Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

C57BL/6J माउस में सेंट्रल कॉर्ड सिंड्रोम मॉडल की स्थापना

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65028
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Orthopaedics, Qilu Hospital of Shandong University, 2Department of Orthopaedics, Tianjin Medical University General Hospital
* These authors contributed equally

Summary

चूहों में केंद्रीय कॉर्ड सिंड्रोम (सीसीएस) का अनुकरण करने वाले वर्तमान प्रोटोकॉल ने दोहराव में सुधार किया है और प्रयोगात्मक जानवरों को ऑपरेशन क्षति को कम किया है, जिससे शारीरिक संरचना को अत्यधिक बाधित करने से बचा जा सकता है। इस अध्ययन में रणनीति फायदेमंद है क्योंकि यह लगातार परिणाम उत्पन्न करके चोट तंत्र में अनुसंधान की अनुमति देता है।

Abstract

केंद्रीय कॉर्ड सिंड्रोम (सीसीएस) के पशु मॉडल प्रीक्लिनिकल अनुसंधान को काफी हद तक लाभान्वित कर सकते हैं। पहचाने जाने योग्य शारीरिक रास्ते न्यूनतम इनवेसिव एक्सपोजर दृष्टिकोण दे सकते हैं और प्रयोगों की प्रजनन क्षमता में सुधार करने के लिए व्यक्तियों के बीच व्यवहार और ऊतकीय मतभेदों को कम करने के लिए प्रयोगों के दौरान प्रयोगों के दौरान लगातार और स्थिर शारीरिक आकृति विज्ञान के रखरखाव को सक्षम करने के लिए प्रयोगात्मक जानवरों को अतिरिक्त चोट को कम कर सकते हैं। इस अध्ययन में, C6 स्तर की रीढ़ की हड्डी को रीढ़ की हड्डी की चोट समाक्षीय मंच (SCICP) और न्यूनतम इनवेसिव तकनीक के साथ संयोजन का उपयोग करके उजागर किया गया था। एक कशेरुक स्थिरीकरण की सहायता से, हमने कशेरुकाओं को ठीक किया और C57 रीढ़ की हड्डी की चोट के विभिन्न डिग्री को प्रेरित करने के लिए SCICP के साथ 5 g/mm2 और 10 g/mm2 वजन के साथ C6BL/6J चूहों की रीढ़ की हड्डी को संकुचित किया। सीसीएस के पिछले विवरण के अनुरूप, परिणाम बताते हैं कि इस मॉडल में घाव केंद्रीय कॉर्ड के चारों ओर ग्रे पदार्थ में केंद्रित है, जिससे सीसीएस में आगे के शोध को सक्षम किया जा सकता है। अंत में, हिस्टोलॉजिकल परिणाम पाठकों के लिए एक संदर्भ के रूप में प्रदान किए जाते हैं।

Introduction

हाल के वर्षों में रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) की लगातार बढ़ती घटनाएं देखी गई हैं, कम हिंसक तौमा1 से वृद्ध लोगों में अधिक चोटों के साथ। इन चोटों में अधिक बार ग्रीवा रीढ़ शामिल होती है और अधिक बार एक अपूर्ण न्यूरोलॉजिक डिसफंक्शन2 होता है।

इक्कीसवीं सदी में, सीसीएस अपूर्ण एससीआई का सबसे प्रचलित प्रकार है, जो सभी एससीआई के आधे से अधिक के लिए जिम्मेदार है। पारंपरिक अपूर्ण एससीआई की तुलना में, सीसीएस को निचले छोरों की तुलना में ऊपरी की असमान रूप से अधिक हानि की विशेषता है3. यह कम महत्वपूर्ण संवेदी और मूत्राशय की शिथिलता के साथ मुख्य रूप से ऊपरी छोर की कमजोरी की विशेषता है। सीसीएस को पोस्ट-ट्रॉमेटिक सेंट्रल रीजन हेमोरेज और एडिमा के कारण माना जाता है या, जैसा कि हाल ही में प्रस्तावित किया गया है, स्पाइनल कैनाल स्टेनोसिस में रीढ़ की हड्डी के संपीड़न से वालेरियन अपघटन द्वारा। सीसीएस के प्रबंधन में मार्गदर्शन करने के लिए उच्च-स्तरीय साक्ष्य का अभाव है, जिसके लिए इसके पैथोफिज़ियोलॉजी4 की व्यापक समझ की आवश्यकता होती है। हालांकि, सीसीएस के मॉडल की सूचना नहीं दी गई है। पैथोफिज़ियोलॉजी की समझ के लिए उपयुक्त पशु मॉडल आवश्यक हैं, जो नैदानिक और प्रीक्लिनिकल अध्ययन 5,6,7,8,9,10के लिए एक शोध आधार प्रदान कर सकते हैं।

इस अध्ययन में, चूहों में एक सीसीएस मॉडल एक रीढ़ की हड्डी की चोट समाक्षीय मंच (एससीआईसीपी) और एक न्यूनतम इनवेसिव ऑपरेशन योजना के साथ स्थापित किया गया है, जो सीसीएस में आगे के शोध और समझ के लिए अनुमति देता है। मॉडल हिस्टोलॉजिकल, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण द्वारा अनुसंधान प्रक्रिया के दौरान वैध साबित हुआ है।

Protocol

प्रयोगों को शेडोंग विश्वविद्यालय चीलू कॉलेज ऑफ मेडिसिन (अनुमोदन संख्या: 22021) की प्रयोगशाला पशु नैतिक और कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। वे राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच प्रकाशन संख्या 85-23, संशोधित 1996) द्वारा प्रकाशित प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार प्रदर्शन किए गए थे। इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए सभी चूहे जिनान पेंग्यु एक्सपेरिमेंटल एनिमल कंपनी (जिनान, चीन) से खरीदे गए 9-10 सप्ताह की महिला C57BL/6J चूहे थे। इस अध्ययन में शामिल कुल 9 चूहों को नियंत्रण, हल्के और गंभीर समूहों के लिए समान रूप से यादृच्छिक किया गया था। 7, 28 और 70 दिनों के बाद चोट लगने पर, प्रत्येक समूह से एक माउस की बलि दी गई थी।

1. C6 लैमिनेक्टॉमी और स्पाइनल कॉर्ड एक्सपोजर

नोट: एक्सपोजर एक माइक्रोस्कोप के तहत किया गया था। दो पहलुओं पर ध्यान देकर रक्तस्राव से बचा जा सकता है: (i) सभी रक्त वाहिकाओं से बचा जाना चाहिए। (ii) मांसपेशियों को मांसपेशियों के मूल और समाप्ति बिंदुओं पर अलग करने की आवश्यकता होती है।

  1. सर्जिकल उपकरण और SCICP तैयार करें।
    नोट: एससीआईसीपी की संरचना पिछले अध्ययन11 में बताई गई है। पिछले अध्ययन के संबंध में अंतर यह है कि वर्तमान प्रोटोकॉल संपीड़न द्वारा रीढ़ की हड्डी की चोट को पूरा करता है। इस मंच के दो अलग-अलग वजन (10.4 ग्राम और 20.8 ग्राम) क्रमशः 5 ग्राम/मिमी2 और 10 ग्राम/मिमी2 का संपीड़न उत्पन्न कर सकते हैं (चित्र 1)। रीढ़ की हड्डी जोखिम और संपीड़न कदम चित्रा 2 में दिखाया गया है.
  2. एक नाक शंकु (प्रेरण: 3% -5%, रखरखाव: 1.5% -2%) का उपयोग साँस लेना द्वारा माउस के लिए isoflurane प्रशासन.
  3. संज्ञाहरण प्रभावी होने के बाद, चूहों की गर्दन के पीछे मिडलाइन पर एक छोटे से उभार का पता लगाएं, जो दूसरे वक्ष कशेरुका (टी 2) की स्पिनस प्रक्रिया है।
  4. इस उभार के आसपास के बालों को शेव करें। त्वचा एंटीसेप्टिक्स 75% इथेनॉल के बाद एक आयोडोफोर समाधान के तीन वैकल्पिक अनुप्रयोगों के साथ त्वचा कीटाणुरहित करें।
  5. माउस प्रवण को ऑपरेशन टेबल पर रखें। आंखों की सुरक्षा के लिए आंखों का मरहम लगाएं।
  6. छाती के नीचे एक 3-4 मिमी-मोटी पैड बिछाएं ताकि एक आर्किंग ग्रीवा रीढ़ वक्र की अनुमति मिल सके, जिससे ऑपरेशन के दौरान अंतर-लामिना स्थान और एक अबाधित वायुमार्ग के संपर्क में सुविधा हो। ब्यूप्रेनोर्फिन को प्री-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया (0.05-0.1 मिलीग्राम/किग्रा, वर्ग) के रूप में इंजेक्ट करें।
  7. प्रावरणी परत(चित्रा 2ए)को बेनकाब करने के लिए 2एन डी वक्षीय कशेरुका स्पिनस प्रक्रिया पर केंद्रित एक बाँझ स्केलपेल के साथ 1-1.5 सेमी अनुदैर्ध्य चीरा बनाएं।
  8. T2 स्पिनस प्रक्रिया को खोजने के लिए बाँझ सूक्ष्म कैंची के साथ T2 के ऊपर वसा ऊतक के एक हिस्से को हटा दें।
  9. माइक्रो कैंची(चित्रा 2बी)के साथ मिडलाइन के साथ सी 5-टी 2 से द्विपक्षीय ट्रेपेज़ियस और रॉमबॉइड मांसपेशियों को अलग करें।
  10. माइक्रो कैंची के साथ C5-T2 कशेरुकाओं के लामिना पर मांसपेशियों को अलग करें, और बाँझ माइक्रो-रिट्रैक्टर(चित्रा 2C)के साथ पक्षों को मांसपेशियों की परत को वापस लें।
  11. कशेरुकाओं की सतह पर मल्टीफिडस और ग्रीवा रीढ़ की मांसपेशियों को काटें।
  12. स्पिनस प्रक्रियाओं के उच्चतम बिंदु के अनुसार टी 2 का पता लगाएँ। C6(चित्रा 3)का पता लगाने के लिए T2 से रोस्ट्रल अंत की ओर क्रमिक रूप से स्पिनस प्रक्रियाओं की जांच करें।
  13. संदंश के साथ सी 6 लामिना उठाओ, लामिना काट लें, और रीढ़ की हड्डी उजागर हो जाती है (चित्र 2डी)।

2. ग्रीवा रीढ़ की हड्डी संपीड़न चोट

  1. कशेरुक स्थिरीकरण के साथ C6-7 पहलू जोड़ों दबाना, और इसे (चित्रा 2E) ताला.
  2. उजागर रीढ़ की हड्डी पर बाँझ वजन टिप निशाना लगाओ, और टिप के फ्लैट तल रीढ़ की हड्डी (चित्रा 2F) के पृष्ठीय सतह के समानांतर स्थित है सुनिश्चित करें.
  3. रीढ़ की हड्डी को संपीड़ित करने के लिए वजन बनाने के लिए आस्तीन को समायोजित करें। समायोजन बंद करो जब वजन रीढ़ की हड्डी (चित्रा 2 जी) के साथ एक निरंतर रिश्तेदार स्थिति रहता है.
    नोट: इस प्रक्रिया को बहुत हिंसक या त्वरित न बनाएं यदि वजन रीढ़ की हड्डी पर संलयन बल डालता है।
  4. एक 5 मिनट संपीड़न के बाद वजन और कशेरुक स्थिरीकरण निकालें.
  5. माइक्रोस्कोप (चित्रा 2एच) के तहत संपीड़न के बाद रीढ़ की हड्डी के रंग परिवर्तन का निरीक्षण करें।
  6. बाँझ पीबीएस के साथ कुल्ला और ऑपरेशन साइट को साफ करने के लिए चूषण का उपयोग करें।
  7. पॉलीप्रोपाइलीन गैर-अवशोषक सिवनी (आकार: 6-0) का उपयोग करके परतों में मांसपेशियों और त्वचा को सीवन करें।
  8. शल्य चिकित्सा क्षेत्र कीटाणुरहित, एक गर्म पैड पर माउस जगह जब तक माउस पूर्ण चेतना पुनर्स्थापित करता है, और फिर माउस पिंजरे में वापसी.
  9. एनाल्जेसिया (0.05-0.1 मिलीग्राम/किग्रा, वर्ग) के लिए हर 8-12 घंटे में 3 दिनों के लिए ब्यूप्रेनोर्फिन इंजेक्ट करें।

3. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण

  1. चोट के बाद 7, 28, या 70 दिनों पर 1.25% ट्राइब्रोमोथेनॉल (0.02 एमएल / जी शरीर के वजन) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा माउस को एनेस्थेटाइज करें। Transcardially फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 60 एमएल और 4%paraformaldehyde 11 के 20 एमएल के साथ माउस डालना.
  2. सूक्ष्म कैंची के साथ दोनों तरफ से घाव केंद्र से 0.5 सेमी पर रीढ़ की हड्डी को स्थानांतरित करें, और 1 सेमी-लंबे खंड को संरक्षित करें।
  3. संरक्षित रीढ़ की हड्डी अनुभाग को 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30% सुक्रोज में विसर्जित करें।
  4. OCT के साथ ऊतकों एम्बेड करें, ऊतकों को क्रायोटोम के साथ 6 माइक्रोन मोटी वर्गों में काटें, और एक ग्लास स्लाइड पर वर्गों को इकट्ठा करें।
  5. हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन धुंधला हो जाना
    1. अवशिष्ट OCT को हटाने के लिए 5 मिनट 3 बार के लिए 1x पीबीएस के साथ 6 माइक्रोन वर्गों को कुल्ला।
    2. 90 एस के लिए hematoxylin में वर्गों विसर्जित कर दिया. 3 मिनट के लिए बहते पानी के नीचे वर्गों धो लें.
    3. 4 मिनट के लिए eosin में वर्गों विसर्जित कर दिया. अतिरिक्त ईओसिन को हटाने के लिए 30 एस के लिए 95% अल्कोहल में भिगोएँ।
    4. अंत में, 30 एस के लिए शराब (95% शराब और 100% शराब दो बार, क्रमिक रूप से) के साथ स्लाइड निर्जलीकरण और 2 मिनट के लिए समाशोधन के लिए एक xylene स्नान में स्लाइड डाल दिया. फिर, एक कवर ग्लास और राल जेल के साथ वर्गों को सील करें।
  6. प्रशिया नीला धुंधला हो जाना
    1. पोटेशियम ferrocyanide (10%) और हाइड्रोक्लोरिक एसिड (10%) का एक बराबर मिश्रण में 20 मिनट के लिए स्लाइड जलमग्न.
    2. आसुत जल के साथ 3 बार कुल्ला, और परमाणु फास्ट लाल के साथ 5 मिनट के लिए काउंटरस्टेन।
    3. आसुत जल के साथ तीन बार कुल्ला, 95% शराब के साथ एक कुल्ला और 5 मिनट के लिए 100% शराब के साथ दो rinses के बाद.
    4. 3 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार xylene में वर्गों को साफ़ करें और फिर राल जेल12 के साथ सील करें।
  7. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ स्लाइड को इनक्यूबेट करें: खरगोश विरोधी आयनित कैल्शियम-बाध्यकारी एडाप्टर अणु 1 (आईबीए -1) (1: 500), जो तंत्रिका चोट के बाद माइक्रोग्लिया में अप-विनियमित था; माउस एंटी-ग्लियाल फाइब्रिलरी एसिडिक प्रोटीन (जीएफएपी) (1:300), जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में एस्ट्रोसाइट्स में व्यक्त किया जाता है; खरगोश एंटी-न्यूरोफिलामेंट -200 (एनएफ -200) (1: 2000), जो न्यूरोफिलामेंट में व्यक्त किया गया है।
    2. कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं: एलेक्सा फ्लोर488 बकरी विरोधी माउस और एलेक्सा फ्लोर594 बकरी विरोधी खरगोश (1: 1,000)।
    3. स्नैप तस्वीरें और आगे एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप13 के साथ विश्लेषण.

4. चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग

  1. एक मिनी मास्क के माध्यम से प्रशासित Isoflurane संज्ञाहरण (1% -2% isoflurane, 20% -30% O2) के साथ चोट के बाद 7 दिनों में माउस को एनेस्थेटाइज करें।
  2. ग्रीवा रीढ़ की हड्डी को धनु अभिविन्यास में स्कैन करें। एमआरआई इमेजिंग के लिए निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: टीआर/टीई = 2500/12 एमएस के साथ मल्टीस्लाइस और इंटरलीव्ड फैशन में स्पिन-इको (एसई) अनुक्रम, अधिग्रहण मैट्रिक्स = 256 x 128 मैट्रिक्स देखने के क्षेत्र में (एफओवी) = 12 x 8 मिमी2, स्लाइस मोटाई = 1 मिमी, और उत्तेजनाओं की संख्या (नेक्स) = 2।
    नोट: श्वसन से संबंधित छवि कलाकृतियों14 को खत्म करने के लिए स्कैनिंग के दौरान माउस की श्वसन दर 10-15/मिनट पर रखें.

Representative Results

धनु एचई खंड से पता चलता है कि भले ही ग्रे पदार्थ में क्षतिग्रस्त क्षेत्र गंभीर समूह में व्यापक था, लेकिन सफेद पदार्थ पर निरंतरता मौजूद थी। इसके अलावा, गंभीर और हल्के समूहों के बीच क्षतिग्रस्त ग्रे मैटर क्षेत्र में अंतर प्रोटोकॉल (चित्रा 4) में समूह सेटिंग की तर्कसंगतता का समर्थन करता है।

कोरोनल एचई वर्गों से पता चलता है कि घाव मुख्य रूप से दोनों समूहों में ग्रे पदार्थ में मौजूद है। गंभीर समूह में, ग्रे पदार्थ के आसपास के सफेद पदार्थ की संरचना प्रभावित होने की अधिक संभावना थी, लेकिन सफेद पदार्थ की रूपरेखा अभी भी बनाए रखी गई थी (चित्र 5)। एनएफ -200 इम्यूनोफ्लोरेसेंस से पता चलता है कि भले ही ग्रे पदार्थ के आसपास के सफेद पदार्थ गंभीर समूह में प्रभावित थे, फिर भी सफेद पदार्थ अपेक्षाकृत बरकरार था। ये परिणाम पिछले अध्ययन4 (चित्रा 6) में सीसीएस के लिए वर्णित विशेषताओं के अनुरूप हैं।

हल्के या गंभीर समूह में चोट लगने के 7 दिनों के बाद धनु एचई वर्गों में कोई लाल रक्त कोशिकाएं नहीं मिलीं। प्रशिया ब्लू धुंधला हल्के समूह में कोई हेमोसिडरोसिस नहीं बल्कि गंभीर समूह में प्रकट हुआ। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि रक्तस्राव के प्रलोभन को अपेक्षाकृत गंभीर डिग्री की क्षति की आवश्यकता हो सकती है (चित्र 7)।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस ने हल्के और गंभीर चोट दोनों में ऊंचा जीएफएपी और आईबीए -1 अभिव्यक्ति के क्षेत्रों का खुलासा किया, एक भड़काऊ प्रतिक्रिया और घाव में एक ग्लियल निशान के गठन का सुझाव दिया। इसके अलावा, गंभीर समूह ने हल्के समूह (चित्रा 8) की तुलना में एक बड़ा घाव क्षेत्र प्रदर्शित किया।

एमआरआई रीढ़ की हड्डी का निरीक्षण करने के लिए अपेक्षाकृत न्यूनतम इनवेसिव विधि है। परिणाम बताते हैं कि हल्के और गंभीर दोनों समूहों में, उच्च सिग्नल रूपरेखा के साथ घाव में एक हाइपोइंटेंस सिग्नल परिवर्तन होता है। गंभीर समूह ने एक काफी बड़ा हाइपोइंटेंस सिग्नल क्षेत्र (चित्रा 9) दिखाया। हाइपोइंटेंस सिग्नल इस क्षेत्र में रेटिकुलोसाइट लाइसेट से एक अवक्षेप का सुझाव देता है, और आसपास के हाइपरटेंसिव सिग्नल एक भड़काऊ प्रतिक्रिया का सुझाव देता है। हमने अपने पिछले अध्ययन में कई व्यवहार परीक्षण किए थे। उदाहरण के लिए, forelimbs में पकड़ शक्ति परीक्षण एक महत्वपूर्ण अंतर15 का पता चलता है.

Figure 1
चित्रा 1: एससीआईसीपी की आस्तीन और वजन। टिप की सतह क्षेत्र को सी 6 लैमिनेक्टॉमी के बाद मापा रीढ़ की हड्डी के उजागर क्षेत्र के आधार पर 1.3 मिमी x 1.6 मिमी बनाया गया था। वजन PTFE के साथ लेपित है, जो प्रभावी रूप से आस्तीन की आंतरिक दीवार और वजन के बीच घर्षण को कम करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: रीढ़ की हड्डी का एक्सपोजर और संपीड़न। (ए) त्वचा का अनुदैर्ध्य चीरा; (बी) टी 2 स्पिनस प्रक्रिया से मांसपेशियों को रोस्टली अलग करें; (सी) लैमिना के ऊपर की मांसपेशियों को अलग करें; (डी) सी 6 लैमिनेक्टॉमी; (ई) कशेरुक शरीर को ठीक करना; (एफ) संपीड़न के स्थान का निर्धारण; (जी) रीढ़ की हड्डी का संपीड़न; (एच) रीढ़ की हड्डी के संपीड़न के बाद रीढ़ की हड्डी के ऊपर सफेद पदार्थ को कोई महत्वपूर्ण नुकसान नहीं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: माउस ग्रीवा कंकाल शरीर रचना विज्ञान। तीर द्वारा इंगित साइट T2 स्पिनस प्रक्रिया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: धनु एचई दाग वाले खंड। (ए) ग्रीवा रीढ़ की हड्डी धनु खंड। (बी, सी) गंभीर समूह को हल्के समूह की तुलना में अधिक गंभीर क्षति हुई, लेकिन दोनों ने केंद्रीय कॉर्ड के चारों ओर ग्रे पदार्थ पर ध्यान केंद्रित किया। 7, 28, और 70 डीपीआई छवियां अलग-अलग अवधि में एक ही चोट समूह में चोट की अभिव्यक्ति में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं बताती हैं और यह कि बेहतर और अवर रीढ़ की हड्डी में सफेद पदार्थ की निरंतरता बनाए रखी जाती है। स्केल बार: 1 मिमी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी की चोट कोरोनल एचई दाग वाले खंड। (ए-सी) चोट मुख्य रूप से केंद्रीय कॉर्ड के आसपास के ग्रे पदार्थ को प्रभावित करती है, जैसा कि पैनल बी और सी में देखा गया है। गंभीर चोट समूह हल्के चोट समूह की तुलना में अधिक व्यापक क्षति से ग्रस्त है, जो सफेद पदार्थ को प्रभावित करने की अधिक संभावना है। स्केल बार: 400 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: एनएफ -200 कोरोनल इम्यूनोफ्लोरेसेंस चोट के बाद। सफेद पदार्थ की रूपरेखा पर कोई महत्वपूर्ण अंतर के साथ एनएफ -200 प्रतिक्रिया। स्केल बार: 400 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: प्रशिया नीला धुंधला हो जाना। (ए-सी) हेमोसिडरोसिस गंभीर समूह में देखा गया था लेकिन हल्के समूह में नहीं। स्केल बार: 400 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: चोट के बाद धनु जीएफएपी और आईबीए -1 इम्यूनोफ्लोरेसेंस। (ए-सी) जैसे-जैसे चोट की डिग्री बढ़ती है, GFAP और Iba-1 प्रतिक्रिया का क्षेत्र बढ़ता है। स्केल बार: 1 मिमी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: ग्रीवा रीढ़ की हड्डी की चोट (टी 2-भारित छवियों) के बाद धनु एमआरआई। चोट क्षेत्र को हल्के और गंभीर चोट समूहों में एक हाइपोइंटेंस सिग्नल के रूप में देखा गया था, जिसमें गंभीर चोट समूह में हाइपोइंटेंस सिग्नल का काफी व्यापक क्षेत्र था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

रीढ़ की हड्डी की चोट के कई प्रकार में से, सीसीएस 3,4 चोट के सबसे संभावित उपचार योग्य प्रकारों में से एक है। प्रयोगशाला अनुसंधान मॉडल की कमी के कारण, 1950 के दशक से सीसीएस पर शोध नैदानिक अध्ययन और कैडेवरिक विच्छेदन जांच 3,16,17 पर केंद्रित था। वर्तमान अध्ययन चूहों के सीसीएस मॉडल को स्थापित करने के लिए संगत उपकरणों और न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रियाओं का उपयोग करके दिखाता है। तकनीकी दृष्टिकोण से, इस मंच में मजबूत संचालन क्षमता और अच्छी प्रजनन क्षमता है। यह देखते हुए कि प्रयोग के परिणाम वैधता प्रदर्शित करते हैं, मानक पिछले अध्ययनों के निकटतम मॉडल को स्थापित करने की हमारी तकनीक ने सीसीएस4 के लिए परिभाषित किया है।

संपीड़न चोट के पिछले अध्ययनों ने मुख्य रूप से एन्यूरिज्म क्लिप, गुब्बारे, और कैलिब्रेटेड संदंश 9,10,18 को नियोजित किया है। इसके अलावा, अधिकांश चोटें वक्षीय रीढ़ की हड्डी18 के स्तर पर हुईं। सी 6 स्तर पर रीढ़ की हड्डी को सीसीएस की विशेषताओं की जांच के लिए इस अध्ययन में घायल खंड के रूप में चुना गया था। यह ध्यान देने योग्य है कि सीसीएस मॉडल की उत्तरजीविता दर भी प्रयोगात्मक स्थिरता सुनिश्चित करने में एक आवश्यक कारक है। वर्तमान अध्ययन माउस ग्रीवा रीढ़ की हड्डी को द्विपक्षीय संपीड़न चोट का कारण बनता है, जबकि उच्च स्तरीय रीढ़ की हड्डी की दर्दनाक चोट, विशेष रूप से द्विपक्षीय चोट, प्रयोग जानवरों के लिए घातक हो सकती है यदि बहुत गंभीर हो। एल-बोही के अनुसार, C4/5 रीढ़ की हड्डी अवरोही बल्बोस्पाइनल ट्रैक्ट और श्वसन से संबंधित मोटोन्यूरॉन्स को प्रभावित करने की अधिक संभावना है, जो प्रयोग जानवरों को श्वसन अवसाद और मृत्यु 18,19,20,21,22,23 की ओर ले जाती है। हिस्टोलॉजिकल परीक्षण। यद्यपि फोर्गियोन द्वारा रिपोर्ट किए गए माउस ग्रीवा रीढ़ की हड्डी क्लैंपिंग मॉडल में महत्वपूर्ण व्यवहार और हिस्टोलॉजिकल अंतर थे, संशोधित क्लैंप के साथ रीढ़ की हड्डी को जकड़ने के लिए पेडिकल, आर्टिकुलर प्रक्रियाओं, लैमिना और यहां तक कि तंत्रिका जड़ों के विघटन की आवश्यकता थी, जिसका गर्भाशय ग्रीवा संरचनाओं की स्थिरता पर महत्वपूर्ण प्रभाव था24. गर्भाशय ग्रीवा की चोटों का एक और अध्ययन एक निर्धारण साइट के रूप में अनुप्रस्थ प्रक्रिया का उपयोग करने की सूचना दी5. भले ही आर्टिकुलर प्रक्रियाओं को क्षति से रोका गया था, लेकिन अधिक मांसपेशियों के ऊतकों के टूटने से रीढ़ की हड्डी की स्थिरता पर भी असर पड़ सकता है। वर्तमान अध्ययन में, केवल 6वें ग्रीवा लैमिना को ग्रीवा रीढ़ की हड्डी की स्थिरता बनाए रखने के लिए उच्छेदित किया गया था, जिसमें आस-पास के आर्टिकुलर जोड़ों को संरक्षित किया गया था और अत्यधिक मांसपेशियों की क्षति से बचा गया था। इसी समय, रीढ़ की हड्डी के ऊपर से संपीड़न तंत्रिका जड़ों को नुकसान से बचाता है।

एचई परिणाम बताते हैं कि प्रत्येक समूह में चूहों की ग्रीवा रीढ़ की हड्डी को नुकसान का क्षेत्र मुख्य रूप से केंद्रीय कॉर्ड के पास ग्रे पदार्थ में था, जो सीसीएस की विशेषता थी, जिसमें विभिन्न समूहों के बीच चोट के दायरे में महत्वपूर्ण अंतर थे। विशेष रूप से, हमारे द्वारा प्रदर्शित पैथोलॉजिकल सेक्शन ने चोट की अभिव्यक्ति को कम किया हो सकता है क्योंकि नमूने चोट के कुछ दिनों बाद एकत्र किए गए थे। इम्यूनोफ्लोरेसेंस (एनएफ -200) ने रीढ़ की हड्डी के सफेद पदार्थ क्षेत्र में तंत्रिका पथ को कम नुकसान दिखाया, जिसने यह भी पुष्टि की कि सीसीएस में क्षति मुख्य रूप से केंद्रीय कॉर्ड के आसपास केंद्रित थी। इम्यूनोफ्लोरेसेंस परिणाम पैथोलॉजी के पिछले हिस्टोलॉजिकल परिणामों द्वारा जटिल था। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि सीसीएस केंद्रीय कॉर्ड के पास एडिमा की ओर जाता है, जिससे हेमेटोमा होता है और अंततः, पार्श्व कॉर्टिकोस्पाइनल ट्रैक्ट3 के औसत दर्जे का हिस्सा होता है। रक्तस्राव सीसीएस का एक ठेठ घटक के रूप में सूचित किया गया है, लेकिन शायद ही कभी बाद इमेजिंग और शव परीक्षा17 अध्ययन में देखा जाता है. इस अध्ययन में, 7 दिनों के बाद चोट के बाद एचई परिणाम सभी समूहों में ऊतक शोफ के संकेत सुझाए; हालांकि, चोट क्षेत्र में कोई अवशिष्ट लाल रक्त कोशिकाएं नहीं मिलीं। इसलिए, प्रशिया ब्लू का उपयोग रक्तस्राव के लिए चोट क्षेत्र की जांच करने के लिए किया गया था, और परिणाम चोट के बाद 7 दिनों में गंभीर चोट समूह के चोट क्षेत्र में देखे गए हेमोसिडरोसिस के अनुरूप थे, जबकि हल्के समूह ने नहीं किया था। एमआरआई टी 2 छवियों से पता चला है कि हल्के और गंभीर दोनों चोटों में चोट के 7 दिनों के बाद चोट के क्षतिग्रस्त क्षेत्र में कम संकेत क्षेत्र थे, यहां रेटिकुलोसाइट लाइसेट के जमाव का संकेत मिलता है। ये परिणाम परिस्थितिजन्य साक्ष्य प्रदान करते हैं कि पहले रिपोर्ट किए गए निष्कर्षों के बीच विसंगति संभवतः एमआरआई परीक्षण के कारण हिस्टोलॉजिकल परीक्षण14 की तुलना में संभावित रूप से अधिक संवेदनशील होने के कारण है, चोट की गंभीरता के अलावा, जो रक्तस्राव की मात्रा को भी प्रभावित कर सकती है चोट के क्षेत्र में। क्षतिग्रस्त क्षेत्र में जीएफएपी को भी बड़े पैमाने पर व्यक्त किया गया था। उसी समय, इबा -1 अभिव्यक्ति को बरकरार क्षेत्रों में भी देखा गया था, एमआरआई परिणामों के अनुरूप एक भड़काऊ प्रतिक्रिया की दृढ़ता का सुझाव देते हुए, जहां घाव में हाइपोइंटेंस सिग्नल क्षेत्र के चारों ओर हाइपरटेंसिव सिग्नल की एक अंगूठी एक भड़काऊ प्रतिक्रिया की उपस्थिति का सुझाव देती है। अंततः, वर्तमान अध्ययन के परिणामों के आधार पर, मॉडल में चोट का क्षेत्र केंद्रीय कॉर्ड के चारों ओर ग्रे पदार्थ पर केंद्रित था, जो आम तौर पर पहले रिपोर्ट किए गए विवरणों के अनुरूप होता है13. दुर्भाग्य से, हमने हर प्रयोग जानवर में एमआरआई को दोहराए जाने के लिए प्रदर्शन नहीं किया ताकि यह दिखाया जा सके कि चोट साइट समय के साथ गतिशील रूप से कैसे बदलती है। भविष्य के शोधकर्ता सीसीएस में बेहतर जांच के लिए इसे अपने काम में शामिल कर सकते हैं। इसके अलावा, न्यूएन जैसे न्यूरोनल मार्करों के साथ इम्यूनोलेबलिंग, जो ग्रे पदार्थ को परिभाषित करता है, को अध्ययन में शामिल किया जा सकता है।

अंत में, पैथोलॉजी और एमआरआई स्कैन पर निष्कर्षों की विशेषताओं में पिछले अध्ययनों में सीसीएस के लिए वर्णित लोगों के साथ घनिष्ठ समानताएं हैं4. वर्तमान प्रोटोकॉल संभवतः सीसीएस मॉडलिंग सीसीएस में आगे अनुसंधान और समझ को सक्षम बनाता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को स्टेम सेल और ट्रांसफॉर्मेशन रिसर्च (2019YFA0112100) के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास परियोजना और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान के राज्य कुंजी कार्यक्रम (81930070) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% fixative solution Solarbio P1110 4%
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody Abcam ab8135 Dilution ratio (1:2000)
Eosin Staining Solution (water soluble) Biosharp BL727B
Ethanol Fuyu Reagent
Fluorescent microscope KEYENCE BZ-X800
Frozen Slicer Leica
GFAP (GA5) Mouse mAb  Cell Signaling TECHNOLOGY #3670 Dilution ratio (1:600)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 ThermoFisher SCIENTIFIC A32723TR Dilution ratio (1:1000)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 ThermoFisher SCIENTIFIC A32740 Dilution ratio (1:1000)
Hematoxylin Staining Solution Biosharp BL702A
Mice Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany  C57BL/6J 
Microsurgery apparatus  Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd All the surgey instruments are custom-made Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors
Normal sheep serum for blocking (working solution) Zhong Shan Jin Qiao ZLI-9022 working solution
O.C.T. Compound SAKURA 4583
Phosphate buffered solution (PBS)  Solarbio P1020 pH 7.2–7.4
Prussian Blue Iron Stain Kit (With Eosin) Solarbio G1424
RWD Laboratory inhalation anesthetic station RWD Life Science Co., Ltd R550
Small animal in vivo microCT imaging system PerkinElmer  Quantum GX2
Spinal cord injury coaxial platform Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd Custom-made(Feng's standard) https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~
1~b0yRFKOq&alg_id=
0&slg=tagGoodList-default%2COpBottom%2Cuuid%
2CabTraceId&components_
style_layout
=1&reft=1659409105184&spm=
g.930111970_f.81386274&alias=
367x5ovgn69q18g&from_uuid=
1362cc46-ffe0-6886-2c65-01903
dbacbba&sf=qq_sm&is_share=
1&shopAutoEnter=1&share_cmpt
=native_wechat&is_silence_auth=1
Surgery microscope  Zumax Medical Co., Ltd. zumax, OMS2355
Tris Buffered Saline+Tween (TBST) Solarbio T1082 Dilution ratio (1:19)
Xylene Fuyu Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, C., et al. Survival in 222 Patients With Severe CSCI: An 8-Year Epidemiologic Survey in Western China. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 100 (10), 1872-1880 (2019).
  2. Qi, C., Xia, H., Miao, D., Wang, X., Li, Z. The influence of timing of surgery in the outcome of spinal cord injury without radiographic abnormality (SCIWORA). Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 223 (2020).
  3. Brooks, N. P. Central cord syndrome. Neurosurgery Clinics of North America. 28 (1), 41-47 (2017).
  4. Avila, M. J., Hurlbert, R. J. Central cord syndrome redefined. Neurosurgery Clinics of North America. 32 (3), 353-363 (2021).
  5. Forgione, N., Chamankhah, M., Fehlings, M. G. A mouse model of bilateral cervical contusion-compression spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (6), 1227-1239 (2017).
  6. López-Dolado, E., Lucas-Osma, A. M., Collazos-Castro, J. E. Dynamic motor compensations with permanent, focal loss of forelimb force after cervical spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 30 (3), 191-210 (2013).
  7. Allen, L. L., et al. Phrenic motor neuron survival below cervical spinal cord hemisection. Experimental Neurology. 346, 113832 (2021).
  8. Reinhardt, D. R., Stehlik, K. E., Satkunendrarajah, K., Kroner, A. Bilateral cervical contusion spinal cord injury: A mouse model to evaluate sensorimotor function. Experimental Neurology. 331, 113381 (2020).
  9. Ropper, A. E., Ropper, A. H. Acute spinal cord compression. The New England Journal of Medicine. 376 (14), 1358-1369 (2017).
  10. Sun, G. D., et al. A progressive compression model of thoracic spinal cord injury in mice: function assessment and pathological changes in spinal cord. Neural Regeneration Research. 12 (8), 1365-1374 (2017).
  11. Elzat, E. Y., et al. Establishing a mouse contusion spinal cord injury model based on a minimally invasive technique. Journal of Visualized Experiments. (187), 64538 (2022).
  12. Lu, J., Xu, F., Lu, H. LncRNA PVT1 regulates ferroptosis through miR-214-mediated TFR1 and p53. Life Sciences. 260, 118305 (2020).
  13. Zeng, H., et al. Lentivirus-mediated downregulation of α-synuclein reduces neuroinflammation and promotes functional recovery in rats with spinal cord injury. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 283 (2019).
  14. Bilgen, M., Al-Hafez, B., Berman, N. E., Festoff, B. W. Magnetic resonance imaging of mouse spinal cord. Magnetic Resonance in Medicine. 54 (5), 1226-1231 (2005).
  15. Yilihamu, E. E., et al. A novel mouse model of central cord syndrome. Neural Regeneration Research. 18 (12), 2751-2756 (2023).
  16. Chikuda, H., et al. Effect of early vs delayed surgical treatment on motor recovery in incomplete cervical spinal cord injury with preexisting cervical stenosis: A randomized clinical trial. JAMA Network Open. 4 (11), e2133604 (2021).
  17. Jimenez, O., Marcillo, A., Levi, A. D. A histopathological analysis of the human cervical spinal cord in patients with acute traumatic central cord syndrome. Spinal Cord. 38 (9), 532-537 (2000).
  18. Menezes, K., et al. Human mesenchymal stromal/stem cells recruit resident pericytes and induce blood vessels maturation to repair experimental spinal cord injury in rats. Scientific Reports. 10 (1), 19604 (2020).
  19. Hutson, T. H., Di Giovanni, S. The translational landscape in spinal cord injury: focus on neuroplasticity and regeneration. Nature Reviews. Neurology. 15 (12), 732-745 (2019).
  20. El-Bohy, A. A., Schrimsher, G. W., Reier, P. J., Goshgarian, H. G. Quantitative assessment of respiratory function following contusion injury of the cervical spinal cord. Experimental Neurology. 150 (1), 143-152 (1998).
  21. El-Bohy, A. A., Goshgarian, H. G. The use of single phrenic axon recordings to assess diaphragm recovery after cervical spinal cord injury. Experimental Neurology. 156 (1), 172-179 (1999).
  22. Gonzalez-Rothi, E. J., Lee, K. Z. Intermittent hypoxia and respiratory recovery in preclinical rodent models of incomplete cervical spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 113751 (2021).
  23. Locke, K. C., Randelman, M. L., Hoh, D. J., Zholudeva, L. V., Lane, M. A. Respiratory plasticity following spinal cord injury: perspectives from mouse to man. Neural Regeneration Research. 17 (10), 2141-2148 (2022).
  24. Forgione, N., et al. Bilateral contusion-compression model of incomplete traumatic cervical spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 31 (21), 1776-1788 (2014).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 199 C57BL/6J माउस शारीरिक मार्ग न्यूनतम इनवेसिव एक्सपोजर दृष्टिकोण प्रायोगिक जानवर सुसंगत और स्थिर शारीरिक आकृति विज्ञान प्रयोगों की प्रजनन क्षमता C6 स्तर की रीढ़ की हड्डी रीढ़ की हड्डी की चोट समाक्षीय मंच (SCICP) न्यूनतम इनवेसिव तकनीक कशेरुक स्थिरीकरणकर्ता संपीड़ित रीढ़ की हड्डी C57BL/6J चूहे C6 रीढ़ की हड्डी की चोट की विभिन्न डिग्री ग्रे पदार्थ आगे के शोध हिस्टोलॉजिकल परिणाम
C57BL/6J माउस में सेंट्रल कॉर्ड सिंड्रोम मॉडल की स्थापना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yilizati-Yilihamu Elzat, E., Fan,… More

Yilizati-Yilihamu Elzat, E., Fan, X., Feng, S. Establishment of Central Cord Syndrome Model in C57BL/6J Mouse. J. Vis. Exp. (199), e65028, doi:10.3791/65028 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter