Summary
疟疾是通过受感染的蚊子接种 疟原虫 的子孢子阶段传播的。转基因 疟原虫 使我们能够更好地了解疟疾的生物学，并直接促进了疟疾疫苗的开发工作。在这里，我们描述了一种生成转基因 伯氏疟 原虫孢子体的简化方法。
Abstract
疟疾是一种由寄生虫疟原虫引起的致命疾病，通过雌性按蚊叮咬传播。蚊子沉积在脊椎动物宿主皮肤中的疟原虫孢子阶段在开始临床疟疾之前在肝脏中经历了一个强制性发育阶段。我们对肝脏中疟原虫发育的生物学知之甚少;进入孢子阶段和对这种孢子进行基因改造的能力是研究疟原虫感染性质和肝脏中由此产生的免疫反应的关键工具。在这里，我们提出了用于产生转基因伯氏疟原虫孢子体的综合方案。我们对血液阶段的伯氏疟原虫进行基因改造，并在按蚊吸血时使用这种形式感染按蚊。转基因寄生虫在蚊子中发育后，我们从蚊子唾液腺中分离出寄生虫的孢子阶段，进行体内和体外实验。我们通过生成表达绿色荧光蛋白 （GFP） 亚基 11 （GFP11） 的新型伯氏疟原虫菌株的孢子来证明该协议的有效性，并展示了如何将其用于研究肝期疟疾的生物学。
Introduction
尽管在药物开发和疟疾预防和治疗研究方面取得了进展，但疟疾的全球疾病负担仍然很高。每年有五十多万人死于疟疾，其中生活在疟疾流行地区（如撒哈拉以南非洲）的儿童死亡率最高1。疟疾是由寄生虫疟原虫引起的，疟原虫通过唾液腺中携带寄生虫的雌性按蚊叮咬传播给人类。疟原虫的感染阶段 - 子孢子 - 在血粉中沉积在脊椎动物宿主的皮肤中，并通过血液感染肝细胞，在感染红细胞之前，它们会经历强制性发育（构成红细胞前期疟疾）。红细胞感染启动了疟疾的血液阶段，并导致了与该疾病相关的全部发病率和死亡率 2,3。
疟原虫红细胞前发育的专性使其成为预防性疫苗和药物开发工作的有吸引力的靶标4.研究红细胞性疟疾前期的生物学以及开发针对肝脏阶段的疫苗或药物的先决条件是获得疟原虫孢子体。此外，我们产生转基因疟原虫孢子体的能力对此类研究工作的成功起到了重要作用5,6,7,8,9。表达荧光或发光报告蛋白的转基因疟原虫系使我们能够跟踪它们在体内和体外的发育 10,11。通过疟原虫中多个基因的缺失而产生的遗传减毒寄生虫 （GAP） 也是一些最有希望的候选疫苗12,13。
啮齿动物和非人类灵长类疟疾模型有助于我们了解人类疟疾中宿主-寄生虫相互作用的机制，因为疟原虫物种在生物学和生命周期方面具有相似性14.使用感染啮齿动物但不感染人类的疟原虫物种（例如，伯氏疟原虫）可以维持完整的寄生虫生命周期并产生传染性子孢子体，以便在受控的生物安全 1 级环境中研究肝期疟疾。对于转基因血液阶段疟原虫寄生虫的产生 15、蚊子感染 16 和孢子体分离17，已经存在各种单独的方案。在这里，我们概述了一种结合这些方法的综合方案，以产生和分离转基因伯氏疟原虫子，以新型转基因菌株PbGFP11为例。PbGFP 11 将超文件夹绿色荧光蛋白 （GFP） 的第 11 β链 GFP11 转运到宿主肝细胞中产生的寄生虫液泡 （PV） 中。PbGFP 11 与转基因肝细胞（Hepa1-6 背景）结合使用，这些转基因肝细胞表达在细胞质（Hepa GFP 1-10 细胞）中构成 GFP 1-10 片段 （GFP 1-10） 的残基。PbGFP11 通过自我互补和功能性 GFP 的重建以及绿色荧光信号18 报道宿主肝细胞中的 PV 裂解。值得注意的是，GFP 11 在 PbGFP11 中被编码为一系列七个串联序列，以增强产生的荧光信号。用细胞质染料 CellTrace Violet （CTV） 对 PbGFP11 孢子体进行染色后，我们可以追踪寄生虫。这种CTV染色的细胞内寄生虫本身的裂解导致CTV泄漏到宿主细胞质中并对宿主细胞进行染色。除了可视化和区分宿主肝细胞中疟原虫PV和/或寄生虫的裂解外，该系统还可以可靠地用于研究负责这些过程的免疫途径，通过遗传或治疗扰动这些途径的分子成分。
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Protocol
我们实验室中所有涉及脊椎动物的研究均按照佐治亚大学的动物使用指南和协议进行。
1. 伯氏疟原虫 感染小鼠的产生
- 使用野生型 伯氏疟 原虫在雄性或雌性，6-8周龄的C57BL / 6（B6）小鼠中启动血液阶段感染。为此，将冷冻保存的 伯氏疟原虫感染的血液（2 x 105 感染的红细胞）在400μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中复溶到腹膜内（ip）中的一只或两只供体小鼠中。
- 在感染后5天（d.p.i.）将通过眶后出血从供体小鼠收集的新鲜血液转移到两只幼稚B6小鼠中。为此，收集 200 μL 血液，用 300 μL PBS 复溶，并将 200 μL ipp 注射到受体小鼠中。确保此时供体中的寄生虫血症为 2%-5%19,20。
- 如前所述监测寄生虫血症19,20，从接受者的 2 d.p.i. 开始。当寄生虫血症范围为3%-5%（约5 d.p.i.）时，对受体小鼠实施安乐死，然后通过心脏穿刺或眼眶后出血收集血液。使用吸入二氧化碳对小鼠实施安乐死，然后进行颈椎脱位，或根据机构指南。
注：一旦寄生虫血症超过5%，转染效率可能会降低，因为多重感染红细胞的患病率增加。
2. 文化中裂殖体的产生
- 在无菌环境中，将步骤1.3中受感染小鼠的血液（来自两只小鼠总共约2mL）收集到5mL的Alsever溶液（参见 材料表）中。在无菌条件下执行步骤2.1至3.12。
注意：无菌条件包括戴手套、用 70% 乙醇擦拭手套和表面、使用无菌消耗品和材料以及在生物安全柜内工作。 - 在室温（RT）下以450× g 离心血液8分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10mL完全RPMI培养基（RPMI 1640，含20%胎牛血清[FBS]和1%青霉素 - 链霉素，v / v）中。
- 在室温下以450× g 离心8分钟，将沉淀重悬于25mL完全RPMI培养基中，并转移到带有过滤盖的T75培养瓶中。
- 置于36.5°C和5%CO2的培养箱中，同时轻轻摇动以保持细胞悬浮16小时。
- 在 16 小时时间点，检查裂殖体的发展。为此，收集500μL样品，以450× g 离心8分钟，将沉淀重悬于10μL完全RPMI培养基中，并制备薄血涂片。用Giemsa染色剂19 染色血涂片（见 材料表）并确定分裂体的频率（图1）。
- 为了获得最佳转染效率，60%-70%的寄生虫应处于裂殖期。如果确定的阈值少于此阈值，则按照步骤2.4继续培养，并每小时检查一次，以确保在继续操作之前超过上述阈值。
3. 裂 殖疟原虫 的转染
- 通过在 50 mL 离心管中用 1.44 mL 的 1.5 M NaCl 和 5.6 mL 的 0.15 M NaCl 复溶 13 mL 密度梯度储备培养基（参见 材料表）来制备梯度离心缓冲液。
- 将 25 mL 血培养物转移到新鲜的 50 mL 离心管中。使用窄玻璃移液管小心地将 20 mL 梯度离心缓冲液分层到离心管底部，以创建梯度柱。注意不要干扰液层和界面，并确保缓冲液和介质之间的明确划分。
- 以450× g 离心20分钟，室温下无制动器。 使用巴斯德移液管，小心地除去位于培养基和梯度离心缓冲液界面处的裂殖层15 ，并将其置于新的50mL离心管中。
- 将分离的裂殖体重悬于完全RPMI培养基中，并将总体积增至40mL。在室温下以450× g 离心8分钟，弃去上清液。
- 将裂殖体重悬于10mL完全RPMI培养基中。然后，将 1 mL 该溶液转移到 1.5 mL 微量离心管中，每次转染，并以 16,000 x g 离心 5 秒以沉淀感染的红细胞。以上述方式来源于两只小鼠的感染红细胞可用于多达 10 次单独的转染。
- 在室温下将 100 μL 电穿孔缓冲液（电穿孔试剂盒中的核分子溶液;参见 材料表）与 5 μg 环状或线性化靶质粒 DNA（最大体积为 10 μL）混合，适用于每次转染，在单独的 1.5 mL 微量离心管中。必须包括“无质粒”样品作为转染和抗生素选择的对照。
- 从步骤3.5离心后除去上清液，并小心地将感染的红细胞重悬于制备的核分子溶液+质粒DNA（来自步骤3.6）中。
- 将悬浮液（核分子溶液+质粒+裂殖子;最大110μL）转移到电穿孔比色皿中。使用合适的核分子程序（U-033，参见材料表）进行转染。
注意： 确保在 RT 时执行步骤 3.8 至 3.10。 - 向比色皿中加入 100 μL 完全 RPMI 培养基，并将整个溶液（现在总体积为 200 μL）转移到 1.5 mL 微量离心管中并保持室温。
- 将转染寄生虫的200μL溶液静脉注射到小鼠体内（iv），以尽量减少转染和最终注射到小鼠之间的时间。
注：在电穿孔后不到5分钟将转染的裂殖体注射到小鼠中，以最大限度地提高方案的效率。
4. 转染寄生虫的选择
- 从2 d.p.i.开始每天检查接种转染裂殖分子的小鼠的寄生虫血症水平，以验证感染。
- 一旦确认感染，开始在饮用水中口服药物， 随意提供药物。
注：乙胺嘧啶被用作质粒的选择性药物标记物。在这种情况下，将 17.5 mg 乙胺嘧啶加入 250 mL 清水中（终浓度为 70 mg/L）。此外，在该水中加入10克糖，以鼓励小鼠充分摄入含乙胺嘧啶的水。 - 从乙胺嘧啶治疗开始后 6 天开始，每两天使用用 5 μl 血液制成的血涂片监测寄生虫血症。15 天后未检测到寄生虫表明转染失败;在这种情况下，请重新启动步骤 1.1 中的进程以进行新的尝试。
- 当寄生虫血症达到至少1%时，将寄生虫转移到幼稚的B6小鼠中，以产生血液阶段的寄生虫原液。在新感染的小鼠中继续选择，直到寄生虫血症达到2%-5%，此时产生储备液并冷冻保存它们21。
5. 转基因品系蚊子感染
- 用含有选定寄生虫的 200 μL 血液感染 B6 小鼠（2 x 105 个感染的红细胞/小鼠，静脉注射）。在蚊子喂养和感染当天确定这些小鼠的寄生虫血症。2%-5%之间的寄生虫血症是蚊子感染的最佳药物。一旦验证，立即根据步骤5.2-5.4将感染转移到雌性 按蚊 上。
注意：含有蚊子感染的培养箱应保持在20.5°C，80%湿度和12小时的光/暗循环（在上午07：00至下午07：00之间开灯）。 - 在蚊子感染的前一天，通过在装有雄性和雌性蚊子的笼子顶部放置热源来分离雌性蚊子，例如装满加热至37°C的水的薄塑料膀胱或手套。 使用昆虫吸气器清除被热源吸引的雌性蚊子，并将其转移到单独的较小笼子中以进行感染。
注意：雄性蚊子与雌性蚊子的区别在于它们的体型略小，触角呈羽状。 - 向受感染的小鼠注射全身麻醉剂（例如，2%三溴乙醇/阿维丁）。通过牢牢捏住每只鼠标的脚垫来确保完全麻醉。如果它们没有反应，它们就会充分镇静并准备好将感染转移到蚊子身上。
- 将麻醉的小鼠置于胸骨卧位下的笼子雌性蚊子（来自步骤5.2）的顶部。手动展开前腿和后腿，为蚊子喂食提供最大的表面积。将受感染的小鼠放在每个笼子上总共15分钟，每5分钟检查一次以确保小鼠没有醒来。喂食完成后，使用颈椎脱位或按照机构动物使用协议对小鼠实施安乐死，并安全处置它们。
6. 孢子体的收集
- 在大约 10 d.p.i. 时检查蚊子中肠是否有卵囊，以验证蚊子体内的成功感染和 疟原虫 的发展。使用镊子取出末端腹节，将蚊子中肠与腹部隔离开来。在偏振光下观察中肠是否存在卵囊22。
- 野生型孢子体预计在以受感染小鼠为食后 18-21 天存在于蚊子的唾液腺中。在第 18 天，解剖 5-10 只蚊子以评估子孢子数量。
注意：蚊子在乙醇中清洗和杀死。随后，在解剖前用PBS清洗死蚊子两次以去除碎屑。 - 为了分离和计数孢子体，小心地取出蚊子的头部，同时使用镊子或细解剖针对蚊子胸部施加压力。唾液腺仍然附着在移除的头部上（图2）。
- 从唾液腺中取出任何其他蚊子碎片，并置于含有400μL蚊子解剖培养基（含有1%小鼠血清，100U / mL青霉素和100μg/ mL链霉素的Dulbecco改良Ealge培养基[DMEM]）的微量离心管中;参见 材料表）。
- 通过30G针刺注射器15-20次来破坏分离的唾液腺。将 10 μL 被破坏的唾液腺放入蚊子解剖培养基中并计数。重悬于所需浓度的蚊子解剖培养基或PBS中，用于注射到小鼠体内，接种到细胞培养物中，或长期冷冻保存23,24。
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Representative Results
确定裂殖的频率和发育对于确保足够多的活寄生虫处于转染的最佳阶段至关重要。未成熟的裂殖子可以与完全成熟的裂殖子区分开来，因为裂殖子较少，这些裂殖子不会填充红细胞的整个细胞内空间（图1B）。需要注意的是，当从培养的血液中制作血涂片时，受感染的红细胞可能会破裂，导致在血涂片中观察到游离的细胞外裂殖子（图1）。这种裂殖子不计入步骤 2.5 中裂殖体频率的评估。
如果使用者不熟悉蚊子的生理学或小规模解剖，从蚊子身上切除唾液腺可能具有挑战性。在从蚊子中分离唾液腺的过程中，请注意腺体的半透明性可用于将它们与不透明的蚊子碎片区分开来（图2）。腺体破裂后孢子的计数在400倍放大倍率下最有效，并且使用相差可以更容易地识别计数室内的孢子。
我们已经表明，肝细胞中超过 90% 的疟原虫可能通过细胞内在免疫机制被消除23.因此，我们预计相当数量的肝细胞中的寄生虫会发生裂解。作为确定疟原虫或其PV在宿主肝细胞中裂解的工具，我们生成了表达GFP 1-10亚基（Hepa-GFP1-10）的转基因肝细胞和表达GFP 11亚基并将其转运到其PV（Pb-GFP 11）的转基因伯氏疟原虫。GFP 1-10片段含有构成GFP发色团的残基，其本身是非荧光的，只有在与GFP 11结合时才会发出荧光，可能是通过自互补。除了在功能上验证疟原虫的转基因外，在Pb-GFP 11感染的Hepa-GFP 1-10宿主细胞中产生绿色荧光信号表明PV裂解（图3）。野生型伯氏疟原虫感染的Hepa-GFP 1-10细胞或Pb-GFP11感染的野生型Hepa 1-6细胞未能产生任何绿色荧光信号（数据未显示）。我们认为PV的裂解是破坏肝脏阶段疟原虫的关键前一步。Pb-GFP11 孢子也用 CTV 染色以可视化肝细胞中的寄生虫。CTV预计仅在寄生虫本身裂解后才会泄漏到宿主细胞中（图3）。在宿主肝细胞中观察到的分散CTV信号可能表明肝细胞内寄生虫的裂解。CTV 和 GFP 信号之间的紧密重叠预计会伴随着 PV 和寄生虫的裂解。该系统使我们能够查询先天和细胞内在免疫途径中单个宿主分子在调节疟原虫或其PV裂解方面的独特贡献。
图1： 伯氏疟 原虫裂殖株。 代表性光学显微镜图像描绘了用 Giemsa 染色的寄生小鼠血培养物 （16 h） 中的 P. berghei schizonts。箭头表示完全成熟 （A） 或未成熟 （B） 分裂症。比例尺：5 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：蚊子唾液腺和子孢子。 光学显微镜图像描绘了从 Pb-GFP11感染的雌性 按蚊 中分离出的唾液腺。（A） 在解剖过程中唾液腺（箭头）在取出和进一步处理之前仍然完好无损的蚊头图像（比例尺：1 毫米）。（乙，丙）较低 （B） 和较高 （C） 放大倍率（比例尺分别为 0.1 mm 和 0.04 mm）的唾液腺代表性图像。孢子体可以在腺体内部和外部看到（箭头）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：检测宿主肝细胞中疟原虫及其寄生液泡的裂解。 微分干涉对比 （DIC） 和伪彩色免疫荧光图像，叠加描绘了感染 Pb-GFP 11 孢子体的 Hepa-GFP1-10 肝细胞。在感染前用CTV对子孢子进行染色（比例尺：10μm）。将总共 1 x 106 个 Hepa-GFP 1-10 个肝细胞接种在 35/10 mm 玻璃底培养皿中，并在接种后 4 小时接种 3 x 10 5PbGFP11 孢子。使用倒置荧光显微镜在600倍放大倍率和感染后16小时拍摄图像。缩写：DIC=微分干涉对比。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
我们已经在我们的实验室中使用了上述方案来创建几种转基因 伯氏疟 原虫寄生虫系。虽然针对 P. berghei 进行了优化，但我们也成功地使用该协议来生成转基因 P. yoelii 子孢子。将转染的裂殖体注射到小鼠体内后，寄生虫通常不晚于3 d.p.i.在所有组中检测到，包括无质粒对照。只有在检测到寄生虫血症后才开始选择，以确保电穿孔后寄生虫的活力。此外，在准备药物选择时，可能需要用盐酸酸化水，使pH值降至4，才能使乙胺嘧啶完全溶解。我们期望从无质粒对照组中完全清除寄生虫，而接种转染剂的小鼠仍然被感染。对照小鼠的清除通常发生在乙胺嘧啶治疗开始后5-8天。值得注意的是，感染 伯氏疟原虫 的 B6 小鼠可能表现出实验性脑疟疾的迹象并死于死亡（根据机构动物使用指南遵循人道终点），通常在 6-12 d.p.i. 的间隔内。这可以通过在 TCRaKO 小鼠25 中对转染子进行药物选择来避免，或者通过将以 5 d.p.i. 进行选择的寄生虫转移到新的 B6 受体并在后者中继续选择来避免。 疟原 虫的转基因可以使用多种方法进行验证，例如遗传筛选、表型评估或特定功能的获得或丧失。
需要注意的是，选择合适的质粒对于成功转染和保留寄生虫中引入的DNA至关重要。质粒在实现不同疟原虫物种的转基因方面也可能显示出有限的功效。例如，pSKspGFP11质粒（基于PL0017;BEI 资源）我们用于生成 PbGFP11 也可用于有效地生成转基因 P. yoelli，但不能用于 P. chabaudi。为了生成 pSKspGFP11，我们将亲本 pL0017 质粒（BEI 资源）中的 GFP 突变体 3 序列替换为超文件夹 GFP 第 11 β链 GFP 11 （GFP11-7X）18 的 7 个串联序列。尽管转染前质粒的线性化可以更好地进行基因组整合，但使用我们的方案，线性质粒和环状质粒都显示出相似的转染效率。通过转染环状质粒产生的疟原虫系似乎在蚊子孢子的产生过程中也保持了其转基因特性。
值得注意的是，只有雌性蚊子才能携带和传播 疟原虫。 隔离蚊子后，建议现阶段不要为隔离蚊子提供糖水源。以这种方式让它们挨饿会增加任何可能无意中转移的雄性蚊子死亡的机会，而雌性蚊子则更有效地从受感染的小鼠身上吸血。我们通常在将感染从小鼠转移到蚊子后 1 天返回糖水。值得注意的是，蚊子体内孢子体发育和成熟的时间范围可能因转基因 疟原虫 品系而异。因此，在建立针对每个转基因系的特异性方案之前，在感染后的多个时间点评估唾液腺中的子孢子数量非常重要。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）对SPK的资助AI168307。 我们感谢 UGA CTEGD 流式细胞术核心和 UGA CTEGD 显微镜核心。我们还要感谢 Ash Pathak、Anne Elliot 和 UGA Sporocore 的工作人员在优化协议方面的贡献。我们要感谢 Daichi Kamiyama 博士的宝贵见解、讨论以及含有 GFP11 和 GFP 1-10 的亲本质粒。我们还要感谢Kurup实验室成员一直以来的支持、耐心和鼓励。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II - Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
References
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