Summary
El protocolo actual, que simula el síndrome del cordón central (CCS) en ratones, ha mejorado la repetibilidad y minimizado el daño operativo a los animales de experimentación, evitando alterar excesivamente la estructura anatómica. La estrategia de este estudio es ventajosa porque permite investigar los mecanismos de lesión al producir resultados consistentes.
Abstract
Los modelos animales del síndrome de la médula central (CCS, por sus siglas en inglés) podrían beneficiar sustancialmente la investigación preclínica. Las vías anatómicas identificables pueden proporcionar enfoques de exposición mínimamente invasivos y reducir las lesiones adicionales a los animales de experimentación durante la operación, lo que permite mantener una morfología anatómica consistente y estable durante los experimentos para minimizar las diferencias conductuales e histológicas entre los individuos para mejorar la reproducibilidad de los experimentos. En este estudio, la médula espinal a nivel de C6 se expuso utilizando una plataforma coaxial de lesión medular (SCICP) y en combinación con una técnica mínimamente invasiva. Con la ayuda de un estabilizador vertebral, fijamos las vértebras y comprimimos la médula espinal de ratones C57BL/6J con pesas de 5 g/mm2 y 10 g/mm2 con SCICP para inducir diferentes grados de lesión medular C6. De acuerdo con la descripción previa de CCS, los resultados revelan que la lesión en este modelo se concentra en la sustancia gris alrededor del cordón central, lo que permite una mayor investigación sobre CCS. Finalmente, se proporcionan los resultados histológicos como referencia para los lectores.
Introduction
En los últimos años se ha observado un aumento constante de la incidencia de lesiones medulares (LME), con más lesiones en personas mayores por tauma1 menos violentas. Estas lesiones afectan con mayor frecuencia a la columna cervical y con mayor frecuencia conducen a una disfunción neurológica incompleta2.
En el siglo XXI, la CCS es el tipo más prevalente de LME incompleta, representando más de la mitad de todas las LME. En comparación con la LME incompleta convencional, la CCS se caracteriza por un deterioro desproporcionadamente mayor de las extremidades superiores que de las inferiores3. Se caracteriza por una debilidad predominante de las extremidades superiores con disfunción sensorial y vesical menos significativa. Se cree que el CCS es causado por una hemorragia y edema postraumáticos de la región central o, como se propuso recientemente, por la degeneración walleriana por compresión de la médula espinal en la estenosis del canal espinal. El manejo del CCS carece de evidencia de alto nivel para orientar, lo que requiere una comprensión integral de su fisiopatología4. Sin embargo, no se han reportado modelos de CCS. Los modelos animales adecuados son esenciales para la comprensión de la fisiopatología, lo que puede proporcionar una base de investigación para estudios clínicos y preclínicos 5,6,7,8,9,10.
En este estudio, se establece un modelo de CCS en ratones con una plataforma coaxial de lesión medular (SCICP) y un plan de operación mínimamente invasivo, lo que permite una mayor investigación y comprensión de la CCS. La validez del modelo se ha demostrado en el curso del proceso de investigación mediante análisis histológico, de resonancia magnética (RM) y de inmunofluorescencia.
Protocol
Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar de los Animales de Laboratorio de la Facultad de Medicina Cheeloo de la Universidad de Shandong (número de aprobación: 22021). Se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH Publications No. 85-23, revisada en 1996). Todos los ratones utilizados en este estudio fueron ratones hembra C57BL/6J de 9-10 semanas de edad comprados a Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, China). Un total de 9 ratones que participaron en este estudio fueron igualmente aleatorizados a los grupos de control, leve y grave. A los 7, 28 y 70 días después de la lesión, se sacrificó un ratón de cada grupo.
1. Laminectomía C6 y exposición de la médula espinal
NOTA: La exposición se realizó bajo un microscopio. La hemorragia puede evitarse prestando atención a dos aspectos: (i) Se deben evitar todos los vasos sanguíneos. (ii) Los músculos deben separarse en los puntos de origen y terminación del músculo.
- Preparar instrumental quirúrgico y SCICP.
NOTA: La estructura del SCICP ha sido reportada en estudios previos11. La diferencia con respecto al estudio previo es que el presente protocolo logra la lesión medular por compresión. Dos pesos diferentes (10,4 g y 20,8 g) de esta plataforma pueden producir una compresión de 5 g/mm2 y 10 g/mm2, respectivamente (Figura 1). Los pasos de exposición y compresión de la médula espinal se muestran en la Figura 2. - Administrar isoflurano al ratón por inhalación utilizando un cono nasal (inducción: 3%-5%, mantenimiento: 1,5%-2%).
- Después de que la anestesia haga efecto, explore una pequeña protuberancia en la línea media detrás del cuello de los ratones, que es la apófisis espinosa de la segunda vértebra torácica (T2).
- Afeita el vello alrededor de este bulto. Desinfecte la piel con tres aplicaciones alternas de una solución de yodóforo seguida de antisépticos cutáneos al 75% de etanol.
- Coloque el ratón boca abajo en la mesa de operaciones. Aplique ungüento para los ojos para proteger los ojos.
- Coloque una almohadilla de 3-4 mm de grosor debajo del pecho para permitir una curva arqueada de la columna cervical, lo que facilita la exposición del espacio interlamina y una vía aérea sin obstrucciones durante la operación. Inyectar buprenorfina como analgesia preoperatoria (0,05-0,1 mg/kg, SQ).
- Realizar una incisión longitudinal de 1-1,5 cm con un bisturí estéril centrado en la2ª apófisis espinosa de la vértebra torácica para exponer la capa fascial (Figura 2A).
- Retire una porción del tejido adiposo por encima de T2 con microtijeras estériles para encontrar el proceso espinoso T2.
- Separe los músculos trapecios bilaterales y romboides de C5-T2 a lo largo de la línea media con microtijeras (Figura 2B).
- Separe los músculos de la lámina de las vértebras C5-T2 con microtijeras y retraiga la capa muscular hacia los lados con microrretractores estériles (Figura 2C).
- Corta los multífidos y los músculos de la columna cervical en la superficie de las vértebras.
- Localice T2 de acuerdo con el punto más alto de las apófisis espinosas. Sondea las apófisis espinosas sucesivamente hacia el extremo rostral desde T2 para localizar C6 (Figura 3).
- Levante la lámina C6 con fórceps, corte la lámina y la médula espinal quedará expuesta (Figura 2D).
2. Lesión por compresión de la médula espinal cervical
- Sujete las articulaciones facetarias C6-7 con el estabilizador vertebral y bloquéelo (Figura 2E).
- Apunte la punta de la pesa estéril a la médula espinal expuesta y asegúrese de que la parte inferior plana de la punta esté colocada paralela a la superficie dorsal de la médula espinal (Figura 2F).
- Ajuste la manga para que el peso comprima la médula espinal. Deje de ajustar cuando el peso mantenga una posición relativa constante con la médula espinal (Figura 2G).
NOTA: No haga que este proceso sea demasiado violento o rápido en caso de que el peso ejerza una fuerza de contusión sobre la médula espinal. - Retire el peso y el estabilizador vertebral después de una compresión de 5 minutos.
- Observar las alteraciones de color de la médula espinal después de la compresión bajo el microscopio (Figura 2H).
- Enjuague con PBS estéril y use succión para limpiar el sitio de operación.
- Suturar los músculos y la piel en capas con sutura de polipropileno no absorbible (tamaño: 6-0).
- Desinfecte el área quirúrgica, coloque el mouse sobre una almohadilla tibia hasta que el mouse recupere la conciencia completa y luego regrese el mouse a la jaula del mouse.
- Inyectar buprenorfina para analgesia (0,05-0,1 mg/kg, SQ) cada 8-12 h durante 3 días.
3. Análisis histológico
- Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de tribromoetanol al 1,25% (0,02 ml/g de peso corporal) los días 7, 28 o 70 después de la lesión. Infundir por vía transcardíaca al ratón 60 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 20 ml de paraformaldehído al 4%11.
- Seccionar la médula espinal a 0,5 cm del centro de la lesión desde ambos lados con microtijeras y conservar la sección de 1 cm de largo.
- Sumergir la sección de la médula espinal preservada en sacarosa al 30% a 4 °C durante 48 h.
- Incruste los tejidos con OCT, corte los tejidos en secciones de 6 μm de grosor con un criotomo y recoja las secciones en un portaobjetos de vidrio.
- Tinción de hematoxilina y eosina
- Enjuague las secciones de 6 μm con 1x PBS durante 5 minutos 3 veces para eliminar la OCT residual.
- Sumergir las secciones en hematoxilina durante 90 s. Lave las secciones con agua corriente durante 3 min.
- Sumerge las secciones en eosina durante 4 min. Remojar en alcohol al 95% durante 30 s para eliminar el exceso de eosina.
- Por último, deshidratar los portaobjetos con alcohol (95% de alcohol y 100% de alcohol dos veces, sucesivamente) durante 30 s y poner los portaobjetos en un baño de xileno para su limpieza durante 2 min. A continuación, sella las secciones con un cubreobjetos y gel de resina.
- Tinción de azul de Prusia
- Sumerja los portaobjetos durante 20 minutos en una mezcla igual de ferrocianuro de potasio (10%) y ácido clorhídrico (10%).
- Enjuague 3 veces con agua destilada y vuelva a teñir durante 5 minutos con Nuclear Fast Red.
- Enjuague tres veces con agua destilada, seguido de un enjuague con alcohol al 95% y dos enjuagues con alcohol al 100% durante 5 min.
- Limpie las secciones en xileno dos veces durante 3 minutos cada una y luego selle con gel de resina12.
- Tinción por inmunofluorescencia
- Incubar los portaobjetos con los siguientes anticuerpos primarios durante 1 h a 37 °C: molécula adaptadora de unión al calcio antiionizada de conejo 1 (Iba-1) (1:500), que se reguló al alza en la microglía después de una lesión nerviosa; proteína ácida fibrilar antiglial (GFAP) de ratón (1:300), que se expresa en los astrocitos del sistema nervioso central; anti-neurofilamento-200 de conejo (NF-200) (1:2000), que se expresa en neurofilamento.
- Incubar con anticuerpos secundarios durante 1 h a temperatura ambiente (RT): Alexa Fluor488 cabra anti-ratón y Alexa Fluor594 cabra anti-conejo (1:1.000).
- Tome fotografías y analice más a fondo con un microscopio de fluorescencia13.
4. Resonancia magnética
- Anestesiar al ratón a los 7 días después de la lesión con anestesia de isoflurano (1%-2% de isoflurano, 20%-30% deO2) administrada a través de una mini máscara.
- Escanear la médula espinal cervical en orientación sagital. Utilice los siguientes ajustes para la obtención de imágenes de RMN: secuencia de espín-eco (SE) en forma multicorte e intercalada con TR/TE = 2500/12 ms, matriz de adquisición = matriz de 256 x 128 sobre el campo de visión (FOV) = 12 x 8 mm2, grosor de corte = 1 mm y número de excitaciones (NEX) = 2.
NOTA: Mantenga la frecuencia respiratoria del ratón entre 10 y 15 por minuto durante la exploración para eliminar los artefactos de imagen relacionados con la respiración14.
Representative Results
La sección sagital de HE sugiere que, aunque el área dañada en la sustancia gris era más amplia en el grupo severo, la continuidad sobre la sustancia blanca estaba presente. Además, la diferencia en el área de materia gris dañada entre los grupos severo y leve apoya la razonabilidad de la configuración del grupo en el protocolo (Figura 4).
Los cortes coronales de HE muestran que la lesión existe principalmente en la sustancia gris en ambos grupos. En el grupo severo, la estructura de la sustancia blanca que rodea a la materia gris tenía más probabilidades de verse afectada, pero el contorno de la sustancia blanca aún se mantenía (Figura 5). La inmunofluorescencia NF-200 sugiere que, aunque la sustancia blanca que rodea a la sustancia gris se vio afectada en el grupo grave, la sustancia blanca todavía estaba relativamente intacta. Estos resultados son consistentes con las características descritas para la CCS en el estudio previo4 (Figura 6).
No se encontraron glóbulos rojos en las secciones sagitales de EH a los 7 días después de la lesión, ni en el grupo leve ni en el grave. La tinción con azul de Prusia no reveló hemosiderosis en el grupo leve, pero sí en el grupo grave. Estos resultados indican que la inducción de la hemorragia puede requerir un grado relativamente severo de daño (Figura 7).
La inmunofluorescencia reveló áreas de expresión elevada de GFAP e Iba-1 tanto en lesiones leves como graves, lo que sugiere una respuesta inflamatoria y la formación de una cicatriz glial en la lesión. Además, el grupo severo presentó un área lesional mayor que el grupo leve (Figura 8).
La resonancia magnética es un método relativamente mínimamente invasivo para observar la médula espinal. Los resultados sugieren que, tanto en el grupo leve como en el grave, existe un cambio de señal hipointenso en la lesión con un contorno de señal alto. El grupo severo mostró un área de señal hipointensa significativamente mayor (Figura 9). La señal hipointensa sugiere un precipitado del lisado de reticulocitos en esta área, y la señal hiperintensa circundante sugiere una respuesta inflamatoria. Realizamos varias pruebas de comportamiento en nuestro estudio anterior. Por ejemplo, la prueba de fuerza de agarre en las extremidades anteriores revela una diferencia significativa15.
Figura 1: La manga y los pesos de SCICP. El área superficial de la punta se diseñó para ser de 1,3 mm x 1,6 mm en función del área expuesta de la médula espinal medida después de la laminectomía C6. El peso está recubierto con PTFE, lo que reduce eficazmente la fricción entre la pared interior del manguito y el peso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Exposición y compresión de la médula espinal. (A) Incisión longitudinal de la piel; (B) Separar los músculos rostralmente de la apófisis espinosa T2; (C) Separar los músculos por encima de las láminas; (D) laminectomía C6; E) Fijación del cuerpo vertebral; (F) Determinar la ubicación de la compresión; (G) Compresión de la médula espinal; (H) No hay daño significativo a la sustancia blanca por encima de la médula espinal después de la compresión de la médula espinal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Anatomía del esqueleto cervical del ratón. El sitio indicado por la flecha es la apófisis espinosa T2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Las secciones teñidas de HE sagital. (A) Sección sagital de la médula espinal cervical. (B,C) El grupo severo tuvo un daño más severo que el grupo leve, pero ambos se centraron en la materia gris alrededor del cordón central. Las imágenes de 7, 28 y 70 ppp sugieren que no hay diferencias significativas en la expresión de la lesión en el mismo grupo de lesión en diferentes períodos y que se mantiene la continuidad de la sustancia blanca en la médula espinal superior e inferior. Barra de escala: 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Lesión de la médula espinal cervical, secciones coronales teñidas de HE. (A-C) La lesión afecta principalmente a la materia gris que rodea el cordón central, como se ve en los paneles B y C. El grupo de lesiones graves sufre una gama más amplia de daños que el grupo de lesiones leves, que es más probable que afecte a la sustancia blanca. Barra de escala: 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Inmunofluorescencia coronal NF-200 después de una lesión. Respuesta de NF-200 sin diferencias significativas en el contorno de la sustancia blanca. Barra de escala: 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Tinción con azul de Prusia. (A-C) Se observó hemosiderosis en el grupo grave, pero no en el grupo leve. Barra de escala: 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Inmunofluorescencia sagital GFAP e Iba-1 después de la lesión. (A-C) A medida que aumenta el grado de lesión, aumenta el área de respuesta GFAP e Iba-1. Barra de escala: 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Resonancia magnética sagital después de una lesión medular cervical (imágenes ponderadas en T2). La región de lesión se observó como una señal hipointensa en los grupos de lesión leve y grave, con un área significativamente más amplia de señal hipointensa en el grupo de lesión grave. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
De los numerosos tipos de lesión medular, la CCS es uno de los tipos de lesión potencialmente más tratables 3,4. Debido a la falta de modelos de investigación de laboratorio, las investigaciones sobre CCS de la década de 1950 se centraron en estudios clínicos e investigaciones de disección cadavérica 3,16,17. El presente estudio muestra el uso de herramientas compatibles y procedimientos mínimamente invasivos para establecer el modelo CCS de ratones. Desde el punto de vista técnico, esta plataforma tiene una gran operatividad y una buena reproducibilidad. Dado que los resultados del experimento demuestran la validez, nuestra técnica para establecer el modelo más cercano al estándar que estudios previos han definido para CCS4.
Los estudios previos de lesión por compresión han empleado principalmente clips de aneurisma, balones y pinzas calibradas 9,10,18. Además, la mayoría de las lesiones ocurrieron a nivel de la médula espinal torácica18. La médula espinal a nivel de C6 fue elegida como segmento lesionado en este estudio para investigar las características del CCS. Vale la pena prestar atención a que la tasa de supervivencia del modelo CCS también es un factor esencial para garantizar la consistencia experimental. El presente estudio informa que causa lesiones por compresión bilateral en la médula espinal cervical del ratón, mientras que las lesiones traumáticas de la médula espinal de alto nivel, especialmente las lesiones bilaterales, podrían ser fatales para los animales de experimentación si son demasiado graves. Según El-Bohy, es más probable que la médula espinal C4/5 afecte el tracto bulboespinal descendente y las motoneuronas relacionadas con la respiración, lo que lleva a los animales de experimento a la depresión respiratoria y a la muerte 18,19,20,21,22,23., En este estudio, los ratones con diferentes grados de compresión en la médula espinal cervical C6 tienen características de lesión significativamente diferenciadas sugeridas por pruebas histológicas. A pesar de que hubo diferencias significativas de comportamiento e histológicas en el modelo de pinzamiento de la médula espinal cervical de ratón reportado por Forgione, se requirió la interrupción de los pedículos, los procesos articulares, las láminas e incluso las raíces nerviosas para pinzar la médula espinal con las pinzas modificadas, lo que tuvo una influencia significativa en la estabilidad de las estructuras cervicales24. Otro estudio de lesiones cervicales relató el uso de la apófisis transversa como sitio de fijación5. A pesar de que se evitó que se dañaran los procesos articulares, la descomposición excesiva del tejido muscular también podría tener un impacto en la estabilidad de la médula espinal. En el presente estudio, solo se resecó la6ª lámina cervical para mantener la estabilidad de la médula espinal cervical, preservando las articulaciones adyacentes y evitando el daño muscular excesivo. Al mismo tiempo, la compresión desde arriba de la médula espinal evita el daño a las raíces nerviosas.
Los resultados de la EH sugieren que el área de daño a la médula espinal cervical de los ratones de cada grupo fue principalmente en la sustancia gris cerca de la médula central, que caracterizó a la CCS, con diferencias significativas en el alcance de la lesión entre los diferentes grupos. En particular, las secciones patológicas que mostramos pueden haber aliviado la manifestación de la lesión porque las muestras se recolectaron unos días después de la lesión. La inmunofluorescencia (NF-200) mostró menos daño a los tractos neurales en la región de la sustancia blanca de la médula espinal, lo que también confirmó que el daño en CCS se concentraba principalmente alrededor de la médula central. El resultado de la inmunofluorescencia se vio agravado por los resultados histológicos previos de la patología. Estudios previos han demostrado que el CCS conduce a un edema cerca de la médula central, lo que conduce a un hematoma y, en última instancia, a una disfunción en la porción medial del tracto corticoespinal lateral3. La hemorragia ha sido reportada como un componente típico del CCS, pero rara vez se observa en estudios de imagen y autopsia posteriores17. En este estudio, los resultados de la EH a los 7 días después de la lesión sugirieron signos de edema tisular en todos los grupos; sin embargo, no se encontraron glóbulos rojos residuales en el área de la lesión. Por lo tanto, se utilizó azul de Prusia para examinar el área de la lesión en busca de hemorragia, y los resultados se correspondieron con la hemosiderosis observada en el área de la lesión del grupo de lesión grave a los 7 días después de la lesión, mientras que el grupo leve no lo hizo. Las imágenes de RM T2 mostraron que tanto las lesiones leves como las graves tenían áreas de señal baja en el área dañada de la lesión a los 7 días después de la lesión. indicando aquí la deposición de lisado de reticulocitos. Estos resultados proporcionan evidencia circunstancial de que la discrepancia entre los hallazgos previamente reportados probablemente se deba a que la prueba de RM es potencialmente más sensible que la prueba histológica14, además de la gravedad de la lesión, lo que también puede influir en la cantidad de hemorragia en el área de la lesión. La GFAP también se expresó ampliamente en la zona dañada. Al mismo tiempo, también se observó expresión de Iba-1 en áreas intactas, lo que sugiere la persistencia de una respuesta inflamatoria, consistente con los resultados de la resonancia magnética, donde un anillo de señal hiperintensa alrededor del área de señal hipointensa en la lesión sugiere la presencia de una respuesta inflamatoria. Finalmente, con base en los resultados del presente estudio, el área de lesión en el modelo se centró en la sustancia gris alrededor del cordón central, lo que en general es consistente con las descripciones reportadas anteriormente13. Desafortunadamente, no realizamos resonancias magnéticas de forma repetitiva en todos los animales de experimentación para mostrar cómo el sitio de la lesión cambia dinámicamente con el tiempo. Los futuros investigadores pueden incluir esto en su trabajo para una mejor investigación sobre la CAC. Además, se puede incluir en el estudio el inmunomarcaje con marcadores neuronales como NeuN, que definen la materia gris.
En conclusión, las características de los hallazgos sobre patología y resonancia magnética tienen grandes similitudes con las descritas para la CCS en estudios previos4. El presente protocolo que modela de forma factible la CCS permite una mayor investigación y comprensión de la CCS.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio contó con el apoyo del Proyecto Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de Investigación de Células Madre y Transformación (2019YFA0112100) y el Programa Estatal Clave de Ciencias Naturales Nacionales de China (81930070).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
| Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | Abcam | ab8135 | Dilution ratio (1:2000) |
| Eosin Staining Solution (water soluble) | Biosharp | BL727B | |
| Ethanol | Fuyu Reagent | ||
| Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
| Frozen Slicer | Leica | ||
| GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1:600) |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1:1000) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1:1000) |
| Hematoxylin Staining Solution | Biosharp | BL702A | |
| Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
| Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
| Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| Phosphate buffered solution (PBS) | Solarbio | P1020 | pH 7.2–7.4 |
| Prussian Blue Iron Stain Kit (With Eosin) | Solarbio | G1424 | |
| RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
| Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
| Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~ 1~b0yRFKOq&alg_id= 0&slg=tagGoodList-default%2COpBottom%2Cuuid% 2CabTraceId&components_ style_layout =1&reft=1659409105184&spm= g.930111970_f.81386274&alias= 367x5ovgn69q18g&from_uuid= 1362cc46-ffe0-6886-2c65-01903 dbacbba&sf=qq_sm&is_share= 1&shopAutoEnter=1&share_cmpt =native_wechat&is_silence_auth=1 |
| Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
| Tris Buffered Saline+Tween (TBST) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1:19) |
| Xylene | Fuyu Reagent |
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