Summary
הפרוטוקול הנוכחי המדמה תסמונת חבל הטבור המרכזי (CCS) בעכברים שיפר את יכולת החזרתיות וממזער את הנזק הניתוחי לחיות הניסוי, תוך הימנעות משיבוש יתר של המבנה האנטומי. האסטרטגיה במחקר זה מועילה מכיוון שהיא מאפשרת מחקר של מנגנוני פציעה על ידי הפקת תוצאות עקביות.
Abstract
מודלים של בעלי חיים של תסמונת חבל הטבור המרכזי (CCS) יכולים להועיל באופן משמעותי למחקר פרה-קליני. מסלולים אנטומיים הניתנים לזיהוי יכולים לתת גישות חשיפה זעיר פולשניות ולהפחית פגיעה נוספת בחיות ניסוי במהלך הפעולה, מה שמאפשר שמירה על מורפולוגיה אנטומית עקבית ויציבה במהלך ניסויים כדי למזער הבדלים התנהגותיים והיסטולוגיים בין פרטים כדי לשפר את יכולת השחזור של ניסויים. במחקר זה, חוט השדרה ברמת C6 נחשף באמצעות פלטפורמה קואקסיאלית של פגיעה בחוט השדרה (SCICP) ובשילוב עם טכניקה זעיר פולשנית. בעזרת מייצב חוליות, קיבענו את החוליות ודחסנו את חוטי השדרה של עכברי C57BL/6J עם משקולות של 5 גרם/מ"מ2 ו-10 גרם/מ"מ2 עם SCICP כדי לגרום לדרגות שונות של פגיעה בחוט השדרה C6. בהתאם לתיאור הקודם של CCS, התוצאות מגלות כי הנגע במודל זה מרוכז בחומר האפור סביב הכבל המרכזי, מה שמאפשר מחקר נוסף על CCS. לבסוף, תוצאות היסטולוגיות מסופקות כהתייחסות לקוראים.
Introduction
בשנים האחרונות אנו עדים לעלייה מתמדת בשכיחות של פגיעה בחוט השדרה (SCI), עם יותר פציעות בקרב אנשים מבוגרים מטאומה1 פחות אלימה. פציעות אלה מערבות בתדירות גבוהה יותר את עמוד השדרה הצווארי ולעיתים קרובות יותר מובילות לתפקוד נוירולוגי לקוי2.
במאה העשרים ואחת, CCS הוא הסוג הנפוץ ביותר של SCI חלקי, המהווה יותר ממחצית מכל SCI. בהשוואה ל- SCI לא שלם קונבנציונאלי, CCS מאופיין בליקוי רב יותר באופן לא פרופורציונלי של הגפיים העליונות מאשר התחתונות3. היא מאופיינת בעיקר בחולשה בגפיים העליונות עם תפקוד תחושתי ותפקוד לקוי פחות משמעותי של שלפוחית השתן. CCS נחשב כנגרם על ידי דימום פוסט-טראומטי באזור המרכז ובצקת או, כפי שהוצע לאחרונה, על ידי ניוון וולרי מדחיסה של חוט השדרה בהיצרות תעלת עמוד השדרה. הניהול של CCS חסר ראיות ברמה גבוהה כדי להדריך, אשר דורש הבנה מקיפה של הפתופיזיולוגיה שלה4. עם זאת, מודלים של CCS לא דווחו. מודלים מתאימים של בעלי חיים חיוניים להבנת הפתופיזיולוגיה, אשר יכולים לספק בסיס מחקרי למחקרים קליניים ופרה-קליניים 5,6,7,8,9,10.
במחקר זה, מודל CCS בעכברים מבוסס עם פלטפורמה קואקסיאלית לפגיעה בחוט השדרה (SCICP) ותוכנית ניתוח זעיר פולשנית, המאפשרת מחקר נוסף והבנה של CCS. המודל הוכח כתקף במהלך תהליך המחקר על ידי דימות היסטולוגי, דימות תהודה מגנטית (MRI) וניתוח אימונופלואורסצנטי.
Protocol
הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה והרווחה של חיות מעבדה של מכללת Cheeloo לרפואה של אוניברסיטת שאנדונג (מספר אישור: 22021). הם בוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסם על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (פרסומי NIH מס '85-23, מתוקן 1996). כל העכברים ששימשו במחקר זה היו נקבות C57BL/6J בנות 9-10 שבועות שנרכשו מחברת בעלי החיים הניסיוניים ג'ינאן פנגיואה (ג'ינאן, סין). 9 עכברים שהשתתפו במחקר זה חולקו באופן אקראי באופן שווה לקבוצות הביקורת, הקלות והחמורות. ב-7, 28 ו-70 יום לאחר הפציעה, הוקרב עכבר אחד מכל קבוצה.
1. C6 למינקטומיה וחשיפה לחוט השדרה
הערה: החשיפה בוצעה תחת מיקרוסקופ. דימום ניתן למנוע על ידי שימת לב לשני היבטים: (i) כל כלי הדם יש להימנע. (ii) יש להפריד את השרירים בנקודות המוצא והסיום של השריר.
- הכינו כלי ניתוח ו-SCICP.
הערה: המבנה של SCICP דווח במחקר קודם11. ההבדל ביחס למחקר הקודם הוא שהפרוטוקול הנוכחי משיג פגיעה בחוט השדרה על ידי דחיסה. שני משקלים שונים (10.4 גרם ו-20.8 גרם) של פלטפורמה זו יכולים לייצר דחיסה של 5 גרם/מ"מ2 ו-10 גרם/מ"מ2, בהתאמה (איור 1). שלבי החשיפה והדחיסה של חוט השדרה מוצגים באיור 2. - מתן איזופלורן לעכבר על ידי שאיפה באמצעות חרוט אף (אינדוקציה: 3%-5%, תחזוקה: 1.5%-2%).
- לאחר שההרדמה נכנסת לתוקף, חקרו בליטה קטנה בקו האמצע מאחורי צוואר העכברים, שהיא התהליך עמוד השדרה של חוליית בית החזה השנייה (T2).
- יש לגלח את השיער סביב בליטה זו. לחטא את העור עם שלושה יישומים לסירוגין של תמיסת יודופור ואחריה חיטוי העור 75% אתנול.
- מקם את העכבר נוטה על שולחן הניתוחים. החל משחת עיניים כדי להגן על העיניים.
- הניחו כרית בעובי 3-4 מ"מ מתחת לחזה כדי לאפשר קימור מקושת של עמוד השדרה הצווארי, מה שמקל על חשיפת החלל הבין-למינה ונתיב אוויר ללא הפרעה במהלך הניתוח. להזריק buprenorphine כמו שיכוך כאבים לפני הניתוח (0.05-0.1 מ"ג / ק"ג, SQ).
- בצעו חתך אורכי בקוטר 1-1.5 ס"מ עם אזמל סטרילי שבמרכזו התהליך הספינוסי של חוליית בית החזההשנייה כדי לחשוף את השכבה הפאשיאלית (איור 2A).
- הסר חלק מרקמת השומן מעל T2 עם מספריים מיקרו סטריליים כדי למצוא את תהליך עמוד השדרה T2.
- הפרידו את שרירי הטרפז והרומבואיד הדו-צדדיים מ-C5-T2 לאורך קו האמצע בעזרת מיקרו-מספריים (איור 2B).
- הפרידו את השרירים על הלמינה של חוליות C5-T2 בעזרת מיקרו מספריים, ומשכו את שכבת השריר לצדדים בעזרת מיקרו-רטקטיטורים סטריליים (איור 2C).
- חתכו את שרירי עמוד השדרה הרב-צדדיים והצוואריים על פני החוליות.
- אתר T2 לפי הנקודה הגבוהה ביותר של התהליכים בעמוד השדרה. בחנו את התהליכים בעמוד השדרה ברצף לקראת הקצה הרוסטרלי מ-T2 כדי לאתר את C6 (איור 3).
- הרימו את הלמינה C6 בעזרת מלקחיים, חתכו את הלמינה, וחוט השדרה חשוף (איור 2D).
2. פגיעה בדחיסת חוט השדרה הצווארי
- הדקו את מפרקי הפאה C6-7 עם מייצב החוליות ונעלו אותו (איור 2E).
- כוונו את קצה המשקולת הסטרילית אל חוט השדרה החשוף, וודאו שהחלק התחתון השטוח של הקצה ממוקם במקביל לפני השטח הגבי של חוט השדרה (איור 2F).
- כוונן את השרוול כדי לגרום למשקל לדחוס את חוט השדרה. הפסיקו לכוונן כאשר המשקולת שומרת על מיקום יחסי קבוע עם חוט השדרה (איור 2G).
הערה: אל תהפוך תהליך זה לאלים או מהיר מדי במקרה שהמשקל מפעיל כוח חבלה על חוט השדרה. - הסר את המשקל ואת מייצב החוליות לאחר דחיסה של 5 דקות.
- שימו לב לשינויי הצבע של חוט השדרה לאחר דחיסה מתחת למיקרוסקופ (איור 2H).
- יש לשטוף עם PBS סטרילי ולהשתמש בשאיבה כדי לנקות את אתר הניתוח.
- תפרו את השרירים והעור בשכבות באמצעות תפר פוליפרופילן שאינו נספג (גודל: 6-0).
- יש לחטא את אזור הניתוח, להניח את העכבר על כרית חמה עד שהעכבר יחזור להכרה מלאה, ולאחר מכן להחזיר את העכבר לכלוב העכבר.
- להזריק buprenorphine עבור שיכוך כאבים (0.05-0.1 מ"ג / ק"ג, SQ) כל 8-12 שעות במשך 3 ימים.
3. ניתוח היסטולוגי
- להרדים את העכבר על ידי הזרקה intraperitoneal של 1.25% tribromoethanol (0.02 מ"ל / גרם משקל גוף) בימים 7, 28, או 70 לאחר פציעה. יש להחדיר לעכבר 60 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) ו-20 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד11.
- חצו את חוט השדרה במרחק של 0.5 ס"מ ממרכז הנגע משני הצדדים בעזרת מספריים מיקרו, ושמרו על החלק שאורכו 1 ס"מ.
- טבלו את קטע חוט השדרה המשומר ב-30% סוכרוז ב-4°C למשך 48 שעות.
- הטמע את הרקמות עם OCT, פרוס את הרקמות לחלקים בעובי 6 מיקרומטר עם קריוטום ואסף את החלקים על שקופית זכוכית.
- צביעת המטוקסילין ואאוזין
- שטפו את המקטעים בגודל 6 מיקרומטר עם 1x PBS במשך 5 דקות 3 פעמים כדי להסיר שאריות OCT.
- לטבול את החלקים hematoxylin במשך 90 שניות. שטפו את החלקים תחת מים זורמים במשך 3 דקות.
- לטבול את החלקים eosin במשך 4 דקות. השרו 95% אלכוהול למשך 30 שניות כדי להסיר עודפי אאוזין.
- לבסוף, יש לייבש את המגלשות באלכוהול (95% אלכוהול ו-100% אלכוהול פעמיים, ברצף) למשך 30 שניות ולשים את המגלשות באמבט קסילן לניקוי למשך 2 דקות. לאחר מכן, אטמו את החלקים עם כיסוי וג'ל שרף.
- כתמים כחולים פרוסיים
- השקיעו את המגלשות במשך 20 דקות בתערובת שווה של אשלגן פרוציאניד (10%) וחומצה הידרוכלורית (10%).
- יש לשטוף 3 פעמים במים מזוקקים, ולהכתים נגד כתמים במשך 5 דקות עם Nuclear Fast Red.
- יש לשטוף שלוש פעמים במים מזוקקים, ולאחר מכן שטיפה אחת עם 95% אלכוהול ושתי שטיפות עם 100% אלכוהול במשך 5 דקות.
- נקה את החלקים בקסילן פעמיים למשך 3 דקות כל אחד ולאחר מכן אטם עם ג'ל שרף12.
- צביעה אימונופלואורסצנטית
- דגרו על השקופיות עם הנוגדנים העיקריים הבאים למשך שעה אחת ב-37°C: מולקולת מתאם קשירת סידן אנטי-מייננת ארנבת 1 (Iba-1) (1:500), אשר הווסתה בתאי מיקרוגליה לאחר פגיעה עצבית; חלבון חומצי פיברילרי נגד גליה בעכבר (GFAP) (1:300), המתבטא באסטרוציטים במערכת העצבים המרכזית; ארנב anti-neurofilament-200 (NF-200) (1:2000), אשר מבוטא neurofilament.
- דגירה עם נוגדנים משניים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT): Alexa Fluor488 עז נגד עכבר ו-Alexa Fluor594 עז נגד ארנב (1:1,000).
- צלם תמונות ונתח עוד יותר עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי13.
4. הדמיית תהודה מגנטית
- יש להרדים את העכבר 7 ימים לאחר הפציעה באמצעות הרדמה איזופלורנית (1%-2% איזופלורן, 20%-30% O2) הניתנת באמצעות מסכת מיני.
- סרוק את חוט השדרה הצווארי בכיוון קשת. השתמש בהגדרות הבאות עבור הדמיית MRI: רצף ספין-הד (SE) בצורה מרובת פרוסות ושזורות עם TR/TE = 2500/12 אלפיות השנייה, מטריצת רכישה = מטריצה של 256 x 128 מעל שדה הראייה (FOV) = 12 x 8 מ"מ2, עובי הפרוסה = 1 מ"מ ומספר העירורים (NEX) = 2.
הערה: שמור על קצב הנשימה של העכבר על 10-15/דקה במהלך הסריקה כדי למנוע תוצרי תמונה הקשורים לנשימה14.
Representative Results
מקטע ה-HE הסגיטלי עולה כי למרות שהאזור הפגוע בחומר האפור היה רחב יותר בקבוצה הקשה, הייתה המשכיות על החומר הלבן. בנוסף, ההבדל בשטח החומר האפור הפגוע בין הקבוצות החמורות והקלות תומך בסבירות ההגדרה הקבוצתית בפרוטוקול (איור 4).
מקטעי העטרה HE עולה כי הנגע קיים בעיקר בחומר האפור בשתי הקבוצות. בקבוצה החמורה היה סיכוי גבוה יותר שמבנה החומר הלבן המקיף את החומר האפור יושפע, אולם קווי המתאר של החומר הלבן עדיין נשמרו (איור 5). NF-200 immunofluorescence מצביע על כך שלמרות שהחומר הלבן סביב החומר האפור הושפע בקבוצה הקשה, החומר הלבן עדיין היה שלם יחסית. תוצאות אלה תואמות את המאפיינים שתוארו עבור CCS במחקר הקודם4 (איור 6).
לא נמצאו תאי דם אדומים בניתוחי קשת לאחר 7 ימים לאחר הפציעה בקבוצה הקלה או הקשה. הכתם הכחול הפרוסי לא גילה המוסידרוזיס בקבוצה הקלה אלא בקבוצה הקשה. תוצאות אלה מצביעות על כך שזירוז הדימום עשוי לדרוש מידה חמורה יחסית של נזק (איור 7).
אימונופלואורסנציה חשפה אזורים של ביטוי מוגבר של GFAP ו- Iba-1 בפציעה קלה וחמורה, מה שמרמז על תגובה דלקתית והיווצרות צלקת גליה בנגע. כמו כן, הקבוצה החמורה הציגה שטח נגע גדול יותר מאשר הקבוצה הקלה (איור 8).
MRI היא שיטה זעיר פולשנית יחסית לצפייה בחוט השדרה. התוצאות מצביעות על כך שגם בקבוצות הקלות וגם בקבוצות החמורות, יש שינוי אות היפואינטנסיבי בנגע עם מתאר אות גבוה. הקבוצה החמורה הראתה אזור אות היפואינטנסיבי גדול משמעותית (איור 9). האות ההיפואינטנסיבי מצביע על משקע מהרטיקולוציטים ליזט באזור זה, והאות ההיפר-אינטנסיבי שמסביב מצביע על תגובה דלקתית. במחקר הקודם ערכנו מספר מבחנים התנהגותיים. לדוגמה, מבחן חוזק האחיזה בגפיים הקדמיות מגלה הבדל משמעותי15.
איור 1: השרוול והמשקולות של SCICP. שטח הפנים של הקצה תוכנן להיות 1.3 מ"מ x 1.6 מ"מ בהתבסס על האזור החשוף של חוט השדרה שנמדד לאחר כריתת C6. המשקולת מצופה ב-PTFE, מה שמפחית ביעילות את החיכוך בין הדופן הפנימית של השרוול לבין המשקל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: חשיפה ודחיסה של חוט השדרה. (A) חתך אורכי של העור; (B) להפריד את השרירים באופן רוסטרלי מתהליך עמוד השדרה T2; (ג) להפריד את השרירים שמעל הלמינה; (D) כריתת למינקטומיה C6; (ה) תיקון גוף החוליה; (ו) קביעת מיקום הדחיסה; (G) דחיסה של חוט השדרה; (H) אין נזק משמעותי לחומר הלבן מעל חוט השדרה לאחר דחיסת חוט השדרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אנטומיה של שלד צוואר הרחם של עכבר. האתר המצוין על ידי החץ הוא תהליך עמוד השדרה T2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: החתכים המוכתמים ב-HE הסגיטלי. (A) מקטע סגיטלי של חוט השדרה הצווארי. (ב,ג) לקבוצה החמורה היה נזק חמור יותר מאשר לקבוצה המתונה, אך שתיהן התמקדו בחומר האפור סביב החוט המרכזי. התמונות של 7, 28 ו-70 dpi מצביעות על כך שאין הבדל משמעותי בביטוי הפגיעה באותה קבוצת פציעה בתקופות שונות, וכי רציפות החומר הלבן בחוט השדרה העליון והתחתון נשמרת. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: פגיעה בחוט השדרה הצווארי, קטעים מוכתמים בקורונל. (א-ג) הפגיעה משפיעה בעיקר על החומר האפור המקיף את החוט המרכזי, כפי שניתן לראות בלוחות B ו-C. קבוצת הפציעה הקשה סובלת ממגוון רחב יותר של נזקים מאשר קבוצת הפציעה הקלה, אשר סביר יותר שתשפיע על החומר הלבן. סרגל קנה מידה: 400 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: NF-200 coronal immunofluorescence לאחר פציעה. תגובת NF-200 ללא הבדל משמעותי במתווה החומר הלבן. סרגל קנה מידה: 400 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: כתמים כחולים פרוסיים. (A-C) המוסידרוזיס נצפתה בקבוצה הקשה אך לא בקבוצה הקלה. סרגל קנה מידה: 400 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: GFAP Sagittal ו-Iba-1 immunofluorescence after injury. (א-ג) ככל שדרגת הפציעה עולה, שטח התגובה של GFAP ו-Iba-1 גדל. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: MRI Sagittal לאחר פגיעה בחוט השדרה הצווארי (תמונות משוקללות T2). אזור הפציעה נצפה כאות היפו-אינטנסיבי בקבוצות הפציעה הקלה והחמורה, עם שטח רחב משמעותית של אות היפו-אינטנסיבי בקבוצת הפציעה הקשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
מבין הסוגים הרבים של פגיעה בחוט השדרה, CCS הוא אחד מסוגי הפגיעה הפוטנציאליים ביותר הניתנים לטיפול 3,4. בשל היעדר מודלים מחקריים במעבדה, המחקר על CCS משנות החמישים התמקד במחקרים קליניים ובחקירות דיסקציה של גופות 3,16,17. המחקר הנוכחי מראה שימוש בכלים תואמים ופרוצדורות זעיר פולשניות כדי לבסס את מודל CCS של עכברים. מנקודת מבט טכנית, פלטפורמה זו יש יכולת הפעלה חזקה ויכולת שחזור טובה. בהתחשב בכך שתוצאות הניסוי מדגימות את התוקף, הטכניקה שלנו לבסס את המודל הקרוב ביותר לתקן שמחקרים קודמים הגדירו עבור CCS4.
מחקרים קודמים על פציעת דחיסה השתמשו בעיקר בקליפסים למפרצת, בלונים ומלקחיים מכוילים 9,10,18. יתר על כן, רוב הפציעות התרחשו ברמה של חוט השדרה החזי18. חוט השדרה ברמת C6 נבחר כמקטע הפגוע במחקר זה כדי לחקור את המאפיינים של CCS. כדאי לשים לב ששיעור ההישרדות של מודל CCS הוא גם גורם חיוני בהבטחת עקביות ניסיונית. המחקר הנוכחי מדווח על גרימת פגיעת דחיסה דו-צדדית בחוט השדרה הצווארי של העכבר, בעוד שפגיעה טראומטית בחוט השדרה ברמה גבוהה, במיוחד פגיעה דו-צדדית, עלולה להיות קטלנית עבור חיות ניסוי אם היא חמורה מדי. לדברי אל-בוהי, חוט השדרה C4/5 סביר יותר להשפיע על מערכת הבולבוסנל היורדת ועל מוטונוירונים הקשורים לנשימה, מה שמוביל חיות ניסוי לדיכאון נשימתי ומוות 18,19,20,21,22,23., במחקר זה, עכברים עם דרגות שונות של דחיסה על חוט השדרה הצווארי C6 יש מאפייני פציעה מובחנים באופן משמעותי המוצעים על ידי בדיקות היסטולוגיות. למרות שהיו הבדלים התנהגותיים והיסטולוגיים משמעותיים במודל הידוק חוט השדרה הצווארי של העכבר שדווח על ידי פורג'יונה, נדרשו שיבוש של הדוכנים, תהליכים מפרקיים, למינה ואפילו שורשי עצבים על מנת להדק את חוט השדרה עם מלחציים מותאמים, אשר השפיעו באופן משמעותי על יציבות מבני צוואר הרחם24. מחקר נוסף על פגיעות בצוואר הרחם דיווח על שימוש בתהליך הרוחבי כאתר קיבוע5. למרות שהתהליכים המפרקיים נמנעו מנזק, פירוק יתר של רקמות שריריות יכול גם להוביל להשפעה על יציבות חוט השדרה. במחקר הנוכחי, רק הלמינה הצווארית ה-6 נכרתה כדי לשמור על יציבות חוט השדרה הצווארי, כאשר המפרקים המפרקיים הסמוכים נשמרו ונזק שרירי מוגזם נמנע. יחד עם זאת, דחיסה מעל חוט השדרה מונעת נזק לשורשי העצבים.
תוצאות ה-HE מצביעות על כך שאזור הפגיעה בחוט השדרה הצווארי של העכברים בכל קבוצה היה בעיקר בחומר האפור הסמוך לחוט המרכזי, שאפיין את CCS, עם הבדלים משמעותיים בהיקף הפגיעה בין הקבוצות השונות. יש לציין כי ייתכן שהקטעים הפתולוגיים שהצגנו הקלו על ביטוי הפציעה מכיוון שהדגימות נאספו מספר ימים לאחר הפציעה. Immunofluorescence (NF-200) הראה פחות נזק לדרכי העצבים באזור החומר הלבן של חוט השדרה, אשר גם אישר כי הנזק CCS היה מרוכז בעיקר סביב החוט המרכזי. תוצאת האימונופלואורסנציה התווספה לתוצאות היסטולוגיות קודמות של הפתולוגיה. מחקרים קודמים הראו כי CCS מוביל בצקת ליד החוט המרכזי, המוביל להמטומה, ובסופו של דבר, תפקוד לקוי בחלק המדיאלי של מערכת קורטיקוספינלית לרוחב3. דימום דווח כמרכיב טיפוסי של CCS, אך נדיר לראות אותו במחקרי הדמיה ונתיחה שלאחר המוות17. במחקר זה, תוצאות HE לאחר 7 ימים לאחר הפציעה הצביעו על סימנים של בצקת רקמות בכל הקבוצות; עם זאת, לא נמצאו שאריות של תאי דם אדומים באזור הפציעה. לכן, הכחול הפרוסי שימש לבדיקת אזור הפציעה לדימום, והתוצאות תאמו עם המוסידרוזיס שנצפתה באזור הפציעה של קבוצת הפציעה הקשה לאחר 7 ימים לאחר הפציעה, בעוד שהקבוצה הקלה לא. תמונות MRI T2 הראו כי הן לפציעות קלות והן לפציעות חמורות היו אזורי אות נמוכים באזור הפגוע של הפציעה לאחר 7 ימים לאחר הפציעה, המציין את התצהיר של reticulocyte lysate כאן. תוצאות אלה מספקות ראיות נסיבתיות לכך שהפער בין הממצאים שדווחו קודם לכן נובע ככל הנראה מכך שבדיקת ה-MRI עשויה להיות רגישה יותר מהבדיקה ההיסטולוגית14, בנוסף לחומרת הפגיעה, מה שעשוי להשפיע גם על כמות הדימום באזור הפגיעה. GFAP בא לידי ביטוי נרחב גם באזור הפגוע. במקביל, ביטוי Iba-1 נצפה גם באזורים שלמים, מה שמרמז על התמדה של תגובה דלקתית, התואמת את תוצאות ה- MRI, שם טבעת של אות היפראינטנסיבי סביב אזור האות ההיפואינטנסיבי בנגע מרמזת על נוכחות של תגובה דלקתית. בסופו של דבר, בהתבסס על תוצאות המחקר הנוכחי, אזור הפגיעה במודל התמקד בחומר האפור סביב החוט המרכזי, אשר בדרך כלל תואם את התיאורים שדווחו בעבר13. למרבה הצער, לא ביצענו MRI באופן חוזר ונשנה בכל חיית ניסוי כדי להראות כיצד אתר הפציעה משתנה באופן דינמי עם הזמן. חוקרים עתידיים יכולים לכלול זאת בעבודתם לחקירה טובה יותר של CCS. כמו כן, תיוג חיסוני עם סמנים עצביים כמו NeuN, המגדירים את החומר האפור יכול להיכלל במחקר.
לסיכום, מאפייני הממצאים בסריקות פתולוגיה ו-MRI דומים מאוד לאלה שתוארו עבור CCS במחקרים קודמים4. הפרוטוקול הנוכחי המידול האפשרי של CCS מאפשר מחקר נוסף והבנה של CCS.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי פרויקט המחקר והפיתוח הלאומי של תאי גזע ומחקר טרנספורמציה (2019YFA0112100) ותוכנית מפתח המדינה של מדעי הטבע הלאומיים של סין (81930070).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
| Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | Abcam | ab8135 | Dilution ratio (1:2000) |
| Eosin Staining Solution (water soluble) | Biosharp | BL727B | |
| Ethanol | Fuyu Reagent | ||
| Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
| Frozen Slicer | Leica | ||
| GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1:600) |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1:1000) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1:1000) |
| Hematoxylin Staining Solution | Biosharp | BL702A | |
| Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
| Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
| Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| Phosphate buffered solution (PBS) | Solarbio | P1020 | pH 7.2–7.4 |
| Prussian Blue Iron Stain Kit (With Eosin) | Solarbio | G1424 | |
| RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
| Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
| Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~ 1~b0yRFKOq&alg_id= 0&slg=tagGoodList-default%2COpBottom%2Cuuid% 2CabTraceId&components_ style_layout =1&reft=1659409105184&spm= g.930111970_f.81386274&alias= 367x5ovgn69q18g&from_uuid= 1362cc46-ffe0-6886-2c65-01903 dbacbba&sf=qq_sm&is_share= 1&shopAutoEnter=1&share_cmpt =native_wechat&is_silence_auth=1 |
| Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
| Tris Buffered Saline+Tween (TBST) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1:19) |
| Xylene | Fuyu Reagent |
References
- Liu, C., et al. Survival in 222 Patients With Severe CSCI: An 8-Year Epidemiologic Survey in Western China. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 100 (10), 1872-1880 (2019).
- Qi, C., Xia, H., Miao, D., Wang, X., Li, Z. The influence of timing of surgery in the outcome of spinal cord injury without radiographic abnormality (SCIWORA). Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 223 (2020).
- Brooks, N. P.
- Avila, M. J., Hurlbert, R. J.
- Forgione, N., Chamankhah, M., Fehlings, M. G. A mouse model of bilateral cervical contusion-compression spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (6), 1227-1239 (2017).
- López-Dolado, E., Lucas-Osma, A. M., Collazos-Castro, J. E. Dynamic motor compensations with permanent, focal loss of forelimb force after cervical spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 30 (3), 191-210 (2013).
- Allen, L. L., et al. Phrenic motor neuron survival below cervical spinal cord hemisection. Experimental Neurology. 346, 113832 (2021).
- Reinhardt, D. R., Stehlik, K. E., Satkunendrarajah, K., Kroner, A. Bilateral cervical contusion spinal cord injury: A mouse model to evaluate sensorimotor function. Experimental Neurology. 331, 113381 (2020).
- Ropper, A. E., Ropper, A. H.
- Sun, G. D., et al. A progressive compression model of thoracic spinal cord injury in mice: function assessment and pathological changes in spinal cord. Neural Regeneration Research. 12 (8), 1365-1374 (2017).
- Elzat, E. Y., et al. Establishing a mouse contusion spinal cord injury model based on a minimally invasive technique. Journal of Visualized Experiments. (187), 64538 (2022).
- Lu, J., Xu, F., Lu, H. LncRNA PVT1 regulates ferroptosis through miR-214-mediated TFR1 and p53. Life Sciences. 260, 118305 (2020).
- Zeng, H., et al. Lentivirus-mediated downregulation of α-synuclein reduces neuroinflammation and promotes functional recovery in rats with spinal cord injury. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 283 (2019).
- Bilgen, M., Al-Hafez, B., Berman, N. E., Festoff, B. W. Magnetic resonance imaging of mouse spinal cord. Magnetic Resonance in Medicine. 54 (5), 1226-1231 (2005).
- Yilihamu, E. E., et al. A novel mouse model of central cord syndrome. Neural Regeneration Research. 18 (12), 2751-2756 (2023).
- Chikuda, H., et al. Effect of early vs delayed surgical treatment on motor recovery in incomplete cervical spinal cord injury with preexisting cervical stenosis: A randomized clinical trial. JAMA Network Open. 4 (11), e2133604 (2021).
- Jimenez, O., Marcillo, A., Levi, A. D. A histopathological analysis of the human cervical spinal cord in patients with acute traumatic central cord syndrome. Spinal Cord. 38 (9), 532-537 (2000).
- Menezes, K., et al. Human mesenchymal stromal/stem cells recruit resident pericytes and induce blood vessels maturation to repair experimental spinal cord injury in rats. Scientific Reports. 10 (1), 19604 (2020).
- Hutson, T. H., Di Giovanni, S. The translational landscape in spinal cord injury: focus on neuroplasticity and regeneration. Nature Reviews. Neurology. 15 (12), 732-745 (2019).
- El-Bohy, A. A., Schrimsher, G. W., Reier, P. J., Goshgarian, H. G. Quantitative assessment of respiratory function following contusion injury of the cervical spinal cord. Experimental Neurology. 150 (1), 143-152 (1998).
- El-Bohy, A. A., Goshgarian, H. G. The use of single phrenic axon recordings to assess diaphragm recovery after cervical spinal cord injury. Experimental Neurology. 156 (1), 172-179 (1999).
- Gonzalez-Rothi, E. J., Lee, K. Z. Intermittent hypoxia and respiratory recovery in preclinical rodent models of incomplete cervical spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 113751 (2021).
- Locke, K. C., Randelman, M. L., Hoh, D. J., Zholudeva, L. V., Lane, M. A. Respiratory plasticity following spinal cord injury: perspectives from mouse to man. Neural Regeneration Research. 17 (10), 2141-2148 (2022).
- Forgione, N., et al. Bilateral contusion-compression model of incomplete traumatic cervical spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 31 (21), 1776-1788 (2014).
