Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

आनुवंशिक रूप से संशोधित प्लास्मोडियम बर्गेई स्पोरोज़ोइट्स उत्पन्न करना

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64992
Automatic Translation
1, 1,2
1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

Summary

मलेरिया संक्रमित मच्छरों द्वारा प्लास्मोडियम के स्पोरोज़ोइट चरण के टीकाकरण के माध्यम से फैलता है। ट्रांसजेनिक प्लाज्मोडियम ने हमें मलेरिया के जीव विज्ञान को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति दी है और मलेरिया वैक्सीन विकास प्रयासों में सीधे योगदान दिया है। यहां, हम ट्रांसजेनिक प्लास्मोडियम बर्गेई स्पोरोज़ोइट्स उत्पन्न करने के लिए एक सुव्यवस्थित पद्धति का वर्णन करते हैं।

Abstract

मलेरिया परजीवी प्लाज्मोडियम के कारण होने वाली एक घातक बीमारी है और मादा एनोफिलीज मच्छरों के काटने से फैलती है। कशेरुक मेजबानों की त्वचा में मच्छरों द्वारा जमा प्लास्मोडियम का स्पोरोज़ोइट चरण नैदानिक मलेरिया शुरू करने से पहले यकृत में अनिवार्य विकास के चरण से गुजरता है। हम यकृत में प्लास्मोडियम विकास के जीव विज्ञान के बारे में बहुत कम जानते हैं; स्पोरोज़ोइट चरण तक पहुंच और आनुवंशिक रूप से ऐसे स्पोरोज़ोइट्स को संशोधित करने की क्षमता प्लास्मोडियम संक्रमण की प्रकृति और यकृत में परिणामी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। यहां, हम ट्रांसजेनिक प्लास्मोडियम बर्गेई स्पोरोज़ोइट्स की पीढ़ी के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम आनुवंशिक रूप से रक्त-चरण पी बर्गेई को संशोधित करते हैं और इस रूप का उपयोग एनोफिलीज मच्छरों को संक्रमित करने के लिए करते हैं जब वे रक्त भोजन लेते हैं। मच्छरों में ट्रांसजेनिक परजीवी के विकास के बाद, हम विवो और इन विट्रो प्रयोग के लिए मच्छर लार ग्रंथियों से परजीवी के स्पोरोज़ोइट चरण को अलग करते हैं। हम ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) सबयूनिट 11 (जीएफपी11) को व्यक्त करने वाले पी बर्गेई के एक नए स्ट्रेन के स्पोरोज़ोइट्स उत्पन्न करके प्रोटोकॉल की वैधता का प्रदर्शन करते हैं, और दिखाते हैं कि यकृत-चरण मलेरिया के जीव विज्ञान की जांच के लिए इसका उपयोग कैसे किया जा सकता है।

Introduction

मलेरिया की रोकथाम और उपचार में दवा विकास और अनुसंधान में प्रगति के बावजूद, मलेरिया का वैश्विक रोग बोझ उच्च बना हुआ है। हर साल मलेरिया से पांच लाख से अधिक लोग मर जाते हैं, जिसमें मलेरिया-स्थानिक क्षेत्रों में रहने वाले बच्चों में मृत्यु दर का उच्चतम स्तर देखा जाता है, जैसे कि उप-सहारा अफ्रीका1। मलेरिया परजीवी प्लाज्मोडियम के कारण होता है, जो मादा एनोफिलीज मच्छरों के काटने से मनुष्यों में फैलता है, जो उनकी लार ग्रंथियों में परजीवी को सहन करते हैं। प्लास्मोडियम का संक्रामक चरण-स्पोरोज़ोइट्स-रक्त भोजन के दौरान कशेरुक मेजबानों की त्वचा में जमा होता है और यकृत कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए रक्तप्रवाह के माध्यम से यात्रा करता है, जहां वे एरिथ्रोसाइट्स को संक्रमित करने से पहले अनिवार्य विकास (पूर्व-एरिथ्रोसाइटिक मलेरिया का गठन) से गुजरते हैं। एरिथ्रोसाइट्स का संक्रमण मलेरिया के रक्त-चरण को शुरू करता हैऔर रोग से जुड़ी रुग्णता और मृत्यु दर की संपूर्णता के लिए जिम्मेदार है।

प्लाज्मोडियम के पूर्व-एरिथ्रोसाइटिक विकास की बाध्यकारी प्रकृति ने इसे रोगनिरोधी टीका और दवाविकास प्रयासों के लिए एक आकर्षक लक्ष्य बना दिया है। प्री-एरिथ्रोसाइटिक मलेरिया के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के साथ-साथ यकृत चरण को लक्षित करने वाले टीकों या दवाओं के विकास के लिए एक शर्त प्लास्मोडियम स्पोरोज़ोइट्स तक पहुंच है। इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से संशोधित प्लास्मोडियम स्पोरोज़ोइट्स उत्पन्न करने की हमारी क्षमता 5,6,7,8,9 ऐसे शोध प्रयासों की सफलता में सहायक रही है। फ्लोरोसेंट या ल्यूमिनेसेंट रिपोर्टर प्रोटीन को व्यक्त करने वाली ट्रांसजेनिक प्लाज्मोडियम लाइनों ने हमें विवो और इन विट्रो10,11 में उनके विकास को ट्रैक करने की अनुमति दी है। प्लास्मोडियम में कई जीनों के विलोपन के माध्यम से उत्पन्न आनुवंशिक रूप से क्षीण परजीवी (जीएपी) भी कुछ सबसे आशाजनक वैक्सीन उम्मीदवारहैं।

कृंतक और गैर-मानव प्राइमेट मलेरिया मॉडल ने हमें प्लास्मोडियम प्रजातियों के बीच जीव विज्ञान और जीवन चक्र में समानता के कारण मानव मलेरिया में मेजबान-परजीवी बातचीत के तंत्र को समझने में मदद की है। प्लास्मोडियम प्रजातियों का उपयोग जो कृन्तकों को संक्रमित करता है, लेकिन मनुष्यों को नहीं (जैसे, पी बर्गेई) एक नियंत्रित, जैव सुरक्षा स्तर 1 सेटिंग में यकृत-चरण मलेरिया का अध्ययन करने के लिए पूर्ण परजीवी जीवन चक्र और संक्रामक स्पोरोज़ोइट्स की पीढ़ी के रखरखाव की अनुमति देता है। ट्रांसजेनिक रक्त-चरण प्लास्मोडियम परजीवी15, मच्छरों के संक्रमण16 और स्पोरोज़ोइट्स17 के अलगाव के लिए विभिन्न प्रकार के अलग-अलग प्रोटोकॉल पहले से ही मौजूद हैं। यहां, हम एक उदाहरण के रूप में नोवेल ट्रांसजेनिक स्ट्रेन पीबीजीएफपी11 का उपयोग करते हुए, ट्रांसजेनिक पी बर्गेई स्पोरोज़ोइट्स को उत्पन्न करने और अलग करने के लिए इन पद्धतियों के संयोजन के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं। पीबीजीएफपी 11 सुपर-फ़ोल्डर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी), जीएफपी 11 के11 वें β-स्ट्रैंड को मेजबान हेपेटोसाइट्स में उत्पन्न पैरासिटोफोरस रिक्तिका (पीवी) में ले जाता है। पीबीजीएफपी11 का उपयोग ट्रांसजेनिक हेपेटोसाइट्स (हेपा 1-6 पृष्ठभूमि) के साथ संयोजन के रूप में किया जाता है जो अवशेषों को व्यक्त करता है जो साइटोप्लाज्म (हेपा जीएफपी 1-10 कोशिकाओं) में जीएफपी 1-10 टुकड़े (जीएफपी 1-10) का गठन करते हैं। पीबीजीएफपी11 मेजबान हेपेटोसाइट्स में आत्म-पूरक और कार्यात्मक जीएफपी के सुधार और ग्रीन फ्लोरेसेंस सिग्नल18 के माध्यम से पीवी लाइसिस की रिपोर्ट करता है। ध्यान दें, जीएफपी 11 को परिणामी प्रतिदीप्ति संकेत को बढ़ाने के लिए पीबीजीएफपी11 में सात अग्रानुक्रम अनुक्रमों की एक श्रृंखला के रूप में एन्कोड किया गया है। साइटोप्लाज्मिक डाई सेलट्रेस वायलेट (सीटीवी) के साथ पीबीजीएफपी11 स्पोरोज़ोइट्स को धुंधला करने पर, हम परजीवियों को ट्रैक कर सकते हैं। इस तरह के सीटीवी-दाग वाले इंट्रासेल्युलर परजीवियों के लाइसिस के परिणामस्वरूप मेजबान सेल साइटोप्लाज्म में सीटीवी का रिसाव होता है और मेजबान सेल का धुंधलापन होता है। मेजबान हेपेटोसाइट्स में प्लास्मोडियम पीवी और / या परजीवी के लाइसिस को देखने और अलग करने के अलावा, इस प्रणाली का उपयोग ऐसे मार्गों के आणविक घटकों के आनुवंशिक या चिकित्सीय गड़बड़ी के माध्यम से इन प्रक्रियाओं में से किसी एक के लिए जिम्मेदार प्रतिरक्षा मार्गों का अध्ययन करने के लिए मज़बूती से किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

हमारी प्रयोगशाला में कशेरुक जानवरों को शामिल करने वाले सभी शोध जॉर्जिया विश्वविद्यालय पशु उपयोग दिशानिर्देशों और प्रोटोकॉल के अनुपालन में किए गए थे।

1. पी बर्गेई -संक्रमित चूहों की पीढ़ी

  1. जंगली प्रकार के पी बर्गेई परजीवी का उपयोग करके नर या मादा, 6-8 सप्ताह के सी 57बीएल / 6 (बी 6) चूहों में रक्त-चरण संक्रमण शुरू करें। ऐसा करने के लिए, क्रायोप्रिजर्व्ड पी बर्गेई-संक्रमित रक्त (2 x 105 संक्रमित आरबीसी), फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 400 μL में पुनर्गठित, एक या दो दाता चूहों को इंट्रापरिटोनियल रूप से (यानी) में स्थानांतरित करें।
  2. संक्रमण के 5 दिनों के बाद दाता चूहों से रेट्रो-ऑर्बिटल रक्तस्राव के माध्यम से एकत्र किए गए ताजा रक्त को दो भोले बी 6 चूहों में स्थानांतरित करें। ऐसा करने के लिए, 200 μL रक्त एकत्र करें, PBS के 300 μL के साथ पुनर्गठित करें, और प्राप्तकर्ता चूहों में 200 μL यानी इंजेक्ट करें। सुनिश्चित करें कि इस समय दाताओं में परजीवीता 2% -5% 19,20 है।
  3. पैरासाइटिमिया की निगरानी करें जैसा कि पहले वर्णित19,20 है, जो प्राप्तकर्ताओं में 2 डी.पी.आई. से शुरू होता है। जब परजीवीमिया 3% -5% (लगभग 5 डी.पी.आई.) से होता है, तो प्राप्तकर्ता चूहों को इच्छामृत्यु दें और फिर कार्डियक पंचर या रेट्रो-ऑर्बिटल रक्तस्राव के माध्यम से रक्त एकत्र करें। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद या संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना का उपयोग करके चूहों को इच्छामृत्यु दें।
    नोट: एक बार जब परजीवीता 5% से अधिक हो जाती है, तो गुणा संक्रमित आरबीसी के बढ़ते प्रसार के कारण अभिकर्मक दक्षता कम हो सकती है।

2. संस्कृति में स्किज़ोन्ट्स की पीढ़ी

  1. एक बाँझ वातावरण में चरण 1.3 (दो चूहों से कुल मिलाकर लगभग 2 एमएल) में संक्रमित चूहों से रक्त एकत्र करें (सामग्री की तालिका देखें)। बाँझ परिस्थितियों में चरण 2.1 से 3.12 तक करें।
    नोट: बाँझ स्थितियों में दस्ताने पहनना, दस्ताने और 70% इथेनॉल के साथ सतहों को पोंछना, बाँझ उपभोग्य सामग्रियों और सामग्रियों को नियोजित करना और जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर काम करना शामिल है।
  2. कमरे के तापमान (आरटी) पर 450 x g पर 8 मिनट के लिए रक्त को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाला को छोड़ दें और पूर्ण आरपीएमआई मीडिया के 10 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें (आरपीएमआई 1640 20% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस] और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, वी / वी के साथ)।
  3. आरटी में 450 x g पर 8 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। पूर्ण RPMI मीडिया के 25 मिलीलीटर में गोली को पुन: निलंबित करें और फ़िल्टर कैप के साथ T75 कल्चर फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
  4. कोशिकाओं को 16 घंटे तक निलंबन में रखने के लिए धीरे से हिलाते हुए 36.5 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक इनक्यूबेटर में रखें।
  5. 16 घंटे के समय बिंदु पर, स्किज़ोंट विकास की जांच करें। ऐसा करने के लिए, नमूने के 500 μL एकत्र करें, 8 मिनट के लिए 450 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, पूर्ण RPMI मीडिया के 10 μL में गोली को फिर से निलंबित करें, और एक पतला रक्त स्मीयर तैयार करें। गिम्सा स्टेन19 ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ रक्त स्मीयर को दाग दें और स्किज़ोन्ट्स की आवृत्ति निर्धारित करें (चित्रा 1)।
  6. इष्टतम अभिकर्मक दक्षता के लिए, 60% -70% परजीवी स्किज़ोंट चरण में होना चाहिए। यदि इस सीमा से कम निर्धारित किया जाता है, तो चरण 2.4 के अनुसार खेती जारी रखें और आगे बढ़ने से पहले उपरोक्त सीमा को पार करने के लिए हर घंटे जांच करें।

3. प्लास्मोडियम स्किज़ोन्ट्स का अभिकर्मक

  1. 50 एमएल सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब में 1.5 एमएल एनएसीएल के 1.44 एमएल और 0.15 एमएल एनएसीएल के 5.6 एमएल के साथ 13 एमएल घनत्व ग्रेडिएंट स्टॉक मीडियम ( सामग्री की तालिका देखें) का पुनर्गठन करके एक ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन बफर तैयार करें।
  2. 25 एमएल रक्त संस्कृति को एक ताजा 50 एमएल सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब में स्थानांतरित करें। ग्रेडिएंट कॉलम बनाने के लिए एक संकीर्ण ग्लास पिपेट का उपयोग करके सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब के तल पर ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन बफर की 20 एमएल की सावधानीपूर्वक परत करें। तरल परतों और इंटरफेस को परेशान न करने का ध्यान रखें और बफर और मीडिया के बीच एक स्पष्ट विभाजन सुनिश्चित करें।
  3. पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, कल्चर मीडिया और ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन बफर के इंटरफ़ेस पर स्थित स्किज़ोंट परत15 को सावधानीपूर्वक हटा दें, और इसे एक नए 50 एमएल सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब में रखें।
  4. पूर्ण आरपीएमआई मीडिया में पृथक स्किज़ोन्ट्स को फिर से निलंबित करें और कुल मात्रा को 40 एमएल तक लाएं। आरटी पर 8 मिनट के लिए 450 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
  5. पूर्ण आरपीएमआई मीडिया के 10 एमएल में स्किज़ोन्ट्स को फिर से निलंबित करें। फिर, इस घोल के 1 एमएल को प्रत्येक अभिकर्मक के लिए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और संक्रमित आरबीसी को पेलेट करने के लिए 5 सेकंड के लिए 16,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें। उपरोक्त तरीके से दो चूहों से प्राप्त संक्रमित आरबीसी का उपयोग 10 अलग-अलग अभिकर्मकों के लिए किया जा सकता है।
  6. आरटी पर इलेक्ट्रोपोरेशन बफर (इलेक्ट्रोपोरेशन किट से न्यूक्लियोफेक्टर समाधान; सामग्री की तालिका देखें) के 100 μL को 5 μg गोलाकार या रैखिक लक्ष्य प्लास्मिड डीएनए (अधिकतम 10 μL वॉल्यूम तक) के साथ मिलाएं, जैसा कि अलग-अलग 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में प्रत्येक अभिकर्मक के लिए लागू होता है। एक "नो प्लास्मिड" नमूना अभिकर्मक और एंटीबायोटिक चयन के लिए एक नियंत्रण के रूप में शामिल किया जाना चाहिए।
  7. चरण 3.5 से सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और तैयार न्यूक्लियोफेक्टर समाधान + प्लास्मिड डीएनए (चरण 3.6 से) में संक्रमित आरबीसी को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें।
  8. निलंबन (न्यूक्लियोफेक्टर समाधान + प्लास्मिड + स्किज़ोन्ट्स; 110 μL अधिकतम) को इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट में स्थानांतरित करें। एक उपयुक्त न्यूक्लियोफेक्टर प्रोग्राम (यू -033, सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके ट्रांसफर करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि चरण 3.8 से 3.10 आरटी में किए जाते हैं।
  9. क्यूवेट में पूर्ण आरपीएमआई मीडिया के 100 μL जोड़ें और पूरे समाधान (अब 200 μL कुल मात्रा) को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और आरटी पर रखें।
  10. चूहों में अंतःशिरा (यानी) में संक्रमित परजीवियों के 200 μL समाधान को इंजेक्ट करें, जो चूहों में अभिकर्मक और अंतिम इंजेक्शन के बीच के समय को कम करने के लिए काम कर रहा है।
    नोट: प्रोटोकॉल की दक्षता को अधिकतम करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद 5 मिनट से भी कम समय में चूहों में ट्रांसक्रिप्टेड स्किज़ोन्ट्स इंजेक्ट किए जाते हैं।

4. संक्रमित परजीवियों का चयन।

  1. संक्रमण को सत्यापित करने के लिए प्रतिदिन 2 बजे से संक्रमित स्किज़ोन्ट्स के साथ टीका लगाए गए चूहों में परजीवीता के स्तर की जांच करें।
  2. एक बार संक्रमण सत्यापित हो जाने के बाद, पीने के पानी में दवा के मौखिक प्रशासन का उपयोग करके दवा का चयन शुरू करें।
    नोट: पाइरिमेथामाइन को प्लास्मिड के लिए चयन योग्य दवा मार्कर के रूप में नियोजित किया गया था। इस मामले में, 17.5 मिलीग्राम पाइरिमेथामाइन को 250 एमएल साफ पानी (70 मिलीग्राम / एल की अंतिम एकाग्रता) में जोड़ा गया था। इसके अलावा, चूहों द्वारा पाइरिमेथामाइन युक्त पानी की पर्याप्त खपत को प्रोत्साहित करने के लिए इस पानी में 10 ग्राम चीनी मिलाई गई थी।
  3. 5 μl रक्त से बने रक्त स्मीयर का उपयोग करके हर दो दिनों में परजीवीमिया की निगरानी करें, जो पाइरिमेथामाइन उपचार की शुरुआत के 6 दिन बाद से शुरू होता है। 15 दिनों के बाद पता लगाने योग्य परजीवी की कमी एक असफल अभिकर्मक को इंगित करती है; इस स्थिति में, एक नए प्रयास के लिए चरण 1.1 से प्रक्रिया को पुन: प्रारंभ करें।
  4. जब परजीवीकम से कम 1% तक पहुंच जाता है, तो रक्त-चरण परजीवी स्टॉक के निर्माण के लिए परजीवी को भोले बी 6 चूहों में स्थानांतरित करें। नए संक्रमित चूहों में चयन जारी रखें जब तक कि पैरासाइटिमिया 2% -5% तक नहीं पहुंच जाता, जिस बिंदु पर स्टॉक उत्पन्न होता है और उन्हें क्रायोप्रिजर्व21 तक पहुंचाता है।

5. ट्रांसजेनिक लाइनों के साथ मच्छरों का संक्रमण

  1. चयनित परजीवी (2 x 105 संक्रमित आरबीसी / माउस, यानी) युक्त रक्त के 200 μL के साथ बी 6 चूहों को संक्रमित करें। मच्छर के भोजन और संक्रमण के दिन इन चूहों में परजीवीता का निर्धारण करें। मच्छरों के संक्रमण के लिए 2% -5% के बीच परजीवीमिया इष्टतम है। एक बार सत्यापित होने के बाद, चरण 5.2-5.4 के अनुसार तुरंत महिला एनोफिलीज स्टीफेंसी मच्छरों को संक्रमण स्थानांतरित करें)।
    नोट: संक्रमण के लिए मच्छरों वाले इनक्यूबेटरों को 20.5 डिग्री सेल्सियस, 80% आर्द्रता पर, और 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र (सुबह 07:00 बजे से शाम 07:00 बजे के बीच रोशनी चालू) पर बनाए रखा जाना चाहिए।
  2. मच्छर के संक्रमण से एक दिन पहले, नर और मादा दोनों मच्छरों वाले पिंजरे के ऊपर एक गर्मी स्रोत रखकर मादा मच्छरों को अलग करें, जैसे कि एक पतला प्लास्टिक मूत्राशय या पानी से भरा दस्ताने 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है। मादा मच्छरों को हटा दें, जो एक कीट एस्पिरेटर का उपयोग करके गर्मी स्रोत की ओर आकर्षित होते हैं और संक्रमण के लिए इन्हें एक अलग, छोटे पिंजरे में स्थानांतरित करते हैं।
    नोट: नर मच्छरों को मादा मच्छरों से उनके थोड़े कम शरीर के आकार और प्लमोस एंटीना द्वारा अलग किया जा सकता है।
  3. संक्रमित चूहों को एक सामान्य एनेस्थेटिक (जैसे, 2% ट्राइब्रोमोइथेनॉल / एवर्टिन) के साथ इंजेक्ट करें। प्रत्येक माउस के पैर पैड को मजबूती से चुटकी मारकर पूर्ण संज्ञाहरण सुनिश्चित करें। यदि वे प्रतिक्रिया नहीं करते हैं, तो वे पर्याप्त रूप से बेहोश हो जाते हैं और मच्छरों में संक्रमण को स्थानांतरित करने के लिए तैयार होते हैं।
  4. एनेस्थेटाइज्ड चूहों को पिंजरे में बंद मादा मच्छरों (चरण 5.2 से) के ऊपर स्टर्नल रिकंबेंसी के तहत रखें। मच्छरों के भोजन के लिए सबसे बड़ा सतह क्षेत्र प्रदान करने के लिए मैन्युअल रूप से सामने और पीछे के पैरों को फैलाएं। संक्रमित चूहों को प्रत्येक पिंजरे पर कुल 15 मिनट के लिए छोड़ दें, यह सुनिश्चित करने के लिए हर 5 मिनट की जांच करें कि चूहे जाग नहीं रहे हैं। एक बार भोजन पूरा हो जाने के बाद, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग करके या संस्थागत पशु उपयोग प्रोटोकॉल के अनुसार चूहों को इच्छामृत्यु दें, और उन्हें सुरक्षित रूप से निपटाएं।

6. स्पोरोज़ोइट्स का संग्रह

  1. सफल संक्रमण और मच्छरों के भीतर प्लास्मोडियम के विकास को सत्यापित करने के लिए लगभग 10 बजे ओसिस्ट के लिए मच्छर ों के मिडगट की जांच करें। पेट के अंतिम भाग को बल का उपयोग करके हटाकर पेट से मच्छर के मध्य भाग को अलग करें। ओसिस्ट22 की उपस्थिति के लिए ध्रुवीकृत प्रकाश के तहत मिडगट्स की कल्पना करें।
  2. संक्रमित चूहों को खिलाने के 18-21 दिनों के बाद मच्छरों की लार ग्रंथियों में जंगली प्रकार के स्पोरोज़ोइट्स मौजूद होने की उम्मीद है। 18 वें दिन, स्पोरोज़ोइट संख्या का आकलन करने के लिए 5-10 मच्छरों का विच्छेदन करें।
    नोट: मच्छरों को इथेनॉल में धोया और मारा जाता है। इसके बाद, विच्छेदन से पहले मलबे को हटाने के लिए मृत मच्छरों को पीबीएस के साथ दो बार धोया जाता है।
  3. स्पोरोज़ोइट्स को अलग करने और गिनने के लिए, मच्छर के वक्ष पर दबाव डालते समय मच्छर के सिर को सावधानीपूर्वक हटा दें। लार ग्रंथियां हटाए गए सिर से जुड़ी रहती हैं (चित्रा 2)।
  4. लार ग्रंथियों से किसी भी अतिरिक्त मच्छर के मलबे को हटा दें और एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें जिसमें 400 μL मच्छर विच्छेदन मीडिया (1% माउस सीरम, 100 U / mL पेनिसिलिन, और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ डलबेकको का संशोधित ईल्ज माध्यम [डीएमईएम]; सामग्री की तालिका देखें)।
  5. 30 ग्राम की आवश्यकता वाले सिरिंज से 15-20 बार गुजरकर पृथक लार ग्रंथियों को बाधित करें। मच्छर विच्छेदन मीडिया में बाधित लार ग्रंथियों के 10 μL को हेमोसाइटोमीटर में रखें और गिनती करें। चूहों में इंजेक्शन के लिए मच्छर विच्छेदन मीडिया या पीबीएस की वांछित एकाग्रता में पुन: निलंबित, सेल संस्कृतियों में टीकाकरण, या दीर्घकालिक क्रायोप्रिजर्वेशन23,24।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

स्किज़ोन्ट्स की आवृत्ति और विकास का निर्धारण यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि पर्याप्त व्यवहार्य परजीवी अभिकर्मक के लिए इष्टतम चरण में हैं। अपरिपक्व स्किज़ोन्ट्स को कम मेरोज़ोइट्स की उपस्थिति से पूरी तरह से परिपक्व स्किज़ोन्ट्स से अलग किया जा सकता है जो आरबीसी के पूरे इंट्रासेल्युलर स्पेस को नहीं भरते हैं (चित्रा 1 बी)। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सुसंस्कृत रक्त से रक्त स्मीयर बनाते समय, संक्रमित आरबीसी खुल सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप रक्त स्मीयर में मुक्त, बाह्य मेरोज़ोइट्स का अवलोकन होता है (चित्रा 1)। इस तरह के मेरोज़ोइट्स चरण 2.5 में स्किज़ोन्ट्स की आवृत्ति के आकलन की ओर नहीं गिने जाते हैं।

मच्छरों से लार ग्रंथियों को हटाना चुनौतीपूर्ण हो सकता है यदि उपयोगकर्ता मच्छर शरीर विज्ञान या छोटे पैमाने पर विच्छेदन से अपरिचित है। मच्छरों से लार ग्रंथियों के अलगाव के दौरान, ध्यान दें कि ग्रंथियों के पारभासी का उपयोग उन्हें अपारदर्शी मच्छर मलबे से अलग करने के लिए किया जा सकता है (चित्रा 2)। ग्रंथियों के विघटन के बाद स्पोरोज़ोइट्स की गिनती 400x आवर्धन पर सबसे कुशल है, और चरण-कंट्रास्ट का उपयोग गिनती कक्ष के भीतर स्पोरोज़ोइट्स की आसान पहचान की अनुमति देता है।

हमने दिखाया है कि हेपेटोसाइट्स में 90% से अधिक प्लास्मोडियम संभवतः सेल-आंतरिक प्रतिरक्षा तंत्र23 के माध्यम से समाप्त हो जाते हैं। इसलिए, हम उम्मीद करते हैं कि हेपेटोसाइट्स की काफी संख्या में परजीवी लाइसिस से गुजरेंगे। मेजबान हेपेटोसाइट्स में प्लास्मोडियम या इसके पीवी के लाइसिस को निर्धारित करने के लिए एक उपकरण के रूप में, हमने जीएफपी 1-10 सबयूनिट (हेपा-जीएफपी 1-10) और ट्रांसजेनिक पी बर्गेई को व्यक्त करते हुए ट्रांसजेनिक हेपेटोसाइट्स उत्पन्न किए। जीएफपी1-10 टुकड़ा, जिसमें जीएफपी क्रोमोफोर का गठन करने वाले अवशेष होते हैं, अपने आप में नॉनफ्लोरोसेंट है और जीएफपी11 के साथ जुड़ने पर ही फ्लोरेसेस होता है, संभवतः आत्म-पूरक के माध्यम से। प्लाज्मोडियम में ट्रांसजेनेसिस को कार्यात्मक रूप से मान्य करने के अलावा, पीबी-जीएफपी 11 संक्रमित हेपा-जीएफपी1-10 मेजबान कोशिकाओं में हरे रंग के प्रतिदीप्ति संकेत की पीढ़ी ने पीवी के लाइसिस का संकेत दिया (चित्रा 3)। बर्गेई-संक्रमित हेपा-जीएफपी 1-10 कोशिकाएं या पीबी-जीएफपी11-संक्रमित जंगली-प्रकार हेपा 1-6 कोशिकाएं किसी भी हरे रंग की प्रतिदीप्ति संकेत उत्पन्न करने में विफल रहीं (डेटा नहीं दिखाया गया)। हम पीवी के लाइसिस को यकृत चरण प्लास्मोडियम के विनाश में एक महत्वपूर्ण पूर्ववर्ती कदम मानते हैं। हेपेटोसाइट्स में परजीवियों की कल्पना करने के लिए पीबी-जीएफपी11 स्पोरोज़ोइट्स को सीटीवी के साथ भी दाग दिया गया था। सीटीवी को परजीवी के लाइसिस पर ही मेजबान कोशिका में लीक होने की उम्मीद है (चित्रा 3)। मेजबान हेपेटोसाइट में देखा गया छितरी हुई सीटीवी संकेत संभवतः हेपेटोसाइट के भीतर परजीवी के लाइसिस को इंगित करता है। पीवी और परजीवी दोनों के सहवर्ती लाइसिस के साथ सीटीवी और जीएफपी संकेतों के बीच घनिष्ठ ओवरलैप की उम्मीद है। यह प्रणाली हमें प्लास्मोडियम या इसके पीवी के लाइसिस को संशोधित करने में जन्मजात और कोशिका-आंतरिक प्रतिरक्षा मार्गों में व्यक्तिगत मेजबान अणुओं के अलग-अलग योगदान को क्वेरी करने की अनुमति देती है।

Figure 1
चित्र 1: प्लास्मोडियम बर्गेई स्किज़ोन्ट्स। प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियां जो जिम्सा दाग से सना हुआ पैरासिटाइज्ड माउस ब्लड कल्चर (16 घंटे) में पी बर्गेई स्किज़ोन्ट्स को दर्शाती हैं। तीर पूरी तरह से परिपक्व (ए) या अपरिपक्व (बी) स्किज़ोन्ट्स का संकेत देते हैं। स्केल सलाखों: 5 μm . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: मच्छर लार ग्रंथियां और स्पोरोज़ोइट्स। पीबी-जीएफपी11 संक्रमित मादा एनोफिलीज मच्छरों से अलग लार ग्रंथियों को दर्शाते हुए प्रकाश माइक्रोस्कोपी चित्र। (ए) लार ग्रंथियों (तीर) के साथ एक मच्छर के सिर की छवि अभी भी विच्छेदन के दौरान बरकरार है, इसके हटाने और आगे की प्रक्रिया से पहले (स्केल बार: 1 मिमी)। (बी, सी) निचले (बी) और उच्च (सी) आवर्धन (स्केल बार: 0.1 मिमी और 0.04 मिमी, क्रमशः) पर लार ग्रंथियों की प्रतिनिधि छवियां। स्पोरोज़ोइट्स ग्रंथि (तीर) के अंदर और बाहर दोनों को देखा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: मेजबान हेपेटोसाइट्स में प्लास्मोडियम और इसके पैरासिटोफोरस रिक्तिका के लाइसिस का पता लगाना। अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) और छद्म रंगीन इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां ओवरले के साथ पीबी-जीएफपी 11 स्पोरोज़ोइट्स से संक्रमित हेपा-जीएफपी1-10 हेपेटोसाइट्स को दर्शाती हैं। स्पोरोज़ोइट्स को संक्रमण से पहले सीटीवी से दाग दिया गया था (स्केल बार: 10 μm)। कुल 1 x 106 हेपा-जीएफपी 1-10 हेपेटोसाइट्स को 35/10 मिमी ग्लास-बॉटम कल्चर डिश में चढ़ाया गया और चढ़ाना के 4 घंटे बाद 3 x 105PbGFP11 स्पोरोज़ोइट्स के साथ टीका लगाया गया। छवियों को 600 x आवर्धन पर एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ और संक्रमण के बाद 16 घंटे में लिया गया था। संक्षेप: डीआईसी = अंतर हस्तक्षेप विपरीत। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हमने ट्रांसजेनिक पी बर्गेई परजीवी की कई लाइनें बनाने के लिए हमारी प्रयोगशाला में उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग किया है। हालांकि पी बर्गेई के लिए अनुकूलित, हमने ट्रांसजेनिक पी योएली स्पोरोज़ोइट्स उत्पन्न करने के लिए इस प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। चूहों में ट्रांसक्रिप्टेड स्किज़ोन्ट्स को इंजेक्ट करने के बाद, परजीवी आमतौर पर सभी समूहों में 3 डी.पी.पी. से बाद में पता लगाने योग्य होते हैं, जिसमें कोई प्लास्मिड नियंत्रण भी शामिल है। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद परजीवियों की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए परजीवीमिया का पता चलने के बाद ही चयन शुरू किया जाता है। इसके अतिरिक्त, दवा चयन की तैयारी करते समय, हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ पानी का अम्लीकरण, पीएच को 4 तक नीचे लाना, पाइरिमेथामाइन को पूरी तरह से भंग करने के लिए आवश्यक हो सकता है। हम बिना प्लास्मिड नियंत्रण समूह से परजीवियों की पूरी निकासी की उम्मीद करते हैं, जबकि ट्रांसेंट्स के साथ टीका लगाए गए चूहे संक्रमित रहते हैं। नियंत्रण चूहों में निकासी आमतौर पर पाइरिमेथामाइन उपचार की शुरुआत के 5-8 दिन बाद होती है। बर्गेई से संक्रमित बी 6 चूहे प्रयोगात्मक सेरेब्रल मलेरिया के लक्षण दिखा सकते हैं और मृत्यु के शिकार हो सकते हैं (संस्थागत पशु उपयोग दिशानिर्देशों के अनुसार मानवीय समापन बिंदु का पालन करें), आमतौर पर 6-12 डी.पी.आई के अंतराल में। टीसीआरकेओ चूहों25 में ट्रांसट्रांसेंट्स के दवा चयन करके, या 5 डी.पी. पर चयन से गुजरने वाले परजीवियों को नए बी 6 प्राप्तकर्ताओं में स्थानांतरित करके और बाद में चयन जारी रखकर इससे बचा जा सकता है। प्लास्मोडियम में ट्रांसजेनेसिस को विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग करके सत्यापित किया जा सकता है, जैसे आनुवंशिक स्क्रीन, फेनोटाइपिक मूल्यांकन, या विशिष्ट कार्यों का लाभ या हानि।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि परजीवी में पेश किए गए डीएनए के सफल अभिकर्मक और प्रतिधारण के लिए एक उपयुक्त प्लास्मिड का चयन महत्वपूर्ण है। प्लास्मिड विभिन्न प्लाज्मोडियम प्रजातियों में ट्रांसजेनेसिस प्राप्त करने में सीमित प्रभावकारिता भी दिखा सकते हैं। उदाहरण के लिए, पीएसकेएसपीजीएफपी 11 प्लास्मिड (पीएल 0017 पर आधारित; बीईआई संसाधन) हमने पीबीजीएफपी11 उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया है, जिसका उपयोग ट्रांसजेनिक पी योली को कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन पी चाबौडी नहीं। पीएसकेएसपीजीएफपी 11 उत्पन्न करने के लिए, हमने मूल पीएल 0017 प्लास्मिड (बीईआई संसाधन) में जीएफपी उत्परिवर्ती 3 अनुक्रम को सुपर-फ़ोल्डर जीएफपी, जीएफपी 11 (जीएफपी 11-7एक्स) 18 के11 वें β-स्ट्रैंड के सात अग्रानुक्रम अनुक्रमों के साथ बदल दिया। यद्यपि अभिकर्मक से पहले प्लास्मिड का रैखिककरण बेहतर जीनोमिक एकीकरण की अनुमति देता है, रैखिक और परिपत्र प्लास्मिड दोनों हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करके समान अभिकर्मक क्षमता दिखाते हैं। गोलाकार प्लास्मिड के साथ अभिकर्मक द्वारा उत्पन्न प्लास्मोडियम लाइनें भी मच्छरों में स्पोरोज़ोइट्स की पीढ़ी के दौरान अपने ट्रांसजेनिक गुणों को बनाए रखती हैं।

विशेष रूप से, केवल मादा मच्छर प्लास्मोडियम को आश्रय और संचारित कर सकते हैं।मच्छरों के अलगाव के बाद, इस स्तर पर अलग-थलग मच्छरों को चीनी के पानी का स्रोत प्रदान नहीं करने की सिफारिश की जाती है। इस तरह से उन्हें भूखा रखने से किसी भी नर मच्छरों के मरने की संभावना बढ़ जाएगी जो अनजाने में स्थानांतरित हो सकते हैं, और मादाएं संक्रमित चूहों से रक्त को अधिक कुशलता से खिलाती हैं। हम आम तौर पर चूहों से मच्छरों को संक्रमण स्थानांतरित करने के 1 दिन बाद चीनी का पानी वापस करते हैं। यह उल्लेखनीय है कि मच्छरों में स्पोरोज़ोइट के विकास और परिपक्वता के लिए समय सीमा ट्रांसजेनिक प्लास्मोडियम लाइनों के बीच भिन्न हो सकती है। इसलिए, प्रत्येक ट्रांसजेनिक लाइन के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल स्थापित करने से पहले संक्रमण के बाद कई समय बिंदुओं पर लार ग्रंथियों में स्पोरोज़ोइट संख्या का आकलन करना महत्वपूर्ण है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को एसपीके को AI168307 राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था।  हम यूजीए सीटीईजीडी फ्लो साइटोमेट्री कोर और यूजीए सीटीईजीडी माइक्रोस्कोपी कोर को धन्यवाद देते हैं। हम प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने में ऐश पाठक, ऐनी इलियट और यूजीए स्पोरोकोर के कर्मचारियों के योगदान को भी स्वीकार करते हैं। दाइची कामियामा को मूल्यवान अंतर्दृष्टि, चर्चा और जीएफपी 11 और जीएफपी 1-10 युक्त मूल प्लास्मिड के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम कुरूप प्रयोगशाला के सदस्यों को उनके निरंतर समर्थन, धैर्य और प्रोत्साहन के लिए भी धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 G x 1/2" Syringe needle Exel international 26437
Alsever's solution Sigma-Aldritch A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 Lonza VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) TCI America T1420
Blood collection tubes BD bioscience 365967 for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer INCYTO DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish Greiner Bio-One 627860
Centrifuge 5425 Eppendorf 5405000107
Centrifuge 5910R Eppendorf 5910R For gradient centrifugation
Delta Vision II - Inverted microscope system Olympus IX-71
Dimethyl Sulfoxide Sigma D5879-500ml
Fetal bovine serum GenClone 25-525
GFP11 plasmid Kurup Lab pSKspGFP11 Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain Sigma-Aldritch 48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells Kurup Lab Hepa GFP1-10 Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum Used for mosquito dissection media
NaCl Millipore-Sigma SX0420-5 1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II Amaxa Biosystems (Lonza) Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette VWR 14673-043
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldritch P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium) Cytivia 17-0891-02 Details in protocol
PL0017 Plasmid BEI Resources MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration) Sigma 46706 Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640 Corning 15-040-CV
SoftWoRx microscopy software Applied Precision v6.1.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Geneva. World Health Organization. , 1 (2020).
  2. Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
  3. Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
  4. Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P. Pre-erythrocytic vaccines against malaria. Vaccines. 8 (3), 400 (2020).
  5. Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
  6. Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
  7. Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7 (2020).
  8. Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
  9. Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321 (2014).
  10. Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
  11. Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).
  12. Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
  13. Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).
  14. Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86 (2014).
  15. Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
  16. Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).
  17. Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
  18. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  19. Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
  20. Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
  21. de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
  22. Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).
  23. Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).
  24. Bowers, C., et al. Cryopreservation of Plasmodium sporozoites. Pathogens. 11 (12), 1487 (2022).
  25. Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).

Tags

आनुवंशिक रूप से संशोधित प्लास्मोडियम बर्गेई स्पोरोज़ोइट्स मलेरिया परजीवी प्लाज्मोडियम एनोफिलीज मच्छर यकृत-चरण विकास नैदानिक मलेरिया प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ट्रांसजेनिक परजीवी रक्त-चरण पी. बर्गहेई मच्छर लार ग्रंथियां विवो प्रयोग में इन विट्रो प्रयोग ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) यकृत-चरण मलेरिया
आनुवंशिक रूप से संशोधित <em>प्लास्मोडियम बर्गेई</em> स्पोरोज़ोइट्स उत्पन्न करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bowers, C., Kurup, S. P. Generating… More

Bowers, C., Kurup, S. P. Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites. J. Vis. Exp. (195), e64992, doi:10.3791/64992 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter