Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

אבלציה של דיבור עיניים להגברת התבגרות השחלות בסרטני בוץ

Published: March 31, 2023 doi: 10.3791/65039
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 2,4, 5, 1,2,3
1Higher Institution Centre of Excellence (HICoE), Institute of Tropical Aquaculture and Fisheries, Universiti Malaysia Terengganu, 2Centre for Chemical Biology, Universiti Sains Malaysia, 3Department of Aquaculture, Faculty of Fisheries, Kasetsart University, 4School of Biological Sciences, Universiti Sains Malaysia, 5International Research Center for Marine Biosciences, Ministry of Science and Technology, Shanghai Ocean University

ERRATUM NOTICE

Summary

שני פרוטוקולי אבלציה של דיבור עיניים (כלומר, גישות צריבה וניתוח) בוצעו על נקבות סרטנים מורדמות. אבלציה של סרטני בוץ זירזה את הבשלת השחלות מבלי להפחית את שיעור ההישרדות.

Abstract

סרטני בוץ (Scylla spp.) הם מיני סרטנים בעלי חשיבות מסחרית שניתן למצוא בכל אזור הודו-מערב האוקיינוס השקט. במהלך התרבות, השראת הבשלת השחלות חשובה כדי לענות על הביקוש הצרכני לסרטני בוץ בוגרים ולהאיץ את ייצור הזרעים. אבלציה של Eyestalk היא כלי יעיל לשיפור התבגרות השחלות בסרטני בוץ. עם זאת, אין פרוטוקול סטנדרטי לאבלציה של סרטני בוץ. במחקר זה מתוארות שתי טכניקות אבלציה של דיבור עיניים: צריבה (שימוש במתכת חמה כדי לעבד את העיניים של סרטן מורדם) וניתוח (הסרת העיניים באמצעות מספריים כירורגיים). לפני אבלציה של דיבור עיניים, נקבות בוגרות מינית (CW > 86 מ"מ) הורדמו באמצעות שקית קרח (-20 מעלות צלזיוס) עם מי ים. כאשר טמפרטורת המים הגיעה ל -4 מעלות צלזיוס, שקית הקרח הוסרה מהמים. מי ים זורמים (טמפרטורת סביבה: 28 מעלות צלזיוס) שימשו להתאוששות מההרדמה מיד לאחר אבלציה של דיבור עיניים. התמותה לא התרחשה במהלך או אחרי תהליך אבלציה של דיבור עיניים. פרוטוקול האבלציה של שיחות העיניים שהוצג כאן האיץ את ההבשלה השחלתית של סרטני הבוץ.

Introduction

כל ארבעת מיני סרטני הבוץ השייכים לסוג Scylla הם מיני סרטנים בעלי חשיבות מסחרית בחקלאות ימית 1,2. גדילתם של סרטנים, כולל סרטני בוץ, והפיכתם משלב הפג (תת-בוגר או התבגרות מינית) לשלב הבוגר מינית (בוגר) מתרחשים בתהליך התכה הכולל נשירה תקופתית של שלד חיצוני ישן וקטן יותר. רוחב קרפצ'ה (CW), כלפידים ומורפולוגיה של דש הבטן נמצאים בשימוש נרחב כדי לקבוע את הבגרות המינית של Scylla spp. 3,4,5. תהליך ההתכה מוסדר על ידי פעולה של הורמונים שונים ודורש כמות עצומה של אנרגיה6. בנוסף לתהליך ההתכה הרגיל, אובדן הגפיים, בין אם מרצון או על ידי גורמים חיצוניים, מזרז את ההתכה של סרטנים מבלי להשפיע על שיעור ההישרדות שלהם 7,8,9. לכן, אוטוטומיה של הגפיים משמשת בדרך כלל להשראת מותך בתעשיית גידול סרטני הבוץ הרכים 7,9.

אבלציה חד צדדית או דו-צדדית פופולרית בעיקר בסרטני מים מתוקים ושרימפס ימיים להבשלת גונאד וייצור זרעים10,11,12,13. טכניקות אבלציה נפוצות בסרטנים כוללות את הדברים הבאים: (i) קשירה בבסיס העין באמצעות מחרוזת14,15; (2) צריבת העיניים באמצעות מלקחיים חמים או מכשירים חשמליים16; (3) הסרה או צביטה ישירה של העיניים כדי להשאיר פצע פתוח12; ו-(4) הסרת תוכן העיניים דרך חתך לאחר חיתוך החלק הדיסטלי של העין בתער17. איברי X הם איברים אנדוקריניים חשובים בסרטנים, שכן הם מווסתים הורמונים היפרגליקמיים סרטניים (CHH), הורמונים מעכבי מותך (MIH) והורמונים מעכבי ויטלוגנזה (VIH)6,18,19,20,21,22. איברי X של Eyestalk (או קומפלקס בלוטת הסינוס) מסנתזים ומשחררים הורמונים מעכבי גונאד (GIH), הידועים גם בשם הורמונים מעכבי ויטלוגנזה (VIH), השייכים למשפחת ההורמונים הנוירופפטידים6. אבלציה חד צדדית או דו-צדדית מפחיתה את סינתזת GIH, וכתוצאה מכך דומיננטיות של הורמונים מעוררים (כלומר, הורמונים מעוררי גונאד, GSH) והאצת תהליך ההתבגרות השחלתית בסרטנים23,24,25,26. ללא השפעת GIH לאחר אבלציה של דיבור עיניים, נקבות סרטנים מקדישות את האנרגיה שלהן להתפתחות השחלה27. נמצא כי אבלציה חד צדדית בעיניים מספיקה להשראת הבשלה שחלתית בסרטנים11 וכי העיניים האבלטיות של שרימפס וסרטנים יכולות להתחדש לאחר מספר התכות28. ישנם ארבעה שלבי התפתחות שחלות שתועדו ב- Scylla spp.: i) לא בשלים (שלב 1), ii) הבשלה מוקדמת (שלב -2), iii) טרום הבשלה (שלב -3), ו- iv) הבשלה מלאה (שלב 4)29,30. השלב השחלתי הלא בשל נמצא אצל נקבות לא בוגרות. לאחר ההתכה המינית וההזדווגות, השחלה הלא בשלה מתחילה להתפתח ולבסוף מבשילה (שלב 4) לפני ההשרצה31.

פרוטוקול אבלציה של Eyestalk חיוני להתפתחות סרטני בוץ ולייצור זרעים. בשוק המזון העולמי, סרטני בוץ בוגרים עם שחלות בשלות לחלוטין (שלב 4) על פני סרטנים עם תכולת שרירים גבוהה יותר מועדפים על ידי הצרכנים, ולכן יש להם ערך מסחרי גבוה יותר, אפילו גבוה יותר מאשר זכרים גדולים. אין פרוטוקול מלא לאבלציה של סרטני בוץ בעיניים. פרוטוקול אבלציה של דיבור עיניים בעבודה זו ממזער מתח על ידי שימוש בסרטנים מורדמים לחלוטין וממזער את הפגיעה הפיזית באנשי צוות מעקיצות סרטנים. פרוטוקול זה קל וחסכוני. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור אבלציה עיניים של Scylla spp. שיכול לגרום להבשלה של הגונדה. נבדקו שתי טכניקות של אבלציה של דיבור עיניים (צריבה וניתוח) ויעילותן הושוותה בהתבסס על קצב התפתחות הגונדל של נקבות סרטני הבוץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר קוד העיסוק המלזי לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות שנקבע על ידי האגודה למדעי חיות מעבדה של מלזיה. הקרבת דגימות הניסוי נעשתה על פי מדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (פרסומי NIH מס '8023, מתוקן 1978). סרטני בוץ נקביים פגים מינית (סרטן בוץ כתום S. olivacea) נאספו מהשוק המקומי (5°66′62′′N, 102°72′33′′E) בביצות סטיו במלזיה. מין סרטני הבוץ זוהה על סמך מאפיינים מורפולוגיים1.

1. איסוף דגימות וחיטוי

  1. אספו סרטני בוץ בריאים, פעילים ופגים (איור 1).
    הערה: לנקבות סרטנים פגות יש דשי בטן משולשים ובהירים יחד עם טווח CW של 80-85 מ"מ.
  2. שטפו את הסרטנים במי ברז עם כלור (מים מתוקים) כדי להסיר פסולת וטפילים אוסמופיליים.
  3. משרים את הסרטנים בפורמלדהיד של 150 ppm עם מליחות של 20 ppt למשך 30 דקות.
  4. יש לשמור על אוורור רציף ועדין עם אבני אוויר במהלך הטיפול בפורמלדהיד. מקור האוורור יכול להיות מקו אוורור מרכזי או משאבת אוורור אקווריום.
  5. שטפו את הסרטנים במי ים זורמים כדי להסיר שאריות פורמלדהיד.

Figure 1
איור 1: מורפולוגיה בטנית של נקבות סרטני בוץ המשמשת לזיהוי שלבי ההתבגרות המינית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. התאקלמות

  1. מעבירים כל נקבה שעברה חיטוי למיכל עגול נפרד בנפח 32 ליטר.
  2. מגדלים את הנקבות במשך 3 ימים במליחות של 20 ppt וממשיכות להאכיל פעמיים ביום (בוקר 09:00 בבוקר וערב 20:00) עם דגי ים קצוצים בכ-4%-5% ממשקל הגוף של הסרטנים.
  3. הסר מזון עודף ולא נאכל על ידי siphoning לפני האכלת הבוקר.
  4. החליפו 10% ממי הים המגדלים סרטנים (20 ppt) מדי יום.

3. השראת התכה לבגרות מינית

  1. חותכים את כל הרגליים למעט רגלי השחייה באמצעות מספריים מעוקרים.
    1. תפסו את הסרטן עם רשת סקופ, והחזיקו את הסרטן בזהירות. חותכים תחילה את שתי הרגליים ההולכות במפרק השני באמצעות מספריים. הסרטן יבצע אוטוטומיזציה אוטומטית של התוספתן הפגוע. הרדמה אינה נדרשת עבור אוטוטומיה של הגפיים.
  2. לשטוף את הסרטן במים מתוקים מיד לאחר אוטוטומיה הגפיים.
  3. מעבירים בנפרד את הסרטנים האוטוטומיים לגפיים לסלי פלסטיק מחוררים (רוחב 28 ס"מ x 22 ס"מ רוחב x 7 ס"מ גובה), ומניחים אותם במיכל פיברגלס (אורך 305 ס"מ x רוחב 120 ס"מ x גובה 60 ס"מ).
    הערה: ניתן לקשור ולחתוך שני סלים זה לזה. הסל העליון משמש ככיסוי כך שהסרטן לא יכול לברוח מהסל.
  4. השתמש במערכת חקלאות ימית מחזורית (RAS) עם מליחות של 20 ppt ועומק מים של לפחות 10 ס"מ כדי להבטיח שכל סל הפלסטיק שקוע.
  5. המשיכו להאכיל את נקבת הסרטן בדג ימי קצוץ פעמיים ביום ב-5%-7% ממשקל גופו של הסרטן.
  6. מגדלים את הסרטנים עד לבגרות מינית באמצעות התכה (35 יום).
    הערה: ניתן לדלג על התכה מושרית לצורך הבשלה מסחרית של השחלות וייצור זרעים עם נקבות סרטני בוץ בוגרות בטבע. נקבות בוגרות שנקטפו מהטבע חייבות להתאקלם ולהיות חשופות ישירות להלם קר ולהלציה של דיבור עיניים לאחר מכן.

4. הרדמה

  1. בחרו נקבות בוגרות מינית עם דש בטן בצורת אליפסה בצבע כהה עם CW >86 מ"מ (איור 1).
  2. תפסו את הסרטנים עם רשת סקופ, ושמרו אותם בנפרד באקווריומים קטנים להרדמה.
  3. לאחר 5 דקות של תקופת התאקלמות, הוסף 2-פנוקסיאתנול (2-PE) ב 2 מ"ל / ליטר לכל אקווריום ולאפשר 15 דקות של טיפול הרדמה.
  4. ודא שהסרטנים מורדמים לחלוטין על ידי חוסר תנועה ספונטנית.

5. אבלציה של דיבור עיניים

  1. טכניקת צריבה
    1. בצע את כל ההליכים על גבי שולחן ובשטח פתוח.
    2. קחו מוט מתכת מפלדת ניקל עם ראש שטוח (למשל, מברג) עם ידית עץ או פלסטיק, וכסו את הידית במגבת כותנה רטובה.
    3. לעקר שני מלקחיים כירורגיים מנירוסטה באוטוקלאב.
    4. הכינו אתנול 70% בבקבוק תרסיס והרחיקו אותו מכל מקור הקשור לאש, כגון לפיד ניפוח ומברג חם אדום. הכינו נייר טישו לשימוש.
      הערה: אתנול דליק מאוד. יש לשמור על מרחק בטוח ממקורות האש.
    5. חבר פנס נשיפה לבלון גז (בוטאן) בצורה מאובטחת.
      התראה: בצע את ההוראות המופיעות על לפיד הנשיפה ובלון הגז. ודא כי הלפיד כבוי בעת חיבור עם בלון הגז. קרא ופעל לפי כל אמצעי בטיחות האש המוזכרים על בלון הגז.
    6. לבשו כפפות כותנה עבות כדי למנוע פציעה מחפצים חמים.
    7. יש להכפיף את קצה מוט המתכת לאש הלפיד עד שמוט המתכת יהיה אדום בוהק.
    8. מכסים את הסרטן המורדם במגבת כותנה רטובה.
      הערה: כסו את האנטנות של הסרטן כדי למנוע נזק מיותר.
    9. החזיקו עין אחת של הסרטן במלקחיים מעוקרות.
      הערה: יש לעקר את המלקחיים באוטוקלאבה לשימוש ראשון, ולחטא באמצעות 70% אתנול לשימוש עתידי על סרטנים אחרים.
    10. החזיקו את קצה המתכת האדום-חם על עין הסרטן ולחצו מעט במשך כ-10-15 שניות עד שצבע העיניים יהפוך לכתום או אדמדם-כתום. היזהר בעת ביצוע צעד זה כדי למנוע נזק למבנים סמוכים.
      הערה: שני אנשים נדרשים לבצע אבלציה של דיבור עיניים בשיטת הצריבה: אחד להחזיק את הסרטן והשני לבצע את הליך האבלציה.
    11. יש לחטא את המלקחיים בתרסיס אתנול 70% כדי להבטיח שאין זיהום צולב בין סרטנים.
      הערה: בצע שלב זה רק לפחות 5 דקות לאחר הליך אבלציה של דיבור עיניים כדי להבטיח קירור המלקחיים לפני החיטוי באמצעות אתנול 70% כדי למנוע סיכוני אש פוטנציאליים.
    12. לאחר ביצוע אבלציה של דיבור העיניים על כל הסרטנים, טבלו את מוט המתכת החם מפלדת ניקל (מברג) במי ברז.
    13. יש לחטא את המגבת לפני שימוש חוזר. ניתן להשתמש במספר מגבות כדי לחסוך זמן.
      הערה: שטפו את המגבת במי ברז וטבלו אותה במי כלור של 30 ppm למשך 5 דקות. לאחר מכן, שטפו שוב את המגבת במי ברז וטבלו אותה בתמיסת נתרן תיוסולפט 1 גרם / ליטר.
    14. יש לשמור את הפנס במקום בטוח לאחר כיבויו, ולהמתין עד שהוא יחזור לטמפרטורת הסביבה (כ-30 דקות) לפני הניתוק.
  2. טכניקת ניתוח
    1. בצע את ההליך באזור מאוורר היטב.
    2. לעקר שני מספריים כירורגיים ומלקחיים באוטוקלאב.
    3. יוצקים 50 מ"ל של 70% אתנול לתוך זכוכית 100 מ"ל.
    4. יש ללבוש כפפות כותנה עבות.
    5. החזיקו את הסרטן המורדם, וכסו אותו במגבת כותנה רטובה.
    6. החזיקו עין אחת של הסרטן במלקחיים מעוקרות.
    7. חתכו במהירות את העיניים באמצעות מספריים כירורגיים מעוקרים.
      הערה: המולימפה עלולה ללכת לאיבוד מהחלק הפצוע של הסרטן.
    8. טובלים את המספריים והמלקחיים באתנול 70% לאחר כל שימוש, ומייבשים אותם באמצעות נייר טישו לפני שימוש חוזר.

6. טיפול לאחר הרדמה

  1. הכינו מי ים מסוננים של 20 ppt, ושמרו במיכל עילי עם אוורור רציף.
  2. חבר צינור גמיש עם המיכל העילי לזרימת מים כבידתית.
  3. מיד לאחר אבלציה של דיבור עיניים, הכניסו את הסרטן לסלסלה, וחשפו את הסרטן למי ים זורמים (טמפרטורת הסביבה: 28 מעלות צלזיוס) מהמיכל שמעליו.
  4. שמרו על זרימת מי הים, ועקבו אחר הסרטן עד שהוא יכול לנוע באופן ספונטני, מה שמעיד על התאוששות מההרדמה.
    הערה: ניתן להכין מי ים במיכל קרקע, וניתן להשתמש במשאבת מים טבולים לזרימת המים.
  5. שמור את הסרטנים בנפרד במי ים של 20 ppt עם אוורור באקווריום למשך 30 דקות לתצפית נוספת.
    הערה: הסרטנים שהתאוששו יתרבו בנפרד בתהליך תרבית הברודסטוק הבא.

7. תצפית על התבגרות השחלות

  1. גידול ברודסטוק
    1. מעבירים את הסרטנים הבוגרים למיכלים עגולים בודדים של 32 ליטר.
    2. המשיכו להאכיל עם דגים ימיים קצוצים (קפואים בטמפרטורה של 20°C-) פעמיים ביום (בבוקר 09:00 בבוקר ובערב 20:00 בערב), והוציאו מזון שלא נאכל לפני האכלת הבוקר.
    3. מחזירים את הברודסטוק בנפרד למשך 30 יום במליחות של 20 ppt.
    4. יש להסיר צואה ולהחליף 10% ממי הים (20 ppt) מדי יום.
  2. דיסקציה
    1. נקו מגש ניתוח, מספריים ומלקחיים עם 70% אתנול.
    2. מרדימים את הנקבות בנפרד בשיטת הרדמה טבילה 2-PE.
    3. בחרו באופן אקראי נקבות חדשות (לאחר התכה של נקבות פגות) שלא עברו אבלציה של דיבור עיניים כדי לאשר את שלבי הגונדל שלהן.
    4. הקריבו את כל נקבות הניסוי בעיניים בנפרד, וזהו את שלבי ההבשלה של הגונד. להרוס את גרעיני החזה של הסרטן באמצעות awl סטרילי חד. הסר תחילה את השריון העליון ולאחר מכן את hepatopancreas כדי להפוך את השחלה גלוי. התבוננו בצבע השחלה וזהו את שלב ההבשלה השחלתית (איור 2).
  3. זיהוי שלבי התבגרות השחלות
    1. שימו לב לצבע השחלה בעין בלתי או מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
    2. זהה את שלבי ההבשלה השחלות על סמך צבע30: הלא בוגר (שלב -1) מראה צבע לבן שקוף או שמנת; ההתבגרות המוקדמת (שלב 2) מראה צבע צהבהב חיוור עד בהיר; (iii) טרום ההתבגרות (שלב 3) מראה צבע צהוב עד כתום בהיר; ו-(iv) הבשלה מלאה (שלב 4) מראה צבע כתום כהה עד אדמדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התבגרות גונאד
רקמות שחלה לבנות וקרמיות (שחלות לא בשלות, שלב 1) נמצאו ב-100% מהנקבות שנותחו (n = 6) לפני ביצוע אבלציה של דיבור עיניים (איור 2). שיעור ההבשלה של נקבות סרטנים עם דיבור עיניים (n = 63; 31 נקבות עם טכניקת הצריבה ו-32 נקבות עם טכניקת הניתוח) היה גבוה יותר בהשוואה לנקבות סרטנים שלא עברו אבלציה של דיבור עיניים (n = 31) לאחר 30 יום של גידול אינדיבידואלי (איור 3). האחוזים הגבוהים ביותר של שחלות טרום הבשלה (שלב 3) נמצאו אצל נקבות סרטנים עם דיבור עיניים (איור 3; גם טכניקות צריבה וגם טכניקות ניתוח), וניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) הראה הבדלים מובהקים (p < 0.05) בין שלבי ההבשלה השחלתיים של נקבות הסרטנים הניסיוניות (טבלה 1). בקבוצת הביקורת הייתה שכיחות גבוהה יותר של נקבות סרטנים לא בוגרות בהשוואה לקבוצות הצריבה והטיפול בניתוח (בדיקת HSD של Tukey, p < 0.001). טיפולי הצריבה והניתוח לא הראו הבדלים משמעותיים מבחינת אחוז הסרטנים הנקבות בכל שלבי ההבשלה (בדיקת HSD של Tukey, כל p > 0.1). הן בטיפולי הצריבה (בדיקת HSD של Tukey, p = 0.004) והן בניתוח (בדיקת HSD של Tukey, p = 0.006) היו אחוזים גבוהים משמעותית של סרטנים נקבות בשלב 3 לפני הבשלה מאשר טיפול הביקורת, ורק טיפולי צריבה וניתוח הצליחו לייצר נקבות סרטנים בשלב 4 משלב לא בוגר תוך 30 יום לאחר הטיפול (טבלה 2).

Figure 2
איור 2: ארבעה שלבי הבשלה שחלתיים של נקבות סרטני בוץ. הבדלים בצבע ובנפח השחלות בין השלבים מסומנים בבירור על ידי החצים השחורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שלבי ההבשלה של השחלות של נקבות סרטנים שעברו אבלציה של דיבור העיניים (ניתוח וצריבה) ובקרה לאחר תקופת הגידול של 30 יום (n = 94). סרגל השגיאה מייצג את סטיית התקן. האותיות בכתב עילי מצביעות על הבדלים משמעותיים בין הטיפולים בכל שלב הבשלה ב-p <-0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

שלב ההתבגרות סכום הריבועים ד"פ ריבוע ממוצע F P
לא בוגר (שלב 1) בין קבוצות 3755.556 2 1877.778 169 <0.001
בתוך קבוצות 66.667 6 11.111
סך 3822.222 8
התבגרות מוקדמת (שלב-2) בין קבוצות 1355.556 2 677.778 8.714 0.017
בתוך קבוצות 466.667 6 77.778
סך 1822.222 8
טרום התבגרות (שלב-3) בין קבוצות 4688.889 2 2344.444 17.58 0.003
בתוך קבוצות 800 6 133.333
סך 5488.889 8
התבגרות מלאה (שלב-4) בין קבוצות 822.222 2 411.111 9.25 0.015
בתוך קבוצות 266.667 6 44.444
סך 1088.889 8
הערה: ההבדל הממוצע משמעותי ברמה p = 0.05.

טבלה 1: השוואה בין אבלט עיניים (צריבה וניתוח) לבין שלבי ההבשלה של נקבות סרטנים לאחר בדיקת ANOVA חד-כיוונית. ההבדל הממוצע היה משמעותי ב p = 0.05.

שלב ההתבגרות טיפול טיפול השוואה P
לא בוגר (שלב 1) צריבה כירורגיה 1
צריבה לשלוט <0.001
כירורגיה לשלוט <0.001
התבגרות מוקדמת (שלב-2) צריבה כירורגיה 0.129
צריבה לשלוט 0.014
כירורגיה לשלוט 0.232
טרום התבגרות (שלב-3) צריבה כירורגיה 0.934
צריבה לשלוט 0.004
כירורגיה לשלוט 0.006
התבגרות מלאה (שלב-4) צריבה כירורגיה 0.109
צריבה לשלוט 0.012
כירורגיה לשלוט 0.237
הערה: ההבדל הממוצע משמעותי ברמה p = 0.05.

טבלה 2: בדיקת HSD פוסט-הוק של טוקי על ההבדלים בין אטבלט-דיבור בעיניים (צריבה וניתוח) לבין שלבי ההבשלה הגונדלית של נקבות סרטנים. ההבדל הממוצע היה משמעותי ב p = 0.05.

שיעור הישרדות
שיעור ההישרדות הממוצע של נקבות הסרטנים הנגועות בדיבור עיניים היה 95.45% ±-4.98% (ממוצע ± סטיית תקן) בתקופת 30 ימי הגידול. לא התרחשה תמותה במהלך 7 הימים הראשונים לאחר אבלציה וטיפול בעיניים. במהלך 30 הימים שלאחר אבלציה בעיניים, שיעור התמותה לא היה שונה באופן משמעותי (בדיקת קרוסקל-ואליס, p = 0.67) בין הטיפולים. שיעור ההצלחה בהתכה של נקבות הסרטנים שעברו אוטוטומיזציה בגפיים היה 80% ±-2.86% (n = 115).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה פותח עבור אבלציה של סרטן הבוץ, Scylla spp., וניתן ליישם אותו כשיטה יעילה לגרימת התבגרות הגונד. פרוטוקול זה ניתן לשכפול בקלות להבשלה מסחרית של סרטני בוץ וניתן ליישם אותו כדי להפחית את התקופה הסמויה (הזמן מהשרצה אחת לאחרת) בייצור זרעי סרטני בוץ.

אבלציה של סרטנים (כלומר, סרטני מים מתוקים, שרימפס ימי) נעשית בדרך כלל כדי לגרום להבשלת גונאד והשרצה מחוץ לעונה11,12,13. אבלציה של דיבור עיניים בסרטני ברכיוראן נעשתה גם כדי לחקור התכה 25,32,33, ויסות הורמונלי 18, התבגרות גונאד 34, וזירוז רבייה וביצועי רבייה 35,36,37,38,39 . הרדמה באמצעות טבילה ב-2-פנוקסיאתנול שימשה מכיוון שהיא דומה לשימוש בטריקאין מתאן-סולפונט (MS-222) בארתופודים, אך זולה יותר ואינה דורשת שימוש בחיץנוסף 40. אבלציה חד צדדית או דו צדדית משפיעה על הפיזיולוגיה של הסרטנים. אבלציה של דיבור העיניים בעקבות הפרוטוקול המצוין במחקר זה משפיעה גם על קצב ההבשלה השחלתי של סרטני בוץ. בטיפול הביקורת (ללא אבלציה של דיבור עיניים), 43.33% ±-5.77% מהסרטנים הנקבות סבלו משחלה לא בשלה (שלב 1). עם זאת, באותה תקופת גידול (30 יום), לנקבות סרטנים עם דיבור עיניים היו שחלות טרום הבשלה (שלב 3; 56.67% ± 11.55% ו-53.33% ±-15.28% עם טכניקות הצריבה והניתוח, בהתאמה), מה שמראה כי אבלציה של דיבור עיניים יכולה להגביר את התבגרות הגונד של סרטני בוץ. מחקרים קודמים דיווחו גם כי ההתפתחות השחלתית של סרטנים שלמים (ללא אבלציה של דיבור עיניים) איטית יותר מזו של סרטנים עם דיבור עיניים25,31. בשל התפתחות גונדל איטית יותר בסרטנים שלמים, אבלציה של דיבור העיניים נעשית באופן נרחב במדגרות סרטנים ושרימפס מסחריות. בפרוטוקול זה, נקבות הסרטנים עם הבשלת השחלות השיגו אחוזים גבוהים יותר של הבשלת השחלות בהשוואה לסרטנים הנקבות ללא טיפול אבלציה של דיבור העיניים (איור 3).

התבגרות הגונד של סרטן הבוץ מווסתת על ידי הורמונים21,41,42. שיח העיניים מכיל בלוטות אנדוקריניות חשובות (כלומר, קומפלקס בלוטת האיברים-סינוס X) הממלאות תפקידים חיוניים בתהליך ההבשלה של סרטני בוץ18,21. אבלציה חד צדדית של דיבור עיניים, בין אם על ידי צריבה או ניתוח, פוגעת באחת הבלוטות האנדוקריניות העיקריות המעורבות בסינתזה ובשחרור של הורמונים מעכבים (למשל, VIH), ובכך גורמת לרמה גבוהה יותר של הורמונים מעוררי גונדה (כלומר, VSH).

ניתן להבדיל בין שלבי ההתבגרות השחלתיים של Scylla spp. על ידי התבוננות בצבע רקמת השחלה בעין בלתי 29,30,43. רקמות שחלות לבנות שקופות או שמנות הן אינדיקציות לשחלות לא בשלות 29,30,43,44. במחקר זה, שחלות לא בשלות (שלב 1) עדיין נמצאו בקבוצת הסרטנים הנקבות ללא אבלציה של דיבור העיניים בשל תהליך ההתבגרות השחלתי האיטי יותר. עם זאת, הסרטנים בקבוצות ה-ablated של העיניים (הן על ידי טכניקות הצריבה והן על ידי טכניקות הניתוח) הראו בעיקר שחלות טרום הבשלה (שלב -3), כאשר חלק מהאנשים הציגו שחלות בשלות לחלוטין (שלב -4). לכן, פרוטוקול אבלציה של דיבור עיניים המתואר כאן יכול לשמש להגברת התבגרות השחלות אצל סרטני בוץ נקבות. פרוטוקול זה יכול גם להיות מיושם ישירות על סרטני בוץ בוגרים שנאספו בטבע כדי להאיץ את ייצור הזרעים שלהם. כדי להעריך את היעילות של שיטות צריבה וניתוח על התבגרות גונאד סרטני בוץ וכדי להבטיח הערכה מדויקת של משך ההתכה, נעשה שימוש בסרטנים פגים מינית. לאחר ההתכה (המושרה) של נקבות סרטנים פגות מינית, שמנו לב שהשחלות שלהן עדיין היו בשלבים לא בשלים או מוקדמים של התפתחות29,45. לאחר 30 יום של גידול נקבות סרטנים שזה עתה הבשילו (בין אם עם אבלציה של העיניים או ללא אבלציה של דיבור עיניים), שלבי התפתחות השחלות (שלב 1 עד שלב 4) נקבעו על ידי צבע רקמות השחלה. פרוטוקול זה מעודד את השימוש בטכניקת הצריבה לביצוע אבלציה של דיבור עיניים בסרטני בוץ כדי למנוע אובדן המולימפה ולמנוע זיהום באתרים האבלטים. הצריבה אוטמת מיד את הפצע, בעוד שלטכניקת הניתוח לוקח זמן עד שהפצע מחלים וזה יאפשר סיכוי לזיהום. למטרות מסחריות, יש לבחור סרטנים בוגרים גדולים יותר, רצוי בשלב מאוחר יותר של הבשלת השחלות, לאבלציה של דיבור העיניים כדי לקצר את הזמן להגיע לשלב השחלה הבשלה המלאה למסחר הבא או לתרבית מלאי ברוד. בנוסף לאבלציה של דיבור עיניים, גידול אינדיבידואלי עם מצע חול והאכלה מספקת, רצוי עם הזנה חיה, יכול להגדיל את קצב ההבשלה של סרטני בוץ בשבי 30,35,46,47.

דם סרטני נקרא המולימפה והוא יכול ללכת לאיבוד במהלך אבלציה של דיבור העיניים. אובדן מוגזם של המולימפה עלול להוביל למוות של סרטנים עם דיבור עיניים, במיוחד בעת ביצוע ניתוח להסרת העיניים. ההמולימפה יכולה לנקרש בחלק הפצוע כדי למנוע אובדן. עם זאת, בהשוואה לטכניקת הניתוח, טכניקת הצריבה אוטמת את החלק הפגוע באופן מיידי, ובכך מונעת אובדן המולימפה וזיהום אפשרי.

תמותה מסרטני בוץ לאחר אבלציה חד צדדית בעיניים עם צריבה או ניתוח לא נמצאה במהלך 7 הימים הראשונים. לכן, אבלציה של דיבור עיניים יכולה להיעשות עם שיעור הישרדות גבוה יותר. אבלציה חד צדדית אינה פוגעת בשיעור ההישרדות של הסרטן33.

מתח במהלך טיפול בסרטנים ואבלציה של דיבור עיניים עשוי לתרום לתמותת סרטנים. יש צורך בהרדמה נכונה כדי למזער את הטיפול בלחץ במהלך אבלציה של דיבור עיניים. באבלציה של סרטנים משתמשים בחומרי הרדמה כימיים (כלומר, קסילוקאין, לידוקאין) בבסיס העיניים, לפני אבלציה של דיבור עיניים14,15,17,48. עם זאת, בשל אופיים התוקפני וגודלם הגדול של סרטני הבוץ, השימוש בהרדמה רק בבסיס העיניים אינו מספיק ועלול לגרום ללחץ נוסף לבעלי החיים במהלך ההזרקה. מצד שני, הרדמה על ידי חשיפתם לטמפרטורת מים נמוכה יותר היא חסכונית ובטוחה יותר. השימוש במים קרים להרדמה בסרטני בוץ נפוץ ושימש במחקרים אחרים בשל יעילותו, פשטותו והשפעתו המינימלית על התאוששות והישרדות 37,49,50. בנוסף, מומלץ מחקר עתידי על הערכת כאב בעקבות אבלציה של דיבור עיניים על סרטני בוץ כדי להדגיש את השינוי בהתנהגויות הקשורות לכאב וללחץ, כפי שניתן לראות בסרטני מים מתוקים Macrobrachium americanum51.

למרות שלאבלציה בדיבור עיניים הן בשיטות צריבה והן בשיטות ניתוח יש השפעה מינימלית על הישרדות הסרטנים ומשפרת את הבשלת השחלות, ביצוע אבלציה של דיבור עיניים דורש שליטה מקצועית בטכניקות. העיתוי בין השלבים הוא קריטי מכיוון שכל עיכוב בין פרוטוקולים מוסיף מתח נוסף לסרטנים. בניגוד לטכניקת הניתוח, טכניקת הצריבה מסוכנת משום שהיא כרוכה בשימוש בציוד דליק (כלומר, לפיד מכה וגז בוטאן). לכן, זהירות נוספת נדרשת בעת ביצוע טכניקת הצריבה.

סרטנים הם קניבליים מטבעם, והם ידועים כטורפים אחרים שזה עתה סיימו את מותם ועדיין נמצאים בתנאי הקליפה הרכה שלהם 7,52,53. לכן, גידול הסרטנים בנפרד יכול למנוע תמותה מיותרת עקב קניבליזם. השימוש בגידול אינדיבידואלי בגידול סרטני בוץ מקובל, הן בתרבות בצפיפות גבוהה והן בתרבות בריכות, למטרות פיטום וגידול סרטנים בעלי קליפה רכה 8,53. פרוטוקול זה השתמש גם בגידול ותחזוקה פרטניים. במהלך הובלת הסרטנים לגידול או למסחר, הסרטנים קשורים היטב (או אפילו אוטוטומיים) כדי למנוע לחימה, פציעות מיותרות ואובדן גפיים34.

הפרוטוקול המתואר עבור אבלציה של דיבור עיניים צריך להתבצע עם מספר אנשים. לאחר השלמת אבלציה של דיבור עיניים, יש לחטא ציוד חד פעמי (כגון אקווריום, מגש, מגבת וכו ') עם 30 ppm כלור. יש לעקוב אחר הסרטנים לפחות פעמיים ביום. יש להיפטר במהירות מכל סרטנים מתים, מזון שלא נאכל, איברים מבולבלים או קליפות סרטנים מותכות (כלומר, לקבור אותם באדמה עם אבקת הלבנה) כדי למנוע כל פוטנציאל להתפשטות מחלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לאף אחד מהכותבים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי משרד החינוך, מלזיה, במסגרת תוכנית מרכז המצוינות של המוסד הגבוה (HICoE), מלזיה, מוכר למכון לחקלאות ימית טרופית ודיג, אוניברסיטת מלזיה טרנגאנו (הצבעה מס '63933 והצבעה מס '56048). אנו מכירים בתמיכתם של Universiti Malaysia Terengganu ו- Sayap Jaya Sdn. Bhd. באמצעות מענק המחקר לשותפות פרטית (הצבעה מס '55377). כמו כן מוכרת משרת עמית אקדמי נספח מאוניברסיטת סאיינס מלזיה לח'ור וואיהו וחנפיה פאז'אן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aeration tube  Ming Yu Three N/A aquarium and pet shop
Airstone Ming Yu Three N/A aquarium and pet shop
Autoclave machine HIRAYAMA MANUFACTURING CORPORATION N/A MADE IN JAPAN
Bleaching powder (Hi-Chlon 70%) Nippon Soda Co.Ltd,Japan N/A N/A
Blow torch  MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Circular tank (32L) BEST PLASTIC INDUSTRY SDN. BHD.  N/A N/A
Cotton hand gloves (thick)  MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Cotton towel MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Digital thermometer Hanna Instrument HI9814 Hanna Instruments GroLine Hydroponics Waterproof pH / EC / TDS / Temp. Portable Meter HI9814
Digital Vernier Caliper INSIZE Co., Ltd. N/A
Dissecting tray Hatcheri AKUATROP  N/A Research Center of Universiti Malaysia Terengganu
Dropper bottle/Plastic Pipettes Dropper Shopee Malaysia N/A N/A
Ethanol 70% Thermo Scientific Chemicals 033361.M1 Diluted to 70% using double distilled water
Fiberglass tank (1 ton) Hatcheri AKUATROP  N/A Research Center of Universiti Malaysia Terengganu
Fine sand N/A N/A collected from Sea beach of Universiti Malaysia Terengganu
First Aid Kits Watsons Malaysia N/A N/A
Flat head nickel steel metal rod (Screw driver) MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Formaldehyde Thermo Scientific Chemicals 119690010
Gas cylinder (butane gas) for blow  torch MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Gas lighter gun (long head) MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Glass beaker (100 mL)) Corning Life Sciences 1000-100
Ice bag  Watsons Malaysia N/A N/A
Perforated plastic baskets  Eco-Shop Marketing Sdn. Bhd. N/A N/A
PVC pipe 15mm Bina Plastic Industries Sdn Bhd (HQ) N/A N/A
Refractometer ATAGO CO.,LTD.
Refrigerator Sharp Corporation Japan N/A Chest Freezer SHARP 110L - SJC 118
Scoop net MR D.I.Y. Group Berhad N/A
Seawater Hatcheri AKUATROP  N/A Research Center of Universiti Malaysia Terengganu
Siphoning pipe MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Spray bottle Mr. DIY Sdn Bhd N/A N/A
Stainless surgical forceps  N/A N/A N/A
Stainless surgical scissors  N/A N/A N/A
Submersible water pump  AS N/A model: Astro 4000
Tincture of iodine solution  (Povidone Iodine) Farmasi Fajr Sdn Bhd N/A N/A
Tissue paper  N/A N/A
Transparent plastic aquarium Ming Yu Three N/A aquarium and pet shop
Waterproof table Hatcheri AKUATROP  N/A Research Center of Universiti Malaysia Terengganu

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keenan, C. P., Davie, P. J. F., Mann, D. L. A revision of the genus Scylla de Haan, 1833 (Crustacea: Decapoda: Brachyura: Portunidae). Raffles Bulletin of Zoology. 46 (1), 217-245 (1998).
  2. Fazhan, H., et al. Morphological descriptions and morphometric discriminant function analysis reveal an additional four groups of Scylla spp. PeerJ. 8, e8066 (2020).
  3. Ikhwanuddin, M., Bachok, Z., Hilmi, M. G., Azmie, G., Zakaria, M. Z. Species diversity, carapace width-body weight relationship, size distribution and sex ratio of mud crab, genus Scylla from Setiu Wetlands of Terengganu coastal waters Malaysia. Journal of Sustainability Science and Management. 5 (2), 97-109 (2010).
  4. Ikhwanuddin, M., Bachok, Z., Mohd Faizal, W. W. Y., Azmie, G., Abol-Munafi, A. B. Size of maturity of mud crab Scylla olivacea (Herbst, 1796) from mangrove areas of Terengganu coastal waters. Journal of Sustainability Science and Management. 5 (2), 134-147 (2010).
  5. Waiho, K., et al. On types of sexual maturity in brachyurans, with special reference to size at the onset of sexual maturity. Journal of Shellfish Research. 36 (3), 807-839 (2017).
  6. Mykles, D. L., Chang, E. S. Hormonal control of the crustacean molting gland: Insights from transcriptomics and proteomics. General and Comparative Endocrinology. 294, 113493 (2020).
  7. Fujaya, Y., et al. Is limb autotomy really efficient compared to traditional rearing in soft-shell crab (Scylla olivacea) production. Aquaculture Reports. 18, 100432 (2020).
  8. Waiho, K., et al. Moult induction methods in soft-shell crab production. Aquaculture Research. 52 (9), 4026-4042 (2021).
  9. Rahman, M. R., et al. Evaluation of limb autotomy as a promising strategy to improve production performances of mud crab (Scylla olivacea) in the soft-shell farming system. Aquaculture Research. 51 (6), 2555-2572 (2020).
  10. Okumura, T., et al. Expression of vitellogenin and cortical rod proteins during induced ovarian development by eyestalk ablation in the kuruma prawn, Marsupenaeus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 143 (2), 246-253 (2006).
  11. Pervaiz, P. A., Jhon, S. M., Sikdar-bar, M. Studies on the effect of unilateral eyestalk ablation in maturation of gonads of a freshwater prawn Macrobrachium dayanum. World Journal of Zoology. 6 (2), 159-163 (2011).
  12. Primavera, J. H. Induced maturation and spawning in five-month-old Penaeus monodon Fabricius by eyestalk ablation. Aquaculture. 13 (4), 355-359 (1978).
  13. Shyne Anand, P. S., et al. Reproductive performance of wild brooders of Indian white shrimp, Penaeus indicus: Potential and challenges for selective breeding program. Journal of Coastal Research. 86 (sp1), 65 (2019).
  14. Diarte-Plata, G., et al. Eyestalk ablation procedures to minimize pain in the freshwater prawn Macrobrachium americanum. Applied Animal Behaviour Science. 140 (3-4), 172-178 (2012).
  15. Vargas-Téllez, I., et al. Impact of unilateral eyestalk ablation on Callinectes arcuatus (Ordway, 1863) under laboratory conditions: Behavioral evaluation. Latin American Journal of Aquatic Research. 49 (4), 576-594 (2021).
  16. Chu, K. H., Chow, W. K. Effects of unilateral versus bilateral eyestalk ablation on molting and growth of the shrimp, Penaeus chinensis Osbeck, 1765) (Decapoda, Penaeidea). Crustaceana. 62 (3), 225-233 (1992).
  17. Taylor, J. Minimizing the effects of stress during eyestalk ablation of Litopenaeus vannamei females with topical anesthetic and a coagulating agent. Aquaculture. 233 (1-4), 173-179 (2004).
  18. Wang, M., Ye, H., Miao, L., Li, X. Role of short neuropeptide F in regulating eyestalk neuroendocrine systems in the mud crab Scylla paramamosain. Aquaculture. 560, 738493 (2022).
  19. Nagaraju, G. P. C. Reproductive regulators in decapod crustaceans: an overview. Journal of Experimental Biology. 214 (1), 3-16 (2011).
  20. Kornthong, N., et al. Characterization of red pigment concentrating hormone (RPCH) in the female mud crab (Scylla olivacea) and the effect of 5-HT on its expression. General and Comparative Endocrinology. 185, 28-36 (2013).
  21. Kornthong, N., et al. Molecular characterization of a vitellogenesis-inhibiting hormone (VIH) in the mud crab (Scylla olivacea) and temporal changes in abundances of VIH mRNA transcripts during ovarian maturation and following neurotransmitter administration. Animal Reproduction Science. 208, 106122 (2019).
  22. Liu, C., et al. VIH from the mud crab is specifically expressed in the eyestalk and potentially regulated by transactivator of Sox9/Oct4/Oct1. General and Comparative Endocrinology. 255, 1-11 (2018).
  23. Chen, H. -Y., Kang, B. J., Sultana, Z., Wilder, M. N. Variation of protein kinase C-α expression in eyestalk removal-activated ovaries in whiteleg shrimp, Litopenaeus vannamei. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 237 (300), 110552 (2019).
  24. Rotllant, G., Nguyen, T. V., Aizen, J., Suwansa-ard, S., Ventura, T. Toward the identification of female gonad-stimulating factors in crustaceans. Hydrobiologia. 825 (1), 91-119 (2018).
  25. Supriya, N. T., Sudha, K., Krishnakumar, V., Anilkumar, G. Molt and reproduction enhancement together with hemolymph ecdysteroid elevation under eyestalk ablation in the female fiddler crab, Uca triangularis (Brachyura: Decapoda). Chinese Journal of Oceanology and Limnology. 35 (3), 645-657 (2017).
  26. Wilder, M. N. Advances in the science of crustacean reproductive physiology and potential applications to new seed production technology. Journal of Coastal Research. 86 (sp1), 6-10 (2019).
  27. Arcos, G. F., Ibarra, A. M., Vazquez-Boucard, C., Palacios, E., Racotta, I. S. Haemolymph metabolic variables in relation to eyestalk ablation and gonad development of Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei Boone. Aquaculture Research. 34 (9), 749-755 (2003).
  28. Desai, U. M., Achuthankutty, C. T. Complete regeneration of ablated eyestalk in penaeid prawn, Penaeus monodon. Current Science. 79 (11), 1602-1603 (2000).
  29. Wu, Q., et al. Growth performance and biochemical composition dynamics of ovary, hepatopancreas and muscle tissues at different ovarian maturation stages of female mud crab, Scylla paramamosain. Aquaculture. 515, 734560 (2020).
  30. Ghazali, A., Azra, M. N., Noordin, N. M., Abol-Munafi, A. B., Ikhwanuddin, M. Ovarian morphological development and fatty acids profile of mud crab (Scylla olivacea) fed with various diets. Aquaculture. 468 (Part 1), 45-52 (2017).
  31. Farhadi, A., et al. The regulatory mechanism of sexual development in decapod crustaceans. Frontiers in Marine Science. 8, (2021).
  32. Sukardi, P., Prayogo, N. A., Harisam, T., Sudaryono, A. Effect of eyestalk-ablation and differences salinity in rearing pond on molting speed of Scylla serrata. AIP Conference Proceedings. 2094, 020029 (2019).
  33. Stella, V. S., López Greco, L. S., Rodríguez, E. M. Effects of eyestalk ablation at different times of the year on molting and reproduction of the estuarine grapsid crab Chasmagnathus granulata (Decapoda, Brachyura). Journal of Crustacean Biology. 20 (2), 239-244 (2000).
  34. Jang, I. K., et al. The effects of manipulating water temperature, photoperiod, and eyestalk ablation on gonad maturation of the swimming crab, Portunus trituberculatus. Crustaceana. 83 (2), 129-141 (2010).
  35. Millamena, O. M., Quinitio, E. The effects of diets on reproductive performance of eyestalk ablated and intact mud crab Scylla serrata. Aquaculture. 181 (1-2), 81-90 (2000).
  36. Zeng, C. Induced out-of-season spawning of the mud crab, Scylla paramamosain (Estampador) and effects of temperature on embryo development. Aquaculture Research. 38 (14), 1478-1485 (2007).
  37. Rana, S. Eye stalk ablation of freshwater crab, Barytelphusa lugubris: An alternative approach of hormonal induced breeding. International Journal of Pure and Applied Zoology. 6 (3), 30-34 (2018).
  38. Yi, S. -K., Lee, S. -G., Lee, J. -M. Preliminary study of seed production of the Micronesian mud crab Scylla serrata (Crustacea: Portunidae) in Korea. Ocean and Polar Research. 31 (3), 257-264 (2009).
  39. Azra, M. N., Abol-Munafi, A. B., Ikhwanuddin, M. A review of broodstock improvement to brachyuran crab: Reproductive performance. International Journal of Aquaculture. 5 (38), 1-10 (2016).
  40. Archibald, K. E., Scott, G. N., Bailey, K. M., Harms, C. A. 2-phenoxyethanol (2-PE) and tricaine methanesulfonate (MS-222) immersion anesthesia of American horseshoe crabs (Limulus polyphemus). Journal of Zoo and Wildlife Medicine. 50 (1), 96-106 (2019).
  41. Muhd-Farouk, H., Abol-Munafi, A. B., Jasmani, S., Ikhwanuddin, M. Effect of steroid hormones 17α-hydroxyprogesterone and 17α-hydroxypregnenolone on ovary external morphology of orange mud crab, Scylla olivacea. Asian Journal of Cell Biology. 9 (1), 23-28 (2013).
  42. Muhd-Farouk, H., Jasmani, S., Ikhwanuddin, M. Effect of vertebrate steroid hormones on the ovarian maturation stages of orange mud crab, Scylla olivacea (Herbst, 1796). Aquaculture. 451, 78-86 (2016).
  43. Ghazali, A., Mat Noordin, N., Abol-Munafi, A. B., Azra, M. N., Ikhwanuddin, M. Ovarian maturation stages of wild and captive mud crab, Scylla olivacea fed with two diets. Sains Malaysiana. 46 (12), 2273-2280 (2017).
  44. Aaqillah-Amr, M. A., Hidir, A., Noordiyana, M. N., Ikhwanuddin, M. Morphological, biochemical and histological analysis of mud crab ovary and hepatopancreas at different stages of development. Animal Reproduction Science. 195, 274-283 (2018).
  45. Amin-Safwan, A., Muhd-Farouk, H., Mardhiyyah, M. P., Nadirah, M., Ikhwanuddin, M. Does water salinity affect the level of 17β-estradiol and ovarian physiology of orange mud crab, Scylla olivacea (Herbst, 1796) in captivity. Journal of King Saud University - Science. 31 (4), 827-835 (2019).
  46. Wu, X., et al. Effect of dietary supplementation of phospholipids and highly unsaturated fatty acids on reproductive performance and offspring quality of Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis (H. Milne-Edwards), female broodstock. Aquaculture. 273 (4), 602-613 (2007).
  47. Azra, M. N., Ikhwanuddin, M. A review of maturation diets for mud crab genus Scylla broodstock: Present research, problems and future perspective. Saudi Journal of Biological Sciences. 23 (2), 257-267 (2016).
  48. Maschio Rodrigues, M., López Greco, L. S., de Almeida, L. C. F., Bertini, G. Reproductive performance of Macrobrachium acanthurus (Crustacea, Palaemonidae) females subjected to unilateral eyestalk ablation. Acta Zoologica. 103 (3), 326-334 (2022).
  49. Zhang, C., et al. Changes in bud morphology, growth-related genes and nutritional status during cheliped regeneration in the Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis. PLoS One. 13 (12), e0209617 (2018).
  50. Zhang, C., et al. Hemolymph transcriptome analysis of Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) with intact, left cheliped autotomy and bilateral eyestalk ablation. Fish & Shellfish Immunology. 81, 266-275 (2018).
  51. Diarte-Plata, G., Sainz-Hernandez, J. C., Aguiñaga-Cruz, J. A., Fierro-Coronado, J. A., Polanco-Torres, A., Puente-Palazuelos, C. Eyestalk ablation procedures to minimize pain in the freshwater prawn Macrobrachium americanum. Applied Animal Behaviour Science. 130 (3-4), 172-178 (2012).
  52. Mirera, D. O., Moksnes, P. O. Comparative performance of wild juvenile mud crab (Scylla serrata) in different culture systems in East Africa: Effect of shelter, crab size and stocking density. Aquaculture International. 23 (1), 155-173 (2015).
  53. Ut, V. N., Le Vay, L., Nghia, T. T., Hong Hanh, T. T. Development of nursery cultures for the mud crab Scylla paramamosain (Estampador). Aquaculture Research. 38 (14), 1563-1568 (2007).
  54. Fazhan, H., et al. Limb loss and feeding ability in the juvenile mud crab Scylla olivacea: Implications of limb autotomy for aquaculture practice. Applied Animal Behaviour Science. 247, 105553 (2022).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 193 Scylla olivacea הרדמה בהלם קר צריבה התפתחות גונדל ורבייה מושרית

Erratum

Formal Correction: Erratum: Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs
Posted by JoVE Editors on 05/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs. The Introduction, Protocol, Discussion and References were updated.

The forth sentence in the third paragraph of the Introduction has been updated from:

The eyestalk ablation protocol in this work minimizes stress by using fully sedated crabs and minimizes physical injury to personnel from crab bites. 

to:

The eyestalk ablation protocol in this work minimizes stress by using fully anesthetized crabs and minimizes physical injury to personnel from crab bites. 

The start of the Protocol has been updated from:

This protocol follows the Malaysian Code of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes outlined by the Laboratory Animal Science Association of Malaysia. The sacrifice of the experimental samples was done according to the National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 8023, revised 1978). Sexually pre-mature female mud crabs (orange mud crab S. olivacea) were collected from the local market (5°66′62′′N, 102°72′33′′E) at the Setiu Wetlands in Malaysia. The mud crab species was identified based on morphological characteristics1.

to:

This protocol follows the Malaysian Code of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes outlined by the Laboratory Animal Science Association of Malaysia and was approved by the Universiti Malaysia Terengganu's Research Ethics Committee (Animal ethics approval number: UMT/JKEPHMK/2023/96). The sacrifice of the experimental samples was done according to the AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Sexually pre-mature female mud crabs (orange mud crab Scylla olivacea) were collected from the local market (5°66′62′′N, 102°72′33′′E) at the Setiu Wetlands in Malaysia. The mud crab species was identified based on morphological characteristics1.

Section 4 of the Protocol has been updated from:

4. Cold-shock anesthesia

  1. Select sexually mature females with a dark-colored oval-shaped abdominal flap with a CW >86 mm (Figure 1).
  2. Catch the crabs with a scoop net, and keep them individually in small aquariums for cold shock anesthesia.
  3. Prepare 2 L of 4 °C to 1 °C seawater (20 ppt) in a transparent plastic aquarium. Maintain the temperature using (−20 °C) ice bags for cold shock anesthesia.
    NOTE: Check the temperature with a digital thermometer.
  4. Immerse the crab in the 4 °C seawater until sedated (about 3−5 min).
  5. Ensure the crabs are fully anesthetized by the lack of spontaneous movement. The legs and chelipeds joints will still show minor movements when touched with forceps.

to:

4. Anesthesia

  1. Select sexually mature females with a dark-colored oval-shaped abdominal flap with a CW >86 mm (Figure 1).
  2. Catch the crabs with a scoop net, and keep them individually in small aquariums for anesthesia.
  3. After 5 min of acclimatization period, add 2-phenoxyethanol (2-PE) at 2 mL/L into each aquarium and allow 15 min of anesthesia treatment.
  4. Ensure the crabs are fully anesthetized by the lack of spontaneous movement.

Section 5 of the Protocol has been updated from:

5. Eyestalk ablation

  1. Cauterization technique
    1. Perform all procedures on top of a table and in an open area.
    2. Take a flat head nickel-steel metal rod (e.g., a screwdriver) with a wooden or plastic handle, and cover the handle with a wet cotton towel.
    3. Sterilize two stainless surgical forceps in an autoclave.
    4. Prepare 70% ethanol in a spray bottle. Have tissue paper ready for use.
      NOTE: Ethanol is highly flammable. Maintain a safe distance from fire sources.
    5. Connect a blowtorch to a gas cylinder (butane) securely.
      CAUTION: Follow the instructions on the blowtorch and gas cylinder. Make sure that the blowtorch is switched off when connecting with the gas cylinder. Read and follow all the fire safety precautions mentioned on the gas cylinder.
    6. Wear thick cotton gloves to avoid injury from hot objects.
    7. Subject the tip of the metal rod to the fire of the blowtorch until the metal rod is bright red.
    8. Cover the anesthetized (sedated) crab with a wet cotton towel.
      NOTE: Cover all the tentacles of the crab to avoid unnecessary damage.
    9. Hold one eye of the crab with sterilized forceps.
      NOTE: Sterilize the forceps in an autoclave for first-time use, and disinfect using 70% ethanol for subsequent use on other crabs.
    10. Hold the red-hot metal flat tip onto the eye of the crab and press slightly for about 10−15 s until the eyestalk turns an orange or reddish-orange color.
      NOTE: Two people are needed to execute eyestalk ablation following the cauterization method: one to hold the crab and another to perform the ablation procedure.
    11. Disinfect the forceps with 70% ethanol spray to ensure no cross-contamination between crabs.
    12. After performing the eyestalk ablation on all crabs, dip the hot nickel steel metal rod (screwdriver) into tap water.
    13. Disinfect the towel before reuse. Multiple towels can be used to save time.
      NOTE: Wash the towel with tap water, and dip it into 30 ppm chlorinated water for 5 min. Then, wash the towel with tap water again, and dip it in a 1 g/L sodium thiosulphate solution.
    14. Keep the blowtorch in a safe place after turning it off, and wait until it returns to environmental temperature (about 30 min) before disconnecting.
  2. Surgery technique
    1. Perform the procedure in a well-ventilated area.
    2. Sterilize two surgical scissors and forceps in an autoclave.
    3. Pour 50 mL of 70% ethanol into a 100 mL glass beaker.
    4. Prepare the tincture of iodine solution in a dropper bottle.
      NOTE: Tincture of iodine (iodine tincture or weak iodine solution) is made up of 2%-7% elemental iodine and potassium iodide, or sodium iodide, dissolved in ethanol and water.
    5. Wear thick cotton gloves.
    6. Hold the sedated crab, and cover it with a wet cotton towel.
    7. Hold one eye of the crab with sterilized forceps.
    8. Swiftly cut off the eyestalk using sterilized surgical scissors.
      NOTE: Hemolymph may be lost from the wounded part of the crab.
    9. Dip the scissors and forceps in 70% ethanol after every use, and dry them using tissue paper before reuse.
    10. Apply two to three drops of iodine tincture to the wounded part of the eyestalk immediately after cutting it off.
      NOTE: Tincture of iodine is used for healing and to prevent infection.

to:

5. Eyestalk ablation

  1. Cauterization technique
    1. Perform all procedures on top of a table and in an open area.
    2. Take a flat head nickel-steel metal rod (e.g., a screwdriver) with a wooden or plastic handle, and cover the handle with a wet cotton towel.
    3. Sterilize two stainless surgical forceps in an autoclave.
    4. Prepare 70% ethanol in a spray bottle and keep it away from any fire-related sources, such as blow torch and red hot screwdriver. Have tissue paper ready for use.
      NOTE: Ethanol is highly flammable. Maintain a safe distance from fire sources.
    5. Connect a blowtorch to a gas cylinder (butane) securely.
      CAUTION: Follow the instructions on the blowtorch and gas cylinder. Make sure that the blowtorch is switched off when connecting with the gas cylinder. Read and follow all the fire safety precautions mentioned on the gas cylinder.
    6. Wear thick cotton gloves to avoid injury from hot objects.
    7. Subject the tip of the metal rod to the fire of the blowtorch until the metal rod is bright red.
    8. Cover the anesthetized crab with a wet cotton towel.
      NOTE: Cover the antennae of the crab to avoid unnecessary damage.
    9. Hold one eye of the crab with sterilized forceps.
      NOTE: Sterilize the forceps in an autoclave for first-time use, and disinfect using 70% ethanol for subsequent use on other crabs.
    10. Hold the red-hot metal flat tip onto the eye of the crab and press slightly for about 10−15 s until the eyestalk turns an orange or reddish-orange color. Be careful when conducting this step to avoid damage to adjacent structures. 
      NOTE: Two people are needed to execute eyestalk ablation following the cauterization method: one to hold the crab and another to perform the ablation procedure.
    11. Disinfect the forceps with 70% ethanol spray to ensure no cross-contamination between crabs.
      NOTE: Only perform this step at least waiting for 5 min after the eyestalk ablation procedure to ensure the forceps are cooled down before disinfection using 70% ethanol to prevent potential fire hazards.
    12. After performing the eyestalk ablation on all crabs, dip the hot nickel steel metal rod (screwdriver) into tap water.
    13. Disinfect the towel before reuse. Multiple towels can be used to save time.
      NOTE: Wash the towel with tap water, and dip it into 30 ppm chlorinated water for 5 min. Then, wash the towel with tap water again, and dip it in a 1 g/L sodium thiosulphate solution.
    14. Keep the blowtorch in a safe place after turning it off, and wait until it returns to environmental temperature (about 30 min) before disconnecting.
  2. Surgery technique
    1. Perform the procedure in a well-ventilated area.
    2. Sterilize two surgical scissors and forceps in an autoclave.
    3. Pour 50 mL of 70% ethanol into a 100 mL glass beaker.
    4. Wear thick cotton gloves.
    5. Hold the anesthetized crab, and cover it with a wet cotton towel.
    6. Hold one eye of the crab with sterilized forceps.
    7. Swiftly cut off the eyestalk using sterilized surgical scissors.
      NOTE: Hemolymph may be lost from the wounded part of the crab.
    8. Dip the scissors and forceps in 70% ethanol after every use, and dry them using tissue paper before reuse.

Step 7.2.2 of the Protocol has been updated from:

Sedate the females individually with the cold shock anesthesia method.

to:

Anesthetize the females individually with the 2-PE immersion anesthesia method.

The Discussion has been updated from:

This protocol was developed for the eyestalk ablation of the mud crab, Scylla spp., and can be applied as an efficient method to induce gonad maturation. This protocol can be easily replicated for the commercial ovary maturation of mud crabs and can be implemented to reduce the latent period (time from one spawning to another) in mud crab seed production.

The eyestalk ablation of crustaceans (i.e., freshwater prawn, marine shrimp) is typically done to induce gonad maturation and out-of-season spawning11,12,13. Eyestalk ablation in brachyuran crabs has also been done to study molting25,32,33, hormonal regulation18, gonad maturation34, and induced breeding and reproductive performance35,36,37,38,39. Unilateral or bilateral eyestalk ablation influences the physiology of the crustacean. Eyestalk ablation following the protocol stated in this study also influences the ovarian maturation rate of mud crabs. In the control treatment (without eyestalk ablation), 43.33% ± 5.77% of female crabs had an immature ovary (stage-1). However, in the same rearing period (30 days), eyestalk-ablated female crabs had pre-maturing ovaries (stage-3; 56.67% ± 11.55% and 53.33% ± 15.28% with the cauterization and surgery techniques, respectively), which shows that eyestalk ablation can increase the gonad maturation of mud crabs. Previous studies have also reported that the ovarian development of intact crabs (without eyestalk ablation) is slower than that of eyestalk-ablated crabs25,31. Due to the slower gonadal development in intact crustaceans, eyestalk ablation is widely done in commercial prawn and shrimp hatcheries. In this protocol, the eyestalk-ablated female crabs achieved higher percentages of ovarian maturation compared to the female crabs without the eyestalk ablation treatment (Figure 3).

The gonad maturation of the mud crab is regulated by hormones21,40,41. The eyestalk contains important endocrine glands (i.e., the X-organ-sinus gland complex) that play vital roles in the gonadal maturation process of mud crabs18,21. Unilateral eyestalk ablation, either by cauterization or surgery, damages one of the major endocrine glands that is involved in the synthesis and release of inhibiting hormones (e.g., VIH), thereby resulting in a higher level of gonad-stimulating hormones (i.e., VSH).

The ovarian maturation stages of Scylla spp. can be differentiated by observing the ovarian tissue coloration with the naked eye29,30,42. Translucent or creamy white ovarian tissues are indications of immature ovaries29,30,42,43. In this study, immature ovaries (stage-1) were still found in the group of female crabs without eyestalk ablation due to the slower ovarian maturation process. However, the crabs in the eyestalk-ablated groups (both by the cauterization and surgery techniques) mostly showed pre-maturing ovaries (stage-3), with some individuals exhibiting fully matured ovaries (stage-4). Therefore, the protocol of eyestalk ablation described here can be used to increase ovarian maturation in female mud crabs. This protocol can also be applied directly to wild-collected mature female mud crabs to hasten their seed production. To evaluate the effectiveness of cauterization and surgery methods on mud crab gonad maturation and to ensure the accurate estimation of molting duration, sexually pre-mature crabs were used. After the (induced) molting of sexually pre-mature female crabs, we noticed that their ovaries were still in the immature or early developing stages29,44. After 30 days of rearing the newly mature female crabs (either eyestalk-ablated or without eyestalk ablation), the ovarian development stages (stage-1 to stage-4) were determined by the color of the ovarian tissues. This protocol encourages the use of the cauterization technique to perform eyestalk ablation in mud crabs to avoid any hemolymph loss and prevent infection at the ablated sites. Cauterization immediately seals the wound, whereas the surgery technique requires an additional step of disinfection using iodine. For commercial purposes, larger mature crabs, preferably at a later stage of ovarian maturation, should be selected for eyestalk ablation to shorten the time to reach the fully matured ovary stage for subsequent commerce or brood stock culture. In addition to eyestalk ablation, individual rearing with sand substrate and sufficient feeding, preferably with live feed, can increase the gonad maturation rate of mud crabs in captivity30,35,45,46.

Crustacean blood is called hemolymph and can be lost during eyestalk ablation. An excessive loss of hemolymph may lead to the death of eyestalk-ablated crabs, especially when performing surgery to remove the eyestalk. The hemolymph can coagulate in the wounded part to prevent loss. The application of a tincture of iodine can prevent infection of the wounded part. However, in comparison to the surgery technique, the cauterization technique seals the wounded part immediately, thereby preventing the loss of hemolymph and possible infection.

Mud crab mortality after unilateral eyestalk ablation with either cauterization or surgery was not found within the first 7 days. Thus, eyestalk ablation can be done with a higher survival rate. Unilateral eyestalk ablation does not hamper the survival rate of the crab33.

Stress during crab handling and eyestalk ablation may contribute to crab mortality. Proper anesthesia is needed to minimize handling stress during eyestalk ablation. In crustacean eyestalk ablation, chemical anesthetics (i.e., xylocaine, lidocaine) are used at the base of the eyestalk before eyestalk ablation14,15,17,47. However, due to the aggressive nature and large size of mud crabs, the use of anesthesia only at the base of the eyestalk is not sufficient and might result in additional stress to the animals during the injection. On the other hand, anesthesia by subjecting them to a lower water temperature is more economical and safer. The use of cold water for anesthesia in mud crabs is common and has been used in other studies due to its efficiency, simplicity, and minimal impact on recovery and survival37,48,49.

Although eyestalk ablation using both cauterization and surgery methods has a minimal effect on crab survival and enhances ovarian maturation, performing eyestalk ablation requires professional mastery of the techniques. The timing between the steps is critical as any delay between protocols adds additional stress for the crabs. Unlike the surgery technique, the cauterization technique is dangerous because it involves the use of flammable equipment (i.e., a blow torch and butane gas). Thus, extra caution is needed when performing the cauterization technique.

Crabs are cannibalistic in nature, and they are known to prey on others that have just completed their molt and are still in their soft-shell conditions7,50,51. Thus, rearing the crabs individually can avoid unnecessary mortality due to cannibalism. The use of individual rearing in mud crab culture is commonly practiced, both in high-density culture and pond culture, for fattening and soft-shell crab farming purposes8,52. This protocol also utilized individual rearing and maintenance. During the transportation of the crabs for rearing or commerce, the crab chelipeds are tied up securely (or even autotomized) to prevent fighting, unnecessary injury, and limb loss34.

The described protocol for eyestalk ablation should be performed with multiple persons. After completing the eyestalk ablation, non-disposable equipment (e.g., the aquarium, tray, towel, etc.) should be disinfected with 30 ppm chlorine. The crabs must be monitored at least twice per day. Any dead crabs, uneaten feed, ablated limbs, or molted crab shells should be swiftly disposed of (i.e., buried in soil with bleaching powder) to prevent any potential for disease spread.

to:

This protocol was developed for the eyestalk ablation of the mud crab, Scylla spp., and can be applied as an efficient method to induce gonad maturation. This protocol can be easily replicated for the commercial ovary maturation of mud crabs and can be implemented to reduce the latent period (time from one spawning to another) in mud crab seed production.

The eyestalk ablation of crustaceans (i.e., freshwater prawn, marine shrimp) is typically done to induce gonad maturation and out-of-season spawning11,12,13. Eyestalk ablation in brachyuran crabs has also been done to study molting25,32,33, hormonal regulation18, gonad maturation34, and induced breeding and reproductive performance35,36,37,38,39. Anesthesia via immersion in 2-phenoxyethanol was used as it is comparable to the use of tricaine methanesulfonate (MS-222) in arthopods but cheaper and does not require the use of additional buffer40. Unilateral or bilateral eyestalk ablation influences the physiology of the crustacean. Eyestalk ablation following the protocol stated in this study also influences the ovarian maturation rate of mud crabs. In the control treatment (without eyestalk ablation), 43.33% ± 5.77% of female crabs had an immature ovary (stage-1). However, in the same rearing period (30 days), eyestalk-ablated female crabs had pre-maturing ovaries (stage-3; 56.67% ± 11.55% and 53.33% ± 15.28% with the cauterization and surgery techniques, respectively), which shows that eyestalk ablation can increase the gonad maturation of mud crabs. Previous studies have also reported that the ovarian development of intact crabs (without eyestalk ablation) is slower than that of eyestalk-ablated crabs25,31. Due to the slower gonadal development in intact crustaceans, eyestalk ablation is widely done in commercial prawn and shrimp hatcheries. In this protocol, the eyestalk-ablated female crabs achieved higher percentages of ovarian maturation compared to the female crabs without the eyestalk ablation treatment (Figure 3).

The gonad maturation of the mud crab is regulated by hormones21,41,42. The eyestalk contains important endocrine glands (i.e., the X-organ-sinus gland complex) that play vital roles in the gonadal maturation process of mud crabs18,21. Unilateral eyestalk ablation, either by cauterization or surgery, damages one of the major endocrine glands that is involved in the synthesis and release of inhibiting hormones (e.g., VIH), thereby resulting in a higher level of gonad-stimulating hormones (i.e., VSH).

The ovarian maturation stages of Scylla spp. can be differentiated by observing the ovarian tissue coloration with the naked eye29,30,43. Translucent or creamy white ovarian tissues are indications of immature ovaries29,30,43,44. In this study, immature ovaries (stage-1) were still found in the group of female crabs without eyestalk ablation due to the slower ovarian maturation process. However, the crabs in the eyestalk-ablated groups (both by the cauterization and surgery techniques) mostly showed pre-maturing ovaries (stage-3), with some individuals exhibiting fully matured ovaries (stage-4). Therefore, the protocol of eyestalk ablation described here can be used to increase ovarian maturation in female mud crabs. This protocol can also be applied directly to wild-collected mature female mud crabs to hasten their seed production. To evaluate the effectiveness of cauterization and surgery methods on mud crab gonad maturation and to ensure the accurate estimation of molting duration, sexually pre-mature crabs were used. After the (induced) molting of sexually pre-mature female crabs, we noticed that their ovaries were still in the immature or early developing stages29,45. After 30 days of rearing the newly mature female crabs (either eyestalk-ablated or without eyestalk ablation), the ovarian development stages (stage-1 to stage-4) were determined by the color of the ovarian tissues. This protocol encourages the use of the cauterization technique to perform eyestalk ablation in mud crabs to avoid any hemolymph loss and prevent infection at the ablated sites. Cauterization immediately seals the wound, whereas the surgery technique takes time for the wound to heal and this would allow for chance of infection. For commercial purposes, larger mature crabs, preferably at a later stage of ovarian maturation, should be selected for eyestalk ablation to shorten the time to reach the fully matured ovary stage for subsequent commerce or brood stock culture. In addition to eyestalk ablation, individual rearing with sand substrate and sufficient feeding, preferably with live feed, can increase the gonad maturation rate of mud crabs in captivity30,35,46,47.

Crustacean blood is called hemolymph and can be lost during eyestalk ablation. An excessive loss of hemolymph may lead to the death of eyestalk-ablated crabs, especially when performing surgery to remove the eyestalk. The hemolymph can coagulate in the wounded part to prevent loss. However, in comparison to the surgery technique, the cauterization technique seals the wounded part immediately, thereby preventing the loss of hemolymph and possible infection.

Mud crab mortality after unilateral eyestalk ablation with either cauterization or surgery was not found within the first 7 days. Thus, eyestalk ablation can be done with a higher survival rate. Unilateral eyestalk ablation does not hamper the survival rate of the crab33.

Stress during crab handling and eyestalk ablation may contribute to crab mortality. Proper anesthesia is needed to minimize handling stress during eyestalk ablation. In crustacean eyestalk ablation, chemical anesthetics (i.e., xylocaine, lidocaine) are used at the base of the eyestalk before eyestalk ablation14,15,17,48. However, due to the aggressive nature and large size of mud crabs, the use of anesthesia only at the base of the eyestalk is not sufficient and might result in additional stress to the animals during the injection. On the other hand, anesthesia by subjecting them to a lower water temperature is more economical and safer. The use of cold water for anesthesia in mud crabs is common and has been used in other studies due to its efficiency, simplicity, and minimal impact on recovery and survival37,49,50. In addition, future research on pain assessment following eyestalk ablation on mud crabs is recommended to highlight the change in behaviours associated with pain and stress, as evident in freshwater prawn Macrobrachium americanum51.

Although eyestalk ablation using both cauterization and surgery methods has a minimal effect on crab survival and enhances ovarian maturation, performing eyestalk ablation requires professional mastery of the techniques. The timing between the steps is critical as any delay between protocols adds additional stress for the crabs. Unlike the surgery technique, the cauterization technique is dangerous because it involves the use of flammable equipment (i.e., a blow torch and butane gas). Thus, extra caution is needed when performing the cauterization technique.

Crabs are cannibalistic in nature, and they are known to prey on others that have just completed their molt and are still in their soft-shell conditions7,52,53. Thus, rearing the crabs individually can avoid unnecessary mortality due to cannibalism. The use of individual rearing in mud crab culture is commonly practiced, both in high-density culture and pond culture, for fattening and soft-shell crab farming purposes8,53. This protocol also utilized individual rearing and maintenance. During the transportation of the crabs for rearing or commerce, the crab chelipeds are tied up securely (or even autotomized) to prevent fighting, unnecessary injury, and limb loss34.

The described protocol for eyestalk ablation should be performed with multiple persons. After completing the eyestalk ablation, non-disposable equipment (e.g., the aquarium, tray, towel, etc.) should be disinfected with 30 ppm chlorine. The crabs must be monitored at least twice per day. Any dead crabs, uneaten feed, ablated limbs, or molted crab shells should be swiftly disposed of (i.e., buried in soil with bleaching powder) to prevent any potential for disease spread.

The References have been updated from:

  1. Keenan, C. P., Davie, P. J. F., Mann, D. L. A revision of the genus Scylla de Haan, 1833 (Crustacea: Decapoda: Brachyura: Portunidae). Raffles Bulletin of Zoology. 46 (1), 217-245 (1998).
  2. Fazhan, H. et al. Morphological descriptions and morphometric discriminant function analysis reveal an additional four groups of Scylla spp. PeerJ. 8, e8066 (2020).
  3. Ikhwanuddin, M., Bachok, Z., Hilmi, M. G., Azmie, G., Zakaria, M. Z. Species diversity, carapace width-body weight relationship, size distribution and sex ratio of mud crab, genus Scylla from Setiu Wetlands of Terengganu coastal waters, Malaysia. Journal of Sustainability Science and Management. 5 (2), 97-109 (2010).
  4. Ikhwanuddin, M., Bachok, Z., Mohd Faizal, W. W. Y., Azmie, G., Abol-Munafi, A. B. Size of maturity of mud crab Scylla olivacea (Herbst, 1796) from mangrove areas of Terengganu coastal waters. Journal of Sustainability Science and Management. 5 (2), 134-147 (2010).
  5. Waiho, K. et al. On types of sexual maturity in brachyurans, with special reference to size at the onset of sexual maturity. Journal of Shellfish Research. 36 (3), 807-839 (2017).
  6. Mykles, D. L., Chang, E. S. Hormonal control of the crustacean molting gland: Insights from transcriptomics and proteomics. General and Comparative Endocrinology. 294, 113493 (2020).
  7. Fujaya, Y. et al. Is limb autotomy really efficient compared to traditional rearing in soft-shell crab (Scylla olivacea) production? Aquaculture Reports. 18, 100432 (2020).
  8. Waiho, K. et al. Moult induction methods in soft-shell crab production. Aquaculture Research. 52 (9), 4026-4042 (2021).
  9. Rahman, M. R. et al. Evaluation of limb autotomy as a promising strategy to improve production performances of mud crab (Scylla olivacea) in the soft-shell farming system. Aquaculture Research. 51 (6), 2555-2572 (2020).
  10. Okumura, T. et al. Expression of vitellogenin and cortical rod proteins during induced ovarian development by eyestalk ablation in the kuruma prawn, Marsupenaeus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 143 (2), 246-253 (2006).
  11. Pervaiz, P. A., Jhon, S. M., Sikdar-bar, M. Studies on the effect of unilateral eyestalk ablation in maturation of gonads of a freshwater prawn Macrobrachium dayanum. World Journal of Zoology. 6 (2), 159-163 (2011).
  12. Primavera, J. H. Induced maturation and spawning in five-month-old Penaeus monodon Fabricius by eyestalk ablation. Aquaculture. 13 (4), 355-359 (1978).
  13. Shyne Anand, P. S. et al. Reproductive performance of wild brooders of Indian white shrimp, Penaeus indicus: Potential and challenges for selective breeding program. Journal of Coastal Research. 86 (sp1), 65 (2019).
  14. Diarte-Plata, G. et al. Eyestalk ablation procedures to minimize pain in the freshwater prawn Macrobrachium americanum. Applied Animal Behaviour Science. 140 (3-4), 172-178 (2012).
  15. Vargas-Téllez, I. et al. Impact of unilateral eyestalk ablation on Callinectes arcuatus (Ordway, 1863) under laboratory conditions: Behavioral evaluation. Latin American Journal of Aquatic Research. 49 (4), 576-594 (2021).
  16. Chu, K. H., Chow, W. K. Effects of unilateral versus bilateral eyestalk ablation on molting and growth of the shrimp, Penaeus chinensis (Osbeck, 1765) (Decapoda, Penaeidea). Crustaceana. 62 (3), 225-233 (1992).
  17. Taylor, J. Minimizing the effects of stress during eyestalk ablation of Litopenaeus vannamei females with topical anesthetic and a coagulating agent. Aquaculture. 233 (1-4), 173-179 (2004).
  18. Wang, M., Ye, H., Miao, L., Li, X. Role of short neuropeptide F in regulating eyestalk neuroendocrine systems in the mud crab Scylla paramamosain. Aquaculture. 560, 738493 (2022).
  19. Nagaraju, G. P. C. Reproductive regulators in decapod crustaceans: an overview. Journal of Experimental Biology. 214 (1), 3-16 (2011).
  20. Kornthong, N. et al. Characterization of red pigment concentrating hormone (RPCH) in the female mud crab (Scylla olivacea) and the effect of 5-HT on its expression. General and Comparative Endocrinology. 185, 28-36 (2013).
  21. Kornthong, N. et al. Molecular characterization of a vitellogenesis-inhibiting hormone (VIH) in the mud crab (Scylla olivacea) and temporal changes in abundances of VIH mRNA transcripts during ovarian maturation and following neurotransmitter administration. Animal Reproduction Science. 208, 106122 (2019).
  22. Liu, C. et al. VIH from the mud crab is specifically expressed in the eyestalk and potentially regulated by transactivator of Sox9/Oct4/Oct1. General and Comparative Endocrinology. 255, 1-11 (2018).
  23. Chen, H.-Y., Kang, B. J., Sultana, Z., Wilder, M. N. Variation of protein kinase C-α expression in eyestalk removal-activated ovaries in whiteleg shrimp, Litopenaeus vannamei. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 237 (300), 110552 (2019).
  24. Rotllant, G., Nguyen, T. V., Aizen, J., Suwansa-ard, S., Ventura, T. Toward the identification of female gonad-stimulating factors in crustaceans. Hydrobiologia. 825 (1), 91-119 (2018).
  25. Supriya, N. T., Sudha, K., Krishnakumar, V., Anilkumar, G. Molt and reproduction enhancement together with hemolymph ecdysteroid elevation under eyestalk ablation in the female fiddler crab, Uca triangularis (Brachyura: Decapoda). Chinese Journal of Oceanology and Limnology. 35 (3), 645-657 (2017).
  26. Wilder, M. N. Advances in the science of crustacean reproductive physiology and potential applications to new seed production technology. Journal of Coastal Research. 86 (sp1), 6-10 (2019).
  27. Arcos, G. F., Ibarra, A. M., Vazquez-Boucard, C., Palacios, E., Racotta, I. S. Haemolymph metabolic variables in relation to eyestalk ablation and gonad development of Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei Boone. Aquaculture Research. 34 (9), 749-755 (2003).
  28. Desai, U. M., Achuthankutty, C. T. Complete regeneration of ablated eyestalk in penaeid prawn, Penaeus monodon. Current Science. 79 (11), 1602-1603 (2000).
  29. Wu, Q. et al. Growth performance and biochemical composition dynamics of ovary, hepatopancreas and muscle tissues at different ovarian maturation stages of female mud crab, Scylla paramamosain. Aquaculture. 515, 734560 (2020).
  30. Ghazali, A., Azra, M. N., Noordin, N. M., Abol-Munafi, A. B., Ikhwanuddin, M. Ovarian morphological development and fatty acids profile of mud crab (Scylla olivacea) fed with various diets. Aquaculture. 468 (Part 1), 45-52 (2017).
  31. Farhadi, A. et al. The regulatory mechanism of sexual development in decapod crustaceans. Frontiers in Marine Science. 8 (2021).
  32. Sukardi, P., Prayogo, N. A., Harisam, T., Sudaryono, A. Effect of eyestalk-ablation and differences salinity in rearing pond on molting speed of Scylla serrata. AIP Conference Proceedings. 2094, 020029 (2019).
  33. Stella, V. S., López Greco, L. S., Rodríguez, E. M. Effects of eyestalk ablation at different times of the year on molting and reproduction of the estuarine grapsid crab Chasmagnathus granulata (Decapoda, Brachyura). Journal of Crustacean Biology. 20 (2), 239-244 (2000).
  34. Jang, I. K. et al. The effects of manipulating water temperature, photoperiod, and eyestalk ablation on gonad maturation of the swimming crab, Portunus trituberculatus.Crustaceana. 83 (2), 129-141 (2010).
  35. Millamena, O. M., Quinitio, E. The effects of diets on reproductive performance of eyestalk ablated and intact mud crab Scylla serrata. Aquaculture. 181 (1-2), 81-90 (2000).
  36. Zeng, C. Induced out-of-season spawning of the mud crab, Scylla paramamosain (Estampador) and effects of temperature on embryo development. Aquaculture Research. 38 (14), 1478-1485 (2007).
  37. Rana, S. Eye stalk ablation of freshwater crab, Barytelphusa lugubris: An alternative approach of hormonal induced breeding. International Journal of Pure and Applied Zoology. 6 (3), 30-34 (2018).
  38. Yi, S.-K., Lee, S.-G., Lee, J.-M. Preliminary study of seed production of the Micronesian mud crab Scylla serrata (Crustacea: Portunidae) in Korea. Ocean and Polar Research. 31 (3), 257-264 (2009).
  39. Azra, M. N., Abol-Munafi, A. B., Ikhwanuddin, M. A review of broodstock improvement to brachyuran crab: Reproductive performance. International Journal of Aquaculture. 5 (38), 1-10 (2016).
  40. Muhd-Farouk, H., Abol-Munafi, A. B., Jasmani, S., Ikhwanuddin, M. Effect of steroid hormones 17α-hydroxyprogesterone and 17α-hydroxypregnenolone on ovary external morphology of orange mud crab, Scylla olivacea. Asian Journal of Cell Biology. 9 (1), 23-28 (2013).
  41. Muhd-Farouk, H., Jasmani, S., Ikhwanuddin, M. Effect of vertebrate steroid hormones on the ovarian maturation stages of orange mud crab, Scylla olivacea (Herbst, 1796). Aquaculture. 451, 78-86 (2016).
  42. Ghazali, A., Mat Noordin, N., Abol-Munafi, A. B., Azra, M. N., Ikhwanuddin, M. Ovarian maturation stages of wild and captive mud crab, Scylla olivacea fed with two diets. Sains Malaysiana. 46 (12), 2273-2280 (2017).
  43. Aaqillah-Amr, M. A., Hidir, A., Noordiyana, M. N., Ikhwanuddin, M. Morphological, biochemical and histological analysis of mud crab ovary and hepatopancreas at different stages of development. Animal Reproduction Science. 195, 274-283 (2018).
  44. Amin-Safwan, A., Muhd-Farouk, H., Mardhiyyah, M. P., Nadirah, M., Ikhwanuddin, M. Does water salinity affect the level of 17β-estradiol and ovarian physiology of orange mud crab, Scylla olivacea (Herbst, 1796) in captivity? Journal of King Saud University - Science. 31 (4), 827-835 (2019).
  45. Wu, X. et al. Effect of dietary supplementation of phospholipids and highly unsaturated fatty acids on reproductive performance and offspring quality of Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis (H. Milne-Edwards), female broodstock. Aquaculture. 273 (4), 602-613 (2007).
  46. Azra, M. N., Ikhwanuddin, M. A review of maturation diets for mud crab genus Scylla broodstock: Present research, problems and future perspective. Saudi Journal of Biological Sciences. 23 (2), 257-267 (2016).
  47. Maschio Rodrigues, M., López Greco, L. S., de Almeida, L. C. F., Bertini, G. Reproductive performance of Macrobrachium acanthurus (Crustacea, Palaemonidae) females subjected to unilateral eyestalk ablation. Acta Zoologica. 103 (3), 326-334 (2022).
  48. Zhang, C. et al. Changes in bud morphology, growth-related genes and nutritional status during cheliped regeneration in the Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis. PLoS One. 13 (12), e0209617 (2018).
  49. Zhang, C. et al. Hemolymph transcriptome analysis of Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) with intact, left cheliped autotomy and bilateral eyestalk ablation. Fish & Shellfish Immunology. 81, 266-275 (2018).
  50. Mirera, D. O., Moksnes, P. O. Comparative performance of wild juvenile mud crab (Scylla serrata) in different culture systems in East Africa: Effect of shelter, crab size and stocking density. Aquaculture International. 23 (1), 155-173 (2015).
  51. Ut, V. N., Le Vay, L., Nghia, T. T., Hong Hanh, T. T. Development of nursery cultures for the mud crab Scylla paramamosain (Estampador). Aquaculture Research. 38 (14), 1563-1568 (2007).
  52. Fazhan, H. et al. Limb loss and feeding ability in the juvenile mud crab Scylla olivacea: Implications of limb autotomy for aquaculture practice. Applied Animal Behaviour Science. 247, 105553 (2022).

to:

  1. Keenan, C. P., Davie, P. J. F., Mann, D. L. A revision of the genus Scylla de Haan, 1833 (Crustacea: Decapoda: Brachyura: Portunidae). Raffles Bulletin of Zoology. 46 (1), 217-245 (1998).
  2. Fazhan, H. et al. Morphological descriptions and morphometric discriminant function analysis reveal an additional four groups of Scylla spp. PeerJ. 8, e8066 (2020).
  3. Ikhwanuddin, M., Bachok, Z., Hilmi, M. G., Azmie, G., Zakaria, M. Z. Species diversity, carapace width-body weight relationship, size distribution and sex ratio of mud crab, genus Scylla from Setiu Wetlands of Terengganu coastal waters, Malaysia. Journal of Sustainability Science and Management. 5 (2), 97-109 (2010).
  4. Ikhwanuddin, M., Bachok, Z., Mohd Faizal, W. W. Y., Azmie, G., Abol-Munafi, A. B. Size of maturity of mud crab Scylla olivacea (Herbst, 1796) from mangrove areas of Terengganu coastal waters. Journal of Sustainability Science and Management. 5 (2), 134-147 (2010).
  5. Waiho, K. et al. On types of sexual maturity in brachyurans, with special reference to size at the onset of sexual maturity. Journal of Shellfish Research. 36 (3), 807-839 (2017).
  6. Mykles, D. L., Chang, E. S. Hormonal control of the crustacean molting gland: Insights from transcriptomics and proteomics. General and Comparative Endocrinology. 294, 113493 (2020).
  7. Fujaya, Y. et al. Is limb autotomy really efficient compared to traditional rearing in soft-shell crab (Scylla olivacea) production? Aquaculture Reports. 18, 100432 (2020).
  8. Waiho, K. et al. Moult induction methods in soft-shell crab production. Aquaculture Research. 52 (9), 4026-4042 (2021).
  9. Rahman, M. R. et al. Evaluation of limb autotomy as a promising strategy to improve production performances of mud crab (Scylla olivacea) in the soft-shell farming system. Aquaculture Research. 51 (6), 2555-2572 (2020).
  10. Okumura, T. et al. Expression of vitellogenin and cortical rod proteins during induced ovarian development by eyestalk ablation in the kuruma prawn, Marsupenaeus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 143 (2), 246-253 (2006).
  11. Pervaiz, P. A., Jhon, S. M., Sikdar-bar, M. Studies on the effect of unilateral eyestalk ablation in maturation of gonads of a freshwater prawn Macrobrachium dayanum. World Journal of Zoology. 6 (2), 159-163 (2011).
  12. Primavera, J. H. Induced maturation and spawning in five-month-old Penaeus monodon Fabricius by eyestalk ablation. Aquaculture. 13 (4), 355-359 (1978).
  13. Shyne Anand, P. S. et al. Reproductive performance of wild brooders of Indian white shrimp, Penaeus indicus: Potential and challenges for selective breeding program. Journal of Coastal Research. 86 (sp1), 65 (2019).
  14. Diarte-Plata, G. et al. Eyestalk ablation procedures to minimize pain in the freshwater prawn Macrobrachium americanum. Applied Animal Behaviour Science. 140 (3-4), 172-178 (2012).
  15. Vargas-Téllez, I. et al. Impact of unilateral eyestalk ablation on Callinectes arcuatus (Ordway, 1863) under laboratory conditions: Behavioral evaluation. Latin American Journal of Aquatic Research. 49 (4), 576-594 (2021).
  16. Chu, K. H., Chow, W. K. Effects of unilateral versus bilateral eyestalk ablation on molting and growth of the shrimp, Penaeus chinensis (Osbeck, 1765) (Decapoda, Penaeidea). Crustaceana. 62 (3), 225-233 (1992).
  17. Taylor, J. Minimizing the effects of stress during eyestalk ablation of Litopenaeus vannamei females with topical anesthetic and a coagulating agent. Aquaculture. 233 (1-4), 173-179 (2004).
  18. Wang, M., Ye, H., Miao, L., Li, X. Role of short neuropeptide F in regulating eyestalk neuroendocrine systems in the mud crab Scylla paramamosain. Aquaculture. 560, 738493 (2022).
  19. Nagaraju, G. P. C. Reproductive regulators in decapod crustaceans: an overview. Journal of Experimental Biology. 214 (1), 3-16 (2011).
  20. Kornthong, N. et al. Characterization of red pigment concentrating hormone (RPCH) in the female mud crab (Scylla olivacea) and the effect of 5-HT on its expression. General and Comparative Endocrinology. 185, 28-36 (2013).
  21. Kornthong, N. et al. Molecular characterization of a vitellogenesis-inhibiting hormone (VIH) in the mud crab (Scylla olivacea) and temporal changes in abundances of VIH mRNA transcripts during ovarian maturation and following neurotransmitter administration. Animal Reproduction Science. 208, 106122 (2019).
  22. Liu, C. et al. VIH from the mud crab is specifically expressed in the eyestalk and potentially regulated by transactivator of Sox9/Oct4/Oct1. General and Comparative Endocrinology. 255, 1-11 (2018).
  23. Chen, H.-Y., Kang, B. J., Sultana, Z., Wilder, M. N. Variation of protein kinase C-α expression in eyestalk removal-activated ovaries in whiteleg shrimp, Litopenaeus vannamei. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 237 (300), 110552 (2019).
  24. Rotllant, G., Nguyen, T. V., Aizen, J., Suwansa-ard, S., Ventura, T. Toward the identification of female gonad-stimulating factors in crustaceans. Hydrobiologia. 825 (1), 91-119 (2018).
  25. Supriya, N. T., Sudha, K., Krishnakumar, V., Anilkumar, G. Molt and reproduction enhancement together with hemolymph ecdysteroid elevation under eyestalk ablation in the female fiddler crab, Uca triangularis (Brachyura: Decapoda). Chinese Journal of Oceanology and Limnology. 35 (3), 645-657 (2017).
  26. Wilder, M. N. Advances in the science of crustacean reproductive physiology and potential applications to new seed production technology. Journal of Coastal Research. 86 (sp1), 6-10 (2019).
  27. Arcos, G. F., Ibarra, A. M., Vazquez-Boucard, C., Palacios, E., Racotta, I. S. Haemolymph metabolic variables in relation to eyestalk ablation and gonad development of Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei Boone. Aquaculture Research. 34 (9), 749-755 (2003).
  28. Desai, U. M., Achuthankutty, C. T. Complete regeneration of ablated eyestalk in penaeid prawn, Penaeus monodon. Current Science. 79 (11), 1602-1603 (2000).
  29. Wu, Q. et al. Growth performance and biochemical composition dynamics of ovary, hepatopancreas and muscle tissues at different ovarian maturation stages of female mud crab, Scylla paramamosain. Aquaculture. 515, 734560 (2020).
  30. Ghazali, A., Azra, M. N., Noordin, N. M., Abol-Munafi, A. B., Ikhwanuddin, M. Ovarian morphological development and fatty acids profile of mud crab (Scylla olivacea) fed with various diets. Aquaculture. 468 (Part 1), 45-52 (2017).
  31. Farhadi, A. et al. The regulatory mechanism of sexual development in decapod crustaceans. Frontiers in Marine Science. 8 (2021).
  32. Sukardi, P., Prayogo, N. A., Harisam, T., Sudaryono, A. Effect of eyestalk-ablation and differences salinity in rearing pond on molting speed of Scylla serrata. AIP Conference Proceedings. 2094, 020029 (2019).
  33. Stella, V. S., López Greco, L. S., Rodríguez, E. M. Effects of eyestalk ablation at different times of the year on molting and reproduction of the estuarine grapsid crab Chasmagnathus granulata (Decapoda, Brachyura). Journal of Crustacean Biology. 20 (2), 239-244 (2000).
  34. Jang, I. K. et al. The effects of manipulating water temperature, photoperiod, and eyestalk ablation on gonad maturation of the swimming crab, Portunus trituberculatus.Crustaceana. 83 (2), 129-141 (2010).
  35. Millamena, O. M., Quinitio, E. The effects of diets on reproductive performance of eyestalk ablated and intact mud crab Scylla serrata. Aquaculture. 181 (1-2), 81-90 (2000).
  36. Zeng, C. Induced out-of-season spawning of the mud crab, Scylla paramamosain (Estampador) and effects of temperature on embryo development. Aquaculture Research. 38 (14), 1478-1485 (2007).
  37. Rana, S. Eye stalk ablation of freshwater crab, Barytelphusa lugubris: An alternative approach of hormonal induced breeding. International Journal of Pure and Applied Zoology. 6 (3), 30-34 (2018).
  38. Yi, S.-K., Lee, S.-G., Lee, J.-M. Preliminary study of seed production of the Micronesian mud crab Scylla serrata (Crustacea: Portunidae) in Korea. Ocean and Polar Research. 31 (3), 257-264 (2009).
  39. Azra, M. N., Abol-Munafi, A. B., Ikhwanuddin, M. A review of broodstock improvement to brachyuran crab: Reproductive performance. International Journal of Aquaculture. 5 (38), 1-10 (2016).
  40.  Archibald, K. E., Scott, G. N., Bailey, K. M., Harms, C. A. 2-phenoxyethanol (2-PE) and tricaine methanesulfonate (MS-222) immersion anesthesia of American horseshoe crabs (Limulus polyphemus). Journal of Zoo and Wildlife Medicine. 50 (1), 96-106 (2019).
  41. Muhd-Farouk, H., Abol-Munafi, A. B., Jasmani, S., Ikhwanuddin, M. Effect of steroid hormones 17α-hydroxyprogesterone and 17α-hydroxypregnenolone on ovary external morphology of orange mud crab, Scylla olivacea. Asian Journal of Cell Biology. 9 (1), 23-28 (2013).
  42. Muhd-Farouk, H., Jasmani, S., Ikhwanuddin, M. Effect of vertebrate steroid hormones on the ovarian maturation stages of orange mud crab, Scylla olivacea (Herbst, 1796). Aquaculture. 451, 78-86 (2016).
  43. Ghazali, A., Mat Noordin, N., Abol-Munafi, A. B., Azra, M. N., Ikhwanuddin, M. Ovarian maturation stages of wild and captive mud crab, Scylla olivacea fed with two diets. Sains Malaysiana. 46 (12), 2273-2280 (2017).
  44. Aaqillah-Amr, M. A., Hidir, A., Noordiyana, M. N., Ikhwanuddin, M. Morphological, biochemical and histological analysis of mud crab ovary and hepatopancreas at different stages of development. Animal Reproduction Science. 195, 274-283 (2018).
  45. Amin-Safwan, A., Muhd-Farouk, H., Mardhiyyah, M. P., Nadirah, M., Ikhwanuddin, M. Does water salinity affect the level of 17β-estradiol and ovarian physiology of orange mud crab, Scylla olivacea (Herbst, 1796) in captivity? Journal of King Saud University - Science. 31 (4), 827-835 (2019).
  46. Wu, X. et al. Effect of dietary supplementation of phospholipids and highly unsaturated fatty acids on reproductive performance and offspring quality of Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis (H. Milne-Edwards), female broodstock. Aquaculture. 273 (4), 602-613 (2007).
  47. Azra, M. N., Ikhwanuddin, M. A review of maturation diets for mud crab genus Scylla broodstock: Present research, problems and future perspective. Saudi Journal of Biological Sciences. 23 (2), 257-267 (2016).
  48. Maschio Rodrigues, M., López Greco, L. S., de Almeida, L. C. F., Bertini, G. Reproductive performance of Macrobrachium acanthurus (Crustacea, Palaemonidae) females subjected to unilateral eyestalk ablation. Acta Zoologica. 103 (3), 326-334 (2022).
  49. Zhang, C. et al. Changes in bud morphology, growth-related genes and nutritional status during cheliped regeneration in the Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis. PLoS One. 13 (12), e0209617 (2018).
  50. Zhang, C. et al. Hemolymph transcriptome analysis of Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) with intact, left cheliped autotomy and bilateral eyestalk ablation. Fish & Shellfish Immunology. 81, 266-275 (2018).
  51. Diarte-Plata, G., Sainz-Hernandez, J. C., Aguiñaga-Cruz, J. A., Fierro-Coronado, J. A., Polanco-Torres, A., Puente-Palazuelos, C. Eyestalk ablation procedures to minimize pain in the freshwater prawn Macrobrachium americanum. Applied Animal Behaviour Science. 140 (3-4), 172-178 (2012). 
  52. Mirera, D. O., Moksnes, P. O. Comparative performance of wild juvenile mud crab (Scylla serrata) in different culture systems in East Africa: Effect of shelter, crab size and stocking density. Aquaculture International. 23 (1), 155-173 (2015).
  53. Ut, V. N., Le Vay, L., Nghia, T. T., Hong Hanh, T. T. Development of nursery cultures for the mud crab Scylla paramamosain (Estampador). Aquaculture Research. 38 (14), 1563-1568 (2007).
  54. Fazhan, H. et al. Limb loss and feeding ability in the juvenile mud crab Scylla olivacea: Implications of limb autotomy for aquaculture practice. Applied Animal Behaviour Science. 247, 105553 (2022).
אבלציה של דיבור עיניים להגברת התבגרות השחלות בסרטני בוץ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Asmat-Ullah, M., Rozaimi, R.,… More

Asmat-Ullah, M., Rozaimi, R., Fazhan, H., Shu-Chien, A. C., Wang, Y., Waiho, K. Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs. J. Vis. Exp. (193), e65039, doi:10.3791/65039 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter