Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

יצירת פלסמודיום מהונדס גנטית ברגהיי ספורוזואיטים

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64992
Automatic Translation
1, 1,2
1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

Summary

מלריה מועברת באמצעות חיסון של שלב sporozoite של פלסמודיום על ידי יתושים נגועים. פלסמודיום מהונדס איפשר לנו להבין טוב יותר את הביולוגיה של המלריה ותרם ישירות למאמצי פיתוח החיסון למלריה. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה יעילה ליצירת פלסמודיום ברגהיי sporozoites מהונדס.

Abstract

מלריה היא מחלה קטלנית הנגרמת על ידי הטפיל פלסמודיום ומועברת באמצעות עקיצה של יתושי אנופלס נקביים. שלב הספורוזואיטים של פלסמודיום המושקע על ידי יתושים בעורם של פונדקאים בעלי חוליות עובר שלב של התפתחות חובה בכבד לפני תחילת המלריה הקלינית. אנו יודעים מעט מאוד על הביולוגיה של התפתחות פלסמודיום בכבד; הגישה לשלב הספורוזואיטים והיכולת לשנות גנטית ספורוזואיטים כאלה הם כלים קריטיים לחקר טבעו של זיהום פלסמודיום והתגובה החיסונית הנובעת מכך בכבד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף ליצירת פלסמודיום ברגהיי sporozoites מהונדס. אנו משנים גנטית את שלב הדם P. berghei ומשתמשים בצורה זו כדי להדביק יתושי אנופלס כאשר הם לוקחים ארוחת דם. לאחר שהטפילים הטרנסגניים עוברים התפתחות אצל היתושים, אנו מבודדים את שלב הספורוזואיטים של הטפיל מבלוטות הרוק של היתושים לצורך ניסויים in vivo ו-in vitro . אנו מדגימים את תקפות הפרוטוקול על ידי יצירת ספורוזואיטים של זן חדש של P. berghei המבטא את תת-היחידה 11 של החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) (GFP11), ומראים כיצד ניתן להשתמש בו כדי לחקור את הביולוגיה של מלריה בשלב הכבד.

Introduction

למרות ההתקדמות בפיתוח תרופות ובמחקר למניעה וטיפול במלריה, נטל התחלואה העולמי של המלריה נותר גבוה. יותר מחצי מיליון בני אדם מתים ממלריה מדי שנה, כאשר רמות התמותה הגבוהות ביותר נצפו בקרב ילדים החיים באזורים אנדמיים למלריה, כגון אפריקה שמדרום לסהרה1. מלריה נגרמת על ידי הטפיל פלסמודיום, המועבר לבני אדם באמצעות עקיצה של יתושי אנופלס נקביים הנושאים את הטפיל בבלוטות הרוק שלהם. השלב הזיהומי של פלסמודיום - הספורוזואיטים - מופקדים בעורם של המארחים בעלי החוליות במהלך ארוחת דם ונוסעים דרך זרם הדם כדי להדביק תאי כבד, שם הם עוברים התפתחות חובה (המהווה מלריה טרום אריתרוציטים) לפני הדבקת אריתרוציטים. זיהום של אריתרוציטים מתחיל את שלב הדם של מלריה והוא אחראי על כל התחלואה והתמותה הקשורים למחלה 2,3.

אופיו המחייב של הפיתוח הפרה-אריתרוציטי של פלסמודיום הפך אותו למטרה אטרקטיבית למאמצי חיסון מניעתי ופיתוח תרופות4. תנאי מוקדם לחקר הביולוגיה של מלריה טרום אריתרוציטית, כמו גם לפיתוח חיסונים או תרופות המכוונות לשלב הכבד, הוא גישה לספורוזואיטים פלסמודיום. יתר על כן, היכולת שלנו לייצר פלסמודיום sporozoites מהונדס גנטית כבר חיוני להצלחה של מאמצי מחקר כאלה 5,6,7,8,9. קווי פלסמודיום טרנסגניים המבטאים חלבוני כתב פלואורסצנטיים או זוהרים אפשרו לנו לעקוב אחר התפתחותם in vivo ו- in vitro10,11. טפילים מוחלשים גנטית (GAPs), הנוצרים באמצעות מחיקה של גנים מרובים בפלסמודיום, הם גם חלק מהמועמדים המבטיחים ביותר לחיסון12,13.

מודלים של מכרסמים ומלריה של פרימטים שאינם אנושיים סייעו לנו להבין את המנגנונים של אינטראקציות פונדקאי-טפיל במלריה אנושית בשל הדמיון בביולוגיה ובמחזור החיים בין מיני פלסמודיום 14. השימוש בזני פלסמודיום המדביקים מכרסמים, אך לא בני אדם (למשל, P. berghei) מאפשר שמירה על מחזור החיים המלא של הטפיל ויצירת ספורוזואיטים זיהומיים לחקר מלריה בשלב הכבד בסביבה מבוקרת של בטיחות ביולוגית ברמה 1. מגוון פרוטוקולים נפרדים כבר קיימים ליצירת טפילי פלסמודיום בשלב הדם המהונדס 15, זיהום יתושים16 ובידוד ספורוזואיטים17. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מקיף המשלב מתודולוגיות אלה על מנת ליצור ולבודד sporozoites P. berghei טרנסגני, תוך שימוש בזן המהונדס החדש PbGFP11 כדוגמה. PbGFP 11 מעביר את הגדיל β ה-11 של חלבון פלואורסצנטי ירוק סופר-תיקייה (GFP), GFP11, לתוך הוואקול הטראיטופורי (PV) שנוצר בהפטוציטים המארחים. PbGFP 11 משמש בשילוב עם הפטוציטים טרנסגניים (רקע Hepa1-6) המבטאים שאריות המהוות את מקטע GFP 1-10 (GFP 1-10) בציטופלסמה (תאי Hepa GFP 1-10). PbGFP11 מדווח על ליזה PV בהפטוציטים המארחים באמצעות השלמה עצמית ורפורמה של GFP פונקציונלי ואות פלואורסצנטי ירוק18. יש לציין כי GFP 11 מקודד כסדרה של שבעה רצפי טנדם ב-PbGFP11 כדי לשפר את האות הפלואורסצנטי המתקבל. לאחר צביעת PbGFP11 sporozoites עם צבע cytoplasmic CellTrace Violet (CTV), אנו יכולים לעקוב אחר הטפילים. הליזה של טפילים תוך-תאיים כאלה המוכתמים ב-CTV גורמת בעצמה לדליפה של CTV לתוך הציטופלסמה של התא המארח ולהכתמה של התא המארח. בנוסף להדמיה ולהבחנה של הליזה של פלסמודיום PV ו / או הטפיל בהפטוציטים המארחים, מערכת זו יכולה לשמש באופן אמין לחקר המסלולים החיסוניים האחראים לכל אחד מהתהליכים הללו, באמצעות הפרעה גנטית או טיפולית של המרכיבים המולקולריים של מסלולים כאלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל המחקר שכלל בעלי חוליות במעבדה שלנו בוצע בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים של אוניברסיטת ג'ורג'יה לשימוש בבעלי חיים.

1. דור של P . berghei - עכברים נגועים

  1. ליזום זיהום בשלב הדם בעכברים C57BL/6 (B6) בני 6-8 שבועות בני 6-8 שבועות באמצעות טפילי P. berghei פראיים. כדי לעשות זאת, להעביר דם נגוע P. berghei בהקפאה (2 x 105 RBCs נגועים), reconsformed ב 400 μL של מלוחים חוצצים פוספט (PBS), לתוך עכבר תורם אחד או שניים intraperitoneally (i.p).
  2. העבירו דם טרי שנאסף באמצעות דימום רטרו-אורביטלי מהעכברים התורמים 5 ימים לאחר ההדבקה (d.p.i.) לשני עכברי B6 תמימים. כדי לעשות זאת, לאסוף 200 μL של דם, לשחזר עם 300 μL של PBS, ולהזריק 200 μL i.p. לתוך העכברים המקבלים. ודא כי הפרזיטמיה אצל התורמים בנקודת זמן זו היא 2%-5%19,20.
  3. ניטור פרזיטמיה כפי שתואר קודם לכן19,20, החל מ 2 d.p.i. אצל המושתלים. כאשר הפרזיטמיה נעה בין 3%-5% (סביב 5 d.p.i.), יש להרדים את העכברים המקבלים ולאחר מכן לאסוף דם באמצעות ניקוב לב או דימום רטרו-אורביטלי. יש להרדים את העכברים באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני ולאחריה פריקת צוואר הרחם, או על פי הנחיות מוסדיות.
    הערה: ברגע שהפרזיטמיה עולה על 5%, יעילות הטרנספקציה עשויה להיות מופחתת בשל השכיחות המוגברת של RBCs נגועים מרובים.

2. דור סכיזונטים בתרבות

  1. איסוף דם מהעכברים הנגועים בשלב 1.3 (כ-2 מ"ל בסך הכל משני עכברים) לתוך 5 מ"ל של תמיסת אלסבר (ראו טבלת חומרים) בסביבה סטרילית. בצע את שלבים 2.1 עד 3.12 בתנאים סטריליים.
    הערה: תנאים סטריליים כוללים לבישת כפפות, ניגוב כפפות ומשטחים עם 70% אתנול, שימוש בחומרים מתכלים סטריליים ועבודה בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
  2. צנטריפוגה את הדם במשך 8 דקות ב 450 x גרם בטמפרטורת החדר (RT). יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורית התא ב-10 מ"ל של מדיית RPMI מלאה (RPMI 1640 עם 20% נסיוב בקר עוברי [FBS] ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין, v/v).
  3. צנטריפוגה למשך 8 דקות ב 450 x גרם ב RT. להשהות מחדש את הגלולה ב 25 מ"ל של מדיה RPMI מלאה ולהעביר בקבוק תרבית T75 עם מכסה מסנן.
  4. מניחים באינקובטור בטמפרטורה של 36.5 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, תוך כדי ניעור עדין כדי לשמור על התאים בתרחיף למשך 16 שעות.
  5. בנקודת הזמן של 16 שעות, בדוק את התפתחות סכיזונט. כדי לעשות זאת, לאסוף 500 μL של הדגימה, צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 8 דקות, להשעות את הגלולה ב 10 μL של מדיה RPMI מלא, ולהכין כתם דם דק. הכתימו את כתם הדם בכתם Giemsa19 (ראו טבלת חומרים) וקבעו את תדירות הסכיזונטים (איור 1).
  6. לקבלת יעילות העברה אופטימלית, 60%-70% מהטפילים צריכים להיות בשלב סכיזונט. אם נקבע פחות מסף זה, המשיכו לטפח כמו בשלב 2.4 ובדקו כל שעה כדי לוודא שנחצה הסף הנ"ל לפני שתמשיכו.

3. טרנספקציה של סכיזונט פלסמודיום

  1. הכן חיץ צנטריפוגה הדרגתי על ידי הרכבה מחדש של 13 מ"ל של מדיום מלאי שיפוע צפיפות (ראה טבלת חומרים) עם 1.44 מ"ל של 1.5 M NaCl ו- 5.6 מ"ל של 0.15 M NaCl בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
  2. העבר 25 מ"ל של תרבית דם לצינור צנטריפוגה טרי של 50 מ"ל. שכב בזהירות 20 מ"ל של חיץ צנטריפוגה הדרגתית לתחתית צינור הצנטריפוגה באמצעות פיפטה זכוכית צרה כדי ליצור עמוד הדרגתי. יש להקפיד שלא להפריע לשכבות ולממשקים הנוזליים ולהקפיד על חלוקה ברורה בין החיץ למדיה.
  3. צנטריפוגה למשך 20 דקות ב 450 x גרם ללא בלם ב RT. באמצעות פיפטה פסטר, להסיר בזהירות את שכבת סכיזונט15 הממוקם בממשק של מדיה תרבות ואת חיץ צנטריפוגה הדרגתית, ומניחים אותו בתוך צינור צנטריפוגה חדש 50 מ"ל.
  4. השהה מחדש את הסכיזונטים המבודדים במדיית RPMI מלאה והעלה את הנפח הכולל ל -40 מ"ל. צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 8 דקות ב RT ולהשליך את supernatant.
  5. להשעות מחדש את schizonts ב 10 מ"ל של מדיה RPMI מלא. לאחר מכן, העבר 1 מ"ל של תמיסה זו לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל עבור כל טרנספקציה, וצנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 5 שניות כדי לגלול RBCs נגועים. RBCs נגועים נגזר שני עכברים באופן לעיל יכול לשמש עד 10 transfections נפרדים.
  6. ערבבו 100 μL של חיץ האלקטרופורציה (תמיסת נוקלאופקטור מערכת האלקטרופורציה; ראו טבלת חומרים) ב-RT עם 5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד מטרה מעגלי או ליניארי (בנפח מרבי של 10 μL), לפי הצורך עבור כל טרנספקציה בצינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים של 1.5 מ"ל. דגימה "ללא פלסמיד" חייבת להיכלל כבקרה עבור טרנספקציה ובחירת אנטיביוטיקה.
  7. הסר את supernatant לאחר צנטריפוגה משלב 3.5 בזהירות להשעות מחדש את RBCs נגועים בתמיסת נוקלאופקטור מוכן + DNA פלסמיד (משלב 3.6).
  8. מעבירים את המתלה (תמיסת נוקלאופקטור + פלסמיד + סכיזונט; 110 מיקרוליטר מקסימום) לקוביות אלקטרופורציה. העבר באמצעות תוכנית נוקלאופקטור מתאימה (U-033, ראה טבלת חומרים).
    הערה: ודא ששלבים 3.8 עד 3.10 מבוצעים ב- RT.
  9. הוסף 100 μL של מדיה RPMI מלאה לקובט ולהעביר את הפתרון כולו (עכשיו 200 μL נפח כולל) לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל ולשמור על RT.
  10. הזריקו את תמיסה של 200 μL של טפילים נגועים לעכברים תוך ורידי (i.v.), תוך עבודה כדי למזער את הזמן בין הטרנספקציה לבין הזריקה הסופית לעכברים.
    הערה: סכיזונטים נגועים מוזרקים לעכברים פחות מ-5 דקות לאחר אלקטרופורציה כדי למקסם את יעילות הפרוטוקול.

4. בחירת הטפילים הנגועים

  1. בדוק את רמות הטפילים בעכברים שחוסנו בסכיזונטים הנגועים מדי יום מ -2 d.p.i. כדי לאמת את ההדבקה.
  2. לאחר אימות הזיהום, התחל בבחירת התרופה באמצעות מתן אוראלי של התרופה במי השתייה, המוצע אד ליביטום.
    הערה: Pyrimethamine שימש כסמן התרופה לבחירה עבור פלסמיד. במקרה זה, 17.5 מ"ג של pyrimethamine נוסף 250 מ"ל של מים נקיים (ריכוז סופי של 70 מ"ג / ליטר). בנוסף, 10 גרם סוכר נוסף למים אלה כדי לעודד צריכה נאותה של מים המכילים pyrimethamine על ידי עכברים.
  3. לפקח על פרזיטמיה כל יומיים באמצעות מריחות דם שנעשו עם 5 μl של דם, החל מ 6 ימים לאחר תחילת הטיפול pyrimethamine. היעדר טפילים הניתנים לגילוי לאחר 15 יום מצביע על העברה כושלת; במקרה זה, התחל מחדש את התהליך משלב 1.1 עבור ניסיון חדש.
  4. כאשר הטפילים מגיעים לפחות ל-1%, מעבירים את הטפילים לעכברי B6 תמימים ליצירת מלאי טפילים בשלב הדם. המשיכו את הסלקציה בעכברים החדשים שנדבקו עד שהטפילים יגיעו ל-2%-5%, ואז ייצרו מלאי וישמרו אותם בהקפאה21.

5. זיהום יתושים עם קווים טרנסגניים

  1. להדביק עכברי B6 עם 200 μL של דם המכיל את הטפילים שנבחרו (2 x 105 RBCs נגוע / עכבר, i.v). לקבוע טפילים בעכברים אלה ביום האכלת יתושים וזיהום. פרזיטמיה בין 2%-5% היא אופטימלית להדבקת יתושים. לאחר האימות, העבירו מיד את הזיהום לנקבת יתושי אנופלס סטפנסי לפי שלבים 5.2-5.4).
    הערה: אינקובטורים המכילים יתושים להדבקה צריכים להישמר ב 20.5 ° C, ב 80% לחות, ובמחזור אור / חושך 12 שעות (אורות דולקים בין 07: 00 בבוקר עד 07: 00 בערב).
  2. יום לפני הדבקת יתושים, להפריד את נקבות היתושים על ידי הנחת מקור חום על גבי הכלוב המכיל יתושים זכרים ונקבות כאחד, כגון שלפוחית פלסטיק דקה או כפפה מלאה במים מחוממים ל 37 מעלות צלזיוס. הוציאו את נקבות היתושים, שנמשכות למקור החום, באמצעות שואב חרקים והעבירו אותן לכלוב נפרד וקטן יותר להדבקה.
    הערה: ניתן להבדיל בין יתושים זכרים ליתושים נקבות על ידי גודל גופם המצומצם מעט ואנטנות פלומוזיות.
  3. הזריקו לעכברים הנגועים חומר הרדמה כללי (למשל, 2% טריברומואתנול/אברטין). ודא הרדמה מלאה על ידי צביטה חזקה של כרית כף הרגל של כל עכבר. אם הם לא מגיבים, הם מורדמים מספיק ומוכנים להעביר את הזיהום ליתושים.
  4. הניחו את העכברים המורדמים על נקבות היתושים הכלואות בכלוב (משלב 5.2) תחת שכיבה עצם החזה. פזרו ידנית את הרגליים הקדמיות והאחוריות כדי לספק את שטח הפנים הגדול ביותר להאכלת יתושים. השאירו את העכברים הנגועים מעל כל כלוב למשך 15 דקות בסך הכל, בדקו כל 5 דקות כדי לוודא שהעכברים אינם ערים. לאחר השלמת ההאכלה, יש להרדים את העכברים באמצעות נקע צוואר הרחם, או בהתאם לפרוטוקול השימוש המוסדי בבעלי חיים, ולהשליך אותם בבטחה.

6. אוסף של sporozoites

  1. בדוק את midguts יתושים עבור ביציות בערך 10 d.p.i. כדי לוודא זיהום מוצלח ואת התפתחות פלסמודיום בתוך היתושים. בודדו את היתושים מהבטן על ידי הסרת מקטע הבטן הסופי באמצעות מלקחיים. דמיינו את אמצע המעי תחת אור מקוטב לנוכחות ביציות22.
  2. ספורוזואיטים מסוג בר צפויים להימצא בבלוטות הרוק של יתושים 18-21 ימים לאחר האכלתם בעכברים נגועים. ביום ה-18, נתחו 5-10 יתושים כדי להעריך את מספר הספורוזואיטים.
    הערה: יתושים נשטפים ומומתים באתנול. לאחר מכן, יתושים מתים נשטפים פעמיים עם PBS כדי להסיר פסולת לפני נתיחה.
  3. כדי לבודד ולספור את הספורוזואיטים, הסירו בזהירות את ראש היתוש תוך הפעלת לחץ על בית החזה של היתוש באמצעות מלקחיים או מחט ניתוח עדינה. בלוטות הרוק נשארות מחוברות לראש שהוסר (איור 2).
  4. הסירו פסולת יתושים נוספת מבלוטות הרוק והניחו אותה בצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 400 מיקרוליטר של אמצעי דיסקציה של יתושים (מדיום Ealge של דולבקו [DMEM] עם 1% נסיוב עכברים, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין; ראו טבלת חומרים).
  5. לשבש את בלוטות הרוק המבודדות על ידי מעבר דרך מזרק מחט 30 גרם 15-20 פעמים. מניחים 10 μL של בלוטות הרוק המשובשות במדיה דיסקציה של יתושים לתוך hemocytometer וספירה. השהיה מחדש בריכוז הרצוי של אמצעי דיסקציה של יתושים או PBS להזרקה לעכברים, חיסון לתרביות תאים, או שימור בהקפאה לטווח ארוך23,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קביעת התדירות וההתפתחות של סכיזונטים היא קריטית כדי להבטיח כי מספיק טפילים קיימא נמצאים בשלב האופטימלי עבור transfection. סכיזונטים לא בוגרים יכולים להיות מובחנים מסכיזונטים בוגרים לחלוטין על-ידי נוכחות של פחות מרוזואיטים שאינם ממלאים את כל החלל התוך-תאי של ה-RBC (איור 1B). חשוב לציין שבעת ביצוע מריחות דם מדם מתורבת, RBCs נגועים עשויים להיפתח, וכתוצאה מכך תצפית על מרוזואיטים חוץ-תאיים חופשיים בכתם הדם (איור 1). מרוזואיטים כאלה אינם נכללים בהערכת תדירות הסכיזונטים בשלב 2.5.

הסרת בלוטות רוק מיתושים יכולה להיות מאתגרת אם המשתמש אינו מכיר פיזיולוגיה של יתושים או דיסקציות בקנה מידה קטן. במהלך הבידוד של בלוטות הרוק מיתושים, שימו לב שניתן להשתמש בשקיפות של הבלוטות כדי להבדיל אותן משאריות יתושים אטומות (איור 2). ספירת הספורוזואיטים לאחר הפרעה בבלוטות היא היעילה ביותר בהגדלה של פי 400, והשימוש בניגודיות פאזה מאפשר זיהוי קל יותר של הספורוזואיטים בתוך תא הספירה.

הראינו כי מעל 90% של פלסמודיום ב hepatocytes עשויים להיות מסולקים באמצעות מנגנונים חיסוניים פנימיים התא23. לכן, אנו מצפים טפילים במספר ניכר של hepatocytes לעבור ליזה. ככלי לקביעת הליזה של פלסמודיום או PV שלו בהפטוציטים המארחים, יצרנו הפטוציטים טרנסגניים המבטאים את תת-היחידה GFP 1-10 (Hepa-GFP1-10) ואת תת-היחידה המהונדסת P. berghei המבטאים ומעבירים את תת-היחידה GFP 11 ל-PV שלה (Pb-GFP 11). מקטע GFP 1-10, המכיל את השאריות המרכיבות את כרומופור GFP, אינו פלואורסצנטי בפני עצמו ונופל רק כאשר הוא משויך ל-GFP 11, אולי באמצעות השלמה עצמית. בנוסף לאימות פונקציונלי של טרנסגנזה בפלסמודיום, יצירת אות פלואורסצנטי ירוק בתאי המארח הנגועים ב-Pb-GFP11 של Hepa-GFP 1-10 הצביעה על ליזה של PV (איור 3). תאי Hepa-GFP 1-10 נגועים ב-Wild מסוג P. berghei או תאי Hepa1-6 נגועים ב-Pb-GFP11 לא הצליחו לייצר אות פלואורסצנטי ירוק (הנתונים לא מוצגים). אנו מחשיבים את הליזה של PV כשלב מפתח שקדם להרס שלב הכבד פלסמודיום. Pb-GFP11 sporozoites היו מוכתמים גם עם CTV כדי לדמיין את הטפילים hepatocytes. CTV צפוי לדלוף לתוך התא המארח רק לאחר ליזה של הטפיל עצמו (איור 3). אות ה-CTV המפוזר שנצפה בהפטוציטים של הפונדקאי מצביע ככל הנראה על ליזה של הטפיל בתוך הפטוציטים. החפיפה ההדוקה בין אותות ה-CTV וה-GFP צפויה עם הליזה המקבילה הן של ה-PV והן של הטפיל. מערכת זו מאפשרת לנו לחקור את התרומות הייחודיות של מולקולות מארחות בודדות במסלולים חיסוניים מולדים ופנימיים של תאים בוויסות הליזה של פלסמודיום או PV שלה.

Figure 1
איור 1: Plasmodium berghei schizonts. תמונות במיקרוסקופ אור מייצג המתארות את P. berghei schizonts בתרבית דם של עכבר טפילי (16 שעות) מוכתמת בכתם Giemsa. חצים מציינים סכיזונטים בשלים לחלוטין (A) או לא בוגרים (B). מוטות קנה מידה: 5 מיקרומטר . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: בלוטות רוק של יתושים וספורוזואיטים. תמונות מיקרוסקופ אור המתארות בלוטות רוק שבודדו מנקבות יתושי אנופלס נגועות ב-Pb-GFP11. (A) תמונה של ראש יתוש שבלוטות הרוק (החץ) עדיין שלמות בזמן הדיסקציה, לפני הסרתו ועיבודו הנוסף (סרגל קנה מידה: 1 מ"מ). (ב,ג) תמונות מייצגות של בלוטות רוק בהגדלות נמוכות יותר (B) וגבוהות יותר (C) (פסי קנה מידה: 0.1 מ"מ ו-0.04 מ"מ, בהתאמה). ניתן לראות ספורוזואיטים הן בתוך הבלוטה והן מחוצה לה (חץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: זיהוי הליזה של פלסמודיום והוואקול הטפיליטופורי שלו בהפטוציטים של המאכסן. ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) ותמונות אימונופלואורסצנטיות בצבעים מדומים עם כיסוי המתאר Hepa-GFP1-10 hepatocytes נגועים ב- Pb-GFP11 sporozoites. ספורוזואיטים הוכתמו ב-CTV לפני ההדבקה (סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר). סה"כ 1 x 106 Hepa-GFP 1-10 hepatocytes צופו בצלחת תרבית תחתית זכוכית 35/10 מ"מ וחוסנו עם 3 x 105PbGFP11 sporozoites 4 שעות לאחר ציפוי. התמונות צולמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה של פי 600 ובשעה 16 שעות לאחר ההדבקה. קיצורים: DIC = ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השתמשנו בפרוטוקול הנ"ל במעבדה שלנו כדי ליצור מספר שורות של טפילי P. berghei טרנסגניים. למרות אופטימיזציה עבור P. berghei, השתמשנו בהצלחה פרוטוקול זה כדי ליצור P. yoelii sporozoites טרנסגני. לאחר הזרקת סכיזונטים נגועים לעכברים, טפילים ניתנים לגילוי בדרך כלל לא יאוחר מ 3 d.p.i. בכל הקבוצות, כולל בקרת פלסמיד. הברירה מתחילה רק לאחר זיהוי הטפילים כדי להבטיח את יכולת הקיום של טפילים לאחר התחשמלות. בנוסף, כאשר מתכוננים לבחירת סמים, החמצה של המים עם חומצה הידרוכלורית, להביא את ה- pH למטה ל 4, עשוי להיות נחוץ pyrimethamine להתמוסס לחלוטין. אנו מצפים לסילוק מלא של הטפילים מקבוצת הביקורת ללא פלסמיד, בעוד שהעכברים שחוסנו בחומרים המדביקים נשארים נגועים. פינוי בעכברי הביקורת מתרחש בדרך כלל 5-8 ימים לאחר תחילת הטיפול בפירימתאמין. יש לציין כי עכברי B6 הנגועים ב- P. berghei עשויים להראות סימנים של מלריה מוחית ניסיונית ולהיכנע למוות (עקוב אחר נקודות קצה אנושיות בהתאם להנחיות מוסדיות לשימוש בבעלי חיים), בדרך כלל במרווח של 6-12 d.p.i. ניתן להימנע מכך על ידי ביצוע בחירת תרופות של המזהמים בעכברי TCRaKO25, או על ידי העברת הטפילים שעברו סלקציה ב 5 d.p.i. למושתלי B6 חדשים והמשך סלקציה באחרון. טרנסגנזה בפלסמודיום יכולה להיות מאומתת באמצעות מגוון גישות, כגון מסכים גנטיים, הערכה פנוטיפית, או רווח או אובדן של פונקציות ספציפיות.

חשוב לציין כי הבחירה של פלסמיד מתאים היא קריטית עבור transfection מוצלח ושמירה של ה- DNA הציג טפיל. פלסמידים עשויים גם להראות יעילות מוגבלת בהשגת טרנסגנזה בין מיני פלסמודיום שונים. לדוגמה, פלסמיד pSKspGFP11 (מבוסס על PL0017; משאבי BEI) שהשתמשנו בהם כדי ליצור PbGFP11 יכולים לשמש לייצור יעיל גם P. yoelli מהונדס, אבל לא P. chabaudi. כדי ליצור pSKspGFP11, החלפנו את רצף GFP mutant3 בפלסמיד האב pL0017 (משאבי BEI) בשבעה רצפי טנדם של גדיל β ה-11 של תיקיית העל GFP, GFP 11 (GFP11-7X)18. למרות שלינאריות של הפלסמידים לפני הטרנספקציה מאפשרת אינטגרציה גנומית טובה יותר, הן פלסמידים ליניאריים והן מעגליים מראים יעילות טרנספקציה דומה באמצעות הפרוטוקול שלנו. קווי פלסמודיום שנוצרו על ידי transfection עם פלסמידים עגולים נראה גם לשמור על התכונות המהונדסות שלהם במהלך הדור של sporozoites ביתושים.

יש לציין כי רק נקבות יתושים יכולות להכיל ולהעביר פלסמודיום. לאחר בידוד היתושים, מומלץ שלא לספק ליתושים המבודדים מקור מי סוכר בשלב זה. הרעבתם באופן זה תגדיל את הסיכוי שכל היתושים הזכרים שאולי הועברו בשוגג ימותו, והנקבות יזינו את הדם ביעילות רבה יותר מהעכברים הנגועים. בדרך כלל אנו מחזירים את מי הסוכר יום אחד לאחר העברת הזיהום מעכברים ליתושים. ראוי לציין כי מסגרת הזמן להתפתחות והבשלה של sporozoite יתושים עשוי להשתנות בין קווי פלסמודיום מהונדס. לכן, חשוב להעריך את מספרי הספורוזואיטים בבלוטות הרוק במספר נקודות זמן לאחר ההדבקה לפני קביעת פרוטוקול ספציפי לכל קו מהונדס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי AI168307 המענק של המכונים הלאומיים לבריאות ל- SPK.  אנו מודים לליבת הציטומטריה של זרימה UGA CTEGD ולליבת המיקרוסקופ UGA CTEGD. אנו מכירים גם בתרומתם של אש פאטאק, אן אליוט והצוות של UGA Sporocore באופטימיזציה של הפרוטוקול. אנו רוצים להודות לד"ר דאיצ'י קאמיאמה על תובנות חשובות, דיון, ופלסמידים האב המכילים GFP11 ו- GFP 1-10. ברצוננו להודות גם לחברי מעבדת קורופ על התמיכה, הסבלנות והעידוד הבלתי פוסקים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 G x 1/2" Syringe needle Exel international 26437
Alsever's solution Sigma-Aldritch A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 Lonza VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) TCI America T1420
Blood collection tubes BD bioscience 365967 for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer INCYTO DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish Greiner Bio-One 627860
Centrifuge 5425 Eppendorf 5405000107
Centrifuge 5910R Eppendorf 5910R For gradient centrifugation
Delta Vision II - Inverted microscope system Olympus IX-71
Dimethyl Sulfoxide Sigma D5879-500ml
Fetal bovine serum GenClone 25-525
GFP11 plasmid Kurup Lab pSKspGFP11 Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain Sigma-Aldritch 48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells Kurup Lab Hepa GFP1-10 Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum Used for mosquito dissection media
NaCl Millipore-Sigma SX0420-5 1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II Amaxa Biosystems (Lonza) Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette VWR 14673-043
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldritch P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium) Cytivia 17-0891-02 Details in protocol
PL0017 Plasmid BEI Resources MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration) Sigma 46706 Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640 Corning 15-040-CV
SoftWoRx microscopy software Applied Precision v6.1.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Geneva. World Health Organization. , 1 (2020).
  2. Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
  3. Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
  4. Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P. Pre-erythrocytic vaccines against malaria. Vaccines. 8 (3), 400 (2020).
  5. Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
  6. Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
  7. Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7 (2020).
  8. Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
  9. Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321 (2014).
  10. Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
  11. Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).
  12. Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
  13. Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).
  14. Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86 (2014).
  15. Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
  16. Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).
  17. Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
  18. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  19. Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
  20. Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
  21. de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
  22. Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).
  23. Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).
  24. Bowers, C., et al. Cryopreservation of Plasmodium sporozoites. Pathogens. 11 (12), 1487 (2022).
  25. Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).

Tags

פלסמודיום מהונדס גנטית ברגהיי ספורוזויטים מלריה פלסמודיום טפיל יתושי אנופלס התפתחות שלב הכבד מלריה קלינית תגובה חיסונית טפילים טרנסגניים P. berghei בשלב הדם בלוטות רוק יתושים ניסויים in vivo ניסויים חוץ גופיים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מלריה בשלב הכבד
יצירת <em>פלסמודיום מהונדס גנטית ברגהיי</em> ספורוזואיטים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bowers, C., Kurup, S. P. Generating… More

Bowers, C., Kurup, S. P. Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites. J. Vis. Exp. (195), e64992, doi:10.3791/64992 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter