Summary
אנו מציגים שיטה לגירוי כימי גמיש ורב-מודאלי ורישום של פעילות עצבית בו זמנית מתולעים רבות של Caenorhabditis elegans . שיטה זו משתמשת במיקרופלואידיקה, חומרה ותוכנה בקוד פתוח, וניתוח נתונים אוטומטי מפוקח כדי לאפשר מדידה של תופעות עצביות כגון הסתגלות, עיכוב זמני וגירוי crosstalk.
Abstract
מדדי סידן פלואורסצנטיים המקודדים גנטית תרמו רבות להבנתנו את הדינמיקה העצבית מרמת תאי עצב בודדים ועד למעגלים שלמים במוח. עם זאת, תגובות עצביות עשויות להשתנות עקב ניסיון קודם, מצבים פנימיים או גורמים סטוכסטיים, ובכך ליצור את הצורך בשיטות שיכולות להעריך תפקוד עצבי אצל אנשים רבים בבת אחת. בעוד שרוב טכניקות ההקלטה בוחנות חיה אחת בכל פעם, אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ רחב שדה כדי להגדיל את ההקלטות העצביות לעשרות Caenorhabditis elegans או אורגניזמים אחרים בקנה מידה תת-מילימטרי בבת אחת. חומרה ותוכנה בקוד פתוח מאפשרות גמישות רבה בתכנות ניסויים אוטומטיים לחלוטין השולטים בעוצמה ובתזמון של סוגי גירויים שונים, כולל גירויים כימיים, אופטיים, מכניים, תרמיים ואלקטרומגנטיים. בפרט, התקני זרימה מיקרופלואידים מספקים בקרה מדויקת, חוזרת וכמותית של גירויים כימו-סנסוריים ברזולוציית זמן של תת-שנייה. צינור ניתוח הנתונים החצי-אוטומטי של NeuroTracker מחלץ תגובות עצביות אינדיבידואליות וכלל אוכלוסייה כדי לחשוף שינויים פונקציונליים ברגישות ובדינמיקה העצבית. מאמר זה מציג דוגמאות למדידת הסתגלות עצבית, עיכוב זמני וגירוי crosstalk. טכניקות אלה מגבירות את הדיוק והחזרתיות של גירוי, מאפשרות לחקור את השתנות האוכלוסיות, והן ניתנות להכללה לאותות פלואורסצנטיים דינמיים אחרים במערכות ביולוגיות קטנות מתאים ואורגנואידים לאורגניזמים שלמים וצמחים.
Introduction
טכניקות הדמיית סידן אפשרו רישום לא פולשני של דינמיקה עצבית in vivo בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומדדי סידן מקודדים גנטית המבוטאים בתאי מטרה 1,2,3. חיישנים אלה משתמשים בדרך כלל בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כגון משפחת הפפטיד GFP-calmodulin-M13 (GCaMP), כדי להגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות בעת הפעלה עצבית ורמות סידן תוך-תאיות גבוהות. הדמיית סידן הייתה חזקה במיוחד בנמטודה C. elegans לבחינת האופן שבו נוירונים ומעגלים עצביים מתפקדים בבעלי חיים 4,5,6,7,8,9,10, שכן טבעם השקוף פירושו שלא נדרש תהליך כירורגי לגישה אופטית, ומקדמי גנים ספציפיים לתאים מכוונים ביטוי לתאים המעניינים. טכניקות אלה משתמשות לעתים קרובות בהתקנים מיקרופלואידים, המספקים סביבות מבוקרות במדויק לחקר תופעות ביולוגיות, כימיות ופיזיקליות בקנה מידה פיזיקלי קטן11,12. התקנים מיקרופלואידים נמצאים בשפע למדידת פעילות עצבית, עם עיצובים חדשים הנמצאים בפיתוח ללא הרף, והם מיוצרים בקלות במעבדת המחקר. עם זאת, עיצובים רבים לוכדים חיה אחת בכל פעם, ומגבילים את תפוקת הניסוי 7,9,13. תגובות עצביות לעיתים קרובות משתנות באופן משמעותי בין בעלי חיים עקב הבדלים בניסיון קודם, מצבים פנימיים כגון לחץ או רעב, או גורמים סטוכסטיים כגון רמות ביטוי גנים. הבדלים אלה יוצרים צורך בשיטות שיכולות בו זמנית לגרות ולהתבונן בבעלי חיים רבים ולחלץ מידע מפרטים4.
בנוסף, תופעות נוירומודולטוריות מסוימות מתגלות רק בתנאי גירוי ספציפיים, כגון עיכוב זמני14, המתייחס לדיכוי קצר של תגובות כאשר הגירוי מתרחש ברצף מהיר. מערכות אלקטרופיזיולוגיות יכולות להניע פעילות עצבית על פני מרחב גירוי רחב למטרה זו, ומווסת, למשל, את זרם הפולס החשמלי, המתח, התדר, צורת הגל, מחזור העבודה והתזמון של רכבות גירוי תקופתיות. גירוי עקיף על ידי גירויים או מערכות אופטוגנטיות שזוהו באופן טבעי יפיק תועלת מרוחב דומה של מנגנוני בקרה. כיום, גירויים טבעיים רבים מוצגים באופן פשוט "on-off", כגון הצגה והסרה של ריחות, תוך שימוש במערכות מסחריות שהיו איטיות כדי להוסיף גמישות. עם זאת, מיקרו-בקרים זולים יכולים כעת להפוך את המסירה של מספר סוגים של גירויים לאוטומטית באופן הניתן להתאמה אישית לצרכי החוקרים. בשילוב עם מיקרופלואידיקה, מערכות אלה השיגו את המטרה של תפוקה וגמישות ניסויית מוגברת, המאפשרת לתגובות עצביות למגוון גירויים מדויקים להימדד בו זמנית בבעלי חיים רבים 4,6. גירוי רב-מודאלי יכול לשמש לחקירה נוספת של המעגלים העצביים, כגון על ידי ניטור שינויים ברגישות העצבית בעת גירוי עקבי לפני, במהלך ואחרי הפרעה אורתוגונלית כגון חשיפה לסמים4. היתרונות של מערכות מיקרוסקופיה פתוחות וזולות ברורים לקידום המחקר המדעי, אך בפועל, הצורך במיקור חלקים, בנייה ותיקוף ביצועים יכול לעכב את אימוץ טכניקות אלה.
פרוטוקול זה נועד להקל על חלק מהאתגרים הטכניים הללו. בעוד שהפרוטוקולים הקודמים התמקדו בשימוש בהתקנים מיקרופלואידים ובגירוי בסיסי 9,15,17, אנו מתארים כאן את הבנייה והשימוש במערכת העברת גירויים גמישה, אוטומטית ורב-מודאלית לדימות עצבי ב- C. elegans או באורגניזמים קטנים אחרים המשתמשים בהתקנים מיקרופלואידים שתוארו קודם לכן4. מערכת הקוד הפתוח מתוכנתת באמצעות קבצי טקסט פשוטים כדי להגדיר את הניסויים, ותוכנת ניתוח הנתונים NeuroTracker מחלצת באופן חצי אוטומטי את נתוני הפעילות העצבית מסרטוני המיקרוסקופ. אנו מדגימים את המערכת הזו בעזרת דוגמאות להערכת עיכוב זמני, דיסאינהיביציה וגירוי crosstalk באמצעות תא העצב הכימו-סנסורי AWA, אשר מבצע דה-פולריזציה בתגובה לריחות מזון שונים או בתגובה לאור בעת ביטוי תעלות יונים אופטוגנטיות רגישות לאור 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ציוד הדמיה עצבית
הערה: ראו Lawler and Albrecht15 לקבלת הוראות מפורטות על בניית מערכת הדימות והגירוי, אשר שולטת בתזמון ההארה של המיקרוסקופ, ברכישת התמונה ובהעברת הגירוי (איור 1). בקר גירוי Arduino Nano זול מפעיל את השסתומים הזורמים באמצעות אותות דיגיטליים לבקר שסתומים ושולט בתאורה האופטוגנטית באמצעות אותות מתח אנלוגיים לבקר LED. גירויים אחרים, כגון מנועי רטט ומחממים תרמיים, ניתנים לשליטה באמצעות אותות דיגיטליים או אנלוגיים. בקר הגירוי מסנכרן את הגירוי ואת הקלטת התמונה באמצעות אותות מצלמה, כפי שצוין על ידי תוכנת בקרת המיקרוסקופ Micro-Manager (μManager) בקוד פתוח16. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים, הציוד והאורגניזמים המשמשים בפרוטוקול זה.
- הגדר את ציוד הדימות העצבי, כולל מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם אופטיקת GFP, מצלמת sCMOS עם אות פלט חשיפה דיגיטלי ובקר גירוי15.
- חבר את בקר הגירוי למערכות הרצויות באמצעות אותות דיגיטליים או אנלוגיים. עבור הדוגמאות המוצגות להלן, נעשה שימוש במערכות הבאות:
- השתמש בבקר שסתום לגירוי כימי. חבר את בקר השסתומים לסולנואיד נוזלי או לשסתומי צביטה (איור 1)15.
- השתמש בנורית LED אדומה של 615 ננומטר ובבקר לגירוי אופטוגנטי, המותקן מעל שלב המיקרוסקופ.
- הגדר את המחשב עם תוכנת בקרת המיקרוסקופ, צור הגדרת תצורה מוגדרת מראש עם הגדרות ציוד, והבטח פעולה תקינה של בקרת הגירוי15.
2. ייצור מכשירים מיקרופלואידים
הערה: ראה Lagoy et al.17 לקבלת מידע מפורט על השגת או ייצור תבניות האב וייצור, שימוש וניקוי של התקנים מיקרופלואידים. שלבים אלה מסוכמים להלן.
- השג או ייצר תבנית אב באמצעות קובץ התכנון המיקרופלואידי שסופק (albrechtlab.github.io/microfluidics)17. עבור בוגרים צעירים C. elegans, ודא כי גובה הערוץ הוא 55-70 מיקרומטר.
- ערבבו את בסיס PDMS וחומר הריפוי ביחס של 10:1 לפי משקל וערבבו היטב עם פיפטות העברה.
- מדגזים למשך 30-60 דקות במייבש ואקום עד שהבועות נעלמות.
- מניחים את תבנית האב לתוך צלחת פטרי גדולה (בקוטר 150 מ"מ), ויוצקים את PDMS degassed עד לעומק של 4-5 מ"מ (~ 100 גרם). בדוק והסר אבק או בועות עם פיפטה העברה.
- אופים בחום של 180 מעלות על מדף תנור ישר במשך 3 שעות עד לילה.
- לאחר שנרפא, השתמש באזמל כדי לחתוך את PDMS מהתבנית ובסכין גילוח ישר כדי להפריד בין המכשירים.
- נקבו חורי כניסה ויציאה באמצעות ניקוב עורי של 1 מ"מ, ונקו אותם עם dH 2 O,אתנול, ושוב עם dH2O. יבשו את המכשיר בזרם אוויר (ראו איור 2A).
- נקה את שני הצדדים של התקן PDMS עם סרט הדבקה, והסר אבק או לכלוך.
- הכינו את שקופיות הזכוכית להשלמת המכשיר המיקרופלואידי כמתואר17. קדח חורי כניסה במגלשה העליונה באמצעות ביט יהלום, והפוך את המגלשה התחתונה להידרופובית על-ידי חשיפה לאדי TFOCS או על-ידי יישום טיפול בזכוכית דוחה מים (איור 2B).
- הרכיבו את הכריך של מכשיר PDMS מזכוכית לתוך מהדק (איור 2C).
3. הכנת בעלי חיים
- להשיג או ליצור בעלי חיים עם אינדיקטורים סידן מקודדים גנטית לידי ביטוי נוירונים של עניין.
הערה: לדוגמה, קו NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) מבטא את GCaMP ואת ערוץ הקטיון הרגיש לאור אדום Chrimson בזוג נוירוני החישהAWA 6. שני הטרנסגנים משולבים בגנום לביטוי יציב בכל חיה. - יום לפני הניסוי, הניחו לפחות 20 זחלי L4 שלב C. elegans בכל ניסוי על צלחת אגר בינונית לגידול נמטודות (NGM) שנזרעה עם מדשאה OP50 E. coli. כאשר נשמר ב 20 מעלות צלזיוס, זה יסנכרן את חיות הבר בשלב הבוגר הצעיר למחרת.
הערה: עבור טרנסגנים של מערך, בחר בעלי חיים באמצעות סטריאוסקופ פלואורסצנטי כדי להבטיח ביטוי טרנסגנים בבעלי החיים שנבחרו.
4. הכנת הפתרון
- הכן מאגר בסיסי 1x S (100 mM NaCl ו- 0.05 M KPO4, pH 6.0) מתמיסת מלאי 10x.
- הכן חיץ טטרמיסול 1 mM על ידי דילול מלאי 1 M ב- 1x S Basal. השתמש בחיץ משותק זה כדי להכין את כל הגירויים. ניסוי משתמש בדרך כלל בכ-150 מ"ל.
- הוסף פלואורסצאין 0.1-1 מיקרוגרם/מ"ל למאגרי החיץ "בקרה" כדי להמחיש את הזרימה.
- יצירת פתרונות גירוי על ידי דילול סדרתי לריכוז הסופי הרצוי. לדוגמה, צור דילול של 10-7 של מושך דיאצטיל על ידי יצירת מלאי 10-3 תחילה.
הערה: ניתן להוסיף כמות קטנה של פלואורסצאין (0.1-1 מיקרוגרם/מ"ל) לתמיסת הגירוי או החיץ כדי לאמת את תזמון הגירוי, אך הריכוז צריך להיות מינימלי כדי למנוע ממצאים בפלואורסצנטיות עצבית.
5. הכנת מכשיר מיקרופלואידי
הערה: ראה Reilly et al.9 לקבלת פרוטוקול וידאו המציג את ייצור המאגר, הגדרת המכשיר וטעינת בעלי החיים. ראה גם Lagoy et al.17 עבור פרוטוקול כתוב הכולל עצות מועילות רבות.
- הכינו שלושה מאגרים נוזליים או יותר. עבור כל אחד מהם, חברו מיכל מזרק של 30 מ"ל או 60 מ"ל, מזרק פריימינג של 3 מ"ל וגבעום מחט לשסתום Luer תלת-כיווני (איור 2D). חבר את המחט לצינורות מיקרובור המצוידים בצינור מתכת בקצהו. תייגו את המאגרים, הרכיבו אותם על מדף שמחובר למעמד טבעתי, ומלאו אותם בנוזלי החיץ או הגירוי המתאימים (איור 2E).
- Degas המכשיר microfluidic מורכב ב ואקום מייבש במשך ~ 1 שעות.
- ממלאים ומסירים את בועות האוויר מצינור המאגר באמצעות מזרק הפריימינג. מלא את צינורות הזרימה בחיץ.
- הסר את המכשיר המיקרופלואידי מהוואקום, הכנס במהירות את צינור היציאה והזריק את הנוזל דרך המכשיר עד שטיפה יוצאת מפתח אחד.
- בכניסה זו, השתמשו בחיבור "טיפה לטיפה"17 כדי להכניס את צינור הכניסה הנוזלי המתאים (איור 2F). ודא שיש טיפות נוזל הן על צינור הכניסה והן על חור היציאה של המכשיר כדי למנוע יצירת בועה.
- הזריקו עוד נוזל מהשקע, חברו את צינור הכניסה הבא וחזרו על הפעולה עד שכל הפתחים מתמלאים. הכנס פין חסימה מוצק בכל פתחי הכניסה שאינם בשימוש וביציאת טעינת התולעת.
- ליזום זרימה על ידי פתיחת שסתומי הכניסה והיציאה Luer. בדוק את המכשיר לאיתור נזילות בפתחים ובבסיס הזכוכית. בדוק את ההתקן לאיתור בועות בתעלות הזרימה או בפתחי הזרימה באמצעות תוכנת לכידת התמונות במיקרוסקופ במצב חי.
הערה: אם קיימות בועות, המתן עד שהן ייספגו בחומר PDMS.
6. העמסת בעלי חיים
הערה: ראה Lagoy et al.17.
- העבירו חיות בוגרות צעירות לצלחת אגר NGM ללא זרעים באמצעות "פיק" עם חוט תיל.
- הציפו את הצלחת בכ-5 מ"ל של חיץ בסיסי 1x S כך שהחיות שוחות.
- משוך את התולעים לתוך מזרק העמסה (מזרק 1 מ"ל או 3 מ"ל עם צינורות מחוברים שמולאו מראש עם 1x S בזל).
- באמצעות סטריאוסקופ, הזיזו את קצה הצינור מתחת לפני השטח הנוזליים ביד אחת לכל חיה רצויה, ומשכו אותו לתוך הצינור באמצעות המזרק המוחזק ביד השנייה.
- למשוך את התולעים רק לתוך הצינור, לא לתוך המזרק.
הערה: הצינור מכיל בדרך כלל רק כ-100 מיקרוליטר. ניתן לגרש את בעלי החיים לאזור מקומי ואז למשוך אותם שוב לתוך הצינור עם נפח קטן.
- סגור את קו השקע, הסר את פין טעינת התולעת וחבר את מזרק טעינת התולעת למכשיר באמצעות חיבור טיפה לשחרור.
- להזרים בעדינות את בעלי החיים לזירה, ליצור זרימת חיץ, ולאפשר עד 1 שעה עבור immobilization על ידי tetramisole.
הערה: במהלך תקופת ההשתקה, יש לוודא שרק נוזל חיץ נכנס לזירה. ניתן לכבות את מאגרי התמריצים והבקרה במהלך תקופה זו, אך לפתוח אותם ולוודא את הזרימה הנכונה לפני הפעלת ניסויי הגירוי.
7. גירוי אוטומטי והקלטה עצבית
- צור קובץ טקסט להגדרת גירוי בשם "הגדרות רכישה מוגדרות על-ידי המשתמש.txt" עם עורך טקסט (לדוגמה, פנקס רשימות) המכיל את הגדרות הגירוי עבור רכישת התמונה האוטומטית (ראה דוגמאות באיור 3). ההגדרות מחולקות לשני חלקים:
- הגדרות רכישת מיקרוסקופ: הגדר את סוג הניסוי (גירוי יחיד או רב-תבנית), תזמון חשיפה ועירור, משך ומרווחי זמן של ניסוי ושמור ספרייה.
- הגדרות גירוי: הגדר את פרמטרי בקרת הגירוי. "פקודת גירוי" מציינת את הפעולות המתרחשות במסגרות וידאו מסוימות עם התחביר <קוד אותיות><מספר מסגרת>, כאשר קודי האותיות הם A = valve1, B = valve2, C = valve3, L = תאורת LED; בנוסף, אותיות רישיות = מופעלות ואותיות קטנות = כבוי. עוצמת ה- LED נקבעת עם קוד האות "i" וערך של 0 (כבוי) עד 255 (בהירות מרבית).
הערה: ערך עוצמת LED מ- 0 עד 255 מגדיר את המתח האנלוגי של היציאה מ- 0 V ל- 5 V. לבקר הנוכחי המשמש כאן יש קנה מידה עוצמה ליניארי, ואחרים צריכים להיות מכוילים עם מד כוח אור.- לניסוי של גירוי יחיד עם פקודת גירוי חוזרת אחת בלבד, השתמשו בתבנית שבאיור 3A.
- לניסוי Multi-Pattern עם פקודות גירוי מרובות, השתמשו בתבנית באיור 3B. כלול "רצף תבניות" של ספרות המייצג את סדר דפוסי הגירוי. לכל דוגמת מילוי, הזינו פקודת גירוי בשורה נפרדת.
הערה: רצף פסאודו-אקראי או רצף m יכולים להיות שימושיים לחקר תלות בהיסטוריית גירויים.
- הפעל את תוכנת בקרת המיקרוסקופ. ודאו שכל פתחי הנוזלים פתוחים, שהזרימה היא הרצויה בתוך הזירה (ראו איור 2H), ותאי העצב המעניינים נמצאים בפוקוס בתוך החלון החי.
- סגור את החלון החי והפעל את הסקריפט "MultiPattern_RunScript.bsh" בתוך התוכנה.
הערה: כדאי לבצע ניסוי ללא בעלי חיים כדי לוודא זרימה וגירוי תקינים. החלפת ריכוז פלואורסצאין שונה עבור כל נוזל גירוי יכולה לעזור לדמיין ולתעד דפוסי גירוי חדשים. - לאחר הניסוי, לפרק את המכשיר microfluidic, ולשטוף את כל המשטחים, צינורות ומאגרים עם מים.
הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בכל הרכיבים עשרות פעמים אם שומרים על ניקיון. ודא כי מאגרים, צינורות והתקנים מיקרופלואידים נשמרים רטובים או מיובשים לחלוטין בזרם אוויר כדי למנוע התגבשות מלח, אשר יכול לסתום וקשה להסירו. ניתן לשמור את המכשירים באתנול לעיקור אך יש לייבש אותם לחלוטין לפני שימוש חוזר (>1 שעות ב-65°C)17.
8. ניתוח נתונים באמצעות NeuroTracker
הערה: NeuroTracker 4,18,19 הוא תוסף תוכנה ImageJ/FIJI20 למעקב אחר עוצמת הפלואורסצנטיות של נוירונים ובעלי חיים מרובים, אפילו כשהם נעים במהלך ניסויים. תוסף זה שומר נתונים כקבצי טקסט עם המיקום של כל נוירון ועוצמת פלואורסצנטיות מתוקנת רקע (F). נתוני הפלואורסצנטיות מנורמלים לפלואורסצנטיות הבסיסית (F 0), לדוגמה, הממוצע של מספר שניות לפני הגירוי, כ- Δ F/F 0 = (F -F 0)/F 0, שניתן לממוצע בין אוכלוסיות.
- התקן סקריפטים של NeuroTracker לפי ההוראות (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
- הפעל את NeuroTracker על ידי לחיצה על תוספים | מעקב | NeuroTracker.
- בחר בתיקייה המכילה את הסמל . קבצי וידאו TIF שיש לעקוב אחריהם ובחר את ההגדרות הרצויות.
הערה: אם יש לעקוב רק אחר קבוצת משנה של קבצי הווידאו, בחר את הטווח המספרי של הקבצים שברצונך לנתח בשורת הפקודה. הגדרות המעקב המוגדרות כברירת מחדל מתאימות לבעלי חיים שאינם נעים ברזולוציה של 250 פיקסלים/מ"מ. התאם את הפרמטרים באופן יחסי לרזולוציות אחרות. עיין במדריך למשתמש19 לקבלת מידע נוסף על הגדרות. - קבעו את סף העוצמה כך שתאי העצב יהיו גלויים לבחירה (איור 4).
- פתח את חלונות הבקרה בהירות/ניגודיות (שחור/ג) וסף באמצעות התמונה | התאם תפריט.
- בחלון B/C, התאימו את המחוונים מינימום ומקסימום עד שניתן יהיה להבחין בבירור בין תאי העצב (איור 4A).
- בחלון סף , סמן את רקע כהה ואל תאפס טווח.
- החלק את מחוון המסגרת כדי לצפות בתנועה ובשינויים בעוצמה של תא העצב, וציין בעלי חיים שאין לכלול במעקב, למשל עקב חפיפה עם בעלי חיים אחרים.
- זהה את תאי העצב למעקב.
- עבור כל חיה, התאם את רמת הסף כך שאזור הסף האדום מעל תא העצב ייראה בכל מסגרת לפני, במהלך ואחרי הגירוי.
- לחץ על תא העצב כדי לרשום את מיקומו ואת רמת הסף שלו.
- חזור על התאמת הסף והבחירה עבור כל חיה ותא עצב למעקב. ראו איור 4C לדוגמה טובה של רמת סף ואיור 4D,E עבור דוגמאות של סף יתר ומתחת לסף. נוירונים שנבחרו בעבר מסומנים על ידי קופסה קטנה.
- כאשר כל תאי העצב נבחרים, הקש על מקש הרווח כדי להתחיל במעקב.
הערה: לקבלת דוגמאות נוספות של NeuroTracker, ראה הפניות קודמות 4,19. - עקוב אחר תהליך המעקב אחר כל בעל חיים, ובצע את כל התיקונים הדרושים.
- אם NeuroTracker משתהה, הוא איבד את תא העצב. לחץ מחדש על תא העצב, והתאמת רמת הסף לפי הצורך.
- אם תיבת האינטגרציה קופצת לבעל חיים קרוב אחר או למבנה שאינו עצבי, הקש על מקש הרווח כדי להשהות, הזז את המחוון בחזרה למסגרת השגויה הראשונה ולחץ שוב על מיקום תא העצב הנכון.
9. חקר נתונים והדמיה
הערה: סקריפט הניתוח של MATLAB משמש לעיבוד נתונים ולתצוגה חזותית וליצירת מסמכי PDF מסכמים עבור כל ניתוח.
- הפעל את הקובץ "NeuroTrackerSummary_pdf.m" ב- MATLAB, ובחר את התיקיה המכילה את קבצי הטקסט של נתוני NeuroTracker.
- המתינו להפקת קובץ PDF מסכם, שיאפשר אימות של תהליך המעקב (איור 5). חיות מזוהות על-ידי מספר (איור 5A), וניתן לראות את התגובות העצביות מכל חיה וניסוי כדי להעריך את שונות האוכלוסייה (איור 5B).
- השתמשו בפונקציה "databrowse.m" כדי לחקור את הנתונים העצביים, לדוגמה, קיבוץ לפי מספר ניסוי (איור 5C), לפי מספר בעלי חיים (איור 5D), לפי תבנית גירוי או לפי קטגוריה אחרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מציגים מספר דוגמאות לדפוסי גירוי המעריכים תופעות עצביות שונות, כולל עיכוב זמני, הסתגלות ודיסאינהיביציה. עיכוב זמני הוא דיכוי רגעי של תגובה עצבית למצגת גירוי שנייה המתרחשת זמן קצר לאחר ההצגה הראשונית14. כדי לבחון את התופעה הזו, בניסוי של פולסים זוגיים, הוצגו שמונה תבניות המורכבות משני פולסי ריח של 1 שניות המופרדים במרווח שנע בין 0 שניות ל-20 שניות (איור 6B; ראו איור 3B לקובץ בקרת הגירוי המתאים). הזירה הוקמה עם נוזל גירוי יחיד (דיאצטיל 1.1 מיקרומטר), חיץ וצינורות זרימת בקרה, כאשר פתח הכניסה שאינו בשימוש חסום בסיכה מוצקה (איור 6A). על ידי הפעלת שסתום 1, נוזל הבקרה נכנס לכניסת ctrl1, ומזיז את זרמי הנוזל כך שהגירוי נכנס לזירה; כאשר שסתום 1 כבוי, נוזל הבקרה נכנס לכניסת CTRL2, והחיץ זורם דרך הזירה (ראו איור 2G,H). בעוד שדופק הריח הראשון של 1 שניות עורר עוצמת תגובה זהה בנוירוני AWA המזהים דיאצטיל, התגובות לפעימה השנייה השתנו עם מרווח הגירוי הבין-גירוי (איור 6D). עבור מרווחי דופק של פחות מ -10 שניות, התגובה השנייה הייתה חלשה יותר, והדגימה את תופעת עיכוב הזמן. באמצעות מערך ניסויי זה, נמצא כי שיבוש רכיב הדינאין CHE-3 מונע עיכוב זמני, מה שמסבך את ההובלה האקסונלית בתופעה זו5.
הסתגלות היא ירידה הדרגתית בתגובות עצביות למצגות חוזרות ונשנות של אותו גירוי. תופעה זו יכולה להיגרם על ידי תהליכים שונים, כגון עיכוב פעיל, אשר ניתן להפוך במהירות, או תהליכים אחרים כי הם איטיים להיפוך. ניסוי אחד להערכת הפיכות מהירה הוא ניסוי "מלכוד", שבו גירוי אחד חוזר על עצמו כדי ליצור הסתגלות, ואחריו גירוי "סוטה" או חדש, ואז חזרה לגירוי המקורי. דיסאינהיביציה נצפתה אם התגובות העצביות גדלות בעקבות הגירוי החדש "disinhibiting". איור 7 מדגים דוגמה באמצעות שני ריחות, דיאצטיל ו-2-מתילפירזין (2-MP), שזוהו על-ידי תאי עצב כימו-חושיים של AWA באמצעות קולטנים שונים4. שני מאגרי גירוי וצינורות חוברו למכשיר המיקרופלואידי, עם שסתום צביטה תלת-כיווני נוסף כדי לקבוע איזה גירוי נכנס לזירה (איור 7A). דפוסי הגירוי הוגדרו כך שיציגו פולסים כימיים במשך 4 שניות דרך שסתום 1 עבור כל 30 הניסויים וכדי לבחור בין גירוי S1 או S2 באמצעות שסתום 3, שהופעל לאחר הניסוי ה-25 וכבה לאחר ה-26 (איור 7B). סידור זה הבטיח מספיק זמן לנוזלי הגירוי השונים לזרום דרך המכשיר המיקרופלואידי לפני הצגתם לבעלי החיים. נצפתה הסתגלות לגירוי הדיאצטיל, אולם הצגת הגירוי החדש של 2-MP לא עוררה אפקט דיסאינהיביציה חזק (איור 7C).
גירוי אופטוגנטי משתמש באור כדי להפעיל נוירונים באמצעות תעלות יונים רגישות לאור. בעוד נוח לשימוש, הפעלה אופטוגנטית עוקפת קולטנים חושיים וכמה מסלולים רגולטוריים, ולכן כמה תופעות עצביות עשויות להיות שונות בהשוואה להפעלה על ידי גירויים טבעיים. כדי לבחון את ההבדלים האלה, ניסויים רב-מודאליים שימושיים להצגת סוגים שונים של גירוי בתוך ניסוי יחיד. נוירונים המבטאים את גרסת הצ'נלרודופסין Chrimson מופעלים על ידי חשיפה לאור אדום5. כדי להעריך אם תאי העצב של AWA מסתגלים באופן דומה לגירוי כימי ואופטוגנטי, זן NZ1091 המבטא הן את Chrimson והן את GCaMP בנוירוני AWA נשמר על צלחת המכילה את הקו-פקטור all-trans-retinal (ATR, 100 μM) במשך 14-28 שעות. נורית LED אדומה של 615 ננומטר האירה את הזירה המיקרופלואידית מלמעלה (איור 8A), וסדרה של תבניות גירוי רב-מודאליות נוצרו על-ידי מתן 5 פולסים של דיאצטיל או אור אדום או שניהם באותו ניסוי (איור 8B). גירוי כימי לבדו גרם להסתגלות, בעוד שגירוי אופטי לבדו לא גרם לכך (איור 8C). אולם דפוס הגירוי הרב-מודאלי המשולב הראה שתגובות אופטוגנטיות רגישות להסתגלות כימית (איור 8C,D). ניסויים אלה מצביעים על כך שההסתגלות מתחילה בקולטנים חושיים או בתהליכים דנדריטיים, אך השפעותיה מתפשטות ברחבי תא העצב.
איור 1: סכמה של ציוד ההקלטה והגירוי של סידן עצבי. לכידת התמונה במיקרוסקופ, אור עירור פלואורסצנטי וגירוי נשלטים על ידי מחשב ומיקרו-בקר Arduino בקוד פתוח. הגירוי הכימי בזירה המיקרופלואידית עובר בין חיץ B לתמיסות גירוי S באמצעות זרימת נוזל בקרה C. רכיבי המערכת האופציונליים מסומנים בכוכבית (*), כגון שסתומים נוספים ואופני גירוי אופטיים או אחרים. תמונות המיקרוסקופ הפלואורסצנטי משמשות למדידת הפעילות העצבית באמצעות מעברי סידן, למשל, באמצעות מחוון הסידן GCaMP. הקווים המקווקווים מייצגים את החיבורים החשמליים (דיגיטליים או אנלוגיים), הקווים המעוקלים הם צינורות הנוזל, והחצים המוצקים הישרים הם נתיבי האור האופטיים. קיצור: LED = דיודה פולטת אור. נתון זה שונה מלולר ואלברכט15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הרכבה והתקנה של התקנים מיקרופלואידים. המכשיר המיקרופלואידי מורכב מהתקן PDMS (A) מיקרו-דפוס, הדחוק בין (B) משטח זכוכית קדוח לבין בסיס זכוכית הידרופובית ו-(C) מהודק. (D) המאגרים ממוקמים מעל המכשיר עם מעמד מתלה צינורות (E). הצינור מהמאגרים מחובר ישירות למכשיר או באמצעות שסתומים מופעלים לבקרה זורמת. המכשיר ממוקם מעל המטרה במיקרוסקופ. (F) תמונת תקריב של המכשיר המיקרופלואידי עם כל הצינוריות המחוברות בפתחים, פתח העמסת התולעת והשקע. (G) סכמה של ההתקן המיקרופלואידי בגודל 20 מ"מ x 20 מ"מ. הקווים השחורים מייצגים את תעלות הנוזל בגובה 55-70 מיקרומטר. גיאומטריה זו נועדה לאפשר שליטה מרחבית-טמפורלית מדויקת עם גירוי קדמי בניצב לזרימה תוך שמירה על בעלי החיים בתוך שדה הראייה של הזירה והמיקרוסקופ. זרם החיץ וזרם גירוי אחד (או לחלופין Stim2, אם נעשה בו שימוש) זורמים ברציפות, בעוד שרק כניסת נוזל בקרה אחת זורמת בכל פעם, ומשנה איזה נוזל נכנס לזירה. (H) כאשר שסתום 1 מופעל, נוזל הבקרה זורם מהיציאה הסגורה בדרך כלל לכניסת הבקרה1, והגירוי נדלק וזורם דרך הזירה. כאשר שסתום 1 כבוי, זורם נוזל מהיציאה הפתוחה בדרך כלל לכניסת הבקרה2, והמאגר נכנס לזירה. איזון הזרימה הנכון מוצג, עם צבע פלואורסצאין המשמש כנוזל הגירוי. שימו לב שחלק מהנוזל שנכנס לזירה עוקף אותו גם דרך הערוצים המעוקלים העליונים והתחתונים. זרמים אלה צריכים להיות צרים ובעלי רוחב שווה בערוצים העליונים והתחתונים. ניתן לכוונן את גובה המאגר לפי הצורך. קיצורים: PDMS = polydimethylsiloxane; WL = טעינת תולעת; Buf = חיץ; Stim1 = גירוי ראשון; Stim2 = גירוי שני; NC = סגור בדרך כלל; NO = פתוח בדרך כלל. נתון זה שונה מלולר ואלברכט15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: קובצי הגדרת גירוי לדוגמה. (A) ניסוי גירוי חוזר יחיד לדוגמה: פולס אור של 5 שניות בעוצמה 200 מ-2 שניות עד 7 שניות (מסגרת 20 עד 70). (B) ניסוי גירוי רב-דפוסים לדוגמה עם שמונה דפוסי גירוי שונים, המתאימים לאיור 6. שני פולסים כימיים של 1 שניות מוצגים עם מרווח של 0 שניות עד 20 שניות ביניהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: בחירת תאי עצב ורמות סף ב-NeuroTracker . (A) שדה ראייה מלא במיקרוסקופ, כאשר הבהירות והניגודיות מותאמות כדי לראות בבירור את תאי העצב של AWA. (B) תצוגה מוגדלת של אזור הראש של בעל חיים המתארת את תיבת האינטגרציה שממנה מחושבת עוצמת הפלואורסצנטיות ואת ביטול הרקע לחיסור רקע. (C) תרשים עוצמה משולב המראה תגובה עצבית חזקה. (D) בחירת סף טובה תגרום לאזור סף אדום שנמצא מעל הפרמטר Min Size ומתחת לפרמטר Max Size לכל מסגרת באוסף התמונות ולא כולל אזורים סמוכים, כגון אוטופלואורסצנטיות של המעי (ראו לוח B). (E) סף שנקבע גבוה מדי עשוי להיראות טוב כאשר תא העצב פעיל, אך כאשר תא העצב אינו פעיל, הוא עלול ללכת לאיבוד. לכן, חשוב לבדוק הן את המסגרת לפני הגירוי והן את המסגרת שלאחר הגירוי בעת בחירת סף. (F) סף שנקבע נמוך מדי עשוי להדגיש מבנים לא-עצביים אחרים. בחירת סף או מתחת לסף יכולה להוביל לכך ש- NeuroTracker יאבד את תא העצב וישהה למשוב מהמשתמש כדי לתקן את הסף ואת מיקום הנוירון. קיצור: B&C = בהירות וניגודיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח נתונים לדוגמה. תגובות עצביות של 15 בעלי חיים שנחשפו ל-10 חזרות של גירוי אופטוגנטי בן 5 שניות פעם בדקה. (A) תמונת סיכום המציינת את החיות שאחריהן עקבו ואת תנועת תאי העצב בתוך הניסוי (תיבות אדומות). חיה 2 זזה במהלך המשפט. (B) תגובות של בעלי חיים בודדים לאורך זמן מראות תגובה עקבית יחסית לגירוי באור אדום. (C) פלט חקר נתונים באמצעות הפונקציה databrowse . המעקבים מקובצים לפי חזרה על תקופת הניסיון (לעיל), והממוצעים מוצגים להלן עבור גירסאות ניסיון הניתנות לבחירת המשתמש. (D) נתונים מקובצים לפי מספר בעלי חיים בודדים וממוצעים על פני ניסויים חוזרים. מערך נתונים זה מציג שונות מינימלית בין בעלי חיים, המצדיק תגובות ממוצעות בכל האוכלוסייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ניסוי דופק זוגי עם מרווח משתנה של גירוי אינטרסטיולוס כדי להעריך עיכוב זמני . (A) חיבורי כניסה של התקנים מיקרופלואידים. הכניסה שאינה בשימוש חסומה באמצעות פין מוצק (X). מאגר נוזל הבקרה ושסתום1 מחוברים לפתחי c1 ו- c2, שהושמטו כאן לשם הבהרה. (B) תזמון גירוי לשמונה דפוסים. משך הפולסים הוא 1 שניות ומופרדים על ידי 0-20 שניות. רצף הדפוסים מתואר להלן; כל תבנית הוצגה שש או שבע פעמים. (C) פעילות עצבית AWA מ-50 ניסויים ותשעה בעלי חיים. מפת חום של תגובות ממוינות לפי דפוס גירוי מוצגת לעיל; הפעילות העצבית הממוצעת עבור כל דפוס (N=56-63 תגובות) מוצגת להלן. עיכוב זמני מתרחש במשך ~10 שניות לאחר הדופק הראשוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: ניסוי תפיסת ניסוי כדי להעריך דיסאינהיביציה . (A) חיבורי כניסה של התקנים מיקרופלואידים. שסתום צביטה תלת-כיווני מאפשר רק לגירוי S1 לעבור במנוחה ורק S2 לעבור כאשר הוא מלא אנרגיה. (B) דיאגרמה של שלושת רצפי הדפוסים המשמשים להעברת פעימות הריח הדיאצטיל החוזרות, עם הגירוי החדש 2-methylpyrazine שהוצג במקום בניסוי ה-26. (C) ממוצע תגובות הפעילות העצבית של AWA בקרב 20 בעלי חיים. קיצורים: DA = diacetyl; 2-MP = 2-methylpyrazine. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: דוגמה לגירוי רב-מודאלי. (A) חיבורי כניסה של התקנים מיקרופלואידים, עם כניסה שאינה בשימוש חסומה באמצעות פין מוצק. נורית LED אדומה מאירה את הזירה מלמעלה. (B) תבניות לגירוי אופטי, כימי או רב-מודאלי. (C) פעילות עצבית ממוצעת של AWA (n = 11 בעלי חיים) עבור 30 ניסויים חוזרים עם גירוי אופטוגנטי וכימו-סנסורי זוגי (למעלה), אופטוגנטי בלבד (באמצע) וכימו-סנסורי בלבד (למטה). (D) ממוצע שיא של תגובה עצבית עבור כל ניסוי עבור פולסים אופטוגנטיים מעל ופולסים כימיים מתחת. הפולסים האופטוגנטיים אינם גורמים ישירות להסתגלות, אך תגובותיהם רגישות להסתגלות כימו-חושית. קיצורים: DA = diacetyl. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מתארים מערכת מיקרוסקופיה בגישה פתוחה להערכת תופעות פעילות עצבית באמצעות העברה מדויקת זמנית של דפוסי גירוי שונים. הפלטפורמה המיקרופלואידית מספקת גירויים חוזרים תוך שמירה על עשרות בעלי חיים בשדה הראייה של המיקרוסקופ. מעט חבילות תוכנה מסחריות למיקרוסקופיה מאפשרות תכנות קל של תבניות תזמון גירוי שונות, ואלה שכן דורשות לעתים קרובות הזנה ידנית של כל תבנית או פורמטים קנייניים של קבצים. לעומת זאת, ניסויים מוגדרים במערכת זו על ידי קבצי טקסט, אשר יכולים להיות שנוצרו על ידי מחשב והם קריאים על ידי תוכנת ניתוח. כאן, אנו מדגימים את התועלת של שימוש בדפוסי גירוי משתנים להערכת תופעות עצביות כגון עיכוב זמני, הסתגלות ודיבור צולב במהלך גירוי רב-מודאלי. צינור ניתוח הנתונים מצמצם קבצי וידאו גדולים של מיקרוסקופיה לנתוני פעילות עצבית שניתן להמחיש ולנתח עבור השתנות האוכלוסייה (איור 5B), שינויים לאורך זמן (איור 7C ואיור 8C,D) ושינויים לאחר הפרעה (איור 7C).
יתרון מרכזי של אוטומציה הוא יכולת השחזור של גירוי על פני ניסויים חוזרים ובין ניסויים, ופורמט הזירה המיקרופלואידית מאפשר עלייה של לפחות פי 20 בתפוקה בהשוואה לשיטות קודמות של בעלי חיים בודדים 7,9,13. חשיפת אוכלוסיית בעלי חיים לאותם גירויים ותנאים סביבתיים מבטיחה שהנתונים יהיו דומים ומונעת שינויים יומיומיים פוטנציאליים בהכנת התמיסה, בטמפרטורה, במקורות בעלי חיים או בגורמים אחרים. עם זאת, מגבלה של גישה זו היא המיקרוסקופ בעל ההגדלה הנמוכה וברזולוציה נמוכה המשאיר את כל בעלי החיים בשדה הראייה. רק תא עצב אחד צריך להיות מנוטר לכל חיה כדי למזער טעויות מעקב, אם כי נוירונים המופרדים על ידי לפחות 50 מיקרומטר יכולים, באופן עקרוני, להיות מובחנים. ניתן לדמיין זוגות נוירונים דו-צדדיים יחד אם התגובות צפויות להיות סימטריות. חשוב לזהות תחילה אילו תאי עצב ספציפיים מעורבים בתהליך עצבי מעניין, למשל על ידי דימות מוח שלם7, ולאחר מכן לבטא GCaMP רק בתאי העצב הרלוונטיים לתפוקה מוגברת.
תגובות הסידן העצבי משתנות מבעל חיים עקב רמות הביטוי של המדווח או הבדלים בין-אישיים אחרים. לדוגמה, תגובות AWA GCaMP מנורמלות משתנות פי שניים בשיא גודלן, אפילו בחיות בר איזוגניות עם כתב הסידן משולב ביציבות בגנום4. גירויים מסוימים מראים תגובות משתנות ברחבי האוכלוסייה (למשל, בוטיל אצטט4), מה שמרמז על ביטוי קולטן משתנה. בפועל, יש להעריך לפחות 20 בעלי חיים בודדים כדי לקבוע את שונות האוכלוסייה. מומלץ לעשות שימוש בנתונים של בעלי חיים בודדים כדי להגדיל את הכוח הסטטיסטי בקביעת שינויים בתגובה, למשל על ידי השוואה סטטיסטית של תגובות עצביות בודדות שהוצמדו לפני ואחרי הפרעה.
עם מערכי נתונים גדולים וניסויים אוטומטיים, חשוב לאמת ולאמת את תפקוד הניסוי הנכון, מעקב והפחתת נתונים, במיוחד עבור שלבים ללא השגחה. יש לאמת את דפוסי הזרימה באמצעות תמיסות פלואורסצנטיות (כמו באיור 2H) על-ידי התבוננות בכך שלא ייכנסו בועות או נוזל בקרה לזירה בסרטונים המוקלטים. מערכי נתונים צריכים להיות מאומתים על-ידי, למשל, ציון כל תנועה של חיות (כמו באיור 5A) ואימות תגובות עצביות חלקות (כמו באיור 4C ובאיור 5B). יש להחריג נתונים בעייתיים. חשוב גם לאמת את קיבוץ הנתונים לפני שימוש בממוצע בפונקציה "עיון בנתונים" כדי להבטיח שהתגובה הממוצעת משקפת תגובות בודדות.
מערכת בקרת הגירוי בקוד פתוח ניתנת להרחבה בקלות לגירויים אחרים באמצעות אותות דיגיטליים או אנלוגיים או פקודות תקשורת טוריות. גירויים מדורגים ניתנים בדרך כלל לשליטה על ידי כניסות מתח אנלוגיות (0-5 V), כגון עוצמת אור LED או עוצמת דופק של מגרה עצבי. גירויי On-off נשלטים בדרך כלל באמצעות אותות דיגיטליים (TTL), כגון תזמון גירוי חשמלי. אותות דיגיטליים אלה יכולים גם להפעיל מתגי ממסר כדי להפעיל מערכות חשמליות אחרות, כמו מנועי רטט לגירוי מכנו-חושי. ציוד אחר משתמש בתקשורת טורית, כגון באמצעות חיבור USB, עם פקודות תווים ספציפיות המשודרות להגדרת פעולות. לדוגמה, ניסויי תגובת מינון יכולים להציג מספר ריכוזים כימיים באופן אוטומטי באמצעות שסתום סיבובי5 מבוקר USB או מערכת צלחת מרובת בארות6. ניתן להוסיף פקודות אלה לסקריפטים של בקרת מיקרוסקופ בקוד פתוח שיישלחו במספרי ניסיון ספציפיים. עיכובים בזמן יכולים להיות משולבים באופן דומה; לדוגמה, כדי להשהות את הבדיקה למשך שעה אחת בין שני התקפי גירוי של 30 ניסויים, יש לציין ניסוי של 60 ניסויים ולהוסיף שורת קוד אחת כדי להשהות למשך שעה אחת כאשר מספר הניסוי מגיע ל-31.
מורכבות הניסוי היא כמעט בלתי מוגבלת ואף יכולה להשתנות במהלך ניסוי המבוסס על משוב חי במערכת "לולאה סגורה". לדוגמה, הגירוי יכול להשתנות בזמן אמת בהתבסס על הפעילות העצבית, התנהגות בעלי חיים או פרמטר אחר הניתן לכימות. לאחרונה השתמשנו במערכת כזו כדי להעריך את התגובות העצביות החושיות אצל בעלי חיים ישנים לעומת בעלי חיים ערים על ידי הפעלת גירוי והקלטה עצבית לאחר שינוי בהתנהגות 8,15. תכונת מעקב התנועה של NeuroTracker מאפשרת ניתוח של פעילות עצבית בבעלי חיים הנעים בחופשיות עבור מתאם לפלט התנהגותי. עם זאת, מעקב אחר בעלי חיים נעים בודדים דורש תשומת לב רבה, למשל כאשר הם חוצים נתיבים, ולכן מומלץ להעמיס פחות בעלי חיים בכל זירה (בסביבות חמש) כדי למזער אינטראקציות אלה.
בסך הכל, טכניקות אלה מגבירות את דיוק הגירוי ואת התפוקה הניסויית בחקר השתנות האוכלוסייה ותופעות עצביות ספציפיות. בנוסף למדידת הפעילות העצבית, שיטות אלה ניתנות להכללה למערכות ביולוגיות אחרות, כולל צמחים, המתקשרים גם באמצעות אותות סידן 21, תרבית תאים עצביים ואורגנואידים במוח 22, כמו גם לאותות פלואורסצנטיים דינמיים אחרים, כגון חיישנים לפעילות סינפטית, שחרור מוליכים עצביים23 ושעתוק24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לפוקס אייברי על בדיקת פרוטוקולים אלה וסקירת כתב היד ולאריק הול על הסיוע בתכנות. המימון לשיטות המוצגות כאן ניתן בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע 1724026 (D.R.A).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
References
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1, 025008 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).
- Larsch, J., et al. A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis. Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy. Scientific Reports. 8, 6217 (2018).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Lawler, D. E., et al. Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses. The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).
- Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).
- Han, X., et al. A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy. Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Cohen, R. A. Temporal Inhibition. Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. , Springer. New York, NY. 2480-2481 (2011).
- Lawler, D. E., Albrecht, D. R. Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation. STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
- Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).
- NeuroTracker. GitHub. , Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022).
- NeuroTracker User Guide. GitHub. , Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Galotto, G. Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), 166074 (2019).
- Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons. eLife. 6, 31234 (2017).
- Boulin, T.
