Summary
Här presenterar vi ett protokoll med hög kapacitet för att transfektera miljontals majsprotoplaster för att testa stora bibliotek av plasmider i majsmesofyllceller.
Abstract
Transfektionen av majsmesofyllceller involverar ofta att smälta växtcellväggarna för att skapa protoplaster och sedan infoga DNA via elektroporering eller polyetylenglykol (PEG). Tidigare metoder utvecklades för att producera tiotusentals transfekterade protoplaster samtidigt. Här beskriver vi en enkel metod för att isolera och transfektera miljontals bladmesofyllprotoplaster i majs (Zea mays L.). Denna strömlinjeformade process tar bort vissa vanliga protoplastningssteg, såsom tvätt i W5. Dessutom har steg som centrifugering, PEG-medierad transfektion och inkubation modifierats för att fungera med ett större antal protoplaster. Förmågan att uttrycka stora bibliotek av plasmidkonstruktioner möjliggör experiment på genomskala, såsom massivt parallella reporteranalyser i majs.
Introduction
Övergående genuttryck är ett kraftfullt verktyg inom växtbiologin. Växtceller är dock svåra att transfektera eftersom de är omgivna av en cellvägg. Denna barriär för DNA-inträde finns inte i andra vanligt studerade celltyper såsom däggdjurs- eller insektsceller. Tidigare forskning tog upp denna utmaning genom att använda protoplaster: växtceller vars cellväggar har smälts och tagits bort. Till skillnad från obearbetad bladvävnad är växtprotoplaster lätta att arbeta med i suspension och mottagliga för transfektionstekniker medierade genom elektroporering eller polyetylenglykol (PEG)1. Växtceller behåller mycket av sin funktionalitet även efter borttagning av cellväggen. Således används protoplaster i en mängd olika växter för att studera gen- och proteinfunktion2,3, för att förstå signaltransduktion4 och för att identifiera möjliga mål för växtförädling5. Protoplaster är också ett bekvämt fordon för screening av genomredigeringskonstruktioner i olika grödor, inklusive vete och potatis 6,7. Kort sagt är övergående analyser i protoplaster oumbärliga för bioteknik inom jordbruket.
Majs (Zea mays L.) är den världsledande spannmålsgrödan mätt i tonnage. Som sådan är det ett viktigt fokus för grundläggande och tillämpad växtvetenskaplig forskning8. Till skillnad från modellväxter som Nicotiana tabacum9 utförs dock inte transogent uttryck i intakta majsblad rutinmässigt. Protoplaster har använts för att erhålla och transfektera mesofyllceller av majsblad10,11. Tidigare metoder har uppnått transfektionseffektivitet upp till 75% med hjälp av elektroporering och producerat transfekterade protoplaster i skala tiotusentals10,15.
Detta protokoll beskriver hur man protoplastar miljontals majsmesofyllceller och transfekterar dem med en effektivitet som är jämförbar med tidigare metoder. De viktigaste stegen är att odla etiolerade majsplantor, skörda bladvävnaden, smälta växtcellväggen och leverera plasmid-DNA in i cellerna med PEG. Det viktigaste bidraget från detta protokoll är förmågan att skala upp protoplasttransfektion samtidigt som den cellviabilitet som krävs för funktionella analyser bibehålls. Detta möjliggör användning av experiment på genomskala, såsom massivt parallella reporteranalyser, som kan testa funktionen hos hundratusentals regioner i hela majsgenomet. Denna metod har nyligen använts för att undersöka stora bibliotek av cis-regulatoriska DNA-element inklusive förstärkare och promotorer12,13,14.
Protocol
1. Växtmaterialets tillväxt
- Skölj majskärnorna två gånger med kranvatten. Blötlägg kärnorna i kranvatten över natten vid rumstemperatur.
- Nästa dag fyller du ett 72-cells fröstartbricka med fuktad 1: 1 vermikulit: torvmossa. Skölj kärnorna en gång och plantera dem med lock nedåt, en kärna per cell.
- Odla under långa dagsförhållanden (16 h ljus, 8 h mörk) vid 25 °C i 3 dagar.
- Överför till konstant mörker vid 25 °C och låt verka i 9–11 dagar.
2. Plasmidisolering
- Omvandla kommersiellt kemiskt kompetent E. coli med plasmiderna av intresse enligt tillverkarens instruktioner.
- Odla den transformerade E. coli i 50 ml flytande LB-medium med lämpliga antibiotika över natten vid 37 °C med skakning.
- Pellet E. coli genom centrifugering i 10 minuter vid 3 000 x g vid rumstemperatur. Extrahera plasmiderna med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt midiprep plasmid-DNA-isoleringskit.
- Uppskatta plasmid-DNA-koncentrationen med hjälp av en mikrovolymspektrofotometer.
OBS: Material som är lämpligt för transfektion bör ha en koncentration på ≥800 ng/μL och en A260/A280 på ≥1,8.
3. Protoplast isolering
- Förbered 20 ml enzymlösning.
- Tillsätt 2,18 g mannitol, 0,30 g cellulas R-10 och 0,06 g macerozyme R-10 till ett 50 ml centrifugrör. Invertera för att blanda pulvret. Tillsätt avjoniseradH2Otill 15 ml. Tillsätt 200 μL 1 M MES, pH 5,7. Vortex att blanda.
- Värm lösningen vid 55 °C i 10 minuter. Kyl i rumstemperatur i 10 min.
- Tillsätt 20 μl 1 M CaCl2,0,02 g bovint serumalbumin och 100 μl 1 M β-merkaptoetanol.
- Fyll till 20 ml med avjoniseradH2O. Häll i en folieförpackad 250 ml bägare.
- Ta majsplantorna ur mörkret. Skär dem några centimeter över jorden med ett nytt rakblad. Placera de skurna ändarna i vatten. Förvara dem i mörker vid rumstemperatur när de inte används.
- Välj det andra och tredje bladet av varje planta, var noga med att utesluta löv med bruna eller skadade områden. Välj 12-16 löv. Skär ~ 1 cm av spetsen på varje blad och kassera. Skär sedan en 10 cm sektion från varje blad.
OBS: Om mer vävnad behövs, använd ytterligare 20 ml volym enzymlösning i ytterligare 250 ml bägare. För mycket bladmaterial i en given mängd enzymlösning kan minska livskraften. - Stapla bladsektionerna ovanpå varandra med de basala ändarna ihop. Kläm ihop bunten i batänden med en bindemedelsklämma. Lägg bunten av löv på ett vitt papper.
- Ta tag i bladen ~ 1 cm från den distala änden. Skär bladen från den distala änden vinkelrätt mot venerna i tunna (0,5-1 mm) skivor med ett nytt rakblad. Undvik att hugga rakt ner, utan gör hellre korta, framåtriktade skivor genom vävnaden.
- Byt rakblad när synliga rester börjar deponeras på papperet. Synliga rester indikerar mashing av vävnaden på grund av ett tråkigt blad eller dålig teknik.
- Efter att ha klippt ~ 2 cm av längden på bladbunten, överför omedelbart skivorna till bägaren av enzymlösning. Låt inte materialet torka ut, eftersom detta minskar antalet erhållna protoplaster. Snurra försiktigt enzymlösningen för att blöta materialet.
- Placera ett folielock över bägaren för att blockera ljuset. Upprepa skivnings- och överföringsprocessen tills hela bunten har klippts nära bindemedelsklämman.
- Överför bägaren med enzymlösning till en klockburk. Vakuuminfiltrera mellan −50,8 kPa och −67,7 kPa i förhållande till omgivningstrycket i 3 minuter vid rumstemperatur.
- Överför bägaren till en bordsskakare. Skaka vid 40 varv / min i 2,5 timmar vid rumstemperatur. Snurra försiktigt bägaren för hand. När den är fullständigt smält kommer enzymlösningen att vara något mjölkaktig. Om lösningen fortfarande är klar, fortsätt skaka vid 40 varv/min i upp till en timme till. Överstiga inte 3,5 h.
- Under matsmältningen, gör en mannitol + MES + MgCl2 (MMG) lösning, en polyetylenglykol (PEG) lösning och en inkubationslösning.
- MMG: Tillsätt 5,47 g mannitol, 200 μL 1 M MES, pH 5,7 och 750 μL 1 MMgCl2 till ett 50 ml centrifugrör. Fyll till 50 ml med destilleradH2O. Vortex för att lösa upp. Lägg på is.
- Inkubationslösning: Tillsätt 5,47 g mannitol, 200 μl 1 M MES vid pH 5,7 och 200 μl 1 M KCl till ett 50 ml centrifugrör. Fyll till 50 ml med destilleradH2O. Vortex för att lösa upp. Lägg på is.
- PEG-lösning: Tillsätt 0,44 g mannitol, 1,0 g PEG och 400 μL 1 MCaCl2 till ett 15 ml centrifugrör. Fyll till 4 ml med destilleradH2O. Vortex för att blanda. Inkubera vid 37 °C under skakning i 30 minuter tills den är helt upplöst. Förvaras i rumstemperatur.
- Skaka enzymlösningen vid 80 varv/min i 10 min vid rumstemperatur.
- Placera bägaren med enzymlösningen på is. Ta inte bort foliebeläggningen. Tillsätt 20 ml iskall MMG till enzymlösningen. Filtrera genom en 40 μm cellsil till ett 50 ml centrifugrör.
OBS: Håll alla lösningar på is i följande steg tills PEG läggs till. Håll protoplasterna täckta med folie för att minimera ljusexponeringen. - Dela filtratet i lika stora volymer om 10 ml vardera. Häll varje volym i ett glascentrifugrör med rund botten och snurra ner i 4 minuter vid 100 x g vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten och tillsätt 1 ml iskall MMG till varje rör. Återsuspendera pelletsen genom att försiktigt virvla och knacka på rören. Kombinera proverna till ett enda rundbottnat glascentrifugrör. Lägg till MMG till en total volym på 5 ml. Snurra ner i 3 minuter vid 100 x g vid rumstemperatur.
- Tvätta med 5 ml MMG och snurra ner i 3 minuter vid 100 x g vid rumstemperatur.
- Upprepa tvätten med 5 ml MMG och snurra ner i 3 minuter vid 100 x g vid rumstemperatur. Efter att ha snurrat ner den andra tvätten, observera om supernatanten är klar. Om det förblir grumligt, utför en tredje tvätt.
- Resuspendera protoplasterna i 1 ml MMG. Täck löst med folie och håll isen.
- Bestäm protoplastutbytet och kontrollera livskraften.
- Tillsätt 4 μl protoplaster och 72 μL MMG i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- I ett 1,5 ml mikrocentrifugrör tillsätts 1 μL 0,5% fluoresceindiacetat (FDA) stamlösning till 49 μL MMG för att göra en 20x arbetslösning. Tillsätt 4 μL FDA-arbetslösning till röret med de utspädda protoplasterna. Inkubera i 5 minuter i mörker vid rumstemperatur.
- Fyll 11 μL av protoplastblandningen på en hemocytometer. Placera under ett ljusfältmikroskop. Bekräfta visuellt att cellerna saknar cellväggar. Räkna sedan antalet protoplaster. Använd detta antal för att uppskatta det totala antalet erhållna protoplaster. Räkna sedan antalet protoplaster som fluorescerar grönt under UV-ljus när de färgas med FDA. Framgångsrika protoplastisoleringar ger en livskraft på 70% -90%.
4. PEG-medierad transfektion
- Börja med den uppskattade protoplastkoncentrationen från steg 3.17, justera till ~ 10 000 protoplaster / μL. Om koncentrationen är låg, centrifugera i 3 minuter vid 100 x g och suspendera i MMG till en koncentration av ~10 000 protoplaster/μl.
- Blanda ~1 000 000 protoplaster med 15 μg DNA i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Fyll på blandningen med MMG till 114,4 μl och inkubera på is i 30 minuter.
- Återsuspendera protoplasterna genom att knacka på rörets sida. Tillsätt 105,6 μl 25 % PEG-lösning till protoplasterna för att uppnå en slutlig vikt/volym på 12 % PEG. Blanda försiktigt genom att invertera 5-10 gånger. Protoplaster i PEG-lösning är bräckliga; Skaka inte röret. Inkubera i 10 minuter i mörker vid rumstemperatur.
Anmärkning: Transfektionen kan skalas upp i multiplar av de volymer som anges i steg 4.2 och steg 4.3. Till exempel kan 10 miljoner protoplaster och 150 μg DNA suspenderas i 1 444 μL MMG och behandlas med 1 056 μL PEG-lösning i ett 50 ml centrifugrör. - Späd med 5 volymer inkubationslösning. Blanda försiktigt genom inversion. Snurra ner i 4 minuter vid 100 x g vid rumstemperatur.
OBS: Om uppskalning, dela upp protoplasterna i flera rundbottnade glasrör som innehåller högst 10 ml vardera för att säkerställa fullständig pelletering. Skala proportionellt upp inkubationslösningsvolymen som används för tvättning. - Ta bort supernatanten genom pipettering. Tvätta med 1-5 ml inkubationslösning och snurra ner i 3 minuter vid 100 x g vid rumstemperatur.
- Resuspendera protoplasterna i inkubationslösningen till en koncentration av 500–1 000 celler/μl.
- Inkubera protoplasterna i mörker över natten (~16 timmar) vid rumstemperatur.
5. Protoplaståterställning och verifiering av uttryck
- Snurra ner protoplasterna i 4 minuter vid 100 x g vid rumstemperatur. OBS: Om du skalar upp, dela protoplasterna i flera runda bottenglasrör som innehåller högst 10 ml vardera.
- Tvätta med 1-5 ml inkubationslösning och snurra ner i 3 minuter vid 100 x g vid rumstemperatur.
- Resuspendera och kombinera i 1-5 ml inkubationslösning.
- Om protoplasterna transfekteras med en fluorescerande reportergen (t.ex. GFP), ta en alikvot för att kontrollera transfektionseffektiviteten. Med hjälp av en hemocytometer räknar du först det totala antalet protoplaster med hjälp av ljusfältsljusmikroskopi. Räkna sedan fraktionen av fluorescerande protoplaster under UV-ljus.
- Centrifugera protoplasterna i 3 min vid 100 x g vid rumstemperatur.
Protoplasterna är nu redo för nedströmsapplikationer såsom RNA-extraktion med fenol och guanidinisotiocyanat.
Representative Results
Den vävnad som är bäst lämpad för protoplastisolering är det andra och tredje bladet av 10-11 dagar gamla plantor (figur 1). I detta arbete fick vi cirka 10 miljoner protoplaster från 16 bladsektioner, som var och en var 10 cm lång. Antalet isolerade protoplaster beror på bladmaterialets massa och bredden på bladskivorna som smälts i enzymlösningen.
Under ett ljusfältsljusmikroskop verkar oskadade protoplaster ungefär sfäriska, med plastider som prickar ytan (figur 2A). Innan transfektion påbörjas kan viabiliteten kontrolleras genom färgning av en liten alikvot protoplaster med fluoresceindiacetat (FDA). FDA-färgade protoplaster som fluorescerar under UV-ljus anses vara livskraftiga (figur 2B, C). Inte alla protoplaster som verkar oskadade är fortfarande livskraftiga, och vissa livskraftiga protoplaster kan vara i färd med att dö genom evakuolering (figur 2C). I dessa celler sväller vakuolen och kommer så småningom att matas ut från cellmembranet.
Figur 3 visar protoplaster transformerade med pJT01, en 4,3 kb plasmid för majsuttryck härledd från CD3-911 (ABRC)15. Transfektion resulterar i uttrycket av sGFP märkt med en C-terminal nukleär lokaliseringssignal från c-Myc (figur 3A). Andelen sGFP-uttryckande protoplaster mättes över flera experiment med användning av en hemocytometer. Den mediantransfektionseffektivitet som uppnåddes med denna metod var 40 % efter inkubation över natten (n = 9, figur 4, tabell 1), vilket är jämförbart med tidigare publicerade metoder15. Beroende på experimentell tillämpning, om plasmid- eller plasmidbiblioteket saknar en fluorescerande reporter, rekommenderas det att inkludera en positiv kontroll för att bekräfta transfektion.
Figur 1: Representativ etiolerad majsplanta som odlas i mörker i 10 dagar efter groning. Pilarna indikerar det andra och tredje bladet, som passar bäst för protoplastering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Fluorescensmikroskopi av protoplastviabiliteten efter isolering. (A) Ljusfältsbild av protoplaster omedelbart efter isolering. (B) Fluorescenssignalen från FDA-färgade protoplaster. (C) Överlappning av ljusfält och fluorescens som visar de livsdugliga protoplasterna. Pilen visar en protoplast som genomgår evakuolering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Fluorescensmikroskopi av protoplaster transfekterade med sGFP . (A) Ljusfältsbild av protoplaster efter transfektion. b) Fluorescenssignalen från de transfekterade protoplasterna i GFP-kanalen. (C) Överlappning av ljusfält och fluorescens som visar de transformerade protoplasterna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Procentandel protoplaster som uppvisar GFP-fluorescens efter 16 timmars inkubation. Transfektionseffektiviteten varierade mellan oberoende prövningar, med den lägsta effektiviteten cirka 20% och den högsta nära 50%. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Rättegång | GFP-celler räknade | Totalt antal räknade celler | GFP procent |
| 1 | 104 | 261 | 39.8 |
| 2 | 148 | 298 | 49.5 |
| 3 | 84 | 258 | 32.6 |
| 4 | 137 | 271 | 50.6 |
| 5 | 127 | 299 | 42.5 |
| 6 | 107 | 235 | 45.5 |
| 7 | 83 | 360 | 23.1 |
| 8 | 134 | 549 | 24.4 |
| 9 | 61 | 201 | 30.3 |
| Betyda | 109 | 304 | 36 |
| Standardavvikelse | 29 | 102 | 10 |
Tabell 1: Representativ effektivitet vid transfektion av protoplaster. Data från nio nyligen genomförda protoplasting försök i författarnas laboratorium.
Tilläggsfil 1: GenBank-formaterad textfil med sekvensen pJT01. En 4,3 kb sGFP-uttrycksplasmid fungerar som en positiv kontroll i transfekterade majsprotoplaster. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Som tidigare rapporterats är kvaliteten på växtmaterial som används för protoplastering avgörande för att erhålla högkvalitativa protoplaster16,17,18. Det är viktigt att välja friska obefläckade löv. Detta arbete använde den populära forskningsmajssorten B73. Vi har inte testat andra sorter. Majsplantorna som används för detta protokoll odlades i mörker eftersom etiolerade blad producerar protoplaster med större livskraft 16 timmar efter transfektion jämfört med protoplaster från gröna blad. För applikationer som inte kräver inkubation över natten skulle det vara möjligt att använda grönt eller grönbladmaterial.
Ett kritiskt steg är att skära bladmaterialet ordentligt i tunna skivor före enzymatisk matsmältning. Denna process ökar ytan för mesofyllcellerna att exponeras för enzymlösningen, vilket ökar antalet återvunna protoplaster. De distala bladspetsarna kasseras och tunna (≤1 mm) skivor skärs med nya rakblad, som byts ut omedelbart när de börjar matta. För en given mängd vävnad ger tunnare skivor fler protoplaster förutsatt att rätt teknik används för att minimera krossningen av bladen.
Att tvätta protoplasterna korrekt är också viktigt, eftersom de är ganska känsliga efter att ha genomgått cellväggsborttagning. Efter matsmältningen hålls alla lösningar på is och de mörkvuxna protoplasterna skyddas mot ljus. Osmolariteten och pH buffras genom att tvätta i MMG-lösning. För att isolera protoplasterna från det mindre täta cellulära skräpet sker centrifugering vid 100 x g. Protoplaster centrifugerade vid 200 x g visar liknande livskraft efter isolering men lägre livskraft följande dag, och de omvandlar ungefär hälften så mycket. Vi rekommenderar att man kontrollerar protoplasternas livskraft genom färgning med FDA (fluoresceindiacetat) omedelbart efter isolering. Den normala lönsamheten varierar mellan 70% -90%. Protoplaster med en viabilitet lägre än 40 % efter isolering ger få transformanter.
Pelletering och tvättning är lättare när man arbetar med många protoplaster eftersom en tydligt synlig pellet erhålls efter transfektion. Av denna anledning utförs transfektion med 1 miljon eller fler protoplaster. Vid uppskalning av protokollet bör ett kärl av lämplig storlek väljas för inkubationsstegen (1,5 ml, 15 ml eller 50 ml centrifugrör) och volymen lösning som används för tvättstegen bör skalas i enlighet därmed. I vilket fall som helst är det fördelaktigt att centrifugera i ≤10 ml alikvoter för att säkerställa att protoplasterna inte förblir i supernatanten. En innovation i detta protokoll är avlägsnandet av 1 h inkubation och tvättsteg i W5-lösning som anges i andra protokoll14,19, vilket visade sig onödigt i våra händer.
Som framgår av andra studier är mängden och kvaliteten på DNA båda avgörande för framgångsrik transfektion19. För plasmider i intervallet 4-6 kb används 15 μg DNA per 1 miljon protoplaster. DNA-preparat av dålig kvalitet kan resultera i minskad livskraft efter transfektion, så vi rekommenderar att du använder ett kommersiellt DNA-extraktionskit när du isolerar plasmider från bakterier. Inkubation av protoplaster över natten görs vid rumstemperatur i mörkret för att möjliggöra transkription av plasmid- eller plasmidbiblioteket samtidigt som stressen minimeras. Efter inkubation över natten återvinns ungefär hälften av antalet ursprungligen transfekterade protoplaster. Protoplaster späds till en koncentration av 500-1 000 celler/μl för inkubation över natten. Protoplaster som lämnas att inkuberas över natten i koncentrationer högre än 1 000 celler/μl har lägre återvinningsgrad och lägre livskraft. Vid högre koncentrationer kan skräp från skadade och döda protoplaster bidra till att närliggande protoplaster dör. Tvättning av protoplasterna efter inkubation över natten tjänar både till att avlägsna detta skräp och avlägsna överskottsplasmiden.
Protokoll som dessa har begränsningen att inte alla växtarter eller vävnadstyper är mottagliga för protoplastering. Dessutom kan skillnader i genuttryck induceras av protoplasteringsprocessen.
Sammanfattningsvis har vi detaljerat ett enkelt och skalbart protokoll för att isolera och transfektera miljontals livskraftiga protoplaster från stapeljordbruksgrödan Z. mays. Denna metod kan transfektera många fler protoplaster med PEG, med en transformationseffektivitet nästan lika hög som elektroporeringsbaserade metoder15. Det större nettoantalet transformanter möjliggör testning av hundratals eller tusentals konstruktioner i storskaliga experiment som massivt parallella reporteranalyser12,13. Framtida genomskaleexperiment i majs kommer att göra det möjligt för forskare att bättre förstå majsgenuttryck och genreglering.
Disclosures
Författarna förklarar inte några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Human Genome Research Institute Interdisciplinary Training in Genomic Sciences (T32 utbildningsbidrag nr. HG000035 till JT) och National Institute of Health (NIGMS 1R35GM139532 till C.Q.) och av National Science Foundation (RESEARCH-PGR IOS-1748843 och PlantSynBio 2240888 till CQ). Vi tackar Andrea Gallovatti vid Rutgers University för gåvan av majsfrön.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL graduated microcentrifuge tubes | VWR | 490004-444 | |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tube | Corning | 05-527-90 | |
| 250 mL Pyrex glass beaker | Fisher | 50-121-5005 | |
| 40 um nylon mesh cell strainer | Fisher | 22363547 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 14-432-22 | |
| 72 cell propagation tray | T.O. Plastics | 725607C | |
| Aluminum foil | VWR | 89107-732 | |
| Bell jar | Bel-Art | F42022-0000 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-250ML | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2*2H2O) | PhytoTech Labs | C135 | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Cellulase Onozuka R-10 | Duchefa Biochemie | C8001.0010 | |
| D-Mannitol | PhytoTech Labs | M562 | |
| Dissecting scope | Reichert | Microstar IV | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermofischer Scientific | F1303 | Dissolve in acetone at 0.5% weight/volume to make a 1000X stock solution. Protect from light and store at -20 °C. |
| Fluorescence Illumination Systems | Prior | Lumen200 | |
| Fluorescence microscope | Leica | MDG36 | |
| High-capacity centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Macerozyme | Duchefa Biochemie | M8002.0005 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M292-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Maize seeds | B73 | USDA-ARS | https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473 |
| Medium binder clip | Uline | S-24649 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M5287-250G | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Adjust pH to 5.7 using KOH. Protect from light and store at room temperature. |
| Micropipette 20-200 uL | Gilson | F123601G | |
| Nanodrop microvolume spectrophotometer | Thermofischer Scientific | ND-1000 | |
| NEB 5-alpha competent E. coli | New England BioLabs | C2987H | |
| Neubauer hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| No. 9 Single-edge razor blade | Excel | 20009 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-104 | |
| Poly(ethylene) glycol 4,000 | Sigma-Aldrich | 81240-1KG | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Professional Grade Vermiculite | NK Lawn & Garden | G208 | |
| Round-bottom glass centrifuge tube 30 mL | Kimble Chase | 45500-30 | |
| Rubber adapter for Corex centrifuge tubes | Corning | CLS8445AO | |
| Sphagnum peat moss | Premier Horticulture | 0128P | |
| TRIzol Reagent | Thermofischer Scientific | 15596018 | |
| Tygon vacuum tubing | VWR | 76336-844 | |
| Vacuum gauge | Wika | 4269978 |
References
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: A useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Wang, S., Tiwari, S. B., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. AUXIN RESPONSE FACTOR7 restores the expression of auxin-responsive genes in mutant Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts. The Plant Cell. 17 (7), 1979-1993 (2005).
- Hirner, A., et al. Arabidopsis LHT1 is a high-affinity transporter for cellular amino acid uptake in both root epidermis and leaf mesophyll. The Plant Cell. 18 (8), 1931-1946 (2006).
- Hwang, I., Sheen, J. Two-component circuitry in Arabidopsis cytokinin signal transduction. Nature. 413 (6854), 383-389 (2001).
- Tan, M. -L. M. C., Rietveld, E. M., van Marrewijk, G. A. M., Kool, A. J. Regeneration of leaf mesophyll protoplasts of tomato cultivars (L. esculentum): Factors important for efficient protoplast culture and plant regeneration. Plant Cell Reports. 6 (3), 172-175 (1987).
- Brandt, K. M., Gunn, H., Moretti, N., Zemetra, R. S. A streamlined protocol for wheat (Triticum aestivum) protoplast isolation and transformation with CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes. Frontiers in Plant Science. 11, 769 (2020).
- Nadakuduti, S. S., et al. Evaluation of methods to assess in vivo activity of engineered genome-editing nucleases in protoplasts. Frontiers in Plant Science. 10, 110 (2019).
- OECD, Food and Agriculture Organization of the United Nations.
- Gallois, P., Marinho, P. Leaf disk transformation using Agrobacterium tumefaciens-expression of heterologous genes in tobacco. Plant Gene Transfer and Expression Protocols. 49, 39-48 (1995).
- Schäffner, A. R., Sheen, J. Maize rbcS promoter activity depends on sequence elements not found in dicot rbcS promoters. The Plant Cell. 3 (9), 997-1012 (1991).
- Sheen, J. Molecular mechanisms underlying the differential expression of maize pyruvate, orthophosphate dikinase genes. The Plant Cell. 3 (3), 225-245 (1991).
- Jores, T., et al. Identification of plant enhancers and their constituent elements by STARR-seq in tobacco leaves. The Plant Cell. 32 (7), 2120-2131 (2020).
- Jores, T., et al. Synthetic promoter designs enabled by a comprehensive analysis of plant core promoters. Nature Plants. 7 (6), 842-855 (2021).
- Ricci, W. A., et al. Widespread long-range cis-regulatory elements in the maize genome. Nature Plants. 5 (12), 1237-1249 (2019).
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiology. 127 (4), 1466-1475 (2001).
- Jeon, J. M., et al. Efficient transient expression and transformation of PEG-mediated gene uptake into mesophyll protoplasts of pepper (Capsicum annuum L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 88 (2), 225-232 (2007).
- Pindel, A. Optimization of isolation conditions of Cymbidium protoplasts. Folia Horticulturae. 19, 79-88 (2007).
- Ren, R., et al. Highly efficient leaf base protoplast isolation and transient expression systems for orchids and other important monocot crops. Frontiers in Plant Science. 12, 626015 (2021).
- Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nature Protocols. 2 (7), 1565-1572 (2007).
