Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Ögonstjälkablation för att öka äggstocksmognaden i lerkrabbor

Published: March 31, 2023 doi: 10.3791/65039
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 2,4, 5, 1,2,3
1Higher Institution Centre of Excellence (HICoE), Institute of Tropical Aquaculture and Fisheries, Universiti Malaysia Terengganu, 2Centre for Chemical Biology, Universiti Sains Malaysia, 3Department of Aquaculture, Faculty of Fisheries, Kasetsart University, 4School of Biological Sciences, Universiti Sains Malaysia, 5International Research Center for Marine Biosciences, Ministry of Science and Technology, Shanghai Ocean University

ERRATUM NOTICE

Summary

Två ablationsprotokoll för ögonstjälk (dvs. cauterization och kirurgiska metoder) utfördes på bedövade kvinnliga krabbor. Ögonstjälkens ablation av lerkrabbor påskyndade mogningen av äggstockarna utan att minska överlevnadsgraden.

Abstract

Lerkrabbor (Scylla spp.) är kommersiellt viktiga kräftdjursarter som finns i hela Indo-västra Stillahavsområdet. Under odlingen är induktionen av äggstocksmognad viktig för att möta konsumenternas efterfrågan på mogna lerkrabbor och påskynda fröproduktionen. Ögonstjälkablation är ett effektivt verktyg för att förbättra äggstocksmognad i lerkrabbor. Det finns dock inget standardprotokoll för ögonpratablation av lerkrabbor. I denna studie beskrivs två ablationstekniker för ögonstjälk: cauterization (användning av het metall för att ablatera ögonstjälken på en sövd krabba) och kirurgi (avlägsnande av ögonstjälken med kirurgisk sax). Före ablation av ögonstjälken bedövades könsmogna honor (CW > 86 mm) med hjälp av en ispåse (−20 °C) med havsvatten. När vattentemperaturen nådde 4 °C avlägsnades ispåsen från vattnet. Strömmande havsvatten (omgivningstemperatur: 28 °C) användes för återhämtning från anestesin omedelbart efter ablation av ögonstjälken. Dödlighet inträffade inte under eller efter processen med ablation av ögonstjälken. Ögonstjälkens ablationsprotokoll som presenteras här påskyndade äggstocksmognaden hos lerkrabborna.

Introduction

Alla fyra lerkrabbarter som tillhör släktet Scylla är kommersiellt viktiga kräftdjursarter i vattenbruk 1,2. Tillväxten av kräftdjur, inklusive lerkrabbor, och deras omvandling från den pre-mogna (sub-vuxna eller pubertala) fasen till den sexuellt mogna (vuxna) fasen sker genom en smältprocess som involverar periodisk utsöndring av äldre och mindre exoskelett. Carapace bredd (CW), kelipeder och bukklaffmorfologier används ofta för att bestämma den sexuella mognaden hos Scylla spp. 3,4,5. Smältprocessen regleras av verkan av olika hormoner och kräver en stor mängd energi6. Förutom den normala smältprocessen påskyndar förlusten av lemmar, antingen frivilligt eller inducerad av yttre faktorer, smältningen av krabbor utan att påverka deras överlevnad 7,8,9. Därför används lemautotomi vanligtvis för moltinduktion i mjukskalsindustrinför lerkrabba 7,9.

Ensidig eller bilateral ögonstjälkablation är mest populär i sötvattenräkor och marina räkor för gonadmognad och fröproduktion10,11,12,13. Vanliga ablationstekniker för ögonstjälk hos kräftdjur inkluderar följande: i) ligering vid basen av ögonstjälken med hjälp av ett snöre14,15; ii) kauterisering av ögonstjälken med hjälp av heta pincett eller elektrocautery-anordningar16; (iii) avlägsnande eller direkt klämning av ögonstjälken för att lämna ett öppet sår12; och (iv) avlägsnande av ögonstjälkens innehåll genom snitt efter att ha skurit den distala delen av ögat med en rakhyvel17. X-organen är viktiga endokrina organ i kräftdjur eftersom de reglerar kräftdjur hyperglykemiska hormoner (CHH), smälthämmande hormoner (MIH) och vitellogeneshämmande hormoner (VIH) 6,18,19,20,21,22. Eyestalk X-organ (eller sinuskörtelkomplexet) syntetiserar och frisätter gonadhämmande hormoner (GIH), även kända som vitellogeneshämmande hormoner (VIH), som tillhör neuropeptidhormonfamiljen6. Ensidig eller bilateral ablation av ögonstjälk minskar GIH-syntesen, vilket resulterar i dominans av stimulerande hormoner (dvs. gonadstimulerande hormoner, GSH) och accelerationen av äggstocksmognadsprocessen hos kräftdjur23,24,25,26. Utan påverkan av GIH efter ögonpratablation ägnar kvinnliga kräftdjur sin energi åt äggstocksutveckling27. Det har visat sig att ensidig ablation av ögonstjälk är tillräcklig för induktion av äggstocksmognad hos kräftdjur11 och att den ablerade ögonstjälken hos räkor och krabbor kan regenerera efter flera smältningar28. Det finns fyra äggstocksutvecklingsstadier registrerade i Scylla spp.: i) omogna (stadium-1), ii) tidig mognad (stadium-2), iii) förmognad (steg-3) och iv) fullt mogna (stadium-4)29,30. Det omogna äggstocksstadiet finns hos omogna kvinnor. Efter pubertetssmältning och parning börjar den omogna äggstocken utvecklas och mognar slutligen (stadium-4) innan den leker31.

Ett ablationsprotokoll för ögonstjälk är viktigt för utveckling av lerkrabba och fröproduktion. På den globala livsmedelsmarknaden föredras mogna lerkrabbor med fullt mogna äggstockar (stadium-4) snarare än krabbor med högre muskelinnehåll av konsumenterna och har därmed ett högre kommersiellt värde, ännu högre än stora män. Det finns inget fullständigt protokoll för ögonstjälkablation av lerkrabbor. Ögonstjälkens ablationsprotokoll i detta arbete minimerar stress genom att använda helt bedövade krabbor och minimerar fysisk skada på personal från krabbbett. Detta protokoll är enkelt och kostnadseffektivt. Här presenterar vi ett protokoll för ögonstjälkablation av Scylla spp. som kan inducera mognad av gonaden. Två tekniker för ögonstjälkablation (cauterization och kirurgi) testades och deras effektivitet jämfördes baserat på den gonadala utvecklingshastigheten hos kvinnliga lerkrabbor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll följer den malaysiska uppförandekoden för vård och användning av djur för vetenskapliga ändamål som beskrivs av Laboratory Animal Science Association of Malaysia. Offret av försöksproverna gjordes enligt National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 8023, reviderad 1978). Sexuellt för tidigt mogna kvinnliga lerkrabbor (orange lerkrabba S. olivacea) samlades in från den lokala marknaden (5°66′62′′N, 102°72′33′′E) vid Setiu våtmarker i Malaysia. Lerkrabbarten identifierades baserat på morfologiska egenskaper1.

1. Provtagning och desinfektion

  1. Samla friska, aktiva och pre-mogna kvinnliga lera krabbor (figur 1).
    OBS: Förmogna kvinnliga krabbor har triangulära och ljusa bukflikar tillsammans med ett CW-intervall på 80-85 mm.
  2. Tvätta krabborna med klorerat kranvatten (sötvatten) för att avlägsna skräp och osmofila parasiter.
  3. Blötlägg krabborna i 150 ppm formaldehyd med 20 ppt salthalt i 30 min.
  4. Behåll kontinuerlig och mild luftning med luftstenar under formaldehydbehandlingen. Luftningskällan kan vara från antingen en central luftningslinje eller en akvarieluftningspump.
  5. Tvätta krabborna med strömmande havsvatten för att avlägsna eventuell kvarvarande formaldehyd.

Figure 1
Figur 1: Bukmorfologi hos kvinnliga lerkrabbor som används för att identifiera de sexuella mognadsstadierna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

2. Acklimatisering

  1. Överför varje desinficerad hona till en separat 32 L cirkulär tank.
  2. Föd upp honorna i 3 dagar i 20 ppt salthalt och fortsätt mata två gånger per dag (morgon 09:00 och kväll 20:00) med hackad havsfisk på cirka 4% -5% av krabbans kroppsvikt.
  3. Ta bort överskott och oätat foder genom att sippra före morgonmatningen.
  4. Byt ut 10% av krabba som odlar havsvatten (20 ppt) dagligen.

3. Inducerad smältning för sexuell mognad

  1. Klipp alla ben utom simbenen med steriliserad sax.
    1. Fånga krabban med ett skopnät och håll krabban försiktigt. Klipp båda kelipederna först och sedan gångbenen vid den andra leden med sax. Krabban autotomiserar automatiskt de skadade bilagorna. Anestesi krävs inte för autotomi i extremiteter.
  2. Tvätta krabban i sötvatten omedelbart efter autotomi i lemmar.
  3. Överför de lem-autotomiserade krabborna individuellt till perforerade plastkorgar (28 cm L x 22 cm B x 7 cm H) och placera dem i en glasfibertank (305 cm L x 120 cm B x 60 cm H).
    OBS: Två korgar kan knytas och klippas ihop. Den övre korgen används som ett lock så att krabban inte kan fly från korgen.
  4. Använd ett recirkulerande vattenbrukssystem (RAS) med 20 ppt salthalt och ett vattendjup på minst 10 cm för att säkerställa att hela plastkorgen är nedsänkt.
  5. Fortsätt mata den lem-autotomiserade kvinnliga krabban med hackad marinfisk två gånger per dag vid 5% -7% av krabbans kroppsvikt.
  6. Baka krabborna tills de är sexuellt mogna genom smältning (35 dagar).
    OBS: Inducerad smältning kan hoppas över för kommersiell äggstocksmognad och fröproduktion med vilda mogna kvinnliga lerkrabbor. Skördade mogna kvinnor från naturen måste acklimatiseras och direkt utsättas för kallchockbedövning och efterföljande ögonpratablation.

4. Bedövning

  1. Välj sexuellt mogna honor med en mörkfärgad ovalformad bukflik med CW->86 mm (figur 1).
  2. Fånga krabborna med ett skopnät och håll dem individuellt i små akvarier för anestesi.
  3. Efter 5 min acklimatiseringsperiod, tillsätt 2-fenoxietanol (2-PE) vid 2 ml / L i varje akvarium och tillåt 15 min anestesibehandling.
  4. Se till att krabborna är helt bedövade av bristen på spontan rörelse.

5. Ablation av ögonstjälk

  1. Cauterization teknik
    1. Utför alla procedurer ovanpå ett bord och i ett öppet område.
    2. Ta en metallstav med platt huvud i nickelstål (t.ex. en skruvmejsel) med ett trä- eller plasthandtag och täck handtaget med en våt bomullshandduk.
    3. Sterilisera två rostfria kirurgiska pincett i en autoklav.
    4. Förbered 70% etanol i en sprayflaska och håll den borta från brandrelaterade källor, såsom blåslampa och röd varm skruvmejsel. Ha silkespapper redo att användas.
      OBS: Etanol är mycket brandfarligt. Håll ett säkert avstånd från brandkällor.
    5. Anslut en blåslampa till en gasflaska (butan) ordentligt.
      VARNING: Följ instruktionerna på blåslampan och gasflaskan. Se till att blåslampan är avstängd när du ansluter till gasflaskan. Läs och följ alla brandsäkerhetsåtgärder som nämns på gasflaskan.
    6. Använd tjocka bomullshandskar för att undvika skador från heta föremål.
    7. Utsätt metallstavens spets för blåsbrännarens eld tills metallstaven är ljusröd.
    8. Täck den bedövade krabban med en våt bomullshandduk.
      OBS: Täck krabbans antenner för att undvika onödig skada.
    9. Håll ett öga av krabban med steriliserade pincett.
      OBS: Sterilisera pincetten i en autoklav för första gången och desinficera med 70% etanol för efterföljande användning på andra krabbor.
    10. Håll den glödheta metallplatta spetsen på krabbans öga och tryck något i cirka 10-15 sekunder tills ögonstjälken blir orange eller röd-orange färg. Var försiktig när du utför detta steg för att undvika skador på intilliggande strukturer.
      OBS: Två personer behövs för att utföra ögonstjälkablation enligt cauterization-metoden: en för att hålla krabban och en annan för att utföra ablationsproceduren.
    11. Desinficera pincetten med 70% etanolspray för att säkerställa att ingen korskontaminering mellan krabbor.
      OBS: Utför endast detta steg åtminstone vänta i 5 minuter efter ögonstångsablationsproceduren för att säkerställa att pincetten kyls ner före desinfektion med 70% etanol för att förhindra potentiella brandrisker.
    12. Efter att ha utfört ögonstjälkens ablation på alla krabbor, doppa den heta nickelstålstången (skruvmejseln) i kranvatten.
    13. Desinficera handduken före återanvändning. Flera handdukar kan användas för att spara tid.
      OBS: Tvätta handduken med kranvatten och doppa den i 30 ppm klorerat vatten i 5 min. Tvätta sedan handduken med kranvatten igen och doppa den i en 1 g / L natriumtiosulfatlösning.
    14. Förvara blåslampan på ett säkert ställe efter att den stängts av och vänta tills den återgår till omgivningstemperatur (cirka 30 min) innan du kopplar bort.
  2. Kirurgisk teknik
    1. Utför proceduren i ett välventilerat område.
    2. Sterilisera två kirurgiska saxar och pincett i en autoklav.
    3. Häll 50 ml 70% etanol i en 100 ml glasbägare.
    4. Använd tjocka bomullshandskar.
    5. Håll den bedövade krabban och täck den med en våt bomullshandduk.
    6. Håll ett öga av krabban med steriliserade pincett.
    7. Klipp snabbt av ögonstången med steriliserad kirurgisk sax.
      OBS: Hemolymf kan gå förlorad från den sårade delen av krabban.
    8. Doppa saxen och pincetten i 70% etanol efter varje användning och torka dem med silkespapper före återanvändning.

6. Vård efter anestesi

  1. Förbered 20 ppt filtrerat havsvatten och förvara i en överliggande tank med kontinuerlig luftning.
  2. Anslut ett flexibelt rör med lufttanken för gravitationsvattenflöde.
  3. Omedelbart efter ablation av ögonstjälken, placera krabban i korgen och utsätt krabban för strömmande havsvatten (omgivande vattentemperatur: 28 ° C) från överliggande tank.
  4. Håll havsvattnet flytande och övervaka krabban tills den kan röra sig spontant, vilket indikerar återhämtning från anestesin.
    OBS: Havsvatten kan beredas i en marktank, och en nedsänkbar vattenpump kan användas för vattenflödet.
  5. Håll krabborna individuellt i 20 ppt havsvatten med luftning i ett akvarium i 30 minuter för vidare observation.
    OBS: De återvunna krabborna kommer att odlas individuellt i den efterföljande avelsodlingsprocessen.

7. Observation av äggstocksmognad

  1. Uppfödning av yngel
    1. Överför de mogna krabborna till individuella 32 L cirkulära tankar.
    2. Fortsätt mata med hackad havsfisk (fryst vid -20 ° C) två gånger per dag (morgon 09:00 och kväll 20:00) och ta bort oätat foder före morgonmatningen.
    3. Bakre stammen individuellt i 30 dagar i 20 ppt salthalt.
    4. Ta bort avföring och byt ut 10% av havsvattnet (20 ppt) dagligen.
  2. Dissekering
    1. Rengör en dissekeringsbricka, sax och pincett med 70% etanol.
    2. Bedöva honorna individuellt med 2-PE nedsänkningsanestesimetoden.
    3. Välj slumpmässigt nyligen mogna honor (efter smältning av premogna honor) som inte har gått igenom ögonpratablation för att bekräfta deras gonadala stadier.
    4. Offra alla ögonstjälk-ablerade experimentella honor individuellt och identifiera gonadmognadsstadierna. Förstör krabbans bröstkorgsganglier med en skarp steril öl. Ta bort den övre skölden först och sedan hepatopancreas för att göra äggstocken synlig. Observera äggstocksfärgen och identifiera äggstocksmognadsstadiet (figur 2).
  3. Identifiering av mognadsstadier för äggstockarna
    1. Observera äggstocksfärgen med blotta ögat eller under ett stereomikroskop.
    2. Identifiera äggstocksmognadsstadierna baserat på färg30: den omogna (steg-1) visar en genomskinlig eller krämig vit färg; den tidiga mognaden (steg-2) visar en blek till ljusgulaktig färg; iii) Förmognaden (steg 3) har en gul till ljusorange färg. och (iv) den fullmogna (steg-4) visar en mörkorange till rödaktig färg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gonad mognad
Krämig vit äggstocksvävnad (omogna äggstockar, stadium-1) hittades hos 100% av de dissekerade honorna (n = 6) innan ögonstjälkablationen utfördes (figur 2). Gonadmognadshastigheten hos ögonstjälk-ablerade honkrabbor (n = 63; 31 honor med cauterization-tekniken och 32 honor med kirurgisk teknik) var högre jämfört med honkrabbor som inte utsattes för ögonstjälkablation (n = 31) efter 30 dagars individuell uppfödning (figur 3). De högsta andelarna av förmogna äggstockar (stadium-3) hittades i ögonstjälk-ablerade kvinnliga krabbor (figur 3; både cauterization och kirurgiska tekniker), och en envägsanalys av varians (ANOVA) visade signifikanta skillnader (p < 0,05) bland de experimentella kvinnliga krabbornas äggstocksmognadsstadier (tabell 1). Kontrollgruppen hade en högre förekomst av omogna kvinnliga krabbor jämfört med cauterization och kirurgiska behandlingsgrupper (Tukeys HSD-test, p < 0,001). Cauterization och kirurgiska behandlingar visade inga signifikanta skillnader när det gäller andelen kvinnliga krabbor över alla mognadsstadier (Tukeys HSD-test, alla p > 0,1). Både cauterization (Tukeys HSD-test, p = 0,004) och kirurgi (Tukeys HSD-test, p = 0,006) behandlingar hade signifikant högre procentandelar av pre-mogna stadium 3 kvinnliga krabbor än kontrollbehandlingen, och endast cauterization och kirurgiska behandlingar kunde producera stadium-4 kvinnliga krabbor från ett omoget stadium inom 30 dagar efter behandlingen (tabell 2).

Figure 2
Figur 2: Fyra mognadsstadier av äggstockarna hos kvinnliga lerkrabbor. Skillnader i färg och volym av äggstockarna mellan stadierna påpekas tydligt av de svarta pilarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Mognadsstadier på äggstockarna hos honkrabbor som utsatts för ablation av ögonstjälken (kirurgi och cauterization) och kontroll efter uppfödningsperioden på 30 dagar (n = 94). Felfältet representerar standardavvikelsen. De upphöjda bokstäverna indikerar signifikanta skillnader mellan behandlingar vid varje mognadsstadium vid p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Mognadsstadium Summan av kvadrater Df Medelkvadrat F P
Omogen (steg-1) Mellan grupper 3755.556 2 1877.778 169 <0,001
Inom grupper 66.667 6 11.111
Total 3822.222 8
Tidig mognad (etapp-2) Mellan grupper 1355.556 2 677.778 8.714 0.017
Inom grupper 466.667 6 77.778
Total 1822.222 8
Förmognad (steg-3) Mellan grupper 4688.889 2 2344.444 17.58 0.003
Inom grupper 800 6 133.333
Total 5488.889 8
Fullmognad (steg-4) Mellan grupper 822.222 2 411.111 9.25 0.015
Inom grupper 266.667 6 44.444
Total 1088.889 8
Anm.: Den genomsnittliga skillnaden är signifikant vid p = 0,05 nivå.

Tabell 1: Jämförelse av ögonstjälk-ablerade (cauterization och kirurgi) och kontroll kvinnliga krabbor gonadala mognadsstadier efter ett enkelriktat ANOVA-test. Den genomsnittliga skillnaden var signifikant vid p = 0,05.

Mognadsstadium Behandling Jämförelse behandling P
Omogen (steg-1) Kauterisering Kirurgi 1
Kauterisering Kontroll <0,001
Kirurgi Kontroll <0,001
Tidig mognad (etapp-2) Kauterisering Kirurgi 0.129
Kauterisering Kontroll 0.014
Kirurgi Kontroll 0.232
Förmognad (steg-3) Kauterisering Kirurgi 0.934
Kauterisering Kontroll 0.004
Kirurgi Kontroll 0.006
Fullmognad (steg-4) Kauterisering Kirurgi 0.109
Kauterisering Kontroll 0.012
Kirurgi Kontroll 0.237
Anm.: Den genomsnittliga skillnaden är signifikant vid p = 0,05 nivå.

Tabell 2: Post-hoc Tukeys HSD-test av skillnaderna mellan ögonstjälk-ablerade (cauterization och kirurgiska) och kontroll kvinnliga krabbors gonadala mognadsstadier. Den genomsnittliga skillnaden var signifikant vid p = 0,05.

Överlevnad
Den genomsnittliga överlevnaden för ögonstjälk-ablerade honkrabbor var 95,45% ± 4,98% (medelvärde ± standardavvikelse) under 30 dagars uppfödningsperiod. Ingen dödlighet inträffade inom de första 7 dagarna efter ablation och hantering av ögonstjälken. Under den 30 dagar långa uppfödningsperioden efter ablation av ögonstjälken var dödligheten inte signifikant annorlunda (Kruskal-Wallis-test, p = 0,67) mellan behandlingarna. Smältframgångsgraden för de lem-autotomiserade kvinnliga krabborna var 80% ± 2,86% (n = 115).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll utvecklades för ögonstjälksablation av lerkrabba, Scylla spp., och kan tillämpas som en effektiv metod för att inducera gonadmognad. Detta protokoll kan enkelt replikeras för kommersiell äggstocksmognad av lerkrabbor och kan implementeras för att minska den latenta perioden (tid från en lek till en annan) i lerkrabbfröproduktion.

Kräftdjurens ablation av ögonstjälken (dvs. sötvattenräkor, marina räkor) görs vanligtvis för att inducera gonadmognad och lek utanför säsongen11,12,13. Ögonstjälkablation i brachyurankrabbor har också gjorts för att studera smältning 25,32,33, hormonell reglering 18, gonadmognad34 och inducerad avel och reproduktionsförmåga35,36,37,38,39. Anestesi via nedsänkning i 2-fenoxietanol användes eftersom det är jämförbart med användningen av trikainmetansulfonat (MS-222) i arthopoder men billigare och kräver inte användning av ytterligare buffert40. Ensidig eller bilateral ablation av ögonstjälk påverkar kräftdjurets fysiologi. Ögonstjälkablation enligt protokollet som anges i denna studie påverkar också äggstocksmognadshastigheten hos lerkrabbor. I kontrollbehandlingen (utan ögonstjälkablation) hade 43,33% ± 5,77% av kvinnliga krabbor en omogen äggstock (stadium-1). Men under samma uppfödningsperiod (30 dagar) hade ögonstjälkablerade kvinnliga krabbor förmognad äggstockar (stadium-3; 56,67% ± 11,55% och 53,33% ± 15,28% med cauterization respektive kirurgiska tekniker), vilket visar att ögonstjälkablation kan öka gonadmognaden hos lerkrabbor. Tidigare studier har också rapporterat att äggstocksutvecklingen hos intakta krabbor (utan ögonstjälkablation) är långsammare än hos ögonstjälk-ablerade krabbor25,31. På grund av den långsammare gonadala utvecklingen hos intakta kräftdjur görs ögonstjälkablation i stor utsträckning i kommersiella räkor och räkor. I detta protokoll uppnådde de ögonstjälkablerade kvinnliga krabborna högre procentandelar av äggstocksmognad jämfört med honkrabborna utan ögonstjälkablationsbehandling (figur 3).

Gondmognaden av lerkrabban regleras av hormonerna21,41,42. Ögonstjälken innehåller viktiga endokrina körtlar (dvs X-organ-sinuskörtelkomplexet) som spelar viktiga roller i gonadmognadsprocessen hos lerkrabbor18,21. Ensidig ablation av ögonstjälken, antingen genom cauterization eller kirurgi, skadar en av de viktigaste endokrina körtlarna som är involverade i syntesen och frisättningen av hämmande hormoner (t.ex. VIH), vilket resulterar i en högre nivå av gonadstimulerande hormoner (dvs VSH).

Mognadsstadierna för äggstockarna hos Scylla spp. kan differentieras genom att observera äggstocksvävnadens färgning med blotta ögat 29,30,43. Genomskinliga eller krämiga vita äggstocksvävnader är indikationer på omogna äggstockar 29,30,43,44. I denna studie hittades fortfarande omogna äggstockar (stadium-1) i gruppen kvinnliga krabbor utan ögonstjälkablation på grund av den långsammare äggstocksmognadsprocessen. Krabborna i ögonstjälk-ablerade grupper (både genom cauterization och kirurgiska tekniker) visade dock mestadels förmogna äggstockar (steg-3), med vissa individer som uppvisade fullmogna äggstockar (steg-4). Därför kan protokollet för ögonstjälkablation som beskrivs här användas för att öka äggstocksmognaden hos kvinnliga lerkrabbor. Detta protokoll kan också tillämpas direkt på vildinsamlade mogna kvinnliga lerkrabbor för att påskynda deras fröproduktion. För att utvärdera effektiviteten av cauterization och kirurgiska metoder på lera krabba gonad mognad och för att säkerställa en korrekt uppskattning av smältvaraktighet användes sexuellt förmogna krabbor. Efter den (inducerade) smältningen av sexuellt pre-mogna kvinnliga krabbor märkte vi att deras äggstockar fortfarande var i de omogna eller tidiga utvecklingsstadierna29,45. Efter 30 dagars uppfödning av de nyligen mogna kvinnliga krabborna (antingen ögonstjälk-ablerade eller utan ögonstjälkablation) bestämdes äggstocksutvecklingsstadierna (steg-1 till steg-4) av färgen på äggstocksvävnaderna. Detta protokoll uppmuntrar användningen av cauterization-tekniken för att utföra ögonpratablation i lerkrabbor för att undvika hemolymfförlust och förhindra infektion på de ablerade platserna. Cauterization förseglar omedelbart såret, medan operationstekniken tar tid för såret att läka och detta skulle möjliggöra risk för infektion. För kommersiella ändamål bör större mogna krabbor, helst i ett senare stadium av äggstocksmognad, väljas för ögonstjälkablation för att förkorta tiden för att nå det fullt mogna äggstocksstadiet för efterföljande handel eller yngelkultur. Förutom ablation av ögonstjälk kan individuell uppfödning med sandsubstrat och tillräcklig utfodring, helst med levande foder, öka gonadmognadshastigheten hos lerkrabbor i fångenskap 30,35,46,47.

Kräftdjursblod kallas hemolymf och kan gå vilse under ablation av ögonstjälken. En överdriven förlust av hemolymf kan leda till döden av ögonstjälk-ablerade krabbor, särskilt när man utför kirurgi för att ta bort ögonstjälken. Hemolymfen kan koagulera i den sårade delen för att förhindra förlust. I jämförelse med operationstekniken förseglar emellertid cauteriseringstekniken den sårade delen omedelbart, vilket förhindrar förlust av hemolymph och eventuell infektion.

Mudkrabbdödlighet efter ensidig ögonstjälkablation med antingen cauterization eller kirurgi hittades inte inom de första 7 dagarna. Således kan ögonstjälkablation göras med en högre överlevnad. Ensidig ögonstjälkablation hindrar inte överlevnadsgraden för krabban33.

Stress under krabbhantering och ablation av ögonstjälk kan bidra till krabbdödlighet. Korrekt anestesi behövs för att minimera hantering av stress under ablation av ögonstjälken. Vid ablation av kräftdjur används kemiska anestetika (dvs. xylokain, lidokain) vid basen av ögonstjälken före ögonpratablation14,15,17,48. På grund av den aggressiva naturen och den stora storleken på lerkrabbor är användningen av anestesi endast vid basen av ögonstjälken inte tillräcklig och kan leda till ytterligare stress för djuren under injektionen. Å andra sidan är anestesi genom att utsätta dem för en lägre vattentemperatur mer ekonomisk och säkrare. Användningen av kallt vatten för anestesi i lerkrabbor är vanligt och har använts i andra studier på grund av dess effektivitet, enkelhet och minimala inverkan på återhämtning och överlevnad 37,49,50. Dessutom rekommenderas framtida forskning om smärtbedömning efter ögonpratablation på lerkrabbor för att belysa förändringen i beteenden i samband med smärta och stress, vilket framgår av sötvattenräkor Macrobrachium americanum51.

Även om ögonstjälkablation med både cauterization och kirurgiska metoder har en minimal effekt på krabböverlevnad och förbättrar äggstocksmognad, kräver ögonpratablation professionell behärskning av teknikerna. Tidpunkten mellan stegen är kritisk eftersom varje fördröjning mellan protokoll lägger till ytterligare stress för krabborna. Till skillnad från kirurgitekniken är cauterization-tekniken farlig eftersom den innebär användning av brandfarlig utrustning (dvs. en blåsbrännare och butangas). Således behövs extra försiktighet vid utförandet av cauterization-tekniken.

Krabbor är kannibalistiska till sin natur, och de är kända för att byta på andra som just har avslutat sin molt och fortfarande är i sina mjuka skalförhållanden 7,52,53. Således kan uppfödning av krabborna individuellt undvika onödig dödlighet på grund av kannibalism. Användningen av individuell uppfödning i lerkrabbkultur praktiseras vanligtvis, både i högdensitetskultur och dammkultur, för gödning och krabbodling med mjukt skal 8,53. Detta protokoll använde också individuell uppfödning och underhåll. Under transporten av krabborna för uppfödning eller handel är krabba chelipeds bundna säkert (eller till och med autotomiserade) för att förhindra strider, onödig skada och förlust av lemmar34.

Det beskrivna protokollet för ablation av ögonstjälk bör utföras med flera personer. Efter avslutad ablation av ögonstjälken ska icke-engångsutrustning (t.ex. akvarium, bricka, handduk etc.) desinficeras med 30 ppm klor. Krabborna måste övervakas minst två gånger per dag. Eventuella döda krabbor, oätat foder, ablerade lemmar eller smälta krabbskal bör snabbt kasseras (dvs. begravas i jord med blekpulver) för att förhindra eventuell sjukdomsspridning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen av författarna har några intressekonflikter.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av utbildningsministeriet, Malaysia, under programmet Higher Institution Centre of Excellence (HICoE), Malaysia, ackrediterat till Institute of Tropical Aquaculture and Fisheries, Universiti Malaysia Terengganu (Vot No. 63933 & Vot No. 56048). Vi erkänner stödet från Universiti Malaysia Terengganu och Sayap Jaya Sdn. Bhd. via Private Partnership Research Grant (Vot. No. 55377). En adjungerad akademisk stipendiat från Universiti Sains Malaysia till Khor Waiho och Hanafiah Fazhan erkänns också.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aeration tube  Ming Yu Three N/A aquarium and pet shop
Airstone Ming Yu Three N/A aquarium and pet shop
Autoclave machine HIRAYAMA MANUFACTURING CORPORATION N/A MADE IN JAPAN
Bleaching powder (Hi-Chlon 70%) Nippon Soda Co.Ltd,Japan N/A N/A
Blow torch  MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Circular tank (32L) BEST PLASTIC INDUSTRY SDN. BHD.  N/A N/A
Cotton hand gloves (thick)  MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Cotton towel MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Digital thermometer Hanna Instrument HI9814 Hanna Instruments GroLine Hydroponics Waterproof pH / EC / TDS / Temp. Portable Meter HI9814
Digital Vernier Caliper INSIZE Co., Ltd. N/A
Dissecting tray Hatcheri AKUATROP  N/A Research Center of Universiti Malaysia Terengganu
Dropper bottle/Plastic Pipettes Dropper Shopee Malaysia N/A N/A
Ethanol 70% Thermo Scientific Chemicals 033361.M1 Diluted to 70% using double distilled water
Fiberglass tank (1 ton) Hatcheri AKUATROP  N/A Research Center of Universiti Malaysia Terengganu
Fine sand N/A N/A collected from Sea beach of Universiti Malaysia Terengganu
First Aid Kits Watsons Malaysia N/A N/A
Flat head nickel steel metal rod (Screw driver) MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Formaldehyde Thermo Scientific Chemicals 119690010
Gas cylinder (butane gas) for blow  torch MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Gas lighter gun (long head) MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Glass beaker (100 mL)) Corning Life Sciences 1000-100
Ice bag  Watsons Malaysia N/A N/A
Perforated plastic baskets  Eco-Shop Marketing Sdn. Bhd. N/A N/A
PVC pipe 15mm Bina Plastic Industries Sdn Bhd (HQ) N/A N/A
Refractometer ATAGO CO.,LTD.
Refrigerator Sharp Corporation Japan N/A Chest Freezer SHARP 110L - SJC 118
Scoop net MR D.I.Y. Group Berhad N/A
Seawater Hatcheri AKUATROP  N/A Research Center of Universiti Malaysia Terengganu
Siphoning pipe MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Spray bottle Mr. DIY Sdn Bhd N/A N/A
Stainless surgical forceps  N/A N/A N/A
Stainless surgical scissors  N/A N/A N/A
Submersible water pump  AS N/A model: Astro 4000
Tincture of iodine solution  (Povidone Iodine) Farmasi Fajr Sdn Bhd N/A N/A
Tissue paper  N/A N/A
Transparent plastic aquarium Ming Yu Three N/A aquarium and pet shop
Waterproof table Hatcheri AKUATROP  N/A Research Center of Universiti Malaysia Terengganu

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keenan, C. P., Davie, P. J. F., Mann, D. L. A revision of the genus Scylla de Haan, 1833 (Crustacea: Decapoda: Brachyura: Portunidae). Raffles Bulletin of Zoology. 46 (1), 217-245 (1998).
  2. Fazhan, H., et al. Morphological descriptions and morphometric discriminant function analysis reveal an additional four groups of Scylla spp. PeerJ. 8, e8066 (2020).
  3. Ikhwanuddin, M., Bachok, Z., Hilmi, M. G., Azmie, G., Zakaria, M. Z. Species diversity, carapace width-body weight relationship, size distribution and sex ratio of mud crab, genus Scylla from Setiu Wetlands of Terengganu coastal waters Malaysia. Journal of Sustainability Science and Management. 5 (2), 97-109 (2010).
  4. Ikhwanuddin, M., Bachok, Z., Mohd Faizal, W. W. Y., Azmie, G., Abol-Munafi, A. B. Size of maturity of mud crab Scylla olivacea (Herbst, 1796) from mangrove areas of Terengganu coastal waters. Journal of Sustainability Science and Management. 5 (2), 134-147 (2010).
  5. Waiho, K., et al. On types of sexual maturity in brachyurans, with special reference to size at the onset of sexual maturity. Journal of Shellfish Research. 36 (3), 807-839 (2017).
  6. Mykles, D. L., Chang, E. S. Hormonal control of the crustacean molting gland: Insights from transcriptomics and proteomics. General and Comparative Endocrinology. 294, 113493 (2020).
  7. Fujaya, Y., et al. Is limb autotomy really efficient compared to traditional rearing in soft-shell crab (Scylla olivacea) production. Aquaculture Reports. 18, 100432 (2020).
  8. Waiho, K., et al. Moult induction methods in soft-shell crab production. Aquaculture Research. 52 (9), 4026-4042 (2021).
  9. Rahman, M. R., et al. Evaluation of limb autotomy as a promising strategy to improve production performances of mud crab (Scylla olivacea) in the soft-shell farming system. Aquaculture Research. 51 (6), 2555-2572 (2020).
  10. Okumura, T., et al. Expression of vitellogenin and cortical rod proteins during induced ovarian development by eyestalk ablation in the kuruma prawn, Marsupenaeus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 143 (2), 246-253 (2006).
  11. Pervaiz, P. A., Jhon, S. M., Sikdar-bar, M. Studies on the effect of unilateral eyestalk ablation in maturation of gonads of a freshwater prawn Macrobrachium dayanum. World Journal of Zoology. 6 (2), 159-163 (2011).
  12. Primavera, J. H. Induced maturation and spawning in five-month-old Penaeus monodon Fabricius by eyestalk ablation. Aquaculture. 13 (4), 355-359 (1978).
  13. Shyne Anand, P. S., et al. Reproductive performance of wild brooders of Indian white shrimp, Penaeus indicus: Potential and challenges for selective breeding program. Journal of Coastal Research. 86 (sp1), 65 (2019).
  14. Diarte-Plata, G., et al. Eyestalk ablation procedures to minimize pain in the freshwater prawn Macrobrachium americanum. Applied Animal Behaviour Science. 140 (3-4), 172-178 (2012).
  15. Vargas-Téllez, I., et al. Impact of unilateral eyestalk ablation on Callinectes arcuatus (Ordway, 1863) under laboratory conditions: Behavioral evaluation. Latin American Journal of Aquatic Research. 49 (4), 576-594 (2021).
  16. Chu, K. H., Chow, W. K. Effects of unilateral versus bilateral eyestalk ablation on molting and growth of the shrimp, Penaeus chinensis Osbeck, 1765) (Decapoda, Penaeidea). Crustaceana. 62 (3), 225-233 (1992).
  17. Taylor, J. Minimizing the effects of stress during eyestalk ablation of Litopenaeus vannamei females with topical anesthetic and a coagulating agent. Aquaculture. 233 (1-4), 173-179 (2004).
  18. Wang, M., Ye, H., Miao, L., Li, X. Role of short neuropeptide F in regulating eyestalk neuroendocrine systems in the mud crab Scylla paramamosain. Aquaculture. 560, 738493 (2022).
  19. Nagaraju, G. P. C. Reproductive regulators in decapod crustaceans: an overview. Journal of Experimental Biology. 214 (1), 3-16 (2011).
  20. Kornthong, N., et al. Characterization of red pigment concentrating hormone (RPCH) in the female mud crab (Scylla olivacea) and the effect of 5-HT on its expression. General and Comparative Endocrinology. 185, 28-36 (2013).
  21. Kornthong, N., et al. Molecular characterization of a vitellogenesis-inhibiting hormone (VIH) in the mud crab (Scylla olivacea) and temporal changes in abundances of VIH mRNA transcripts during ovarian maturation and following neurotransmitter administration. Animal Reproduction Science. 208, 106122 (2019).
  22. Liu, C., et al. VIH from the mud crab is specifically expressed in the eyestalk and potentially regulated by transactivator of Sox9/Oct4/Oct1. General and Comparative Endocrinology. 255, 1-11 (2018).
  23. Chen, H. -Y., Kang, B. J., Sultana, Z., Wilder, M. N. Variation of protein kinase C-α expression in eyestalk removal-activated ovaries in whiteleg shrimp, Litopenaeus vannamei. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 237 (300), 110552 (2019).
  24. Rotllant, G., Nguyen, T. V., Aizen, J., Suwansa-ard, S., Ventura, T. Toward the identification of female gonad-stimulating factors in crustaceans. Hydrobiologia. 825 (1), 91-119 (2018).
  25. Supriya, N. T., Sudha, K., Krishnakumar, V., Anilkumar, G. Molt and reproduction enhancement together with hemolymph ecdysteroid elevation under eyestalk ablation in the female fiddler crab, Uca triangularis (Brachyura: Decapoda). Chinese Journal of Oceanology and Limnology. 35 (3), 645-657 (2017).
  26. Wilder, M. N. Advances in the science of crustacean reproductive physiology and potential applications to new seed production technology. Journal of Coastal Research. 86 (sp1), 6-10 (2019).
  27. Arcos, G. F., Ibarra, A. M., Vazquez-Boucard, C., Palacios, E., Racotta, I. S. Haemolymph metabolic variables in relation to eyestalk ablation and gonad development of Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei Boone. Aquaculture Research. 34 (9), 749-755 (2003).
  28. Desai, U. M., Achuthankutty, C. T. Complete regeneration of ablated eyestalk in penaeid prawn, Penaeus monodon. Current Science. 79 (11), 1602-1603 (2000).
  29. Wu, Q., et al. Growth performance and biochemical composition dynamics of ovary, hepatopancreas and muscle tissues at different ovarian maturation stages of female mud crab, Scylla paramamosain. Aquaculture. 515, 734560 (2020).
  30. Ghazali, A., Azra, M. N., Noordin, N. M., Abol-Munafi, A. B., Ikhwanuddin, M. Ovarian morphological development and fatty acids profile of mud crab (Scylla olivacea) fed with various diets. Aquaculture. 468 (Part 1), 45-52 (2017).
  31. Farhadi, A., et al. The regulatory mechanism of sexual development in decapod crustaceans. Frontiers in Marine Science. 8, (2021).
  32. Sukardi, P., Prayogo, N. A., Harisam, T., Sudaryono, A. Effect of eyestalk-ablation and differences salinity in rearing pond on molting speed of Scylla serrata. AIP Conference Proceedings. 2094, 020029 (2019).
  33. Stella, V. S., López Greco, L. S., Rodríguez, E. M. Effects of eyestalk ablation at different times of the year on molting and reproduction of the estuarine grapsid crab Chasmagnathus granulata (Decapoda, Brachyura). Journal of Crustacean Biology. 20 (2), 239-244 (2000).
  34. Jang, I. K., et al. The effects of manipulating water temperature, photoperiod, and eyestalk ablation on gonad maturation of the swimming crab, Portunus trituberculatus. Crustaceana. 83 (2), 129-141 (2010).
  35. Millamena, O. M., Quinitio, E. The effects of diets on reproductive performance of eyestalk ablated and intact mud crab Scylla serrata. Aquaculture. 181 (1-2), 81-90 (2000).
  36. Zeng, C. Induced out-of-season spawning of the mud crab, Scylla paramamosain (Estampador) and effects of temperature on embryo development. Aquaculture Research. 38 (14), 1478-1485 (2007).
  37. Rana, S. Eye stalk ablation of freshwater crab, Barytelphusa lugubris: An alternative approach of hormonal induced breeding. International Journal of Pure and Applied Zoology. 6 (3), 30-34 (2018).
  38. Yi, S. -K., Lee, S. -G., Lee, J. -M. Preliminary study of seed production of the Micronesian mud crab Scylla serrata (Crustacea: Portunidae) in Korea. Ocean and Polar Research. 31 (3), 257-264 (2009).
  39. Azra, M. N., Abol-Munafi, A. B., Ikhwanuddin, M. A review of broodstock improvement to brachyuran crab: Reproductive performance. International Journal of Aquaculture. 5 (38), 1-10 (2016).
  40. Archibald, K. E., Scott, G. N., Bailey, K. M., Harms, C. A. 2-phenoxyethanol (2-PE) and tricaine methanesulfonate (MS-222) immersion anesthesia of American horseshoe crabs (Limulus polyphemus). Journal of Zoo and Wildlife Medicine. 50 (1), 96-106 (2019).
  41. Muhd-Farouk, H., Abol-Munafi, A. B., Jasmani, S., Ikhwanuddin, M. Effect of steroid hormones 17α-hydroxyprogesterone and 17α-hydroxypregnenolone on ovary external morphology of orange mud crab, Scylla olivacea. Asian Journal of Cell Biology. 9 (1), 23-28 (2013).
  42. Muhd-Farouk, H., Jasmani, S., Ikhwanuddin, M. Effect of vertebrate steroid hormones on the ovarian maturation stages of orange mud crab, Scylla olivacea (Herbst, 1796). Aquaculture. 451, 78-86 (2016).
  43. Ghazali, A., Mat Noordin, N., Abol-Munafi, A. B., Azra, M. N., Ikhwanuddin, M. Ovarian maturation stages of wild and captive mud crab, Scylla olivacea fed with two diets. Sains Malaysiana. 46 (12), 2273-2280 (2017).
  44. Aaqillah-Amr, M. A., Hidir, A., Noordiyana, M. N., Ikhwanuddin, M. Morphological, biochemical and histological analysis of mud crab ovary and hepatopancreas at different stages of development. Animal Reproduction Science. 195, 274-283 (2018).
  45. Amin-Safwan, A., Muhd-Farouk, H., Mardhiyyah, M. P., Nadirah, M., Ikhwanuddin, M. Does water salinity affect the level of 17β-estradiol and ovarian physiology of orange mud crab, Scylla olivacea (Herbst, 1796) in captivity. Journal of King Saud University - Science. 31 (4), 827-835 (2019).
  46. Wu, X., et al. Effect of dietary supplementation of phospholipids and highly unsaturated fatty acids on reproductive performance and offspring quality of Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis (H. Milne-Edwards), female broodstock. Aquaculture. 273 (4), 602-613 (2007).
  47. Azra, M. N., Ikhwanuddin, M. A review of maturation diets for mud crab genus Scylla broodstock: Present research, problems and future perspective. Saudi Journal of Biological Sciences. 23 (2), 257-267 (2016).
  48. Maschio Rodrigues, M., López Greco, L. S., de Almeida, L. C. F., Bertini, G. Reproductive performance of Macrobrachium acanthurus (Crustacea, Palaemonidae) females subjected to unilateral eyestalk ablation. Acta Zoologica. 103 (3), 326-334 (2022).
  49. Zhang, C., et al. Changes in bud morphology, growth-related genes and nutritional status during cheliped regeneration in the Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis. PLoS One. 13 (12), e0209617 (2018).
  50. Zhang, C., et al. Hemolymph transcriptome analysis of Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) with intact, left cheliped autotomy and bilateral eyestalk ablation. Fish & Shellfish Immunology. 81, 266-275 (2018).
  51. Diarte-Plata, G., Sainz-Hernandez, J. C., Aguiñaga-Cruz, J. A., Fierro-Coronado, J. A., Polanco-Torres, A., Puente-Palazuelos, C. Eyestalk ablation procedures to minimize pain in the freshwater prawn Macrobrachium americanum. Applied Animal Behaviour Science. 130 (3-4), 172-178 (2012).
  52. Mirera, D. O., Moksnes, P. O. Comparative performance of wild juvenile mud crab (Scylla serrata) in different culture systems in East Africa: Effect of shelter, crab size and stocking density. Aquaculture International. 23 (1), 155-173 (2015).
  53. Ut, V. N., Le Vay, L., Nghia, T. T., Hong Hanh, T. T. Development of nursery cultures for the mud crab Scylla paramamosain (Estampador). Aquaculture Research. 38 (14), 1563-1568 (2007).
  54. Fazhan, H., et al. Limb loss and feeding ability in the juvenile mud crab Scylla olivacea: Implications of limb autotomy for aquaculture practice. Applied Animal Behaviour Science. 247, 105553 (2022).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 193 Scylla olivacea kallchockbedövning cauterization gonadutveckling inducerad avel

Erratum

Formal Correction: Erratum: Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs
Posted by JoVE Editors on 05/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs. The Introduction, Protocol, Discussion and References were updated.

The forth sentence in the third paragraph of the Introduction has been updated from:

The eyestalk ablation protocol in this work minimizes stress by using fully sedated crabs and minimizes physical injury to personnel from crab bites. 

to:

The eyestalk ablation protocol in this work minimizes stress by using fully anesthetized crabs and minimizes physical injury to personnel from crab bites. 

The start of the Protocol has been updated from:

This protocol follows the Malaysian Code of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes outlined by the Laboratory Animal Science Association of Malaysia. The sacrifice of the experimental samples was done according to the National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 8023, revised 1978). Sexually pre-mature female mud crabs (orange mud crab S. olivacea) were collected from the local market (5°66′62′′N, 102°72′33′′E) at the Setiu Wetlands in Malaysia. The mud crab species was identified based on morphological characteristics1.

to:

This protocol follows the Malaysian Code of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes outlined by the Laboratory Animal Science Association of Malaysia and was approved by the Universiti Malaysia Terengganu's Research Ethics Committee (Animal ethics approval number: UMT/JKEPHMK/2023/96). The sacrifice of the experimental samples was done according to the AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Sexually pre-mature female mud crabs (orange mud crab Scylla olivacea) were collected from the local market (5°66′62′′N, 102°72′33′′E) at the Setiu Wetlands in Malaysia. The mud crab species was identified based on morphological characteristics1.

Section 4 of the Protocol has been updated from:

4. Cold-shock anesthesia

  1. Select sexually mature females with a dark-colored oval-shaped abdominal flap with a CW >86 mm (Figure 1).
  2. Catch the crabs with a scoop net, and keep them individually in small aquariums for cold shock anesthesia.
  3. Prepare 2 L of 4 °C to 1 °C seawater (20 ppt) in a transparent plastic aquarium. Maintain the temperature using (−20 °C) ice bags for cold shock anesthesia.
    NOTE: Check the temperature with a digital thermometer.
  4. Immerse the crab in the 4 °C seawater until sedated (about 3−5 min).
  5. Ensure the crabs are fully anesthetized by the lack of spontaneous movement. The legs and chelipeds joints will still show minor movements when touched with forceps.

to:

4. Anesthesia

  1. Select sexually mature females with a dark-colored oval-shaped abdominal flap with a CW >86 mm (Figure 1).
  2. Catch the crabs with a scoop net, and keep them individually in small aquariums for anesthesia.
  3. After 5 min of acclimatization period, add 2-phenoxyethanol (2-PE) at 2 mL/L into each aquarium and allow 15 min of anesthesia treatment.
  4. Ensure the crabs are fully anesthetized by the lack of spontaneous movement.

Section 5 of the Protocol has been updated from:

5. Eyestalk ablation

  1. Cauterization technique
    1. Perform all procedures on top of a table and in an open area.
    2. Take a flat head nickel-steel metal rod (e.g., a screwdriver) with a wooden or plastic handle, and cover the handle with a wet cotton towel.
    3. Sterilize two stainless surgical forceps in an autoclave.
    4. Prepare 70% ethanol in a spray bottle. Have tissue paper ready for use.
      NOTE: Ethanol is highly flammable. Maintain a safe distance from fire sources.
    5. Connect a blowtorch to a gas cylinder (butane) securely.
      CAUTION: Follow the instructions on the blowtorch and gas cylinder. Make sure that the blowtorch is switched off when connecting with the gas cylinder. Read and follow all the fire safety precautions mentioned on the gas cylinder.
    6. Wear thick cotton gloves to avoid injury from hot objects.
    7. Subject the tip of the metal rod to the fire of the blowtorch until the metal rod is bright red.
    8. Cover the anesthetized (sedated) crab with a wet cotton towel.
      NOTE: Cover all the tentacles of the crab to avoid unnecessary damage.
    9. Hold one eye of the crab with sterilized forceps.
      NOTE: Sterilize the forceps in an autoclave for first-time use, and disinfect using 70% ethanol for subsequent use on other crabs.
    10. Hold the red-hot metal flat tip onto the eye of the crab and press slightly for about 10−15 s until the eyestalk turns an orange or reddish-orange color.
      NOTE: Two people are needed to execute eyestalk ablation following the cauterization method: one to hold the crab and another to perform the ablation procedure.
    11. Disinfect the forceps with 70% ethanol spray to ensure no cross-contamination between crabs.
    12. After performing the eyestalk ablation on all crabs, dip the hot nickel steel metal rod (screwdriver) into tap water.
    13. Disinfect the towel before reuse. Multiple towels can be used to save time.
      NOTE: Wash the towel with tap water, and dip it into 30 ppm chlorinated water for 5 min. Then, wash the towel with tap water again, and dip it in a 1 g/L sodium thiosulphate solution.
    14. Keep the blowtorch in a safe place after turning it off, and wait until it returns to environmental temperature (about 30 min) before disconnecting.
  2. Surgery technique
    1. Perform the procedure in a well-ventilated area.
    2. Sterilize two surgical scissors and forceps in an autoclave.
    3. Pour 50 mL of 70% ethanol into a 100 mL glass beaker.
    4. Prepare the tincture of iodine solution in a dropper bottle.
      NOTE: Tincture of iodine (iodine tincture or weak iodine solution) is made up of 2%-7% elemental iodine and potassium iodide, or sodium iodide, dissolved in ethanol and water.
    5. Wear thick cotton gloves.
    6. Hold the sedated crab, and cover it with a wet cotton towel.
    7. Hold one eye of the crab with sterilized forceps.
    8. Swiftly cut off the eyestalk using sterilized surgical scissors.
      NOTE: Hemolymph may be lost from the wounded part of the crab.
    9. Dip the scissors and forceps in 70% ethanol after every use, and dry them using tissue paper before reuse.
    10. Apply two to three drops of iodine tincture to the wounded part of the eyestalk immediately after cutting it off.
      NOTE: Tincture of iodine is used for healing and to prevent infection.

to:

5. Eyestalk ablation

  1. Cauterization technique
    1. Perform all procedures on top of a table and in an open area.
    2. Take a flat head nickel-steel metal rod (e.g., a screwdriver) with a wooden or plastic handle, and cover the handle with a wet cotton towel.
    3. Sterilize two stainless surgical forceps in an autoclave.
    4. Prepare 70% ethanol in a spray bottle and keep it away from any fire-related sources, such as blow torch and red hot screwdriver. Have tissue paper ready for use.
      NOTE: Ethanol is highly flammable. Maintain a safe distance from fire sources.
    5. Connect a blowtorch to a gas cylinder (butane) securely.
      CAUTION: Follow the instructions on the blowtorch and gas cylinder. Make sure that the blowtorch is switched off when connecting with the gas cylinder. Read and follow all the fire safety precautions mentioned on the gas cylinder.
    6. Wear thick cotton gloves to avoid injury from hot objects.
    7. Subject the tip of the metal rod to the fire of the blowtorch until the metal rod is bright red.
    8. Cover the anesthetized crab with a wet cotton towel.
      NOTE: Cover the antennae of the crab to avoid unnecessary damage.
    9. Hold one eye of the crab with sterilized forceps.
      NOTE: Sterilize the forceps in an autoclave for first-time use, and disinfect using 70% ethanol for subsequent use on other crabs.
    10. Hold the red-hot metal flat tip onto the eye of the crab and press slightly for about 10−15 s until the eyestalk turns an orange or reddish-orange color. Be careful when conducting this step to avoid damage to adjacent structures. 
      NOTE: Two people are needed to execute eyestalk ablation following the cauterization method: one to hold the crab and another to perform the ablation procedure.
    11. Disinfect the forceps with 70% ethanol spray to ensure no cross-contamination between crabs.
      NOTE: Only perform this step at least waiting for 5 min after the eyestalk ablation procedure to ensure the forceps are cooled down before disinfection using 70% ethanol to prevent potential fire hazards.
    12. After performing the eyestalk ablation on all crabs, dip the hot nickel steel metal rod (screwdriver) into tap water.
    13. Disinfect the towel before reuse. Multiple towels can be used to save time.
      NOTE: Wash the towel with tap water, and dip it into 30 ppm chlorinated water for 5 min. Then, wash the towel with tap water again, and dip it in a 1 g/L sodium thiosulphate solution.
    14. Keep the blowtorch in a safe place after turning it off, and wait until it returns to environmental temperature (about 30 min) before disconnecting.
  2. Surgery technique
    1. Perform the procedure in a well-ventilated area.
    2. Sterilize two surgical scissors and forceps in an autoclave.
    3. Pour 50 mL of 70% ethanol into a 100 mL glass beaker.
    4. Wear thick cotton gloves.
    5. Hold the anesthetized crab, and cover it with a wet cotton towel.
    6. Hold one eye of the crab with sterilized forceps.
    7. Swiftly cut off the eyestalk using sterilized surgical scissors.
      NOTE: Hemolymph may be lost from the wounded part of the crab.
    8. Dip the scissors and forceps in 70% ethanol after every use, and dry them using tissue paper before reuse.

Step 7.2.2 of the Protocol has been updated from:

Sedate the females individually with the cold shock anesthesia method.

to:

Anesthetize the females individually with the 2-PE immersion anesthesia method.

The Discussion has been updated from:

This protocol was developed for the eyestalk ablation of the mud crab, Scylla spp., and can be applied as an efficient method to induce gonad maturation. This protocol can be easily replicated for the commercial ovary maturation of mud crabs and can be implemented to reduce the latent period (time from one spawning to another) in mud crab seed production.

The eyestalk ablation of crustaceans (i.e., freshwater prawn, marine shrimp) is typically done to induce gonad maturation and out-of-season spawning11,12,13. Eyestalk ablation in brachyuran crabs has also been done to study molting25,32,33, hormonal regulation18, gonad maturation34, and induced breeding and reproductive performance35,36,37,38,39. Unilateral or bilateral eyestalk ablation influences the physiology of the crustacean. Eyestalk ablation following the protocol stated in this study also influences the ovarian maturation rate of mud crabs. In the control treatment (without eyestalk ablation), 43.33% ± 5.77% of female crabs had an immature ovary (stage-1). However, in the same rearing period (30 days), eyestalk-ablated female crabs had pre-maturing ovaries (stage-3; 56.67% ± 11.55% and 53.33% ± 15.28% with the cauterization and surgery techniques, respectively), which shows that eyestalk ablation can increase the gonad maturation of mud crabs. Previous studies have also reported that the ovarian development of intact crabs (without eyestalk ablation) is slower than that of eyestalk-ablated crabs25,31. Due to the slower gonadal development in intact crustaceans, eyestalk ablation is widely done in commercial prawn and shrimp hatcheries. In this protocol, the eyestalk-ablated female crabs achieved higher percentages of ovarian maturation compared to the female crabs without the eyestalk ablation treatment (Figure 3).

The gonad maturation of the mud crab is regulated by hormones21,40,41. The eyestalk contains important endocrine glands (i.e., the X-organ-sinus gland complex) that play vital roles in the gonadal maturation process of mud crabs18,21. Unilateral eyestalk ablation, either by cauterization or surgery, damages one of the major endocrine glands that is involved in the synthesis and release of inhibiting hormones (e.g., VIH), thereby resulting in a higher level of gonad-stimulating hormones (i.e., VSH).

The ovarian maturation stages of Scylla spp. can be differentiated by observing the ovarian tissue coloration with the naked eye29,30,42. Translucent or creamy white ovarian tissues are indications of immature ovaries29,30,42,43. In this study, immature ovaries (stage-1) were still found in the group of female crabs without eyestalk ablation due to the slower ovarian maturation process. However, the crabs in the eyestalk-ablated groups (both by the cauterization and surgery techniques) mostly showed pre-maturing ovaries (stage-3), with some individuals exhibiting fully matured ovaries (stage-4). Therefore, the protocol of eyestalk ablation described here can be used to increase ovarian maturation in female mud crabs. This protocol can also be applied directly to wild-collected mature female mud crabs to hasten their seed production. To evaluate the effectiveness of cauterization and surgery methods on mud crab gonad maturation and to ensure the accurate estimation of molting duration, sexually pre-mature crabs were used. After the (induced) molting of sexually pre-mature female crabs, we noticed that their ovaries were still in the immature or early developing stages29,44. After 30 days of rearing the newly mature female crabs (either eyestalk-ablated or without eyestalk ablation), the ovarian development stages (stage-1 to stage-4) were determined by the color of the ovarian tissues. This protocol encourages the use of the cauterization technique to perform eyestalk ablation in mud crabs to avoid any hemolymph loss and prevent infection at the ablated sites. Cauterization immediately seals the wound, whereas the surgery technique requires an additional step of disinfection using iodine. For commercial purposes, larger mature crabs, preferably at a later stage of ovarian maturation, should be selected for eyestalk ablation to shorten the time to reach the fully matured ovary stage for subsequent commerce or brood stock culture. In addition to eyestalk ablation, individual rearing with sand substrate and sufficient feeding, preferably with live feed, can increase the gonad maturation rate of mud crabs in captivity30,35,45,46.

Crustacean blood is called hemolymph and can be lost during eyestalk ablation. An excessive loss of hemolymph may lead to the death of eyestalk-ablated crabs, especially when performing surgery to remove the eyestalk. The hemolymph can coagulate in the wounded part to prevent loss. The application of a tincture of iodine can prevent infection of the wounded part. However, in comparison to the surgery technique, the cauterization technique seals the wounded part immediately, thereby preventing the loss of hemolymph and possible infection.

Mud crab mortality after unilateral eyestalk ablation with either cauterization or surgery was not found within the first 7 days. Thus, eyestalk ablation can be done with a higher survival rate. Unilateral eyestalk ablation does not hamper the survival rate of the crab33.

Stress during crab handling and eyestalk ablation may contribute to crab mortality. Proper anesthesia is needed to minimize handling stress during eyestalk ablation. In crustacean eyestalk ablation, chemical anesthetics (i.e., xylocaine, lidocaine) are used at the base of the eyestalk before eyestalk ablation14,15,17,47. However, due to the aggressive nature and large size of mud crabs, the use of anesthesia only at the base of the eyestalk is not sufficient and might result in additional stress to the animals during the injection. On the other hand, anesthesia by subjecting them to a lower water temperature is more economical and safer. The use of cold water for anesthesia in mud crabs is common and has been used in other studies due to its efficiency, simplicity, and minimal impact on recovery and survival37,48,49.

Although eyestalk ablation using both cauterization and surgery methods has a minimal effect on crab survival and enhances ovarian maturation, performing eyestalk ablation requires professional mastery of the techniques. The timing between the steps is critical as any delay between protocols adds additional stress for the crabs. Unlike the surgery technique, the cauterization technique is dangerous because it involves the use of flammable equipment (i.e., a blow torch and butane gas). Thus, extra caution is needed when performing the cauterization technique.

Crabs are cannibalistic in nature, and they are known to prey on others that have just completed their molt and are still in their soft-shell conditions7,50,51. Thus, rearing the crabs individually can avoid unnecessary mortality due to cannibalism. The use of individual rearing in mud crab culture is commonly practiced, both in high-density culture and pond culture, for fattening and soft-shell crab farming purposes8,52. This protocol also utilized individual rearing and maintenance. During the transportation of the crabs for rearing or commerce, the crab chelipeds are tied up securely (or even autotomized) to prevent fighting, unnecessary injury, and limb loss34.

The described protocol for eyestalk ablation should be performed with multiple persons. After completing the eyestalk ablation, non-disposable equipment (e.g., the aquarium, tray, towel, etc.) should be disinfected with 30 ppm chlorine. The crabs must be monitored at least twice per day. Any dead crabs, uneaten feed, ablated limbs, or molted crab shells should be swiftly disposed of (i.e., buried in soil with bleaching powder) to prevent any potential for disease spread.

to:

This protocol was developed for the eyestalk ablation of the mud crab, Scylla spp., and can be applied as an efficient method to induce gonad maturation. This protocol can be easily replicated for the commercial ovary maturation of mud crabs and can be implemented to reduce the latent period (time from one spawning to another) in mud crab seed production.

The eyestalk ablation of crustaceans (i.e., freshwater prawn, marine shrimp) is typically done to induce gonad maturation and out-of-season spawning11,12,13. Eyestalk ablation in brachyuran crabs has also been done to study molting25,32,33, hormonal regulation18, gonad maturation34, and induced breeding and reproductive performance35,36,37,38,39. Anesthesia via immersion in 2-phenoxyethanol was used as it is comparable to the use of tricaine methanesulfonate (MS-222) in arthopods but cheaper and does not require the use of additional buffer40. Unilateral or bilateral eyestalk ablation influences the physiology of the crustacean. Eyestalk ablation following the protocol stated in this study also influences the ovarian maturation rate of mud crabs. In the control treatment (without eyestalk ablation), 43.33% ± 5.77% of female crabs had an immature ovary (stage-1). However, in the same rearing period (30 days), eyestalk-ablated female crabs had pre-maturing ovaries (stage-3; 56.67% ± 11.55% and 53.33% ± 15.28% with the cauterization and surgery techniques, respectively), which shows that eyestalk ablation can increase the gonad maturation of mud crabs. Previous studies have also reported that the ovarian development of intact crabs (without eyestalk ablation) is slower than that of eyestalk-ablated crabs25,31. Due to the slower gonadal development in intact crustaceans, eyestalk ablation is widely done in commercial prawn and shrimp hatcheries. In this protocol, the eyestalk-ablated female crabs achieved higher percentages of ovarian maturation compared to the female crabs without the eyestalk ablation treatment (Figure 3).

The gonad maturation of the mud crab is regulated by hormones21,41,42. The eyestalk contains important endocrine glands (i.e., the X-organ-sinus gland complex) that play vital roles in the gonadal maturation process of mud crabs18,21. Unilateral eyestalk ablation, either by cauterization or surgery, damages one of the major endocrine glands that is involved in the synthesis and release of inhibiting hormones (e.g., VIH), thereby resulting in a higher level of gonad-stimulating hormones (i.e., VSH).

The ovarian maturation stages of Scylla spp. can be differentiated by observing the ovarian tissue coloration with the naked eye29,30,43. Translucent or creamy white ovarian tissues are indications of immature ovaries29,30,43,44. In this study, immature ovaries (stage-1) were still found in the group of female crabs without eyestalk ablation due to the slower ovarian maturation process. However, the crabs in the eyestalk-ablated groups (both by the cauterization and surgery techniques) mostly showed pre-maturing ovaries (stage-3), with some individuals exhibiting fully matured ovaries (stage-4). Therefore, the protocol of eyestalk ablation described here can be used to increase ovarian maturation in female mud crabs. This protocol can also be applied directly to wild-collected mature female mud crabs to hasten their seed production. To evaluate the effectiveness of cauterization and surgery methods on mud crab gonad maturation and to ensure the accurate estimation of molting duration, sexually pre-mature crabs were used. After the (induced) molting of sexually pre-mature female crabs, we noticed that their ovaries were still in the immature or early developing stages29,45. After 30 days of rearing the newly mature female crabs (either eyestalk-ablated or without eyestalk ablation), the ovarian development stages (stage-1 to stage-4) were determined by the color of the ovarian tissues. This protocol encourages the use of the cauterization technique to perform eyestalk ablation in mud crabs to avoid any hemolymph loss and prevent infection at the ablated sites. Cauterization immediately seals the wound, whereas the surgery technique takes time for the wound to heal and this would allow for chance of infection. For commercial purposes, larger mature crabs, preferably at a later stage of ovarian maturation, should be selected for eyestalk ablation to shorten the time to reach the fully matured ovary stage for subsequent commerce or brood stock culture. In addition to eyestalk ablation, individual rearing with sand substrate and sufficient feeding, preferably with live feed, can increase the gonad maturation rate of mud crabs in captivity30,35,46,47.

Crustacean blood is called hemolymph and can be lost during eyestalk ablation. An excessive loss of hemolymph may lead to the death of eyestalk-ablated crabs, especially when performing surgery to remove the eyestalk. The hemolymph can coagulate in the wounded part to prevent loss. However, in comparison to the surgery technique, the cauterization technique seals the wounded part immediately, thereby preventing the loss of hemolymph and possible infection.

Mud crab mortality after unilateral eyestalk ablation with either cauterization or surgery was not found within the first 7 days. Thus, eyestalk ablation can be done with a higher survival rate. Unilateral eyestalk ablation does not hamper the survival rate of the crab33.

Stress during crab handling and eyestalk ablation may contribute to crab mortality. Proper anesthesia is needed to minimize handling stress during eyestalk ablation. In crustacean eyestalk ablation, chemical anesthetics (i.e., xylocaine, lidocaine) are used at the base of the eyestalk before eyestalk ablation14,15,17,48. However, due to the aggressive nature and large size of mud crabs, the use of anesthesia only at the base of the eyestalk is not sufficient and might result in additional stress to the animals during the injection. On the other hand, anesthesia by subjecting them to a lower water temperature is more economical and safer. The use of cold water for anesthesia in mud crabs is common and has been used in other studies due to its efficiency, simplicity, and minimal impact on recovery and survival37,49,50. In addition, future research on pain assessment following eyestalk ablation on mud crabs is recommended to highlight the change in behaviours associated with pain and stress, as evident in freshwater prawn Macrobrachium americanum51.

Although eyestalk ablation using both cauterization and surgery methods has a minimal effect on crab survival and enhances ovarian maturation, performing eyestalk ablation requires professional mastery of the techniques. The timing between the steps is critical as any delay between protocols adds additional stress for the crabs. Unlike the surgery technique, the cauterization technique is dangerous because it involves the use of flammable equipment (i.e., a blow torch and butane gas). Thus, extra caution is needed when performing the cauterization technique.

Crabs are cannibalistic in nature, and they are known to prey on others that have just completed their molt and are still in their soft-shell conditions7,52,53. Thus, rearing the crabs individually can avoid unnecessary mortality due to cannibalism. The use of individual rearing in mud crab culture is commonly practiced, both in high-density culture and pond culture, for fattening and soft-shell crab farming purposes8,53. This protocol also utilized individual rearing and maintenance. During the transportation of the crabs for rearing or commerce, the crab chelipeds are tied up securely (or even autotomized) to prevent fighting, unnecessary injury, and limb loss34.

The described protocol for eyestalk ablation should be performed with multiple persons. After completing the eyestalk ablation, non-disposable equipment (e.g., the aquarium, tray, towel, etc.) should be disinfected with 30 ppm chlorine. The crabs must be monitored at least twice per day. Any dead crabs, uneaten feed, ablated limbs, or molted crab shells should be swiftly disposed of (i.e., buried in soil with bleaching powder) to prevent any potential for disease spread.

The References have been updated from:

  1. Keenan, C. P., Davie, P. J. F., Mann, D. L. A revision of the genus Scylla de Haan, 1833 (Crustacea: Decapoda: Brachyura: Portunidae). Raffles Bulletin of Zoology. 46 (1), 217-245 (1998).
  2. Fazhan, H. et al. Morphological descriptions and morphometric discriminant function analysis reveal an additional four groups of Scylla spp. PeerJ. 8, e8066 (2020).
  3. Ikhwanuddin, M., Bachok, Z., Hilmi, M. G., Azmie, G., Zakaria, M. Z. Species diversity, carapace width-body weight relationship, size distribution and sex ratio of mud crab, genus Scylla from Setiu Wetlands of Terengganu coastal waters, Malaysia. Journal of Sustainability Science and Management. 5 (2), 97-109 (2010).
  4. Ikhwanuddin, M., Bachok, Z., Mohd Faizal, W. W. Y., Azmie, G., Abol-Munafi, A. B. Size of maturity of mud crab Scylla olivacea (Herbst, 1796) from mangrove areas of Terengganu coastal waters. Journal of Sustainability Science and Management. 5 (2), 134-147 (2010).
  5. Waiho, K. et al. On types of sexual maturity in brachyurans, with special reference to size at the onset of sexual maturity. Journal of Shellfish Research. 36 (3), 807-839 (2017).
  6. Mykles, D. L., Chang, E. S. Hormonal control of the crustacean molting gland: Insights from transcriptomics and proteomics. General and Comparative Endocrinology. 294, 113493 (2020).
  7. Fujaya, Y. et al. Is limb autotomy really efficient compared to traditional rearing in soft-shell crab (Scylla olivacea) production? Aquaculture Reports. 18, 100432 (2020).
  8. Waiho, K. et al. Moult induction methods in soft-shell crab production. Aquaculture Research. 52 (9), 4026-4042 (2021).
  9. Rahman, M. R. et al. Evaluation of limb autotomy as a promising strategy to improve production performances of mud crab (Scylla olivacea) in the soft-shell farming system. Aquaculture Research. 51 (6), 2555-2572 (2020).
  10. Okumura, T. et al. Expression of vitellogenin and cortical rod proteins during induced ovarian development by eyestalk ablation in the kuruma prawn, Marsupenaeus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 143 (2), 246-253 (2006).
  11. Pervaiz, P. A., Jhon, S. M., Sikdar-bar, M. Studies on the effect of unilateral eyestalk ablation in maturation of gonads of a freshwater prawn Macrobrachium dayanum. World Journal of Zoology. 6 (2), 159-163 (2011).
  12. Primavera, J. H. Induced maturation and spawning in five-month-old Penaeus monodon Fabricius by eyestalk ablation. Aquaculture. 13 (4), 355-359 (1978).
  13. Shyne Anand, P. S. et al. Reproductive performance of wild brooders of Indian white shrimp, Penaeus indicus: Potential and challenges for selective breeding program. Journal of Coastal Research. 86 (sp1), 65 (2019).
  14. Diarte-Plata, G. et al. Eyestalk ablation procedures to minimize pain in the freshwater prawn Macrobrachium americanum. Applied Animal Behaviour Science. 140 (3-4), 172-178 (2012).
  15. Vargas-Téllez, I. et al. Impact of unilateral eyestalk ablation on Callinectes arcuatus (Ordway, 1863) under laboratory conditions: Behavioral evaluation. Latin American Journal of Aquatic Research. 49 (4), 576-594 (2021).
  16. Chu, K. H., Chow, W. K. Effects of unilateral versus bilateral eyestalk ablation on molting and growth of the shrimp, Penaeus chinensis (Osbeck, 1765) (Decapoda, Penaeidea). Crustaceana. 62 (3), 225-233 (1992).
  17. Taylor, J. Minimizing the effects of stress during eyestalk ablation of Litopenaeus vannamei females with topical anesthetic and a coagulating agent. Aquaculture. 233 (1-4), 173-179 (2004).
  18. Wang, M., Ye, H., Miao, L., Li, X. Role of short neuropeptide F in regulating eyestalk neuroendocrine systems in the mud crab Scylla paramamosain. Aquaculture. 560, 738493 (2022).
  19. Nagaraju, G. P. C. Reproductive regulators in decapod crustaceans: an overview. Journal of Experimental Biology. 214 (1), 3-16 (2011).
  20. Kornthong, N. et al. Characterization of red pigment concentrating hormone (RPCH) in the female mud crab (Scylla olivacea) and the effect of 5-HT on its expression. General and Comparative Endocrinology. 185, 28-36 (2013).
  21. Kornthong, N. et al. Molecular characterization of a vitellogenesis-inhibiting hormone (VIH) in the mud crab (Scylla olivacea) and temporal changes in abundances of VIH mRNA transcripts during ovarian maturation and following neurotransmitter administration. Animal Reproduction Science. 208, 106122 (2019).
  22. Liu, C. et al. VIH from the mud crab is specifically expressed in the eyestalk and potentially regulated by transactivator of Sox9/Oct4/Oct1. General and Comparative Endocrinology. 255, 1-11 (2018).
  23. Chen, H.-Y., Kang, B. J., Sultana, Z., Wilder, M. N. Variation of protein kinase C-α expression in eyestalk removal-activated ovaries in whiteleg shrimp, Litopenaeus vannamei. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 237 (300), 110552 (2019).
  24. Rotllant, G., Nguyen, T. V., Aizen, J., Suwansa-ard, S., Ventura, T. Toward the identification of female gonad-stimulating factors in crustaceans. Hydrobiologia. 825 (1), 91-119 (2018).
  25. Supriya, N. T., Sudha, K., Krishnakumar, V., Anilkumar, G. Molt and reproduction enhancement together with hemolymph ecdysteroid elevation under eyestalk ablation in the female fiddler crab, Uca triangularis (Brachyura: Decapoda). Chinese Journal of Oceanology and Limnology. 35 (3), 645-657 (2017).
  26. Wilder, M. N. Advances in the science of crustacean reproductive physiology and potential applications to new seed production technology. Journal of Coastal Research. 86 (sp1), 6-10 (2019).
  27. Arcos, G. F., Ibarra, A. M., Vazquez-Boucard, C., Palacios, E., Racotta, I. S. Haemolymph metabolic variables in relation to eyestalk ablation and gonad development of Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei Boone. Aquaculture Research. 34 (9), 749-755 (2003).
  28. Desai, U. M., Achuthankutty, C. T. Complete regeneration of ablated eyestalk in penaeid prawn, Penaeus monodon. Current Science. 79 (11), 1602-1603 (2000).
  29. Wu, Q. et al. Growth performance and biochemical composition dynamics of ovary, hepatopancreas and muscle tissues at different ovarian maturation stages of female mud crab, Scylla paramamosain. Aquaculture. 515, 734560 (2020).
  30. Ghazali, A., Azra, M. N., Noordin, N. M., Abol-Munafi, A. B., Ikhwanuddin, M. Ovarian morphological development and fatty acids profile of mud crab (Scylla olivacea) fed with various diets. Aquaculture. 468 (Part 1), 45-52 (2017).
  31. Farhadi, A. et al. The regulatory mechanism of sexual development in decapod crustaceans. Frontiers in Marine Science. 8 (2021).
  32. Sukardi, P., Prayogo, N. A., Harisam, T., Sudaryono, A. Effect of eyestalk-ablation and differences salinity in rearing pond on molting speed of Scylla serrata. AIP Conference Proceedings. 2094, 020029 (2019).
  33. Stella, V. S., López Greco, L. S., Rodríguez, E. M. Effects of eyestalk ablation at different times of the year on molting and reproduction of the estuarine grapsid crab Chasmagnathus granulata (Decapoda, Brachyura). Journal of Crustacean Biology. 20 (2), 239-244 (2000).
  34. Jang, I. K. et al. The effects of manipulating water temperature, photoperiod, and eyestalk ablation on gonad maturation of the swimming crab, Portunus trituberculatus.Crustaceana. 83 (2), 129-141 (2010).
  35. Millamena, O. M., Quinitio, E. The effects of diets on reproductive performance of eyestalk ablated and intact mud crab Scylla serrata. Aquaculture. 181 (1-2), 81-90 (2000).
  36. Zeng, C. Induced out-of-season spawning of the mud crab, Scylla paramamosain (Estampador) and effects of temperature on embryo development. Aquaculture Research. 38 (14), 1478-1485 (2007).
  37. Rana, S. Eye stalk ablation of freshwater crab, Barytelphusa lugubris: An alternative approach of hormonal induced breeding. International Journal of Pure and Applied Zoology. 6 (3), 30-34 (2018).
  38. Yi, S.-K., Lee, S.-G., Lee, J.-M. Preliminary study of seed production of the Micronesian mud crab Scylla serrata (Crustacea: Portunidae) in Korea. Ocean and Polar Research. 31 (3), 257-264 (2009).
  39. Azra, M. N., Abol-Munafi, A. B., Ikhwanuddin, M. A review of broodstock improvement to brachyuran crab: Reproductive performance. International Journal of Aquaculture. 5 (38), 1-10 (2016).
  40. Muhd-Farouk, H., Abol-Munafi, A. B., Jasmani, S., Ikhwanuddin, M. Effect of steroid hormones 17α-hydroxyprogesterone and 17α-hydroxypregnenolone on ovary external morphology of orange mud crab, Scylla olivacea. Asian Journal of Cell Biology. 9 (1), 23-28 (2013).
  41. Muhd-Farouk, H., Jasmani, S., Ikhwanuddin, M. Effect of vertebrate steroid hormones on the ovarian maturation stages of orange mud crab, Scylla olivacea (Herbst, 1796). Aquaculture. 451, 78-86 (2016).
  42. Ghazali, A., Mat Noordin, N., Abol-Munafi, A. B., Azra, M. N., Ikhwanuddin, M. Ovarian maturation stages of wild and captive mud crab, Scylla olivacea fed with two diets. Sains Malaysiana. 46 (12), 2273-2280 (2017).
  43. Aaqillah-Amr, M. A., Hidir, A., Noordiyana, M. N., Ikhwanuddin, M. Morphological, biochemical and histological analysis of mud crab ovary and hepatopancreas at different stages of development. Animal Reproduction Science. 195, 274-283 (2018).
  44. Amin-Safwan, A., Muhd-Farouk, H., Mardhiyyah, M. P., Nadirah, M., Ikhwanuddin, M. Does water salinity affect the level of 17β-estradiol and ovarian physiology of orange mud crab, Scylla olivacea (Herbst, 1796) in captivity? Journal of King Saud University - Science. 31 (4), 827-835 (2019).
  45. Wu, X. et al. Effect of dietary supplementation of phospholipids and highly unsaturated fatty acids on reproductive performance and offspring quality of Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis (H. Milne-Edwards), female broodstock. Aquaculture. 273 (4), 602-613 (2007).
  46. Azra, M. N., Ikhwanuddin, M. A review of maturation diets for mud crab genus Scylla broodstock: Present research, problems and future perspective. Saudi Journal of Biological Sciences. 23 (2), 257-267 (2016).
  47. Maschio Rodrigues, M., López Greco, L. S., de Almeida, L. C. F., Bertini, G. Reproductive performance of Macrobrachium acanthurus (Crustacea, Palaemonidae) females subjected to unilateral eyestalk ablation. Acta Zoologica. 103 (3), 326-334 (2022).
  48. Zhang, C. et al. Changes in bud morphology, growth-related genes and nutritional status during cheliped regeneration in the Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis. PLoS One. 13 (12), e0209617 (2018).
  49. Zhang, C. et al. Hemolymph transcriptome analysis of Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) with intact, left cheliped autotomy and bilateral eyestalk ablation. Fish & Shellfish Immunology. 81, 266-275 (2018).
  50. Mirera, D. O., Moksnes, P. O. Comparative performance of wild juvenile mud crab (Scylla serrata) in different culture systems in East Africa: Effect of shelter, crab size and stocking density. Aquaculture International. 23 (1), 155-173 (2015).
  51. Ut, V. N., Le Vay, L., Nghia, T. T., Hong Hanh, T. T. Development of nursery cultures for the mud crab Scylla paramamosain (Estampador). Aquaculture Research. 38 (14), 1563-1568 (2007).
  52. Fazhan, H. et al. Limb loss and feeding ability in the juvenile mud crab Scylla olivacea: Implications of limb autotomy for aquaculture practice. Applied Animal Behaviour Science. 247, 105553 (2022).

to:

  1. Keenan, C. P., Davie, P. J. F., Mann, D. L. A revision of the genus Scylla de Haan, 1833 (Crustacea: Decapoda: Brachyura: Portunidae). Raffles Bulletin of Zoology. 46 (1), 217-245 (1998).
  2. Fazhan, H. et al. Morphological descriptions and morphometric discriminant function analysis reveal an additional four groups of Scylla spp. PeerJ. 8, e8066 (2020).
  3. Ikhwanuddin, M., Bachok, Z., Hilmi, M. G., Azmie, G., Zakaria, M. Z. Species diversity, carapace width-body weight relationship, size distribution and sex ratio of mud crab, genus Scylla from Setiu Wetlands of Terengganu coastal waters, Malaysia. Journal of Sustainability Science and Management. 5 (2), 97-109 (2010).
  4. Ikhwanuddin, M., Bachok, Z., Mohd Faizal, W. W. Y., Azmie, G., Abol-Munafi, A. B. Size of maturity of mud crab Scylla olivacea (Herbst, 1796) from mangrove areas of Terengganu coastal waters. Journal of Sustainability Science and Management. 5 (2), 134-147 (2010).
  5. Waiho, K. et al. On types of sexual maturity in brachyurans, with special reference to size at the onset of sexual maturity. Journal of Shellfish Research. 36 (3), 807-839 (2017).
  6. Mykles, D. L., Chang, E. S. Hormonal control of the crustacean molting gland: Insights from transcriptomics and proteomics. General and Comparative Endocrinology. 294, 113493 (2020).
  7. Fujaya, Y. et al. Is limb autotomy really efficient compared to traditional rearing in soft-shell crab (Scylla olivacea) production? Aquaculture Reports. 18, 100432 (2020).
  8. Waiho, K. et al. Moult induction methods in soft-shell crab production. Aquaculture Research. 52 (9), 4026-4042 (2021).
  9. Rahman, M. R. et al. Evaluation of limb autotomy as a promising strategy to improve production performances of mud crab (Scylla olivacea) in the soft-shell farming system. Aquaculture Research. 51 (6), 2555-2572 (2020).
  10. Okumura, T. et al. Expression of vitellogenin and cortical rod proteins during induced ovarian development by eyestalk ablation in the kuruma prawn, Marsupenaeus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 143 (2), 246-253 (2006).
  11. Pervaiz, P. A., Jhon, S. M., Sikdar-bar, M. Studies on the effect of unilateral eyestalk ablation in maturation of gonads of a freshwater prawn Macrobrachium dayanum. World Journal of Zoology. 6 (2), 159-163 (2011).
  12. Primavera, J. H. Induced maturation and spawning in five-month-old Penaeus monodon Fabricius by eyestalk ablation. Aquaculture. 13 (4), 355-359 (1978).
  13. Shyne Anand, P. S. et al. Reproductive performance of wild brooders of Indian white shrimp, Penaeus indicus: Potential and challenges for selective breeding program. Journal of Coastal Research. 86 (sp1), 65 (2019).
  14. Diarte-Plata, G. et al. Eyestalk ablation procedures to minimize pain in the freshwater prawn Macrobrachium americanum. Applied Animal Behaviour Science. 140 (3-4), 172-178 (2012).
  15. Vargas-Téllez, I. et al. Impact of unilateral eyestalk ablation on Callinectes arcuatus (Ordway, 1863) under laboratory conditions: Behavioral evaluation. Latin American Journal of Aquatic Research. 49 (4), 576-594 (2021).
  16. Chu, K. H., Chow, W. K. Effects of unilateral versus bilateral eyestalk ablation on molting and growth of the shrimp, Penaeus chinensis (Osbeck, 1765) (Decapoda, Penaeidea). Crustaceana. 62 (3), 225-233 (1992).
  17. Taylor, J. Minimizing the effects of stress during eyestalk ablation of Litopenaeus vannamei females with topical anesthetic and a coagulating agent. Aquaculture. 233 (1-4), 173-179 (2004).
  18. Wang, M., Ye, H., Miao, L., Li, X. Role of short neuropeptide F in regulating eyestalk neuroendocrine systems in the mud crab Scylla paramamosain. Aquaculture. 560, 738493 (2022).
  19. Nagaraju, G. P. C. Reproductive regulators in decapod crustaceans: an overview. Journal of Experimental Biology. 214 (1), 3-16 (2011).
  20. Kornthong, N. et al. Characterization of red pigment concentrating hormone (RPCH) in the female mud crab (Scylla olivacea) and the effect of 5-HT on its expression. General and Comparative Endocrinology. 185, 28-36 (2013).
  21. Kornthong, N. et al. Molecular characterization of a vitellogenesis-inhibiting hormone (VIH) in the mud crab (Scylla olivacea) and temporal changes in abundances of VIH mRNA transcripts during ovarian maturation and following neurotransmitter administration. Animal Reproduction Science. 208, 106122 (2019).
  22. Liu, C. et al. VIH from the mud crab is specifically expressed in the eyestalk and potentially regulated by transactivator of Sox9/Oct4/Oct1. General and Comparative Endocrinology. 255, 1-11 (2018).
  23. Chen, H.-Y., Kang, B. J., Sultana, Z., Wilder, M. N. Variation of protein kinase C-α expression in eyestalk removal-activated ovaries in whiteleg shrimp, Litopenaeus vannamei. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 237 (300), 110552 (2019).
  24. Rotllant, G., Nguyen, T. V., Aizen, J., Suwansa-ard, S., Ventura, T. Toward the identification of female gonad-stimulating factors in crustaceans. Hydrobiologia. 825 (1), 91-119 (2018).
  25. Supriya, N. T., Sudha, K., Krishnakumar, V., Anilkumar, G. Molt and reproduction enhancement together with hemolymph ecdysteroid elevation under eyestalk ablation in the female fiddler crab, Uca triangularis (Brachyura: Decapoda). Chinese Journal of Oceanology and Limnology. 35 (3), 645-657 (2017).
  26. Wilder, M. N. Advances in the science of crustacean reproductive physiology and potential applications to new seed production technology. Journal of Coastal Research. 86 (sp1), 6-10 (2019).
  27. Arcos, G. F., Ibarra, A. M., Vazquez-Boucard, C., Palacios, E., Racotta, I. S. Haemolymph metabolic variables in relation to eyestalk ablation and gonad development of Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei Boone. Aquaculture Research. 34 (9), 749-755 (2003).
  28. Desai, U. M., Achuthankutty, C. T. Complete regeneration of ablated eyestalk in penaeid prawn, Penaeus monodon. Current Science. 79 (11), 1602-1603 (2000).
  29. Wu, Q. et al. Growth performance and biochemical composition dynamics of ovary, hepatopancreas and muscle tissues at different ovarian maturation stages of female mud crab, Scylla paramamosain. Aquaculture. 515, 734560 (2020).
  30. Ghazali, A., Azra, M. N., Noordin, N. M., Abol-Munafi, A. B., Ikhwanuddin, M. Ovarian morphological development and fatty acids profile of mud crab (Scylla olivacea) fed with various diets. Aquaculture. 468 (Part 1), 45-52 (2017).
  31. Farhadi, A. et al. The regulatory mechanism of sexual development in decapod crustaceans. Frontiers in Marine Science. 8 (2021).
  32. Sukardi, P., Prayogo, N. A., Harisam, T., Sudaryono, A. Effect of eyestalk-ablation and differences salinity in rearing pond on molting speed of Scylla serrata. AIP Conference Proceedings. 2094, 020029 (2019).
  33. Stella, V. S., López Greco, L. S., Rodríguez, E. M. Effects of eyestalk ablation at different times of the year on molting and reproduction of the estuarine grapsid crab Chasmagnathus granulata (Decapoda, Brachyura). Journal of Crustacean Biology. 20 (2), 239-244 (2000).
  34. Jang, I. K. et al. The effects of manipulating water temperature, photoperiod, and eyestalk ablation on gonad maturation of the swimming crab, Portunus trituberculatus.Crustaceana. 83 (2), 129-141 (2010).
  35. Millamena, O. M., Quinitio, E. The effects of diets on reproductive performance of eyestalk ablated and intact mud crab Scylla serrata. Aquaculture. 181 (1-2), 81-90 (2000).
  36. Zeng, C. Induced out-of-season spawning of the mud crab, Scylla paramamosain (Estampador) and effects of temperature on embryo development. Aquaculture Research. 38 (14), 1478-1485 (2007).
  37. Rana, S. Eye stalk ablation of freshwater crab, Barytelphusa lugubris: An alternative approach of hormonal induced breeding. International Journal of Pure and Applied Zoology. 6 (3), 30-34 (2018).
  38. Yi, S.-K., Lee, S.-G., Lee, J.-M. Preliminary study of seed production of the Micronesian mud crab Scylla serrata (Crustacea: Portunidae) in Korea. Ocean and Polar Research. 31 (3), 257-264 (2009).
  39. Azra, M. N., Abol-Munafi, A. B., Ikhwanuddin, M. A review of broodstock improvement to brachyuran crab: Reproductive performance. International Journal of Aquaculture. 5 (38), 1-10 (2016).
  40.  Archibald, K. E., Scott, G. N., Bailey, K. M., Harms, C. A. 2-phenoxyethanol (2-PE) and tricaine methanesulfonate (MS-222) immersion anesthesia of American horseshoe crabs (Limulus polyphemus). Journal of Zoo and Wildlife Medicine. 50 (1), 96-106 (2019).
  41. Muhd-Farouk, H., Abol-Munafi, A. B., Jasmani, S., Ikhwanuddin, M. Effect of steroid hormones 17α-hydroxyprogesterone and 17α-hydroxypregnenolone on ovary external morphology of orange mud crab, Scylla olivacea. Asian Journal of Cell Biology. 9 (1), 23-28 (2013).
  42. Muhd-Farouk, H., Jasmani, S., Ikhwanuddin, M. Effect of vertebrate steroid hormones on the ovarian maturation stages of orange mud crab, Scylla olivacea (Herbst, 1796). Aquaculture. 451, 78-86 (2016).
  43. Ghazali, A., Mat Noordin, N., Abol-Munafi, A. B., Azra, M. N., Ikhwanuddin, M. Ovarian maturation stages of wild and captive mud crab, Scylla olivacea fed with two diets. Sains Malaysiana. 46 (12), 2273-2280 (2017).
  44. Aaqillah-Amr, M. A., Hidir, A., Noordiyana, M. N., Ikhwanuddin, M. Morphological, biochemical and histological analysis of mud crab ovary and hepatopancreas at different stages of development. Animal Reproduction Science. 195, 274-283 (2018).
  45. Amin-Safwan, A., Muhd-Farouk, H., Mardhiyyah, M. P., Nadirah, M., Ikhwanuddin, M. Does water salinity affect the level of 17β-estradiol and ovarian physiology of orange mud crab, Scylla olivacea (Herbst, 1796) in captivity? Journal of King Saud University - Science. 31 (4), 827-835 (2019).
  46. Wu, X. et al. Effect of dietary supplementation of phospholipids and highly unsaturated fatty acids on reproductive performance and offspring quality of Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis (H. Milne-Edwards), female broodstock. Aquaculture. 273 (4), 602-613 (2007).
  47. Azra, M. N., Ikhwanuddin, M. A review of maturation diets for mud crab genus Scylla broodstock: Present research, problems and future perspective. Saudi Journal of Biological Sciences. 23 (2), 257-267 (2016).
  48. Maschio Rodrigues, M., López Greco, L. S., de Almeida, L. C. F., Bertini, G. Reproductive performance of Macrobrachium acanthurus (Crustacea, Palaemonidae) females subjected to unilateral eyestalk ablation. Acta Zoologica. 103 (3), 326-334 (2022).
  49. Zhang, C. et al. Changes in bud morphology, growth-related genes and nutritional status during cheliped regeneration in the Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis. PLoS One. 13 (12), e0209617 (2018).
  50. Zhang, C. et al. Hemolymph transcriptome analysis of Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) with intact, left cheliped autotomy and bilateral eyestalk ablation. Fish & Shellfish Immunology. 81, 266-275 (2018).
  51. Diarte-Plata, G., Sainz-Hernandez, J. C., Aguiñaga-Cruz, J. A., Fierro-Coronado, J. A., Polanco-Torres, A., Puente-Palazuelos, C. Eyestalk ablation procedures to minimize pain in the freshwater prawn Macrobrachium americanum. Applied Animal Behaviour Science. 140 (3-4), 172-178 (2012). 
  52. Mirera, D. O., Moksnes, P. O. Comparative performance of wild juvenile mud crab (Scylla serrata) in different culture systems in East Africa: Effect of shelter, crab size and stocking density. Aquaculture International. 23 (1), 155-173 (2015).
  53. Ut, V. N., Le Vay, L., Nghia, T. T., Hong Hanh, T. T. Development of nursery cultures for the mud crab Scylla paramamosain (Estampador). Aquaculture Research. 38 (14), 1563-1568 (2007).
  54. Fazhan, H. et al. Limb loss and feeding ability in the juvenile mud crab Scylla olivacea: Implications of limb autotomy for aquaculture practice. Applied Animal Behaviour Science. 247, 105553 (2022).
Ögonstjälkablation för att öka äggstocksmognaden i lerkrabbor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Asmat-Ullah, M., Rozaimi, R.,… More

Asmat-Ullah, M., Rozaimi, R., Fazhan, H., Shu-Chien, A. C., Wang, Y., Waiho, K. Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs. J. Vis. Exp. (193), e65039, doi:10.3791/65039 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter