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Biology

Ablazione del gambo oculare per aumentare la maturazione ovarica nei granchi del fango

Published: March 31, 2023 doi: 10.3791/65039
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 2,4, 5, 1,2,3
1Higher Institution Centre of Excellence (HICoE), Institute of Tropical Aquaculture and Fisheries, Universiti Malaysia Terengganu, 2Centre for Chemical Biology, Universiti Sains Malaysia, 3Department of Aquaculture, Faculty of Fisheries, Kasetsart University, 4School of Biological Sciences, Universiti Sains Malaysia, 5International Research Center for Marine Biosciences, Ministry of Science and Technology, Shanghai Ocean University

ERRATUM NOTICE

Summary

Due protocolli di ablazione del peduncolo oculare (cioè approcci di cauterizzazione e chirurgia) sono stati eseguiti su granchi femmina anestetizzata. L'ablazione del gambo oculare dei granchi del fango ha accelerato la maturazione delle ovaie senza diminuire il tasso di sopravvivenza.

Abstract

I granchi del fango (Scylla spp.) sono specie di crostacei commercialmente importanti che possono essere trovati in tutta la regione del Pacifico indo-occidentale. Durante la coltura, l'induzione della maturazione ovarica è importante per soddisfare la domanda dei consumatori di granchi di fango maturi e accelerare la produzione di semi. L'ablazione del gambo oculare è uno strumento efficace per migliorare la maturazione ovarica nei granchi del fango. Tuttavia, non esiste un protocollo standard per l'ablazione del gambo oculare dei granchi del fango. In questo studio vengono descritte due tecniche di ablazione del gambo oculare: cauterizzazione (l'uso di metallo caldo per ablare il gambo oculare di un granchio anestetizzato) e chirurgia (la rimozione del gambo oculare usando forbici chirurgiche). Prima dell'ablazione del peduncolo oculare, le femmine sessualmente mature (CW > 86 mm) sono state anestetizzate usando una borsa del ghiaccio (-20 ° C) con acqua di mare. Quando la temperatura dell'acqua ha raggiunto i 4 °C, la borsa del ghiaccio è stata rimossa dall'acqua. L'acqua di mare corrente (temperatura ambiente: 28 °C) è stata utilizzata per il recupero dall'anestesia immediatamente dopo l'ablazione del peduncolo oculare. La mortalità non si è verificata durante o dopo il processo di ablazione del peduncolo oculare. Il protocollo di ablazione del gambo oculare qui presentato ha accelerato la maturazione ovarica dei granchi del fango.

Introduction

Tutte e quattro le specie di granchio del fango appartenenti al genere Scylla sono specie di crostacei commercialmente importanti in acquacoltura 1,2. La crescita dei crostacei, compresi i granchi del fango, e la loro trasformazione dalla fase prematura (sub-adulta o pubertale) alla fase sessualmente matura (adulta) avviene attraverso un processo di muta che comporta lo spargimento periodico di esoscheletri più vecchi e più piccoli. La larghezza del carapace (CW), i chelipedi e le morfologie dei lembo addominale sono ampiamente utilizzati per determinare la maturità sessuale di Scylla spp. 3,4,5. Il processo di muta è regolato dall'azione di vari ormoni e richiede un'enorme quantità di energia6. Oltre al normale processo di muta, la perdita degli arti, volontariamente o indotta da fattori esterni, accelera la muta dei granchi senza influire sul loro tasso di sopravvivenza 7,8,9. Pertanto, l'autotomia degli arti è comunemente usata per l'induzione della muta nell'industria dell'allevamento di granchi di fango a guscio molle 7,9.

L'ablazione unilaterale o bilaterale del gambo oculare è per lo più popolare nei gamberi d'acqua dolce e nei gamberetti marini per la maturazione delle gonadi e la produzione di semi10,11,12,13. Le tecniche comuni di ablazione del gambo oculare nei crostacei includono quanto segue: (i) legatura alla base del gambo oculare usando una corda14,15; ii) cauterizzazione del peduncolo oculare mediante pinze calde o dispositivi di elettrocauterizzazione16; iii) rimozione o pizzicamento diretto del gambo oculare per lasciare una ferita aperta12; e (iv) rimozione del contenuto del gambo oculare attraverso l'incisione dopo aver tagliato la porzione distale dell'occhio con un rasoio17. Gli organi X del gambo oculare sono importanti organi endocrini nei crostacei in quanto regolano gli ormoni iperglicemici dei crostacei (CHH), gli ormoni che inibiscono la muta (MIH) e gli ormoni inibitori della vitellogenesi (VIH)6,18,19,20,21,22. Gli organi X del gambo oculare (o il complesso della ghiandola del seno) sintetizzano e rilasciano ormoni che inibiscono le gonadi (GIH), noti anche come ormoni che inibiscono la vitellogenesi (VIH), appartenenti alla famiglia degli ormoni neuropeptidici6. L'ablazione unilaterale o bilaterale del parlato oculare riduce la sintesi di GIH, determinando la dominanza degli ormoni stimolanti (cioè gli ormoni stimolanti le gonadi, GSH) e l'accelerazione del processo di maturazione ovarica nei crostacei23,24,25,26. Senza l'influenza di GIH dopo l'ablazione del gambo oculare, le femmine di crostaceo dedicano la loro energia allo sviluppo ovarico27. È stato riscontrato che l'ablazione unilaterale del gambo oculare è sufficiente per l'induzione della maturazione ovarica nei crostacei11 e che il gambo oculare ablato di gamberetti e granchi può rigenerarsi dopo diverse mute28. Ci sono quattro stadi di sviluppo ovarico registrati in Scylla spp.: i) immaturo (stadio-1), ii) maturazione precoce (stadio-2), iii) pre-maturazione (stadio-3) e iv) completamente maturo (stadio-4)29,30. Lo stadio ovarico immaturo si trova nelle femmine immature. Dopo la muta puberale e l'accoppiamento, l'ovaio immaturo inizia a svilupparsi e infine matura (stadio-4) prima di deporre leuova 31.

Un protocollo di ablazione del gambo oculare è essenziale per lo sviluppo dei riproduttori di granchi del fango e la produzione di semi. Nel mercato alimentare globale, i granchi di fango maturi con ovaie completamente mature (stadio-4) piuttosto che granchi con un contenuto muscolare più elevato sono preferiti dai consumatori e, quindi, hanno un valore commerciale più elevato, persino superiore ai maschi di grandi dimensioni. Non esiste un protocollo completo per l'ablazione del gambo oculare dei granchi del fango. Il protocollo di ablazione del gambo oculare in questo lavoro riduce al minimo lo stress utilizzando granchi completamente anestetizzati e riduce al minimo le lesioni fisiche al personale da morsi di granchio. Questo protocollo è facile ed economico. Qui presentiamo un protocollo per l'ablazione del peduncolo oculare di Scylla spp. che può indurre la maturazione della gonade. Sono state testate due tecniche di ablazione del peduncolo oculare (cauterizzazione e chirurgia) e le loro efficienze sono state confrontate in base al tasso di sviluppo gonadico delle femmine di granchi del fango.

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Protocol

Questo protocollo segue il Codice di condotta malese per la cura e l'uso di animali per scopi scientifici delineato dalla Laboratory Animal Science Association of Malaysia. Il sacrificio dei campioni sperimentali è stato fatto secondo la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 8023, revised 1978). Granchi del fango femmina sessualmente prematuri (granchio del fango arancione S. olivacea) sono stati raccolti dal mercato locale (5 ° 66 ′ 62 ′ N, 102 ° 72 ′ 33 ′ E) nelle zone umide di Setiu in Malesia. La specie di granchio del fango è stata identificata in base alle caratteristiche morfologiche1.

1. Raccolta e disinfezione dei campioni

  1. Raccogliere granchi del fango femmina sani, attivi e prematuri (Figura 1).
    NOTA: I granchi femmina prematuri hanno lembi addominali triangolari e di colore chiaro insieme a una gamma CW di 80-85 mm.
  2. Lavare i granchi con acqua di rubinetto clorata (acqua dolce) per rimuovere detriti e parassiti osmofili.
  3. Immergere i granchi in 150 ppm di formaldeide con 20 ppt di salinità per 30 min.
  4. Mantenere un'aerazione continua e delicata con airstones durante il trattamento con formaldeide. La fonte di aerazione può provenire da una linea di aerazione centrale o da una pompa di aerazione per acquari.
  5. Lavare i granchi con acqua di mare corrente per rimuovere eventuali residui di formaldeide.

Figure 1
Figura 1: Morfologia addominale delle femmine di granchi del fango utilizzate per identificare le fasi di maturazione sessuale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

2. Acclimatazione

  1. Trasferire ogni femmina disinfettata in un serbatoio circolare separato da 32 litri.
  2. Allevare le femmine per 3 giorni in 20 ppt di salinità e continuare a nutrirsi due volte al giorno (mattina 09:00 e sera 20:00) con pesce marino tritato a circa il 4%-5% del peso corporeo del granchio.
  3. Rimuovere il mangime in eccesso e non consumato sifonando prima della poppata mattutina.
  4. Scambia il 10% dell'acqua di mare che alleva granchi (20 ppt) al giorno.

3. Muta indotta per la maturità sessuale

  1. Tagliare tutte le gambe tranne le gambe da nuoto usando forbici sterilizzate.
    1. Prendi il granchio con una rete a paletta e tieni il granchio con cura. Tagliare prima entrambi i chelipedi e poi le gambe che camminano alla seconda articolazione usando le forbici. Il granchio automatizzerà automaticamente le appendici danneggiate. L'anestesia non è richiesta per l'autotomia degli arti.
  2. Lavare il granchio in acqua dolce subito dopo l'autotomia degli arti.
  3. Trasferire singolarmente i granchi autotomizzati in cesti di plastica perforati (28 cm L x 22 cm L x 7 cm A) e metterli in una vasca in fibra di vetro (305 cm L x 120 cm L x 60 cm A).
    NOTA: Due cestini possono essere legati e agganciati insieme. Il cesto superiore viene utilizzato come copertura in modo che il granchio non possa fuoriuscire dal cesto.
  4. Utilizzare un sistema di acquacoltura a ricircolo (RAS) con salinità di 20 ppt e una profondità dell'acqua di almeno 10 cm per garantire che l'intero cestello di plastica sia immerso.
  5. Continuare a nutrire il granchio femmina autotomizzato con pesce marino tritato due volte al giorno al 5% -7% del peso corporeo del granchio.
  6. Allevare i granchi fino a quando non maturano sessualmente attraverso la muta (35 giorni).
    NOTA: La muta indotta può essere saltata per la maturazione ovarica commerciale e la produzione di semi con granchi del fango femmina maturi selvatici. Le femmine mature raccolte in natura devono essere acclimatate e sottoposte direttamente all'anestesia da shock freddo e alla successiva ablazione del gambo oculare.

4. Anestesia

  1. Seleziona femmine sessualmente mature con un lembo addominale di forma ovale di colore scuro con un CW >86 mm (Figura 1).
  2. Prendi i granchi con una rete a paletta e tienili individualmente in piccoli acquari per l'anestesia.
  3. Dopo 5 minuti di periodo di acclimatazione, aggiungere 2-fenossietanolo (2-PE) a 2 ml / L in ciascun acquario e consentire 15 minuti di trattamento anestesiologico.
  4. Assicurati che i granchi siano completamente anestetizzati dalla mancanza di movimento spontaneo.

5. Ablazione del gambo oculare

  1. Tecnica di cauterizzazione
    1. Eseguire tutte le procedure sopra un tavolo e in un'area aperta.
    2. Prendi un'asta di metallo nichel-acciaio a testa piatta (ad esempio, un cacciavite) con un manico di legno o plastica e copri il manico con un asciugamano di cotone bagnato.
    3. Sterilizzare due pinze chirurgiche in acciaio inossidabile in autoclave.
    4. Preparare il 70% di etanolo in un flacone spray e tenerlo lontano da qualsiasi fonte legata al fuoco, come la fiamma ossidrica e il cacciavite rovente. Avere carta velina pronta per l'uso.
      NOTA: L'etanolo è altamente infiammabile. Mantenere una distanza di sicurezza dalle fonti di fuoco.
    5. Collegare saldamente una fiamma ossidrica a una bombola di gas (butano).
      ATTENZIONE: Seguire le istruzioni riportate sulla fiamma ossidrica e sulla bombola del gas. Assicurarsi che la fiamma ossidrica sia spenta quando si collega con la bombola del gas. Leggere e seguire tutte le precauzioni di sicurezza antincendio menzionate sulla bombola del gas.
    6. Indossare guanti di cotone spessi per evitare lesioni da oggetti caldi.
    7. Sottoporre la punta dell'asta metallica al fuoco della fiamma ossidrica fino a quando l'asta metallica è rosso vivo.
    8. Coprire il granchio anestetizzato con un asciugamano di cotone bagnato.
      NOTA: Coprire le antenne del granchio per evitare danni inutili.
    9. Tieni un occhio del granchio con una pinza sterilizzata.
      NOTA: Sterilizzare la pinza in autoclave per il primo utilizzo e disinfettare utilizzando etanolo al 70% per l'uso successivo su altri granchi.
    10. Tenere la punta piatta di metallo rovente sull'occhio del granchio e premere leggermente per circa 10-15 s fino a quando il gambo oculare diventa di colore arancione o rosso-arancio. Fare attenzione quando si esegue questo passaggio per evitare danni alle strutture adiacenti.
      NOTA: Sono necessarie due persone per eseguire l'ablazione del gambo oculare seguendo il metodo di cauterizzazione: una per tenere il granchio e un'altra per eseguire la procedura di ablazione.
    11. Disinfettare la pinza con spray etanolo al 70% per garantire che non vi sia contaminazione incrociata tra i granchi.
      NOTA: eseguire questo passaggio solo attendendo almeno 5 minuti dopo la procedura di ablazione del peduncolo oculare per assicurarsi che le pinze siano raffreddate prima della disinfezione utilizzando etanolo al 70% per prevenire potenziali rischi di incendio.
    12. Dopo aver eseguito l'ablazione del gambo oculare su tutti i granchi, immergere l'asta metallica calda in acciaio nichelato (cacciavite) nell'acqua del rubinetto.
    13. Disinfettare l'asciugamano prima del riutilizzo. È possibile utilizzare più asciugamani per risparmiare tempo.
      NOTA: Lavare l'asciugamano con acqua del rubinetto e immergerlo in 30 ppm di acqua clorata per 5 minuti. Quindi, lavare nuovamente l'asciugamano con acqua di rubinetto e immergerlo in una soluzione di tiosolfato di sodio da 1 g / L.
    14. Tenere la fiamma ossidrica in un luogo sicuro dopo averla spenta e attendere che ritorni alla temperatura ambientale (circa 30 minuti) prima di scollegarla.
  2. Tecnica chirurgica
    1. Eseguire la procedura in un'area ben ventilata.
    2. Sterilizzare due forbici chirurgiche e pinze in autoclave.
    3. Versare 50 ml di etanolo al 70% in un becher di vetro da 100 ml.
    4. Indossare guanti di cotone spessi.
    5. Tenere il granchio anestetizzato e coprirlo con un asciugamano di cotone bagnato.
    6. Tieni un occhio del granchio con una pinza sterilizzata.
    7. Tagliare rapidamente il gambo oculare usando forbici chirurgiche sterilizzate.
      NOTA: L'emolinfa può essere persa dalla parte ferita del granchio.
    8. Immergere le forbici e le pinze in etanolo al 70% dopo ogni utilizzo e asciugarle con carta velina prima di riutilizzarle.

6. Cura post-anestesia

  1. Preparare 20 ppt di acqua di mare filtrata e conservare in un serbatoio sopraelevato con aerazione continua.
  2. Collegare un tubo flessibile con il serbatoio aereo per il flusso d'acqua gravitazionale.
  3. Subito dopo l'ablazione del gambo oculare, posizionare il granchio nel cestello e sottoporlo all'acqua di mare corrente (temperatura dell'acqua ambiente: 28 °C) dalla vasca sopraelevata.
  4. Mantenere l'acqua di mare che scorre e monitorare il granchio fino a quando non può muoversi spontaneamente, il che indica il recupero dall'anestesia.
    NOTA: l'acqua di mare può essere preparata in un serbatoio di terra e una pompa dell'acqua sommergibile può essere utilizzata per il flusso d'acqua.
  5. Tenere i granchi singolarmente in 20 ppt di acqua di mare con aerazione in un acquario per 30 minuti per ulteriori osservazioni.
    NOTA: I granchi recuperati saranno coltivati individualmente nel successivo processo di coltura dei riproduttori.

7. Osservazione della maturazione ovarica

  1. Allevamento di riproduttori
    1. Trasferire i granchi maturi in singole vasche circolari da 32 litri.
    2. Continuare a nutrirsi con pesce marino tritato (congelato a -20 °C) due volte al giorno (mattina 09:00 e sera 20:00) e rimuovere il mangime non consumato prima della poppata mattutina.
    3. Allevare i riproduttori singolarmente per 30 giorni con una salinità di 20 ppt.
    4. Rimuovere le feci e scambiare il 10% dell'acqua di mare (20 ppt) al giorno.
  2. Dissezione
    1. Pulire un vassoio da dissezione, forbici e pinze con etanolo al 70%.
    2. Anestetizzare le femmine individualmente con il metodo di anestesia ad immersione 2-PE.
    3. Seleziona casualmente le femmine appena mature (dopo la muta delle femmine premature) che non hanno subito l'ablazione oculare per confermare i loro stadi gonadici.
    4. Sacrificare individualmente tutte le femmine sperimentali ablate dagli occhi e identificare gli stadi di maturazione delle gonadi. Distruggi i gangli toracici del granchio usando un punteruolo sterile affilato. Rimuovere prima il carapace superiore e poi l'epatopancreas per rendere visibile l'ovaio. Osservare il colore dell'ovaio e identificare lo stadio di maturazione ovarica (Figura 2).
  3. Identificazione delle fasi di maturazione ovarica
    1. Osservare il colore dell'ovaio ad occhio nudo o sotto uno stereomicroscopio.
    2. Identificare le fasi di maturazione ovarica in base alla colorazione30: l'immaturo (stadio-1) mostra un colore bianco traslucido o crema; la maturazione precoce (stadio-2) mostra un colore da pallido a giallastro chiaro; iii) la prestagionatura (fase 3) presenta un colore da giallo ad arancio chiaro; e (iv) il completamente maturo (stadio-4) mostra un colore da arancione scuro a rossastro.

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Representative Results

Maturazione delle gonadi
Tessuti ovarici bianco crema (ovaie immature, stadio 1) sono stati trovati nel 100% delle femmine sezionate (n = 6) prima di eseguire l'ablazione del gambo oculare (Figura 2). Il tasso di maturazione delle gonadi dei granchi femmina ablati con gambo oculare (n = 63; 31 femmine con la tecnica di cauterizzazione e 32 femmine con la tecnica chirurgica) era più alto rispetto ai granchi femmina che non sono stati sottoposti ad ablazione del gambo oculare (n = 31) dopo 30 giorni di allevamento individuale (Figura 3). Le percentuali più alte di ovaie pre-maturazione (stadio 3) sono state trovate nei granchi femmina ablati negli occhi (Figura 3; sia tecniche di cauterizzazione che chirurgia), e un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) ha mostrato differenze significative (p < 0,05) tra gli stadi di maturazione ovarica delle femmine sperimentali (Tabella 1). Il gruppo di controllo aveva una maggiore prevalenza di granchi femmina immaturi rispetto ai gruppi di trattamento di cauterizzazione e chirurgia (test HSD di Tukey, p < 0,001). I trattamenti di cauterizzazione e chirurgia non hanno mostrato differenze significative in termini di percentuale di granchi femmina in tutte le fasi di maturazione (test HSD di Tukey, tutti p > 0,1). Entrambi i trattamenti di cauterizzazione (test HSD di Tukey , p = 0,004) e chirurgici (test HSD di Tukey, p = 0,006) avevano percentuali significativamente più elevate di granchi femmina di stadio 3 pre-maturazione rispetto al trattamento di controllo, e solo i trattamenti di cauterizzazione e chirurgia sono stati in grado di produrre granchi femmina di stadio 4 da uno stadio immaturo entro 30 giorni dal trattamento (Tabella 2).

Figure 2
Figura 2: Quattro fasi di maturazione ovarica delle femmine di granchi del fango. Le differenze nella colorazione e nel volume delle ovaie tra le fasi sono chiaramente evidenziate dalle frecce nere. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Fasi di maturazione ovarica delle femmine di granchio sottoposte ad ablazione del peduncolo oculare (chirurgia e cauterizzazione) e controllo dopo il periodo di allevamento di 30 giorni (n = 94). La barra di errore rappresenta la deviazione standard. Le lettere in apice indicano differenze significative tra i trattamenti in ogni fase di maturazione a p < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Fase di maturazione Somma dei quadrati Df Quadrato medio F P
Immaturo (fase-1) Tra gruppi 3755.556 2 1877.778 169 <0,001
All'interno dei gruppi 66.667 6 11.111
Totale 3822.222 8
Maturazione precoce (stadio-2) Tra gruppi 1355.556 2 677.778 8.714 0.017
All'interno dei gruppi 466.667 6 77.778
Totale 1822.222 8
Pre-stagionatura (fase 3) Tra gruppi 4688.889 2 2344.444 17.58 0.003
All'interno dei gruppi 800 6 133.333
Totale 5488.889 8
Completamente maturato (stadio-4) Tra gruppi 822.222 2 411.111 9.25 0.015
All'interno dei gruppi 266.667 6 44.444
Totale 1088.889 8
Nota: la differenza media è significativa a livello p = 0,05.

Tabella 1: Confronto tra gli stadi di maturazione gonadica dei granchi femmina di controllo (cauterizzazione e chirurgia) e quelli di controllo dei granchi femmina a seguito di un test ANOVA unidirezionale. La differenza media era significativa a p = 0,05.

Fase di maturazione Trattamento Trattamento comparativo P
Immaturo (fase-1) Cauterizzazione Chirurgia 1
Cauterizzazione Controllo <0,001
Chirurgia Controllo <0,001
Maturazione precoce (stadio-2) Cauterizzazione Chirurgia 0.129
Cauterizzazione Controllo 0.014
Chirurgia Controllo 0.232
Pre-stagionatura (fase 3) Cauterizzazione Chirurgia 0.934
Cauterizzazione Controllo 0.004
Chirurgia Controllo 0.006
Completamente maturato (stadio-4) Cauterizzazione Chirurgia 0.109
Cauterizzazione Controllo 0.012
Chirurgia Controllo 0.237
Nota: la differenza media è significativa a livello p = 0,05.

Tabella 2: Test post-hoc di Tukey HSD delle differenze tra gli stadi di maturazione gonadica dei granchi femmina di controllo (cauterizzazione e chirurgia) e controllo delle femmine. La differenza media era significativa a p = 0,05.

Tasso di sopravvivenza
Il tasso medio di sopravvivenza dei granchi femmina ablati con il peduncolo oculare è stato del 95,45% ± del 4,98% (deviazione media ± standard) nel periodo di allevamento di 30 giorni. Nessuna mortalità si è verificata entro i primi 7 giorni dopo l'ablazione e la manipolazione del peduncolo oculare. Durante il periodo di allevamento di 30 giorni dopo l'ablazione del peduncolo oculare, il tasso di mortalità non era significativamente diverso (test di Kruskal-Wallis, p = 0,67) tra i trattamenti. Il tasso di successo della muta dei granchi femmina autotomizzati degli arti era dell'80% ± del 2,86% (n = 115).

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Discussion

Questo protocollo è stato sviluppato per l'ablazione del peduncolo oculare del granchio del fango, Scylla spp., e può essere applicato come metodo efficace per indurre la maturazione delle gonadi. Questo protocollo può essere facilmente replicato per la maturazione ovarica commerciale dei granchi del fango e può essere implementato per ridurre il periodo di latenza (tempo da una deposizione all'altra) nella produzione di semi di granchio del fango.

L'ablazione del gambo oculare dei crostacei (cioè gamberi d'acqua dolce, gamberetti marini) è tipicamente fatta per indurre la maturazione delle gonadi e la deposizione delle uova fuori stagione11,12,13. L'ablazione del gambo oculare nei granchi brachiuri è stata effettuata anche per studiare la muta 25,32,33, la regolazione ormonale 18, la maturazione delle gonadi34 e la riproduzione indotta e le prestazioni riproduttive35,36,37,38,39. L'anestesia per immersione nel 2-fenossietanolo è stata utilizzata in quanto è paragonabile all'uso di tricaina metansolfonato (MS-222) negli arthopodi, ma più economica e non richiede l'uso di tampone aggiuntivo40. L'ablazione unilaterale o bilaterale del gambo oculare influenza la fisiologia del crostaceo. L'ablazione del peduncolo oculare seguendo il protocollo indicato in questo studio influenza anche il tasso di maturazione ovarica dei granchi del fango. Nel trattamento di controllo (senza ablazione del peduncolo oculare), il 43,33% ± il 5,77% dei granchi femmina avevano un'ovaia immatura (stadio 1). Tuttavia, nello stesso periodo di allevamento (30 giorni), i granchi femmina ablati con gli occhi avevano ovaie pre-mature (stadio 3; 56,67% ± 11,55% e 53,33% ± 15,28% con le tecniche di cauterizzazione e chirurgia, rispettivamente), il che dimostra che l'ablazione del gambo oculare può aumentare la maturazione delle gonadi dei granchi del fango. Studi precedenti hanno anche riportato che lo sviluppo ovarico dei granchi intatti (senza ablazione del peduncolo oculare) è più lento di quello dei granchi ablati con gli occhi 25,31. A causa dello sviluppo gonadico più lento nei crostacei intatti, l'ablazione del gambo oculare è ampiamente eseguita negli incubatoi commerciali di gamberi e gamberetti. In questo protocollo, i granchi femmina ablati con gambo oculare hanno raggiunto percentuali più elevate di maturazione ovarica rispetto ai granchi femmina senza il trattamento di ablazione del gambo oculare (Figura 3).

La maturazione delle gonadi del granchio del fango è regolata dagli ormoni21,41,42. Il gambo oculare contiene importanti ghiandole endocrine (cioè il complesso X-organo-seno ghiandola) che svolgono un ruolo vitale nel processo di maturazione gonadica dei granchi del fango18,21. L'ablazione unilaterale del peduncolo oculare, sia per cauterizzazione che per chirurgia, danneggia una delle principali ghiandole endocrine coinvolte nella sintesi e nel rilascio di ormoni inibitori (ad esempio, VIH), risultando così in un livello più elevato di ormoni stimolanti le gonadi (cioè VSH).

Le fasi di maturazione ovarica di Scylla spp. possono essere differenziate osservando la colorazione del tessuto ovarico ad occhio nudo 29,30,43. I tessuti ovarici bianchi traslucidi o cremosi sono indicazioni di ovaie immature 29,30,43,44. In questo studio, le ovaie immature (stadio-1) sono state ancora trovate nel gruppo di granchi femmina senza ablazione del peduncolo oculare a causa del processo di maturazione ovarica più lento. Tuttavia, i granchi nei gruppi ablati con gli occhi (sia con le tecniche di cauterizzazione che chirurgia) mostravano per lo più ovaie pre-mature (stadio 3), con alcuni individui che mostravano ovaie completamente mature (stadio 4). Pertanto, il protocollo di ablazione del gambo oculare qui descritto può essere utilizzato per aumentare la maturazione ovarica nei granchi del fango femmina. Questo protocollo può anche essere applicato direttamente alle femmine di granchio del fango mature raccolte in natura per accelerare la produzione di semi. Per valutare l'efficacia dei metodi di cauterizzazione e chirurgia sulla maturazione delle gonadi del granchio del fango e per garantire la stima accurata della durata della muta, sono stati utilizzati granchi sessualmente prematuri. Dopo la muta (indotta) di granchi femmina sessualmente prematuri, abbiamo notato che le loro ovaie erano ancora nelle fasi di sviluppo immature o precoci29,45. Dopo 30 giorni di allevamento dei granchi femmina appena maturi (ablati con gli occhi o senza ablazione del peduncolo oculare), le fasi di sviluppo ovarico (dallo stadio 1 allo stadio 4) sono state determinate dal colore dei tessuti ovarici. Questo protocollo incoraggia l'uso della tecnica di cauterizzazione per eseguire l'ablazione del gambo oculare nei granchi del fango per evitare qualsiasi perdita di emolinfa e prevenire l'infezione nei siti ablati. La cauterizzazione sigilla immediatamente la ferita, mentre la tecnica chirurgica richiede tempo per la guarigione della ferita e questo consentirebbe la possibilità di infezione. Per scopi commerciali, i granchi maturi più grandi, preferibilmente in una fase successiva della maturazione ovarica, dovrebbero essere selezionati per l'ablazione del peduncolo oculare per ridurre il tempo necessario per raggiungere lo stadio ovarico completamente maturo per il successivo commercio o coltura di covate. Oltre all'ablazione del gambo oculare, l'allevamento individuale con substrato di sabbia e un'alimentazione sufficiente, preferibilmente con mangimi vivi, possono aumentare il tasso di maturazione delle gonadi dei granchi del fango in cattività 30,35,46,47.

Il sangue dei crostacei è chiamato emolinfa e può essere perso durante l'ablazione del gambo oculare. Un'eccessiva perdita di emolinfa può portare alla morte dei granchi ablati nel gambo oculare, specialmente quando si esegue un intervento chirurgico per rimuovere il gambo oculare. L'emolinfa può coagulare nella parte ferita per prevenire la perdita. Tuttavia, rispetto alla tecnica chirurgica, la tecnica di cauterizzazione sigilla immediatamente la parte ferita, prevenendo così la perdita di emolinfa e possibili infezioni.

La mortalità del granchio del fango dopo ablazione unilaterale del gambo oculare con cauterizzazione o chirurgia non è stata trovata entro i primi 7 giorni. Pertanto, l'ablazione del gambo oculare può essere eseguita con un tasso di sopravvivenza più elevato. L'ablazione unilaterale del gambo oculare non ostacola il tasso di sopravvivenza del granchio33.

Lo stress durante la manipolazione del granchio e l'ablazione del peduncolo oculare possono contribuire alla mortalità del granchio. È necessaria una corretta anestesia per ridurre al minimo lo stress da manipolazione durante l'ablazione del diamante degli occhi. Nell'ablazione del gambo oculare dei crostacei, gli anestetici chimici (cioè xilocaina, lidocaina) vengono utilizzati alla base del gambo oculare prima dell'ablazione del gambo oculare14,15,17,48. Tuttavia, a causa della natura aggressiva e delle grandi dimensioni dei granchi del fango, l'uso dell'anestesia solo alla base del gambo oculare non è sufficiente e potrebbe causare ulteriore stress agli animali durante l'iniezione. D'altra parte, l'anestesia sottoponendoli a una temperatura dell'acqua più bassa è più economica e più sicura. L'uso di acqua fredda per l'anestesia nei granchi del fango è comune ed è stato utilizzato in altri studi grazie alla sua efficienza, semplicità e impatto minimo sul recupero e sulla sopravvivenza 37,49,50. Inoltre, si raccomanda una ricerca futura sulla valutazione del dolore dopo l'ablazione del peduncolo oculare sui granchi del fango per evidenziare il cambiamento nei comportamenti associati al dolore e allo stress, come evidente nel gambero d'acqua dolce Macrobrachium americanum51.

Sebbene l'ablazione del gambo oculare utilizzando sia la cauterizzazione che i metodi chirurgici abbia un effetto minimo sulla sopravvivenza del granchio e migliori la maturazione ovarica, l'esecuzione dell'ablazione del gambo oculare richiede una padronanza professionale delle tecniche. La tempistica tra i passaggi è fondamentale in quanto qualsiasi ritardo tra i protocolli aggiunge ulteriore stress per i granchi. A differenza della tecnica chirurgica, la tecnica di cauterizzazione è pericolosa perché comporta l'uso di attrezzature infiammabili (ad esempio, una fiamma ossidrica e gas butano). Pertanto, è necessaria particolare cautela quando si esegue la tecnica di cauterizzazione.

I granchi sono di natura cannibale e sono noti per predare altri che hanno appena completato la loro muta e sono ancora nelle loro condizioni di guscio molle 7,52,53. Pertanto, allevare i granchi individualmente può evitare una mortalità inutile dovuta al cannibalismo. L'uso dell'allevamento individuale nella coltura del granchio del fango è comunemente praticato, sia nella coltura ad alta densità che nella coltura di stagno, per scopi di ingrasso e di allevamento di granchi dal guscio molle 8,53. Questo protocollo utilizzava anche l'allevamento e la manutenzione individuali. Durante il trasporto dei granchi per l'allevamento o il commercio, i chelipedi di granchio sono legati saldamente (o addirittura autotomizzati) per prevenire combattimenti, lesioni inutili e perdita degli arti34.

Il protocollo descritto per l'ablazione del peduncolo oculare deve essere eseguito con più persone. Dopo aver completato l'ablazione del gambo oculare, le attrezzature non usa e getta (ad esempio, l'acquario, il vassoio, l'asciugamano, ecc.) devono essere disinfettate con 30 ppm di cloro. I granchi devono essere monitorati almeno due volte al giorno. Eventuali granchi morti, mangime non consumato, arti ablati o gusci di granchio mutati devono essere smaltiti rapidamente (cioè sepolti nel terreno con polvere sbiancante) per prevenire qualsiasi potenziale diffusione della malattia.

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Disclosures

Nessuno degli autori ha conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto dal Ministero della Pubblica Istruzione, Malesia, nell'ambito del programma Higher Institution Centre of Excellence (HICoE), Malesia, accreditato presso l'Istituto di acquacoltura tropicale e pesca, Universiti Malaysia Terengganu (Vot No. 63933 & Vot No. 56048). Riconosciamo il sostegno di Universiti Malaysia Terengganu e Sayap Jaya Sdn. Bhd. attraverso il Private Partnership Research Grant (Vot. No. 55377). Viene inoltre riconosciuta una posizione di Academic Fellow aggiunto da Universiti Sains Malaysia a Khor Waiho e Hanafiah Fazhan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aeration tube  Ming Yu Three N/A aquarium and pet shop
Airstone Ming Yu Three N/A aquarium and pet shop
Autoclave machine HIRAYAMA MANUFACTURING CORPORATION N/A MADE IN JAPAN
Bleaching powder (Hi-Chlon 70%) Nippon Soda Co.Ltd,Japan N/A N/A
Blow torch  MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Circular tank (32L) BEST PLASTIC INDUSTRY SDN. BHD.  N/A N/A
Cotton hand gloves (thick)  MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Cotton towel MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Digital thermometer Hanna Instrument HI9814 Hanna Instruments GroLine Hydroponics Waterproof pH / EC / TDS / Temp. Portable Meter HI9814
Digital Vernier Caliper INSIZE Co., Ltd. N/A
Dissecting tray Hatcheri AKUATROP  N/A Research Center of Universiti Malaysia Terengganu
Dropper bottle/Plastic Pipettes Dropper Shopee Malaysia N/A N/A
Ethanol 70% Thermo Scientific Chemicals 033361.M1 Diluted to 70% using double distilled water
Fiberglass tank (1 ton) Hatcheri AKUATROP  N/A Research Center of Universiti Malaysia Terengganu
Fine sand N/A N/A collected from Sea beach of Universiti Malaysia Terengganu
First Aid Kits Watsons Malaysia N/A N/A
Flat head nickel steel metal rod (Screw driver) MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Formaldehyde Thermo Scientific Chemicals 119690010
Gas cylinder (butane gas) for blow  torch MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Gas lighter gun (long head) MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Glass beaker (100 mL)) Corning Life Sciences 1000-100
Ice bag  Watsons Malaysia N/A N/A
Perforated plastic baskets  Eco-Shop Marketing Sdn. Bhd. N/A N/A
PVC pipe 15mm Bina Plastic Industries Sdn Bhd (HQ) N/A N/A
Refractometer ATAGO CO.,LTD.
Refrigerator Sharp Corporation Japan N/A Chest Freezer SHARP 110L - SJC 118
Scoop net MR D.I.Y. Group Berhad N/A
Seawater Hatcheri AKUATROP  N/A Research Center of Universiti Malaysia Terengganu
Siphoning pipe MR D.I.Y. Group Berhad N/A N/A
Spray bottle Mr. DIY Sdn Bhd N/A N/A
Stainless surgical forceps  N/A N/A N/A
Stainless surgical scissors  N/A N/A N/A
Submersible water pump  AS N/A model: Astro 4000
Tincture of iodine solution  (Povidone Iodine) Farmasi Fajr Sdn Bhd N/A N/A
Tissue paper  N/A N/A
Transparent plastic aquarium Ming Yu Three N/A aquarium and pet shop
Waterproof table Hatcheri AKUATROP  N/A Research Center of Universiti Malaysia Terengganu

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Questo mese in JoVE Numero 193 Scilla olivacea anestesia da shock freddo cauterizzazione sviluppo gonadico allevamento indotto

Erratum

Formal Correction: Erratum: Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs
Posted by JoVE Editors on 05/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs. The Introduction, Protocol, Discussion and References were updated.

The forth sentence in the third paragraph of the Introduction has been updated from:

The eyestalk ablation protocol in this work minimizes stress by using fully sedated crabs and minimizes physical injury to personnel from crab bites. 

to:

The eyestalk ablation protocol in this work minimizes stress by using fully anesthetized crabs and minimizes physical injury to personnel from crab bites. 

The start of the Protocol has been updated from:

This protocol follows the Malaysian Code of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes outlined by the Laboratory Animal Science Association of Malaysia. The sacrifice of the experimental samples was done according to the National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 8023, revised 1978). Sexually pre-mature female mud crabs (orange mud crab S. olivacea) were collected from the local market (5°66′62′′N, 102°72′33′′E) at the Setiu Wetlands in Malaysia. The mud crab species was identified based on morphological characteristics1.

to:

This protocol follows the Malaysian Code of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes outlined by the Laboratory Animal Science Association of Malaysia and was approved by the Universiti Malaysia Terengganu's Research Ethics Committee (Animal ethics approval number: UMT/JKEPHMK/2023/96). The sacrifice of the experimental samples was done according to the AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Sexually pre-mature female mud crabs (orange mud crab Scylla olivacea) were collected from the local market (5°66′62′′N, 102°72′33′′E) at the Setiu Wetlands in Malaysia. The mud crab species was identified based on morphological characteristics1.

Section 4 of the Protocol has been updated from:

4. Cold-shock anesthesia

  1. Select sexually mature females with a dark-colored oval-shaped abdominal flap with a CW >86 mm (Figure 1).
  2. Catch the crabs with a scoop net, and keep them individually in small aquariums for cold shock anesthesia.
  3. Prepare 2 L of 4 °C to 1 °C seawater (20 ppt) in a transparent plastic aquarium. Maintain the temperature using (−20 °C) ice bags for cold shock anesthesia.
    NOTE: Check the temperature with a digital thermometer.
  4. Immerse the crab in the 4 °C seawater until sedated (about 3−5 min).
  5. Ensure the crabs are fully anesthetized by the lack of spontaneous movement. The legs and chelipeds joints will still show minor movements when touched with forceps.

to:

4. Anesthesia

  1. Select sexually mature females with a dark-colored oval-shaped abdominal flap with a CW >86 mm (Figure 1).
  2. Catch the crabs with a scoop net, and keep them individually in small aquariums for anesthesia.
  3. After 5 min of acclimatization period, add 2-phenoxyethanol (2-PE) at 2 mL/L into each aquarium and allow 15 min of anesthesia treatment.
  4. Ensure the crabs are fully anesthetized by the lack of spontaneous movement.

Section 5 of the Protocol has been updated from:

5. Eyestalk ablation

  1. Cauterization technique
    1. Perform all procedures on top of a table and in an open area.
    2. Take a flat head nickel-steel metal rod (e.g., a screwdriver) with a wooden or plastic handle, and cover the handle with a wet cotton towel.
    3. Sterilize two stainless surgical forceps in an autoclave.
    4. Prepare 70% ethanol in a spray bottle. Have tissue paper ready for use.
      NOTE: Ethanol is highly flammable. Maintain a safe distance from fire sources.
    5. Connect a blowtorch to a gas cylinder (butane) securely.
      CAUTION: Follow the instructions on the blowtorch and gas cylinder. Make sure that the blowtorch is switched off when connecting with the gas cylinder. Read and follow all the fire safety precautions mentioned on the gas cylinder.
    6. Wear thick cotton gloves to avoid injury from hot objects.
    7. Subject the tip of the metal rod to the fire of the blowtorch until the metal rod is bright red.
    8. Cover the anesthetized (sedated) crab with a wet cotton towel.
      NOTE: Cover all the tentacles of the crab to avoid unnecessary damage.
    9. Hold one eye of the crab with sterilized forceps.
      NOTE: Sterilize the forceps in an autoclave for first-time use, and disinfect using 70% ethanol for subsequent use on other crabs.
    10. Hold the red-hot metal flat tip onto the eye of the crab and press slightly for about 10−15 s until the eyestalk turns an orange or reddish-orange color.
      NOTE: Two people are needed to execute eyestalk ablation following the cauterization method: one to hold the crab and another to perform the ablation procedure.
    11. Disinfect the forceps with 70% ethanol spray to ensure no cross-contamination between crabs.
    12. After performing the eyestalk ablation on all crabs, dip the hot nickel steel metal rod (screwdriver) into tap water.
    13. Disinfect the towel before reuse. Multiple towels can be used to save time.
      NOTE: Wash the towel with tap water, and dip it into 30 ppm chlorinated water for 5 min. Then, wash the towel with tap water again, and dip it in a 1 g/L sodium thiosulphate solution.
    14. Keep the blowtorch in a safe place after turning it off, and wait until it returns to environmental temperature (about 30 min) before disconnecting.
  2. Surgery technique
    1. Perform the procedure in a well-ventilated area.
    2. Sterilize two surgical scissors and forceps in an autoclave.
    3. Pour 50 mL of 70% ethanol into a 100 mL glass beaker.
    4. Prepare the tincture of iodine solution in a dropper bottle.
      NOTE: Tincture of iodine (iodine tincture or weak iodine solution) is made up of 2%-7% elemental iodine and potassium iodide, or sodium iodide, dissolved in ethanol and water.
    5. Wear thick cotton gloves.
    6. Hold the sedated crab, and cover it with a wet cotton towel.
    7. Hold one eye of the crab with sterilized forceps.
    8. Swiftly cut off the eyestalk using sterilized surgical scissors.
      NOTE: Hemolymph may be lost from the wounded part of the crab.
    9. Dip the scissors and forceps in 70% ethanol after every use, and dry them using tissue paper before reuse.
    10. Apply two to three drops of iodine tincture to the wounded part of the eyestalk immediately after cutting it off.
      NOTE: Tincture of iodine is used for healing and to prevent infection.

to:

5. Eyestalk ablation

  1. Cauterization technique
    1. Perform all procedures on top of a table and in an open area.
    2. Take a flat head nickel-steel metal rod (e.g., a screwdriver) with a wooden or plastic handle, and cover the handle with a wet cotton towel.
    3. Sterilize two stainless surgical forceps in an autoclave.
    4. Prepare 70% ethanol in a spray bottle and keep it away from any fire-related sources, such as blow torch and red hot screwdriver. Have tissue paper ready for use.
      NOTE: Ethanol is highly flammable. Maintain a safe distance from fire sources.
    5. Connect a blowtorch to a gas cylinder (butane) securely.
      CAUTION: Follow the instructions on the blowtorch and gas cylinder. Make sure that the blowtorch is switched off when connecting with the gas cylinder. Read and follow all the fire safety precautions mentioned on the gas cylinder.
    6. Wear thick cotton gloves to avoid injury from hot objects.
    7. Subject the tip of the metal rod to the fire of the blowtorch until the metal rod is bright red.
    8. Cover the anesthetized crab with a wet cotton towel.
      NOTE: Cover the antennae of the crab to avoid unnecessary damage.
    9. Hold one eye of the crab with sterilized forceps.
      NOTE: Sterilize the forceps in an autoclave for first-time use, and disinfect using 70% ethanol for subsequent use on other crabs.
    10. Hold the red-hot metal flat tip onto the eye of the crab and press slightly for about 10−15 s until the eyestalk turns an orange or reddish-orange color. Be careful when conducting this step to avoid damage to adjacent structures. 
      NOTE: Two people are needed to execute eyestalk ablation following the cauterization method: one to hold the crab and another to perform the ablation procedure.
    11. Disinfect the forceps with 70% ethanol spray to ensure no cross-contamination between crabs.
      NOTE: Only perform this step at least waiting for 5 min after the eyestalk ablation procedure to ensure the forceps are cooled down before disinfection using 70% ethanol to prevent potential fire hazards.
    12. After performing the eyestalk ablation on all crabs, dip the hot nickel steel metal rod (screwdriver) into tap water.
    13. Disinfect the towel before reuse. Multiple towels can be used to save time.
      NOTE: Wash the towel with tap water, and dip it into 30 ppm chlorinated water for 5 min. Then, wash the towel with tap water again, and dip it in a 1 g/L sodium thiosulphate solution.
    14. Keep the blowtorch in a safe place after turning it off, and wait until it returns to environmental temperature (about 30 min) before disconnecting.
  2. Surgery technique
    1. Perform the procedure in a well-ventilated area.
    2. Sterilize two surgical scissors and forceps in an autoclave.
    3. Pour 50 mL of 70% ethanol into a 100 mL glass beaker.
    4. Wear thick cotton gloves.
    5. Hold the anesthetized crab, and cover it with a wet cotton towel.
    6. Hold one eye of the crab with sterilized forceps.
    7. Swiftly cut off the eyestalk using sterilized surgical scissors.
      NOTE: Hemolymph may be lost from the wounded part of the crab.
    8. Dip the scissors and forceps in 70% ethanol after every use, and dry them using tissue paper before reuse.

Step 7.2.2 of the Protocol has been updated from:

Sedate the females individually with the cold shock anesthesia method.

to:

Anesthetize the females individually with the 2-PE immersion anesthesia method.

The Discussion has been updated from:

This protocol was developed for the eyestalk ablation of the mud crab, Scylla spp., and can be applied as an efficient method to induce gonad maturation. This protocol can be easily replicated for the commercial ovary maturation of mud crabs and can be implemented to reduce the latent period (time from one spawning to another) in mud crab seed production.

The eyestalk ablation of crustaceans (i.e., freshwater prawn, marine shrimp) is typically done to induce gonad maturation and out-of-season spawning11,12,13. Eyestalk ablation in brachyuran crabs has also been done to study molting25,32,33, hormonal regulation18, gonad maturation34, and induced breeding and reproductive performance35,36,37,38,39. Unilateral or bilateral eyestalk ablation influences the physiology of the crustacean. Eyestalk ablation following the protocol stated in this study also influences the ovarian maturation rate of mud crabs. In the control treatment (without eyestalk ablation), 43.33% ± 5.77% of female crabs had an immature ovary (stage-1). However, in the same rearing period (30 days), eyestalk-ablated female crabs had pre-maturing ovaries (stage-3; 56.67% ± 11.55% and 53.33% ± 15.28% with the cauterization and surgery techniques, respectively), which shows that eyestalk ablation can increase the gonad maturation of mud crabs. Previous studies have also reported that the ovarian development of intact crabs (without eyestalk ablation) is slower than that of eyestalk-ablated crabs25,31. Due to the slower gonadal development in intact crustaceans, eyestalk ablation is widely done in commercial prawn and shrimp hatcheries. In this protocol, the eyestalk-ablated female crabs achieved higher percentages of ovarian maturation compared to the female crabs without the eyestalk ablation treatment (Figure 3).

The gonad maturation of the mud crab is regulated by hormones21,40,41. The eyestalk contains important endocrine glands (i.e., the X-organ-sinus gland complex) that play vital roles in the gonadal maturation process of mud crabs18,21. Unilateral eyestalk ablation, either by cauterization or surgery, damages one of the major endocrine glands that is involved in the synthesis and release of inhibiting hormones (e.g., VIH), thereby resulting in a higher level of gonad-stimulating hormones (i.e., VSH).

The ovarian maturation stages of Scylla spp. can be differentiated by observing the ovarian tissue coloration with the naked eye29,30,42. Translucent or creamy white ovarian tissues are indications of immature ovaries29,30,42,43. In this study, immature ovaries (stage-1) were still found in the group of female crabs without eyestalk ablation due to the slower ovarian maturation process. However, the crabs in the eyestalk-ablated groups (both by the cauterization and surgery techniques) mostly showed pre-maturing ovaries (stage-3), with some individuals exhibiting fully matured ovaries (stage-4). Therefore, the protocol of eyestalk ablation described here can be used to increase ovarian maturation in female mud crabs. This protocol can also be applied directly to wild-collected mature female mud crabs to hasten their seed production. To evaluate the effectiveness of cauterization and surgery methods on mud crab gonad maturation and to ensure the accurate estimation of molting duration, sexually pre-mature crabs were used. After the (induced) molting of sexually pre-mature female crabs, we noticed that their ovaries were still in the immature or early developing stages29,44. After 30 days of rearing the newly mature female crabs (either eyestalk-ablated or without eyestalk ablation), the ovarian development stages (stage-1 to stage-4) were determined by the color of the ovarian tissues. This protocol encourages the use of the cauterization technique to perform eyestalk ablation in mud crabs to avoid any hemolymph loss and prevent infection at the ablated sites. Cauterization immediately seals the wound, whereas the surgery technique requires an additional step of disinfection using iodine. For commercial purposes, larger mature crabs, preferably at a later stage of ovarian maturation, should be selected for eyestalk ablation to shorten the time to reach the fully matured ovary stage for subsequent commerce or brood stock culture. In addition to eyestalk ablation, individual rearing with sand substrate and sufficient feeding, preferably with live feed, can increase the gonad maturation rate of mud crabs in captivity30,35,45,46.

Crustacean blood is called hemolymph and can be lost during eyestalk ablation. An excessive loss of hemolymph may lead to the death of eyestalk-ablated crabs, especially when performing surgery to remove the eyestalk. The hemolymph can coagulate in the wounded part to prevent loss. The application of a tincture of iodine can prevent infection of the wounded part. However, in comparison to the surgery technique, the cauterization technique seals the wounded part immediately, thereby preventing the loss of hemolymph and possible infection.

Mud crab mortality after unilateral eyestalk ablation with either cauterization or surgery was not found within the first 7 days. Thus, eyestalk ablation can be done with a higher survival rate. Unilateral eyestalk ablation does not hamper the survival rate of the crab33.

Stress during crab handling and eyestalk ablation may contribute to crab mortality. Proper anesthesia is needed to minimize handling stress during eyestalk ablation. In crustacean eyestalk ablation, chemical anesthetics (i.e., xylocaine, lidocaine) are used at the base of the eyestalk before eyestalk ablation14,15,17,47. However, due to the aggressive nature and large size of mud crabs, the use of anesthesia only at the base of the eyestalk is not sufficient and might result in additional stress to the animals during the injection. On the other hand, anesthesia by subjecting them to a lower water temperature is more economical and safer. The use of cold water for anesthesia in mud crabs is common and has been used in other studies due to its efficiency, simplicity, and minimal impact on recovery and survival37,48,49.

Although eyestalk ablation using both cauterization and surgery methods has a minimal effect on crab survival and enhances ovarian maturation, performing eyestalk ablation requires professional mastery of the techniques. The timing between the steps is critical as any delay between protocols adds additional stress for the crabs. Unlike the surgery technique, the cauterization technique is dangerous because it involves the use of flammable equipment (i.e., a blow torch and butane gas). Thus, extra caution is needed when performing the cauterization technique.

Crabs are cannibalistic in nature, and they are known to prey on others that have just completed their molt and are still in their soft-shell conditions7,50,51. Thus, rearing the crabs individually can avoid unnecessary mortality due to cannibalism. The use of individual rearing in mud crab culture is commonly practiced, both in high-density culture and pond culture, for fattening and soft-shell crab farming purposes8,52. This protocol also utilized individual rearing and maintenance. During the transportation of the crabs for rearing or commerce, the crab chelipeds are tied up securely (or even autotomized) to prevent fighting, unnecessary injury, and limb loss34.

The described protocol for eyestalk ablation should be performed with multiple persons. After completing the eyestalk ablation, non-disposable equipment (e.g., the aquarium, tray, towel, etc.) should be disinfected with 30 ppm chlorine. The crabs must be monitored at least twice per day. Any dead crabs, uneaten feed, ablated limbs, or molted crab shells should be swiftly disposed of (i.e., buried in soil with bleaching powder) to prevent any potential for disease spread.

to:

This protocol was developed for the eyestalk ablation of the mud crab, Scylla spp., and can be applied as an efficient method to induce gonad maturation. This protocol can be easily replicated for the commercial ovary maturation of mud crabs and can be implemented to reduce the latent period (time from one spawning to another) in mud crab seed production.

The eyestalk ablation of crustaceans (i.e., freshwater prawn, marine shrimp) is typically done to induce gonad maturation and out-of-season spawning11,12,13. Eyestalk ablation in brachyuran crabs has also been done to study molting25,32,33, hormonal regulation18, gonad maturation34, and induced breeding and reproductive performance35,36,37,38,39. Anesthesia via immersion in 2-phenoxyethanol was used as it is comparable to the use of tricaine methanesulfonate (MS-222) in arthopods but cheaper and does not require the use of additional buffer40. Unilateral or bilateral eyestalk ablation influences the physiology of the crustacean. Eyestalk ablation following the protocol stated in this study also influences the ovarian maturation rate of mud crabs. In the control treatment (without eyestalk ablation), 43.33% ± 5.77% of female crabs had an immature ovary (stage-1). However, in the same rearing period (30 days), eyestalk-ablated female crabs had pre-maturing ovaries (stage-3; 56.67% ± 11.55% and 53.33% ± 15.28% with the cauterization and surgery techniques, respectively), which shows that eyestalk ablation can increase the gonad maturation of mud crabs. Previous studies have also reported that the ovarian development of intact crabs (without eyestalk ablation) is slower than that of eyestalk-ablated crabs25,31. Due to the slower gonadal development in intact crustaceans, eyestalk ablation is widely done in commercial prawn and shrimp hatcheries. In this protocol, the eyestalk-ablated female crabs achieved higher percentages of ovarian maturation compared to the female crabs without the eyestalk ablation treatment (Figure 3).

The gonad maturation of the mud crab is regulated by hormones21,41,42. The eyestalk contains important endocrine glands (i.e., the X-organ-sinus gland complex) that play vital roles in the gonadal maturation process of mud crabs18,21. Unilateral eyestalk ablation, either by cauterization or surgery, damages one of the major endocrine glands that is involved in the synthesis and release of inhibiting hormones (e.g., VIH), thereby resulting in a higher level of gonad-stimulating hormones (i.e., VSH).

The ovarian maturation stages of Scylla spp. can be differentiated by observing the ovarian tissue coloration with the naked eye29,30,43. Translucent or creamy white ovarian tissues are indications of immature ovaries29,30,43,44. In this study, immature ovaries (stage-1) were still found in the group of female crabs without eyestalk ablation due to the slower ovarian maturation process. However, the crabs in the eyestalk-ablated groups (both by the cauterization and surgery techniques) mostly showed pre-maturing ovaries (stage-3), with some individuals exhibiting fully matured ovaries (stage-4). Therefore, the protocol of eyestalk ablation described here can be used to increase ovarian maturation in female mud crabs. This protocol can also be applied directly to wild-collected mature female mud crabs to hasten their seed production. To evaluate the effectiveness of cauterization and surgery methods on mud crab gonad maturation and to ensure the accurate estimation of molting duration, sexually pre-mature crabs were used. After the (induced) molting of sexually pre-mature female crabs, we noticed that their ovaries were still in the immature or early developing stages29,45. After 30 days of rearing the newly mature female crabs (either eyestalk-ablated or without eyestalk ablation), the ovarian development stages (stage-1 to stage-4) were determined by the color of the ovarian tissues. This protocol encourages the use of the cauterization technique to perform eyestalk ablation in mud crabs to avoid any hemolymph loss and prevent infection at the ablated sites. Cauterization immediately seals the wound, whereas the surgery technique takes time for the wound to heal and this would allow for chance of infection. For commercial purposes, larger mature crabs, preferably at a later stage of ovarian maturation, should be selected for eyestalk ablation to shorten the time to reach the fully matured ovary stage for subsequent commerce or brood stock culture. In addition to eyestalk ablation, individual rearing with sand substrate and sufficient feeding, preferably with live feed, can increase the gonad maturation rate of mud crabs in captivity30,35,46,47.

Crustacean blood is called hemolymph and can be lost during eyestalk ablation. An excessive loss of hemolymph may lead to the death of eyestalk-ablated crabs, especially when performing surgery to remove the eyestalk. The hemolymph can coagulate in the wounded part to prevent loss. However, in comparison to the surgery technique, the cauterization technique seals the wounded part immediately, thereby preventing the loss of hemolymph and possible infection.

Mud crab mortality after unilateral eyestalk ablation with either cauterization or surgery was not found within the first 7 days. Thus, eyestalk ablation can be done with a higher survival rate. Unilateral eyestalk ablation does not hamper the survival rate of the crab33.

Stress during crab handling and eyestalk ablation may contribute to crab mortality. Proper anesthesia is needed to minimize handling stress during eyestalk ablation. In crustacean eyestalk ablation, chemical anesthetics (i.e., xylocaine, lidocaine) are used at the base of the eyestalk before eyestalk ablation14,15,17,48. However, due to the aggressive nature and large size of mud crabs, the use of anesthesia only at the base of the eyestalk is not sufficient and might result in additional stress to the animals during the injection. On the other hand, anesthesia by subjecting them to a lower water temperature is more economical and safer. The use of cold water for anesthesia in mud crabs is common and has been used in other studies due to its efficiency, simplicity, and minimal impact on recovery and survival37,49,50. In addition, future research on pain assessment following eyestalk ablation on mud crabs is recommended to highlight the change in behaviours associated with pain and stress, as evident in freshwater prawn Macrobrachium americanum51.

Although eyestalk ablation using both cauterization and surgery methods has a minimal effect on crab survival and enhances ovarian maturation, performing eyestalk ablation requires professional mastery of the techniques. The timing between the steps is critical as any delay between protocols adds additional stress for the crabs. Unlike the surgery technique, the cauterization technique is dangerous because it involves the use of flammable equipment (i.e., a blow torch and butane gas). Thus, extra caution is needed when performing the cauterization technique.

Crabs are cannibalistic in nature, and they are known to prey on others that have just completed their molt and are still in their soft-shell conditions7,52,53. Thus, rearing the crabs individually can avoid unnecessary mortality due to cannibalism. The use of individual rearing in mud crab culture is commonly practiced, both in high-density culture and pond culture, for fattening and soft-shell crab farming purposes8,53. This protocol also utilized individual rearing and maintenance. During the transportation of the crabs for rearing or commerce, the crab chelipeds are tied up securely (or even autotomized) to prevent fighting, unnecessary injury, and limb loss34.

The described protocol for eyestalk ablation should be performed with multiple persons. After completing the eyestalk ablation, non-disposable equipment (e.g., the aquarium, tray, towel, etc.) should be disinfected with 30 ppm chlorine. The crabs must be monitored at least twice per day. Any dead crabs, uneaten feed, ablated limbs, or molted crab shells should be swiftly disposed of (i.e., buried in soil with bleaching powder) to prevent any potential for disease spread.

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Ablazione del gambo oculare per aumentare la maturazione ovarica nei granchi del fango
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Asmat-Ullah, M., Rozaimi, R.,… More

Asmat-Ullah, M., Rozaimi, R., Fazhan, H., Shu-Chien, A. C., Wang, Y., Waiho, K. Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs. J. Vis. Exp. (193), e65039, doi:10.3791/65039 (2023).

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