каждая, чтобы обеспечить полное гранулирование. Пропорционально увеличьте объем инкубационного раствора, используемого для промывки. - Удаляют надосадочную жидкость пипеткой. Вымойте 1-5 мл инкубационного раствора и отжимайте в течение 3 мин при 100 x g при комнатной температуре.
- Ресуспендировать протопласты в инкубационном растворе до концентрации 500-1000 клеток/мкл.
- Инкубируйте протопласты в темноте в течение ночи (~16 ч) при комнатной температуре.
5. Восстановление протопласта и проверка экспрессии
- Отжимайте протопласты в течение 4 мин при 100 x g при комнатной температуре. ПРИМЕЧАНИЕ: При увеличении масштаба разделите протопласты на несколько стеклянных пробирок с круглым дном, содержащих не более 10 мл каждая.
- Вымойте 1-5 мл инкубационного раствора и отжимайте в течение 3 мин при 100 x g при комнатной температуре.
- Ресуспендировать и смешать в 1-5 мл инкубационного раствора.
- Если протопласты трансфицируются флуоресцентным репортерным геном (например, GFP), возьмите аликвоту, чтобы проверить эффективность трансфекции. С помощью гемоцитометра сначала подсчитайте общее количество протопластов с помощью светлопольной световой микроскопии. Затем подсчитайте долю флуоресцентных протопластов под воздействием ультрафиолета.
- Центрифугируйте протопласты в течение 3 мин при 100 х г при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протопласты теперь готовы для последующих применений, таких как экстракция РНК фенолом и изотиоцианатом гуанидина.
Representative Results
Ткань, лучше всего подходящая для выделения протопласта, — это второй и третий листы 10-11-дневной сеянцы (рис. 1). В этой работе мы получили примерно 10 миллионов протопластов из 16 листовых срезов, каждый из которых имел длину 10 см. Количество выделенных протопластов зависит от массы листового материала и ширины листовых срезов, которые перевариваются в растворе фермента.
Под светлопольным световым микроскопом неповрежденные протопласты выглядят примерно сферическими, с пластидами, испещренными поверхностью (рис. 2А). Прежде чем приступить к трансфекции, жизнеспособность можно проверить, окрашивая небольшую аликвоту протопластов флуоресцеиндиацетатом (FDA). Окрашенные FDA протопласты, которые флуоресцируют под ультрафиолетовым светом, считаются жизнеспособными (рис. 2B, C). Не все протопласты, которые кажутся неповрежденными, все еще жизнеспособны, а некоторые жизнеспособные протопласты могут умирать в результате эвакуации (рис. 2C). В этих клетках вакуоль набухает и в конечном итоге выбрасывается из клеточной мембраны.
На рисунке 3 показаны протопласты, трансформированные с помощью pJT01, плазмиды экспрессии кукурузы размером 4,3 кб, полученной из CD3-911 (ABRC)15. Трансфекция приводит к экспрессии sGFP, помеченного сигналом ядерной локализации C-концевого ядра от c-Myc (рис. 3A). Долю протопластов, экспрессирующих sGFP, измеряли в ходе нескольких экспериментов с использованием гемоцитометра. Медиана эффективности трансфекции, достигнутая этим методом, составила 40% после ночной инкубации (n = 9, рисунок 4, таблица 1), что сопоставимо с ранее опубликованными методами15. В зависимости от экспериментального применения, если в плазмиде или плазмидной библиотеке отсутствует флуоресцентный репортер, рекомендуется включить положительный контроль для подтверждения трансфекции.
Рисунок 1: Репрезентативные этиолированные саженцы кукурузы, выращенные в темноте в течение 10 дней после появления всходов. Стрелками обозначены второй и третий листы, которые лучше всего подходят для протопластирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Флуоресцентная микроскопия жизнеспособности протопластов после выделения. (A) Светлопольное изображение протопластов сразу после выделения. (B) Сигнал флуоресценции протопластов, окрашенных FDA. (C) Перекрытие светлого поля и флуоресценции, показывающее жизнеспособные протопласты. Стрелка показывает протопласт, подвергающийся эвакуации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Флуоресцентная микроскопия протопластов, трансфицированных sGFP . (A) Светлопольное изображение протопластов после трансфекции. (B) Сигнал флуоресценции трансфицированных протопластов в канале GFP. (C) Перекрытие светлого поля и флуоресценции, показывающее трансформированные протопласты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Процент протопластов, демонстрирующих флуоресценцию GFP после 16 ч инкубации. Эффективность трансфекции варьировала в разных независимых исследованиях, при этом самая низкая эффективность составляла около 20%, а самая высокая - около 50%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Испытание | Подсчет клеток GFP | Общее количество подсчитанных ячеек | Процент GFP |
| 1 | 104 | 261 | 39.8 |
| 2 | 148 | 298 | 49.5 |
| 3 | 84 | 258 | 32.6 |
| 4 | 137 | 271 | 50.6 |
| 5 | 127 | 299 | 42.5 |
| 6 | 107 | 235 | 45.5 |
| 7 | 83 | 360 | 23.1 |
| 8 | 134 | 549 | 24.4 |
| 9 | 61 | 201 | 30.3 |
| Значить | 109 | 304 | 36 |
| Стандартное отклонение | 29 | 102 | 10 |
Таблица 1: Репрезентативная эффективность трансфекции протопласта. Данные девяти недавних исследований протопластинга в лаборатории авторов.
Дополнительный файл 1: текстовый файл в формате GenBank с последовательностью pJT01. Плазмида экспрессии sGFP размером 4,3 кб служит положительным контролем в трансфицированных протопластах кукурузы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Как сообщалось ранее, качество растительного материала, используемого для протопласта, имеет важное значение для получения высококачественных протопластов16,17,18. Очень важно отбирать здоровые незапятнанные листья. В этой работе использовался популярный исследовательский сорт кукурузы B73. Мы не тестировали другие сорта. Проростки кукурузы, использованные для этого протокола, были выращены в темноте, потому что этиолированные листья производят протопласты с большей жизнеспособностью через 16 часов после трансфекции по сравнению с протопластами из зеленых листьев. Для применений, которые не требуют ночной инкубации, можно использовать зеленый или зеленеющий листовой материал.
Важным этапом является правильная нарезка листового материала тонкими ломтиками перед ферментативным перевариванием. Этот процесс увеличивает площадь поверхности клеток мезофилла, подвергающихся воздействию раствора фермента, что увеличивает количество восстановленных протопластов. Дистальные кончики листьев отбрасывают, а тонкие (≤1 мм) ломтики нарезают новыми бритвенными лезвиями, которые сразу же вынимаются, когда начинают тупиться. Для данного количества ткани более тонкие ломтики дают больше протопластов при условии, что используется правильная техника, чтобы свести к минимуму раздавливание листьев.
Правильная промывка протопластов также важна, так как они довольно деликатны после удаления клеточной стенки. После переваривания все растворы выдерживают на льду, а темные протопласты защищают от света. Осмолярность и рН буферизуются путем промывки в растворе MMG. Чтобы выделить протопласты из менее плотного клеточного мусора, центрифугирование проводят при 100 x g. Протопласты, центрифугированные при 200 x g , демонстрируют аналогичную жизнеспособность после выделения, но более низкую жизнеспособность на следующий день, и они также трансформируются примерно вдвое. Мы рекомендуем проверять жизнеспособность протопластов путем окрашивания FDA (флуоресцеин диацетат) сразу после выделения; Нормальная жизнеспособность колеблется в пределах 70-90%. Протопласты с жизнеспособностью менее 40% после выделения дают мало трансформаторов.
Гранулирование и промывка облегчаются при работе со многими протопластами, потому что после трансфекции получается хорошо видимая гранула. По этой причине трансфекцию проводят с 1 миллионом и более протопластов. При расширении протокола следует выбрать сосуд соответствующего размера для этапов инкубации (центрифужная пробирка объемом 1,5 мл, 15 мл или 50 мл), а объем раствора, используемый для этапов промывки, должен быть соответствующим образом увеличен. В любом случае, полезно центрифугировать аликвоты объемом ≤10 мл, чтобы гарантировать, что протопласты не останутся в надосадочной жидкости. Одним из нововведений этого протокола является удаление 1-часовой стадии инкубации и промывки в растворе W5, которая указана в других протоколах14,19, которая оказалась ненужной в наших руках.
Как видно из других исследований, количество и качество ДНК имеют решающее значение для успешной трансфекции19. Для плазмид в диапазоне 4-6 кб используется 15 мкг ДНК на 1 млн протопластов. Некачественные препараты ДНК могут привести к снижению жизнеспособности после трансфекции, поэтому мы рекомендуем использовать коммерческий набор для выделения ДНК при выделении плазмид из бактерий. Инкубация протопластов в течение ночи проводится при комнатной температуре в темноте, чтобы обеспечить транскрипцию плазмиды или библиотеки плазмид при минимизации стресса. После ночной инкубации восстанавливается примерно половина первоначально трансфицированных протопластов. Протопласты разбавляют до концентрации 500-1000 клеток/мкл для ночной инкубации. Протопласты, оставленные для инкубации на ночь в концентрациях выше 1000 клеток/мкл, имеют более низкую скорость восстановления и меньшую жизнеспособность. При более высоких концентрациях обломки поврежденных и мертвых протопластов могут способствовать гибели соседних протопластов. Промывание протопластов после ночной инкубации служит как для удаления этого мусора, так и для удаления излишков плазмиды.
Такие протоколы имеют ограничение, заключающееся в том, что не все виды растений или типы тканей поддаются протопластированию. Кроме того, различия в экспрессии генов могут быть вызваны протопластическим процессом.
Таким образом, мы подробно описали простой и масштабируемый протокол для выделения и трансфекции миллионов жизнеспособных протопластов из основной сельскохозяйственной культуры Z. mays. Этот метод может трансфицировать гораздо больше протопластов с использованием ПЭГ с эффективностью трансформации, почти такой же высокой, как и методы, основанные на электропорации15. Большее суммарное количество трансформаторов позволяет тестировать сотни или тысячи конструкций в крупномасштабных экспериментах, таких как массивно-параллельные репортерные анализы12,13. Будущие эксперименты на уровне генома кукурузы позволят ученым лучше понять экспрессию генов кукурузы и регуляцию генов.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным научно-исследовательским институтом генома человека, междисциплинарным обучением в области геномных наук (грант на обучение T32 No HG000035 для J.T.) и Национальным институтом здравоохранения (NIGMS 1R35GM139532 для C.Q.), а также Национальным научным фондом (RESEARCH-PGR IOS-1748843 и PlantSynBio 2240888 в CQ). Мы благодарим Андреа Галловатти из Университета Рутгерса за подарок семян кукурузы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL graduated microcentrifuge tubes | VWR | 490004-444 | |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tube | Corning | 05-527-90 | |
| 250 mL Pyrex glass beaker | Fisher | 50-121-5005 | |
| 40 um nylon mesh cell strainer | Fisher | 22363547 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 14-432-22 | |
| 72 cell propagation tray | T.O. Plastics | 725607C | |
| Aluminum foil | VWR | 89107-732 | |
| Bell jar | Bel-Art | F42022-0000 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-250ML | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2*2H2O) | PhytoTech Labs | C135 | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Cellulase Onozuka R-10 | Duchefa Biochemie | C8001.0010 | |
| D-Mannitol | PhytoTech Labs | M562 | |
| Dissecting scope | Reichert | Microstar IV | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermofischer Scientific | F1303 | Dissolve in acetone at 0.5% weight/volume to make a 1000X stock solution. Protect from light and store at -20 °C. |
| Fluorescence Illumination Systems | Prior | Lumen200 | |
| Fluorescence microscope | Leica | MDG36 | |
| High-capacity centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Macerozyme | Duchefa Biochemie | M8002.0005 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M292-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Maize seeds | B73 | USDA-ARS | https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473 |
| Medium binder clip | Uline | S-24649 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M5287-250G | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Adjust pH to 5.7 using KOH. Protect from light and store at room temperature. |
| Micropipette 20-200 uL | Gilson | F123601G | |
| Nanodrop microvolume spectrophotometer | Thermofischer Scientific | ND-1000 | |
| NEB 5-alpha competent E. coli | New England BioLabs | C2987H | |
| Neubauer hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| No. 9 Single-edge razor blade | Excel | 20009 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-104 | |
| Poly(ethylene) glycol 4,000 | Sigma-Aldrich | 81240-1KG | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Professional Grade Vermiculite | NK Lawn & Garden | G208 | |
| Round-bottom glass centrifuge tube 30 mL | Kimble Chase | 45500-30 | |
| Rubber adapter for Corex centrifuge tubes | Corning | CLS8445AO | |
| Sphagnum peat moss | Premier Horticulture | 0128P | |
| TRIzol Reagent | Thermofischer Scientific | 15596018 | |
| Tygon vacuum tubing | VWR | 76336-844 | |
| Vacuum gauge | Wika | 4269978 |
References
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: A useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Wang, S., Tiwari, S. B., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. AUXIN RESPONSE FACTOR7 restores the expression of auxin-responsive genes in mutant Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts. The Plant Cell. 17 (7), 1979-1993 (2005).
- Hirner, A., et al. Arabidopsis LHT1 is a high-affinity transporter for cellular amino acid uptake in both root epidermis and leaf mesophyll. The Plant Cell. 18 (8), 1931-1946 (2006).
- Hwang, I., Sheen, J. Two-component circuitry in Arabidopsis cytokinin signal transduction. Nature. 413 (6854), 383-389 (2001).
- Tan, M. -L. M. C., Rietveld, E. M., van Marrewijk, G. A. M., Kool, A. J. Regeneration of leaf mesophyll protoplasts of tomato cultivars (L. esculentum): Factors important for efficient protoplast culture and plant regeneration. Plant Cell Reports. 6 (3), 172-175 (1987).
- Brandt, K. M., Gunn, H., Moretti, N., Zemetra, R. S. A streamlined protocol for wheat (Triticum aestivum) protoplast isolation and transformation with CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes. Frontiers in Plant Science. 11, 769 (2020).
- Nadakuduti, S. S., et al. Evaluation of methods to assess in vivo activity of engineered genome-editing nucleases in protoplasts. Frontiers in Plant Science. 10, 110 (2019).
- OECD, Food and Agriculture Organization of the United Nations.
- Gallois, P., Marinho, P. Leaf disk transformation using Agrobacterium tumefaciens-expression of heterologous genes in tobacco. Plant Gene Transfer and Expression Protocols. 49, 39-48 (1995).
- Schäffner, A. R., Sheen, J. Maize rbcS promoter activity depends on sequence elements not found in dicot rbcS promoters. The Plant Cell. 3 (9), 997-1012 (1991).
- Sheen, J. Molecular mechanisms underlying the differential expression of maize pyruvate, orthophosphate dikinase genes. The Plant Cell. 3 (3), 225-245 (1991).
- Jores, T., et al. Identification of plant enhancers and their constituent elements by STARR-seq in tobacco leaves. The Plant Cell. 32 (7), 2120-2131 (2020).
- Jores, T., et al. Synthetic promoter designs enabled by a comprehensive analysis of plant core promoters. Nature Plants. 7 (6), 842-855 (2021).
- Ricci, W. A., et al. Widespread long-range cis-regulatory elements in the maize genome. Nature Plants. 5 (12), 1237-1249 (2019).
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiology. 127 (4), 1466-1475 (2001).
- Jeon, J. M., et al. Efficient transient expression and transformation of PEG-mediated gene uptake into mesophyll protoplasts of pepper (Capsicum annuum L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 88 (2), 225-232 (2007).
- Pindel, A. Optimization of isolation conditions of Cymbidium protoplasts. Folia Horticulturae. 19, 79-88 (2007).
- Ren, R., et al. Highly efficient leaf base protoplast isolation and transient expression systems for orchids and other important monocot crops. Frontiers in Plant Science. 12, 626015 (2021).
- Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nature Protocols. 2 (7), 1565-1572 (2007).
