Summary
Burada, mısır mezofil hücrelerinde büyük plazmid kütüphanelerini test etmek için milyonlarca mısır protoplastını geçici olarak transfekte etmek için yüksek verimli bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Mısır mezofil hücrelerinin transfeksiyonu genellikle protoplastlar oluşturmak için bitki hücre duvarlarının sindirilmesini ve daha sonra elektroporasyon veya polietilen glikol (PEG) yoluyla DNA'nın yerleştirilmesini içerir. Aynı anda on binlerce transfekte protoplast üretmek için önceki yöntemler geliştirilmiştir. Burada, mısırdaki milyonlarca yaprak mezofil protoplastını izole etmek ve transfekte etmek için basit bir yöntem açıklıyoruz (Zea mays L.). Bu kolaylaştırılmış işlem, W5'te yıkama gibi bazı yaygın protopkalıcı adımları ortadan kaldırır. Ek olarak, santrifüjleme, PEG aracılı transfeksiyon ve inkübasyon gibi adımlar, daha fazla sayıda protoplastla çalışacak şekilde değiştirilmiştir. Plazmid yapılarının büyük kütüphanelerini ifade etme yeteneği, mısırdaki büyük paralel muhabir testleri gibi genom ölçeğinde deneyler yapılmasını sağlar.
Introduction
Geçici gen ekspresyonu, bitki biyolojisinde güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, bitki hücrelerinin transfekte edilmesi zordur, çünkü bir hücre duvarı ile çevrilidirler. DNA girişindeki bu engel, memeli veya böcek hücreleri gibi yaygın olarak çalışılan diğer hücre tiplerinde mevcut değildir. Geçmiş araştırmalar, protoplastları kullanarak bu zorluğu ele aldı: hücre duvarları sindirilmiş ve çıkarılmış bitki hücreleri. İşlenmemiş yaprak dokusunun aksine, bitki protoplastlarının süspansiyonda çalışması kolaydır ve elektroporasyon veya polietilen glikolün (PEG) aracılık ettiği transfeksiyon tekniklerine uygundur1. Bitki hücreleri, hücre duvarının çıkarılmasından sonra bile işlevlerinin çoğunu korur. Bu nedenle, protoplastlar çeşitli bitkilerde gen ve protein fonksiyonunu incelemek2,3, sinyaliletimini anlamak 4 ve bitki ıslahı için olası hedefleri belirlemek için kullanılır5. Protoplastlar ayrıca buğday ve patates 6,7 dahil olmak üzere çeşitli mahsul türlerinde genom düzenleme yapılarını taramak için uygun bir araçtır. Kısacası, protoplastlardaki geçici tahliller tarımsal biyoteknoloji için vazgeçilmezdir.
Mısır (Zea mays L.), tonaja göre dünyanın önde gelen tahıl ürünüdür; Bu nedenle, temel ve uygulamalı bitki bilimi araştırmalarının ana odak noktasıdır8. Bununla birlikte, Nicotiana tabacum9 gibi model bitkilerin aksine, bozulmamış mısır yapraklarındaki geçici transgen ekspresyonu rutin olarak gerçekleştirilmez. Protoplasting mısır yaprağı mezofil hücrelerini elde etmek ve transfekte etmek için kullanılmıştır10,11. Önceki yöntemler, elektroporasyon kullanarak% 75'e varan transfeksiyon verimliliği elde etmiş ve on binlerce10,15 ölçeğinde transfekte protoplastlar üretmiştir.
Bu protokol, milyonlarca mısır mezofil hücresinin nasıl protoplast edileceğini ve önceki yöntemlerle karşılaştırılabilir bir verimlilikle nasıl transfekte edileceğini detaylandırır. Ana adımlar, etiyole mısır fidelerinin yetiştirilmesi, yaprak dokusunun toplanması, bitki hücre duvarının sindirilmesi ve PEG kullanılarak hücrelere plazmid DNA'sının verilmesidir. Bu protokolün temel katkısı, fonksiyonel tahliller için gerekli hücre canlılığını korurken protoplast transfeksiyonunu ölçeklendirme yeteneğidir. Bu, mısır genomu boyunca yüz binlerce bölgenin işlevini test edebilen kitlesel paralel muhabir testleri gibi genom ölçeğinde deneylerin kullanılmasını sağlar. Bu yöntem son zamanlarda, arttırıcılar ve destekleyiciler12,13,14 dahil olmak üzere cis-düzenleyici DNA elementlerinin büyük kütüphanelerini araştırmak için kullanılmıştır.
Protocol
1. Bitki materyalinin büyümesi
- Mısır çekirdeklerini musluk suyuyla iki kez durulayın. Çekirdekleri gece boyunca oda sıcaklığında musluk suyuna batırın.
- Ertesi gün, 72 hücreli bir tohum başlangıç tepsisini ıslatılmış 1: 1 vermikülit: turba yosunu ile doldurun. Çekirdekleri bir kez durulayın ve hücre başına bir çekirdek olacak şekilde uç kapağını aşağı doğru yerleştirin.
- 3 gün boyunca 25 ° C'de uzun gün koşullarında (16 saat ışık, 8 saat karanlık) büyütün.
- 25 ° C'de sabit karanlığa geçin ve 9-11 gün boyunca büyüyün.
2. Plazmid izolasyonu
- Ticari kimyasal olarak yetkin E. coli'yi , üreticinin talimatlarına göre ilgili plazmid (ler) ile dönüştürün.
- Dönüştürülmüş E. coli'yi 50 mL sıvı LB ortamında uygun antibiyotiklerle gece boyunca 37 ° C'de çalkalama ile büyütün.
- E. coli'yi oda sıcaklığında 3.000 x g'de 10 dakika santrifüj yaparak pelet yapın. Ticari olarak temin edilebilen bir midiprep plazmid DNA izolasyon kiti kullanarak plazmidleri ayıklayın.
- Bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak plazmid DNA konsantrasyonunu tahmin edin.
NOT: Transfeksiyona uygun malzeme ≥800 ng/μL konsantrasyonuna ve A260/A280 konsantrasyonu ≥1.8 olmalıdır.
3. Protoplast izolasyonu
- 20 mL enzim çözeltisi hazırlayın.
- 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 2.18 g mannitol, 0.30 g selülaz R-10 ve 0.06 g macerozyme R-10 ekleyin. Tozları karıştırmak için ters çevirin. DeiyonizeH2O ila 15 mL ekleyin. 200 μL 1 M MES, pH 5.7 ekleyin. Karıştırmak için vorteks.
- Çözeltiyi 55 ° C'de 10 dakika ısıtın. Oda sıcaklığında 10 dakika soğutun.
- 20 μL 1 M CaCl2, 0.02 g sığır serum albümini ve 100 μL 1 M β-merkaptoetanol ekleyin.
- Deiyonize H2O ile 20 mL'ye kadar doldurun Folyo sarılı 250 mL beher içine dökün.
- Mısır fidelerini karanlıktan çıkarın. Yeni bir tıraş bıçağı kullanarak onları toprağın birkaç santimetre yukarısında kesin. Kesilen uçları suya yerleştirin. Kullanmadığınız zamanlarda oda sıcaklığında karanlıkta saklayın.
- Her fidenin ikinci ve üçüncü yapraklarını seçin, kahverengi veya hasarlı alanlara sahip yaprakları dışlamaya özen gösterin. 12-16 yaprak seçin. Her yaprağın ucundan ~ 1 cm kesin ve atın. Ardından, her yapraktan 10 cm'lik bir bölüm kesin.
NOT: Daha fazla dokuya ihtiyaç duyulursa, ilave 250 mL'lik bir beherde ilave 20 mL hacimli enzim çözeltisi kullanın. Belirli miktarda enzim çözeltisindeki çok fazla yaprak materyali canlılığı azaltabilir. - Yaprak bölümlerini bazal uçları birlikte olacak şekilde üst üste istifleyin. Bir bağlayıcı klips kullanarak demeti bazal uçta birbirine kenetleyin. Yaprak demetini bir parça beyaz kağıda yerleştirin.
- Yaprakları distal uçtan ~ 1 cm tutun. Yeni bir tıraş bıçağı kullanarak, yaprakları damarlara dik olan distal uçtan ince (0,5-1 mm) dilimler halinde kesin. Düz bir şekilde doğramaktan kaçının, bunun yerine doku boyunca kısa, ileri dilimler yapın.
- Kağıda görünür kalıntı birikmeye başladığında tıraş bıçağını değiştirin. Görünür kalıntı, donuk bir bıçak veya zayıf bir teknik nedeniyle dokunun ezildiğini gösterir.
- Yaprak demetinin uzunluğunun ~ 2 cm'sini kestikten sonra, dilimleri derhal enzim çözeltisinin kabına aktarın. Malzemenin kurumasına izin vermeyin, çünkü bu elde edilen protoplast sayısını azaltacaktır. Malzemeyi ıslatmak için enzim çözeltisini yavaşça döndürün.
- Işığı engellemek için beherin üzerine bir folyo kapağı yerleştirin. Tüm demet bağlayıcı klipse yakın kesilene kadar dilimleme ve aktarma işlemini tekrarlayın.
- Enzim çözeltisinin kabını bir çan kavanozuna aktarın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca ortam basıncına göre -50,8 kPa ile -67,7 kPa arasında vakum sızması.
- Beher'i bir masa üstü çalkalayıcıya aktarın. Oda sıcaklığında 40 RPM'de 2,5 saat çalkalayın. Beheri elle yavaşça döndürün. Tamamen sindirildiğinde, enzim çözeltisi hafif sütlü görünecektir. Çözüm hala açıksa, 40 RPM'de bir saate kadar sallamaya devam edin. 3,5 saati aşmayın.
- Sindirim sırasında, bir mannitol + MES + MgCl2 (MMG) çözeltisi, bir polietilen glikol (PEG) çözeltisi ve bir inkübasyon çözeltisi yapın.
- MMG: 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 5.47 g mannitol, 200 μL 1 M MES, pH 5.7 ve 750 μL 1 M MgCl2 ekleyin. Çözünmesi için damıtılmışH2O. Vorteks ile 50 mL'ye kadar doldurun. Buzun üzerine yerleştirin.
- Kuluçka çözeltisi: 5.47 g mannitol, pH 5.7'de 200 μL 1 M MES ve 50 mL santrifüj tüpüne 200 μL 1 M KCl ekleyin. Çözünmesi için damıtılmışH2O. Vorteks ile 50 mL'ye kadar doldurun. Buzun üzerine yerleştirin.
- PEG çözeltisi: 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 0,44 g mannitol, 1,0 g PEG ve 400 μL 1 M CaCl2 ekleyin. Karıştırmak için damıtılmışH2O. Vorteks ile 4 mL'ye kadar doldurun. Tamamen eriyene kadar 30 dakika çalkalayarak 37 ° C'de inkübe edin. Oda sıcaklığında muhafaza ediniz.
- Enzim çözeltisini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 80 RPM'de çalkalayın.
- Beheri enzim çözeltisi ile buz üzerine yerleştirin. Folyo kaplamayı çıkarmayın. Enzim çözeltisine 20 mL buz gibi soğuk MMG ekleyin. 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne filtreleyin.
NOT: PEG eklenene kadar aşağıdaki adımlar için tüm çözeltileri buz üzerinde tutun. Işığa maruz kalmayı en aza indirmek için protoplastları folyo ile kaplı tutun. - Filtratı her biri 10 mL'lik eşit hacimlere bölün. Her hacmi yuvarlak tabanlı bir cam santrifüj tüpüne dökün ve oda sıcaklığında 100 x g'de 4 dakika aşağı çevirin.
- Süpernatantı atın ve her tüpe 1 mL buz gibi soğuk MMG ekleyin. Peletleri hafifçe döndürerek ve tüplere dokunarak tekrar askıya alın. Numuneleri tek bir yuvarlak tabanlı cam santrifüj tüpünde birleştirin. MMG'yi toplam 5 mL hacme ekleyin. Oda sıcaklığında 100 x g'de 3 dakika aşağı çevirin.
- 5 mL MMG ile yıkayın ve oda sıcaklığında 100 x g'de 3 dakika aşağı çevirin.
- Yıkamayı 5 mL MMG ile tekrarlayın ve oda sıcaklığında 100 x g'de 3 dakika aşağı çevirin. İkinci yıkamayı döndürdükten sonra, süpernatantın açık olup olmadığını gözlemleyin. Hava bulutlu kalırsa, üçüncü bir yıkama yapın.
- Protoplastları 1 mL MMG'de tekrar askıya alın. Folyo ile gevşek bir şekilde örtün ve buz üzerinde tutun.
- Protoplast verimini belirleyin ve canlılığı kontrol edin.
- 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 4 μL protoplast ve 72 μL MMG'yi bir araya getirin.
- 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 20x çalışma çözeltisi oluşturmak için 49 μL MMG'ye 1 μL% 0,5 floresein diasetat (FDA) stok çözeltisi ekleyin. Seyreltilmiş protoplastlarla tüpe 4 μL FDA çalışma çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında karanlıkta 5 dakika inkübe edin.
- Protoplast karışımının 11 μL'sini bir hemositometreye yükleyin. Parlak alan ışık mikroskobunun altına yerleştirin. Hücrelerin hücre duvarlarından yoksun olduğunu görsel olarak doğrulayın. Ardından, protoplastların sayısını sayın. Elde edilen toplam protoplast sayısını tahmin etmek için bu sayıyı kullanın. Ardından, FDA ile boyandığında UV ışığı altında yeşil floresan protoplastların sayısını sayın. Başarılı protoplast izolasyonları% 70 -% 90'lık bir canlılık sağlar.
4. PEG aracılı transfeksiyon
- Adım 3.17'den itibaren tahmini protoplast konsantrasyonundan başlayarak, ~ 10.000 protoplast / μL'ye ayarlayın. Konsantrasyon düşükse, 100 x g'de 3 dakika santrifüj yapın ve MMG'de ~ 10.000 protoplast / μL'lik bir konsantrasyona geri askıya alın.
- ~ 1.000.000 protoplastı 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 15 μg DNA ile karıştırın. Karışımı MMG ile 114.4 μL'ye kadar doldurun ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- Tüpün yan tarafına dokunarak protoplastları yeniden askıya alın. %12 PEG nihai ağırlığa/hacme ulaşmak için protoplastlara 105.6 μL% 25 PEG çözeltisi ekleyin. 5-10 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın. PEG çözeltisindeki protoplastlar kırılgandır; tüpü sallamayın. Oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin.
NOT: Transfeksiyon, adım 4.2 ve adım 4.3'te verilen birimlerin katları halinde ölçeklendirilebilir. Örneğin, 10 milyon protoplast ve 150 μg DNA, 1.444 μL MMG içinde askıya alınabilir ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 1.056 μL PEG çözeltisi ile muamele edilebilir. - 5 hacim inkübasyon çözeltisi ile seyreltin. Ters çevirerek yavaşça karıştırın. Oda sıcaklığında 100 x g'de 4 dakika aşağı çevirin.
NOT: Ölçeği artırıyorsanız, tam peletleme sağlamak için protoplastları her biri 10 mL'den fazla olmayan birden fazla yuvarlak tabanlı cam tüpe bölün. Yıkama için kullanılan inkübasyon çözeltisi hacmini orantılı olarak artırın. - Süpernatantı pipetleme ile çıkarın. 1-5 mL inkübasyon çözeltisi ile yıkayın ve oda sıcaklığında 100 x g'de 3 dakika aşağı çevirin.
- Protoplastları inkübasyon çözeltisinde 500-1.000 hücre / μL'lik bir konsantrasyona yeniden askıya alın.
- Protoplastları karanlıkta gece boyunca (~ 16 saat) oda sıcaklığında inkübe edin.
5. Protoplast kurtarma ve ifade doğrulama
- Protoplastları oda sıcaklığında 100 x g'de 4 dakika boyunca döndürün. NOT: Ölçeği artırıyorsanız, protoplastları her biri 10 mL'den fazla olmayan çoklu yuvarlak tabanlı cam tüplere bölün.
- 1-5 mL inkübasyon çözeltisi ile yıkayın ve oda sıcaklığında 100 x g'de 3 dakika aşağı çevirin.
- Askıya alın ve 1-5 mL inkübasyon çözeltisinde birleştirin.
- Protoplastlar bir floresan muhabir geni (örneğin, GFP) ile transfekte edilirse, transfeksiyon verimliliğini kontrol etmek için bir aliquot alın. Bir hemositometre kullanarak, önce parlak alan ışık mikroskobu kullanarak toplam protoplast sayısını sayın. Ardından, UV ışığı altında floresan protoplastların fraksiyonunu sayın.
- Protoplastları oda sıcaklığında 100 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj edin.
NOT: Protoplastlar artık fenol ve guanidin izotiyosiyanat ile RNA ekstraksiyonu gibi aşağı akış uygulamaları için hazırdır.
Representative Results
Protoplast izolasyonu için en uygun doku, 10-11 günlük fidelerin ikinci ve üçüncü yapraklarıdır (Şekil 1). Bu çalışmada her biri 10 cm uzunluğunda olan 16 yaprak bölümünden yaklaşık 10 milyon protoplast elde ettik. İzole edilen protoplastların sayısı, yaprak malzemesinin kütlesine ve enzim çözeltisinde sindirilen yaprak dilimlerinin genişliğine bağlıdır.
Parlak alan ışık mikroskobu altında, hasarsız protoplastlar kabaca küresel görünür ve plastitler yüzeyi lekelemektedir (Şekil 2A). Transfeksiyona geçmeden önce, canlılık, floresein diasetat (FDA) ile küçük bir protoplast alikotu boyanarak kontrol edilebilir. UV ışığı altında floresan yapan FDA boyalı protoplastlar uygulanabilir kabul edilir (Şekil 2B, C). Hasarsız görünen tüm protoplastlar hala canlı değildir ve bazı canlı protoplastlar tahliye ile ölme sürecinde olabilir (Şekil 2C). Bu hücrelerde, vakuol şişer ve sonunda hücre zarından dışarı atılır.
Şekil 3, CD3-911 (ABRC)15'ten türetilen 4.3 kb'lik bir mısır ekspresyon plazmidi olan pJT01 ile dönüştürülen protoplastları göstermektedir. Transfeksiyon, c-Myc'den bir C-terminali nükleer lokalizasyon sinyali ile etiketlenmiş sGFP'nin ekspresyonu ile sonuçlanır (Şekil 3A). GFP eksprese eden protoplastların oranı, bir hemositometre kullanılarak çoklu deneylerle ölçüldü. Bu yöntemle elde edilen medyan transfeksiyon etkinliği, gece inkübasyonundan sonra% 40 idi (n = 9, Şekil 4, Tablo 1), bu da daha önce yayınlanmış yöntemlerle karşılaştırılabilir15. Deneysel uygulamaya bağlı olarak, plazmid veya plazmid kütüphanesinde floresan bir muhabir yoksa, transfeksiyonu doğrulamak için pozitif bir kontrol eklenmesi önerilir.
Şekil 1: Çimlenmeden sonra 10 gün boyunca karanlıkta yetişen temsili etiolasyonlu mısır fidesi. Oklar, prototipleme için en uygun olan ikinci ve üçüncü yaprakları gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: İzolasyondan sonra protoplast canlılığının floresan mikroskopisi. (A) İzolasyondan hemen sonra protoplastların parlak alan görüntüsü. (B) FDA boyalı protoplastların floresan sinyali. (C) Uygulanabilir protoplastları gösteren parlak alan ve floresan örtüşmesi. Ok, tahliye edilen bir protoplastı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: sGFP ile transfekte edilen protoplastların floresan mikroskopisi. (A) Transfeksiyon sonrası protoplastların parlak alan görüntüsü. (B) GFP kanalındaki transfekte protoplastların floresan sinyali. (C) Dönüştürülmüş protoplastları gösteren parlak alan ve floresan örtüşmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 16 saatlik inkübasyondan sonra GFP floresansı gösteren protoplastların yüzdesi. Transfeksiyon etkinliği bağımsız çalışmalar arasında değişmekte olup, en düşük verim %20 civarında ve en yüksek verim %50'ye yakındır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Deneme | GFP hücreleri sayıldı | Sayılan toplam hücre sayısı | GFP yüzdesi |
| 1 | 104 | 261 | 39.8 |
| 2 | 148 | 298 | 49.5 |
| 3 | 84 | 258 | 32.6 |
| 4 | 137 | 271 | 50.6 |
| 5 | 127 | 299 | 42.5 |
| 6 | 107 | 235 | 45.5 |
| 7 | 83 | 360 | 23.1 |
| 8 | 134 | 549 | 24.4 |
| 9 | 61 | 201 | 30.3 |
| Demek | 109 | 304 | 36 |
| Standart sapma | 29 | 102 | 10 |
Tablo 1: Temsili protoplast transfeksiyon verimliliği. Yazarların laboratuvarındaki dokuz yeni protoplasting denemeden elde edilen veriler.
Ek Dosya 1: pJT01 dizisine sahip GenBank biçimli metin dosyası. 4.3 kb sGFP ekspresyon plazmid, transfekte mısır protoplastlarında pozitif bir kontrol görevi görür. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Daha önce bildirildiği gibi, protoplasting için kullanılan bitki materyalinin kalitesi, yüksek kaliteli protoplastlar elde etmek için esastır16,17,18. Sağlıklı lekesiz yaprakları seçmek çok önemlidir. Bu çalışmada popüler araştırma mısır çeşidi B73 kullanılmıştır. Diğer çeşitleri test etmedik. Bu protokol için kullanılan mısır fideleri karanlıkta yetiştirildi, çünkü etiollenmiş yapraklar, yeşil yapraklardan elde edilen protoplastlara kıyasla, transfeksiyondan 16 saat sonra daha fazla canlılığa sahip protoplastlar üretiyordu. Gece boyunca inkübasyon gerektirmeyen uygulamalar için, yeşil veya yeşillendirici yaprak malzemesi kullanmak mümkün olacaktır.
Kritik bir adım, enzimatik sindirimden önce yaprak malzemesini ince dilimler halinde düzgün bir şekilde kesmektir. Bu işlem, mezofil hücrelerinin enzim çözeltisine maruz kalması için yüzey alanını arttırır, bu da geri kazanılan protoplastların sayısını arttırır. Distal yaprak uçları atılır ve ince (≤1 mm) dilimler, donuklaşmaya başladıklarında hemen değiştirilen yeni tıraş bıçaklarıyla kesilir. Belirli bir doku miktarı için, daha ince dilimler, yaprakların ezilmesini en aza indirmek için doğru tekniğin kullanılması koşuluyla daha fazla protoplast verir.
Protoplastların doğru bir şekilde yıkanması da önemlidir, çünkü hücre duvarı çıkarıldıktan sonra oldukça hassastırlar. Sindirimden sonra, tüm çözeltiler buz üzerinde tutulur ve karanlık büyümüş protoplastlar ışıktan korunur. Ozmolarite ve pH, MMG çözeltisinde yıkamalar yapılarak tamponlanır. Protoplastları daha az yoğun hücresel enkazdan izole etmek için, santrifüjleme 100 x g'de gerçekleşir. 200 x g'de santrifüjlenen protoplastlar, izolasyondan sonra benzer canlılık gösterir, ancak ertesi gün daha düşük canlılık gösterir ve yaklaşık yarısı da dönüşürler. İzolasyondan hemen sonra FDA (floresein diasetat) ile boyanarak protoplastların canlılığını kontrol etmenizi öneririz; Normal canlılık% 70 -% 90 arasında değişmektedir. İzolasyondan sonra canlılığı% 40'tan düşük olan protoplastlar az sayıda dönüştürücü verir.
Peletleme ve yıkama, birçok protoplastla çalışırken daha kolaydır, çünkü transfeksiyondan sonra açıkça görülebilen bir pelet elde edilir. Bu nedenle transfeksiyon 1 milyon veya daha fazla protoplast ile yapılır. Protokolü ölçeklendirirken, inkübasyon adımları için uygun büyüklükte bir kap seçilmeli (1,5 mL, 15 mL veya 50 mL santrifüj tüpü) ve yıkama adımları için kullanılan çözelti hacmi buna göre ölçeklendirilmelidir. Her durumda, protoplastların süpernatanda kalmamasını sağlamak için ≤10 mL alikotlarda santrifüj yapmak faydalıdır. Bu protokolün bir yeniliği, diğer protokollerde listelenen W5 çözeltisindeki 1 saatlik inkübasyon ve yıkama adımının kaldırılmasıdır14,19, bu da elimizde gereksiz olduğunu kanıtladı.
Diğer çalışmalarda görüldüğü gibi, DNA'nın miktarı ve kalitesi başarılı transfeksiyon için kritik öneme sahiptir19. 4-6 kb aralığındaki plazmidler için, 1 milyon protoplast başına 15 μg DNA kullanılır. Düşük kaliteli DNA preparatları, transfeksiyondan sonra canlılığın azalmasına neden olabilir, bu nedenle plazmidleri bakterilerden izole ederken ticari bir DNA ekstraksiyon kiti kullanmanızı öneririz. Protoplastların gece boyunca inkübe edilmesi, stresi en aza indirirken plazmid veya plazmid kütüphanesinin transkripsiyonuna izin vermek için karanlıkta oda sıcaklığında yapılır. Gece inkübasyonundan sonra, orijinal olarak transfekte edilmiş protoplastların sayısının yaklaşık yarısı geri kazanılır. Protoplastlar, gece boyunca inkübasyon için 500-1.000 hücre / μL'lik bir konsantrasyona seyreltilir. 1.000 hücre / μL'den daha yüksek konsantrasyonlarda gece boyunca inkübe edilmek üzere bırakılan protoplastlar daha düşük geri kazanım oranlarına ve daha düşük canlılığa sahiptir. Daha yüksek konsantrasyonlarda, hasarlı ve ölü protoplastlardan gelen döküntüler, komşu protoplastların ölümüne katkıda bulunabilir. Protoplastların gece inkübasyonundan sonra yıkanması, hem bu kalıntıları gidermek hem de fazla plazmidi çıkarmak için kullanılır.
Bunlar gibi protokoller, tüm bitki türlerinin veya doku tiplerinin protoplasting için uygun olmadığı sınırlamasına sahiptir. Ayrıca, gen ekspresyon farklılıkları protoplasting süreç tarafından indüklenebilir.
Özetle, milyonlarca canlı protoplastı temel tarımsal ürün Z. mays'tan izole etmek ve transfekte etmek için basit ve ölçeklenebilir bir protokol hazırladık. Bu yöntem, PEG kullanarak çok daha fazla protoplastı transfekte edebilir ve neredeyse elektroporasyon tabanlı yöntemler kadar yüksek bir dönüşüm verimliliğine sahiptir15. Daha fazla net dönüştürücü sayısı, yüzlerce veya binlerce yapının büyük ölçekli deneylerde test edilmesini sağlar, örneğin büyük paralel muhabir tahlilleri12,13. Mısırda gelecekteki genom ölçekli deneyler, bilim adamlarının mısır gen ekspresyonunu ve gen düzenlemesini daha iyi anlamalarını sağlayacaktır.
Disclosures
Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü Genomik Bilimlerde Disiplinlerarası Eğitim (T32 eğitim hibesi no. HG000035 to J.T.) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIGMS 1R35GM139532 to C.Q.) ve National Science Foundation (RESEARCH-PGR IOS-1748843 ve PlantSynBio 2240888 to CQ) tarafından desteklenmiştir. Mısır tohumlarının hediyesi için Rutgers Üniversitesi'nden Andrea Gallovatti'ye teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL graduated microcentrifuge tubes | VWR | 490004-444 | |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tube | Corning | 05-527-90 | |
| 250 mL Pyrex glass beaker | Fisher | 50-121-5005 | |
| 40 um nylon mesh cell strainer | Fisher | 22363547 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 14-432-22 | |
| 72 cell propagation tray | T.O. Plastics | 725607C | |
| Aluminum foil | VWR | 89107-732 | |
| Bell jar | Bel-Art | F42022-0000 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-250ML | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2*2H2O) | PhytoTech Labs | C135 | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Cellulase Onozuka R-10 | Duchefa Biochemie | C8001.0010 | |
| D-Mannitol | PhytoTech Labs | M562 | |
| Dissecting scope | Reichert | Microstar IV | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermofischer Scientific | F1303 | Dissolve in acetone at 0.5% weight/volume to make a 1000X stock solution. Protect from light and store at -20 °C. |
| Fluorescence Illumination Systems | Prior | Lumen200 | |
| Fluorescence microscope | Leica | MDG36 | |
| High-capacity centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Macerozyme | Duchefa Biochemie | M8002.0005 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M292-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Maize seeds | B73 | USDA-ARS | https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473 |
| Medium binder clip | Uline | S-24649 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M5287-250G | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Adjust pH to 5.7 using KOH. Protect from light and store at room temperature. |
| Micropipette 20-200 uL | Gilson | F123601G | |
| Nanodrop microvolume spectrophotometer | Thermofischer Scientific | ND-1000 | |
| NEB 5-alpha competent E. coli | New England BioLabs | C2987H | |
| Neubauer hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| No. 9 Single-edge razor blade | Excel | 20009 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-104 | |
| Poly(ethylene) glycol 4,000 | Sigma-Aldrich | 81240-1KG | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Professional Grade Vermiculite | NK Lawn & Garden | G208 | |
| Round-bottom glass centrifuge tube 30 mL | Kimble Chase | 45500-30 | |
| Rubber adapter for Corex centrifuge tubes | Corning | CLS8445AO | |
| Sphagnum peat moss | Premier Horticulture | 0128P | |
| TRIzol Reagent | Thermofischer Scientific | 15596018 | |
| Tygon vacuum tubing | VWR | 76336-844 | |
| Vacuum gauge | Wika | 4269978 |
References
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: A useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Wang, S., Tiwari, S. B., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. AUXIN RESPONSE FACTOR7 restores the expression of auxin-responsive genes in mutant Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts. The Plant Cell. 17 (7), 1979-1993 (2005).
- Hirner, A., et al. Arabidopsis LHT1 is a high-affinity transporter for cellular amino acid uptake in both root epidermis and leaf mesophyll. The Plant Cell. 18 (8), 1931-1946 (2006).
- Hwang, I., Sheen, J. Two-component circuitry in Arabidopsis cytokinin signal transduction. Nature. 413 (6854), 383-389 (2001).
- Tan, M. -L. M. C., Rietveld, E. M., van Marrewijk, G. A. M., Kool, A. J. Regeneration of leaf mesophyll protoplasts of tomato cultivars (L. esculentum): Factors important for efficient protoplast culture and plant regeneration. Plant Cell Reports. 6 (3), 172-175 (1987).
- Brandt, K. M., Gunn, H., Moretti, N., Zemetra, R. S. A streamlined protocol for wheat (Triticum aestivum) protoplast isolation and transformation with CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes. Frontiers in Plant Science. 11, 769 (2020).
- Nadakuduti, S. S., et al. Evaluation of methods to assess in vivo activity of engineered genome-editing nucleases in protoplasts. Frontiers in Plant Science. 10, 110 (2019).
- OECD, Food and Agriculture Organization of the United Nations.
- Gallois, P., Marinho, P. Leaf disk transformation using Agrobacterium tumefaciens-expression of heterologous genes in tobacco. Plant Gene Transfer and Expression Protocols. 49, 39-48 (1995).
- Schäffner, A. R., Sheen, J. Maize rbcS promoter activity depends on sequence elements not found in dicot rbcS promoters. The Plant Cell. 3 (9), 997-1012 (1991).
- Sheen, J. Molecular mechanisms underlying the differential expression of maize pyruvate, orthophosphate dikinase genes. The Plant Cell. 3 (3), 225-245 (1991).
- Jores, T., et al. Identification of plant enhancers and their constituent elements by STARR-seq in tobacco leaves. The Plant Cell. 32 (7), 2120-2131 (2020).
- Jores, T., et al. Synthetic promoter designs enabled by a comprehensive analysis of plant core promoters. Nature Plants. 7 (6), 842-855 (2021).
- Ricci, W. A., et al. Widespread long-range cis-regulatory elements in the maize genome. Nature Plants. 5 (12), 1237-1249 (2019).
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiology. 127 (4), 1466-1475 (2001).
- Jeon, J. M., et al. Efficient transient expression and transformation of PEG-mediated gene uptake into mesophyll protoplasts of pepper (Capsicum annuum L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 88 (2), 225-232 (2007).
- Pindel, A. Optimization of isolation conditions of Cymbidium protoplasts. Folia Horticulturae. 19, 79-88 (2007).
- Ren, R., et al. Highly efficient leaf base protoplast isolation and transient expression systems for orchids and other important monocot crops. Frontiers in Plant Science. 12, 626015 (2021).
- Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nature Protocols. 2 (7), 1565-1572 (2007).
