Summary
We hebben een muismodel van chronische leverfibrose opgesteld, dat een geschikt diermodel biedt voor de virus-geïnduceerde leverfibrose mechanistische studie van galatresie (BA) en een platform voor toekomstige BA-behandelingen.
Abstract
Galatresie (BA) is een dodelijke ziekte met obstructieve geelzucht en het is de meest voorkomende indicatie voor levertransplantatie bij kinderen. Vanwege de complexe etiologie en onbekende pathogenese zijn er nog steeds geen effectieve medicamenteuze behandelingen. Op dit moment is het klassieke BA-muismodel geïnduceerd door rhesus rotavirus (RRV) het meest gebruikte model voor het bestuderen van de pathogenese van BA. Dit model wordt gekenmerkt door groeiachterstand, geelzucht van de huid en het slijmvlies, ontlasting van klei en donkergele urine. De histopathologie toont ernstige leverontsteking en obstructie van de intrahepatische en extrahepatische galwegen, die vergelijkbaar zijn met de symptomen van humaan BA. De levers van eindstadiummuizen in dit model missen echter fibrose en kunnen de kenmerken van leverfibrose in klinische BA niet volledig simuleren. De gepresenteerde studie ontwikkelde een nieuw BA-muismodel van chronische leverfibrose door vier keer 5-10 μg anti-Ly6G-antilichaam te injecteren, met hiaten van 2 dagen na elke injectie. De resultaten toonden aan dat sommige muizen met succes chronische BA vormden met typische fibrose na het tijdsverloop, wat betekent dat deze muizen een geschikt diermodel vormen voor de door virussen geïnduceerde leverfibrose mechanistische studie van BA en een platform voor het ontwikkelen van toekomstige BA-behandelingen.
Introduction
Galatresie (BA) is een ernstige hepatobiliaire ziekte die vaak voorkomt bij zuigelingen en jonge kinderen; In het bijzonder presenteert het zich als een obliteratieve cholangiopathie met neonatale geelzucht en bleke ontlasting1. De klinische kenmerken zijn inflammatoire vernietiging van de intrahepatische en extrahepatische galwegen en progressieve fibrose, die zich uiteindelijk ontwikkelt tot leverfalen2. Volgens statistieken is de incidentie van BA in Aziatische landen hoger dan in Europese en Amerikaanse landen, en de incidentie van BA in Aziatische landen is 1/8.000. De etiologie van BA omvat virale infectie, abnormale galwegontwikkeling, immuunstoornissen en genetische variaties3. Kasai-chirurgie is de meest gebruikte methode om cholestase bij kinderen met BA te verbeteren, maar uiteindelijk kan dit de progressie van fibrose niet voorkomen4. De huidige behandeling voor BA is voornamelijk afhankelijk van levertransplantatie, die wordt beperkt door het gebrek aan leverbronnen. Een diepgaande studie van de pathogenese van BA is het meest directe middel om de uitdagingen van deze ziekte op te lossen. Studies naar de pathogenese van BA zijn echter voornamelijk gebaseerd op BA-diermodellen en het is cruciaal om een geschikt diermodel te selecteren.
De meeste histopathologische studies van BA hebben aangetoond dat galweghyperplasie (BDP), galtrombose en poortaderfibrose de belangrijkste pathologische kenmerken van BA zijn, en andere pathologische kenmerken van verschillende gradaties bestaan tegelijkertijd, zoals portale inflammatoire celinfiltratie en hepatocytenzwelling 5,6. Op dit moment zijn er verschillende muismodellen die BA nabootsen, zoals het chronische 3,5-die-thoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine (DDC)-gevoede muismodel met segmentale galwegobstructie en pericholangitis waarbij de extrahepatische galwegen7 betrokken zijn en het muismodel van leverfibrose met een intraperitoneale injectie van tetrachloorkoolstof8. Het galwegligatiemodel (BDL) wordt gekenmerkt door geelzucht en snelle poortaderfibrose9. Het alfa-naftylisothiocyanaat (ANIT)-gevoede muismodel presenteert zich met cholangitis beperkt tot de intrahepatische galwegen en hepatocytenbeschadiging10. Een muismodel met langdurige geelzucht wordt geïnduceerd door vertraagde rhesus rotavirus (RRV) inenting11. Hoewel er verschillende diermodellen zijn, vooral muismodellen, heeft elk model zijn eigen beperkingen. Ze kunnen slechts een deel van de ziektekenmerken van BA simuleren, zoals acute ontsteking of leverfibrose in het proces van galatresie, en er is geen model dat zeer consistent is met het ziekteproces en pathologische kenmerken van BA.
Het klassieke BA-muismodel wordt geïnduceerd door RRV en dit model lijkt het meest op BA bij mensen. Hoewel RRV-geïnduceerde BA-modelmuizen vergelijkbare klinische symptomen en pathologische kenmerken vertonen als sommige van die van extrahepatische galatresie, mist dit model leverfibrose, wat de diepgaande studie van de BA-mechanismen en de ontwikkeling van nieuwe behandelingen sterk beperkt12. Daarom ontwikkelde deze studie een nieuw BA-muismodel van chronische leverfibrose. Anti-Ly6G-antilichaam werd intraperitoneaal geïnjecteerd vóór RRV-inenting op de dag van geboorte. Vervolgens werd vier keer 5-10 μg anti-Ly6G-antilichaam geïnjecteerd, met een pauze van 2 dagen tussen elke injectie. De BA-symptomen van muizen waren verbeterd, de overlevingstijd werd verlengd en de muizen kwamen in het stadium van chronische fibrose. Dit model simuleert niet alleen de acute faserespons van BA, maar bootst ook de processen van de lever en progressieve fibrose na. Het is dus een geschikter diermodel voor de mechanistische studie van BA en het zou een theoretische basis kunnen bieden voor het ontwikkelen van toekomstige behandelingen voor BA.
Het Gr-1-molecuul is een van myeloïde afgeleide celoppervlakmarker die oorspronkelijk tot expressie kwam in neutrofielen13. De uitputting van anti-Ly6G-antilichamen vermindert circulerende neutrofielen met meer dan 90% en verandert de respons die door andere immuuncellen wordt geactiveerd. De functies van Gr-1+ celpopulaties zijn gerapporteerd in verschillende studies met behulp van specifieke opruimantistoffen, met verschillende effecten geïdentificeerd op cytokines en gemedieerde immuunbescherming14. We hebben de functie van Gr-1+ cellen in RRV-geënte BA-muismodellen bestudeerd. Omdat het Gr-1-molecuul echter niet tot expressie is gekomen bij mensen, is een vergelijkbaar molecuul, CD177, onderzocht bij BA-patiënten15. Onze gegevens bewijzen het belang van Gr-1+ celpopulaties, met name in de chronische fibrotische fase van de ziekte, en bieden een geschikt diermodel om potentiële BA-therapieën te onderzoeken.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Guangzhou Yongnuo Biomedical Animal Center (IACUC-AEWC-F2208020), waar alle dierproeven werden uitgevoerd.
1. Vaststelling van het chronisch fibrotisch BA-muismodel
OPMERKING: Alle dieren werden in een specifieke pathogeenvrije (SPF) omgeving in dezelfde ruimte gehouden en de experimenten werden uitgevoerd in een conventionele omgeving. BALB/c muizen op dag 12,5 van de dracht (leeftijd: 10-12 weken; gewicht 35-40 g) werden gehouden in een ruimte zonder specifieke pathogenen bij 25°C onder een 12 uur donker/licht cyclus en kregen gratis toegang tot geautoclaveerd voedsel en water. Neonatale muizen, binnen 24 uur na de geboorte (gemiddeld lichaamsgewicht: 1,5-1,6 g), werden geselecteerd voor het muis BA-model.
- Bereid RRV voor zoals eerder gemeld16.
OPMERKING: Vanwege de slechte overlevingsstatus van de modelmuizen moeten ze op 21 dagen oud worden gescheiden om te voorkomen dat ze worden gebeten of zelfs gedood door andere muizen in dezelfde kooi. - Verdeel neonatale muizen in drie groepen: de controlegroep, de RRV-groep en de RRV + anti-Ly6G-groep. Injecteer de neonatale muizen intraperitoneaal met 20 μL RRV (titer: 1,5 x 106 PFU/ml) (RRV-groep) of zoutoplossing (controlegroep) binnen 24 uur na de geboorte. Om Gr-1+ cellen uit te putten, moet u elke muis 4 uur voor de RRV-injectie voorbehandelen met een intraperitoneale injectie van 5 μg anti-Ly6G-antilichaam.
OPMERKING: De anti-Ly6G-antilichaamoplossing wordt bewaard bij 2-8 °C en mag niet worden ingevroren. Haal het antilichaam er voor gebruik uit en zet het gedurende 30 minuten op kamertemperatuur om op te warmen. - Injecteer elke 3 dagen 10 μg anti-Ly6G-antilichaam in de buik van de muis tot dag 12 na de RRV-injectie (figuur 1A).
- Controleer en registreer dagelijks het uiterlijk, het gewicht en de overleving van alle muizen.
2. Intraperitoneale injectie van de muizen
- Verwijder pasgeboren muizen uit de kooi. Gebruik een insulinespuit van 1 ml om 20 μl RRV-oplossing of 50 μl anti-Ly6G-antilichaamoplossing te injecteren. Knijp in de nekhuid van de jonge muis met de wijsvinger en duim van één hand en houd de achterpoten van de muis voorzichtig vast met de ringvinger en staartvinger om de buik bloot te leggen.
- Til de naald op in een opwaartse helling. Steek de naald in de middelste dij van de rechterachterpoot van de muis onder een hoek van 15° met de huid. Nadat u langs het onderhuidse pad bent gegaan totdat de naald de rechter ribbelrand van de muis bereikt, richt u de naald naar beneden in de buikholte. Injecteer vervolgens de vloeistof onder de lever van de muis.
OPMERKING: Pasgeboren muizen hebben hun maag en milt in de linker buik. Als een naald aan de linkerkant wordt ingebracht, is het gemakkelijk om de maag te doorboren of miltbloeding te veroorzaken. - Trek de naald onmiddellijk na de injectie uit en let op bloedingen of lekkage op de injectieplaats. Als die er is, veeg het dan af met een geautoclaveerd katoen. Breng de muis terug naar de kooi van zijn moeder.
OPMERKING: Om de invloed van vloeistoflekkage tijdens de injectie op de experimentele resultaten te verminderen, moet u ervoor zorgen dat de injectiewerking zacht is, de naald langzaam verwijderen en gedurende 30 s met een wattenstaafje op de injectieplaats drukken.
3. Verzameling van monsterweefsel
- Verdoof de muizen op dag 12 met 4% isofluraaninhalatie en ontleed ze onder een microscoop. Plaats een insulinespuit van 1 ml in de linkerkamer van het hart om bloed te verzamelen. Na bloedafname euthanaseert u de muizen door inademing van 4% isofluraan gedurende 10 minuten. Centrifugeer het bloed gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 400 × g en scheid het serum voor leverfunctiemetingen.
OPMERKING: Bloedafname moet worden uitgevoerd terwijl de muizen in leven zijn. Als de muizen sterven, wordt het bloed vastgehouden in de bloedvaten en kan het niet worden verzameld. - Fotografeer het algemene uiterlijk van de lever en galwegen. Ontleed vervolgens de muizenlever en milt van de omliggende weefsels met een schaar en een pincet.
OPMERKING: De lever en andere weefsels worden verzameld en gereserveerd bij −80°C voor RNA- en eiwitextractie of gedrenkt in 10% formaline voor de bereiding van histologische monsters.
4. Fluoresceïneangiografie van het extrahepatische galkanaal
- Na het euthanaseren van de muis, stelt u de lever, galblaas en extrahepatische galwegen volledig bloot met een schaar en wattenstaafjes.
- Observeer onder een houdingsmicroscoop, injecteer 5-10 μL van de fluorescerende kleurstof rhodamine 123 (20 mg / ml) in de galblaas met een insulinespuit van 1 ml en maak foto's. Dit proces is hetzelfde als dat gerapporteerd in een eerdere16.
OPMERKING: Verschillende muizen in dezelfde groep worden gebruikt voor de monsterweefselverzameling en fluorescentie-angiografie.
5. H&E kleuring
- Dompel vers muizenleverweefsel gedurende 24 uur onder in 10% formaline.
- Nadat u het weefsel in paraffine hebt ingesloten, gebruikt u een paraffinemicrotoom om het paraffineblok in secties met een dikte van 4 μm te snijden en plaatst u twee opeenvolgende secties op dezelfde dia. Ervaren personeel is nodig om de operatie te standaardiseren om vingersnedente voorkomen 17.
- Leg de plakjes in een snijrek, was ze in xyleen, hydrateer ze achtereenvolgens in absolute ethanol, 95% ethanol, 80% ethanol, 70% ethanol en gedestilleerd water en week ze 5 minuten in.
- Kleur de secties met hematoxyline-oplossing gedurende 5 minuten en week ze gedurende 5 s in 1% zoutzuur en 75% alcohol. Spoel de secties af met schoon water en bevlek ze gedurende 1 minuut met eosine-oplossing.
6. CK19 en F4/80 immunohistochemische kleuring
- De eerste drie stappen zijn hetzelfde als de stappen van weefselinbedding, sectie en dewaxing in de H &E-kleuringssectie.
- Voer antigeenreparatie uit met Tris-EDTA-buffer (10 mmol / L Tris-base, 1 mmol / L EDTA-oplossing, pH 9,0), verwarm de secties in een magnetron op 95 °C gedurende 10 minuten en verwijder en koel ze vervolgens op natuurlijke wijze tot kamertemperatuur.
- Plaats de weefselsecties gedurende 10 minuten in een 3% waterstofperoxide-oplossing om endogene peroxidase te verwijderen.
- Behandel de plakjes met 5% geitenserum om niet-specifieke binding te blokkeren.
- Voeg primair antimuis cytokeratine 19 of anti-muis F4/80 monoklonaal antilichaam bij ratten toe aan de secties en incubeer 's nachts bij 4 °C.
- Incubeer de secties met geschikte secundaire antilichamen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Gebruik 3,3'-diaminobenzidine (DAB) als chromogeen middel om de chromogene reactie onder de microscoop te observeren.
- Observeer de plakjes onder een 40x microscoop om foto's te maken en analyseer ze indien nodig.
7. Sirius Rode kleuring
- Voer de eerste drie stappen uit van het insluiten, doorsneden en verwijderen van weefsel zoals beschreven in de sectie H &E-kleuring.
- Nadat de weefselsecties zijn tegengekleurd met hematoxyline, bedek elk weefsel met 50 μL Sirius Red-kleurstofoplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Droog de dia's op natuurlijke wijze bij kamertemperatuur gedurende 4 uur, voeg een druppel neutrale gom toe aan elke dia en gebruik een dekplaat om het weefsel langzaam te bedekken om bubbels te voorkomen. Laat de dia's 24 uur op kamertemperatuur staan om de neutrale kauwgom te stollen.
- Gebruik een gepolariseerde contrastlichtmicroscopie om de details van collageenafzetting te observeren; Selecteer een helder en geschikt gezichtsveld en pas de helderheid en witbalans van het gezichtsveld van de microscoop aan. Verkrijg afbeeldingen en analyseer ze indien nodig onder een 40x microscoop.
Representative Results
De muizen werden intraperitoneaal geïnjecteerd met 5 μg anti-Ly6G-antilichaam binnen 24 uur na de geboorte en vervolgens intraperitoneaal geïnjecteerd met 20 μL RRV 4 uur later. Vervolgens werd elke 3 dagen tot dag 12 10 μg anti-Ly6G-antilichaam geïnjecteerd (figuur 1A). De mediane overlevingstijd in de RRV-groep was 13 dagen. Integendeel, de meeste muizen die met het antilichaam werden behandeld, ontwikkelden milde geelzucht en er werd geen gewichtsverlies waargenomen (figuur 1C). Ongeveer 20% -30% van de muizen had het BA-syndroom met langdurige geelzucht en een laag lichaamsgewicht, maar overleefde meer dan 42 dagen. Na anti-Ly6G-antilichaambehandeling daalde het aantal Gr-1 + -cellenmet 15 en kwamen de muizen in het stadium van chronische fibrose, chronische BA genoemd. Monsters werden verzameld op dag 12 en dag 42, en weefselplakken gekleurd met Sirius Red vertoonden een geleidelijke toename van leverfibrose. De chronische BA-muizen die 42 dagen overleefden, werden gebruikt voor gedetailleerde analyses. Naast het kleine formaat vertoonden de oren, voeten en staarthuid gemarkeerde geelzucht (blauwe pijlen in figuur 1E). Op dag 6 na de RRV-injectie werd de ontlastingskleur van de muizen lichter en de urinekleur donkerder; dit werd significant anders dan de controlegroep op dag 12, toen de RRV-groepmuizen witte uitwerpselen en donkergele urine vertoonden. Op dag 42 vertoonden de urine en uitwerpselen van de chronische BA-muizen ook duidelijke kenmerken van geelzucht (figuur 1D, E). De levers van de BA-muizen werden verwijderd en vergeleken met die van de controles. De levers waren kleiner (figuur 2B), necrotische laesies waren zichtbaar met het blote oog (figuur 2A, zwarte driehoek) en een segment van galwegatresie werd ook extrahepatisch waargenomen (figuur 2A, witte sterretjes).
Analyse van de leverweefselsectie toonde aan dat een lage dosis anti-Ly6G-therapie de poortaderontsteking verminderde. Op dag 42 werd echter nog steeds accumulatie van ontstekingscellen waargenomen in de plakjes leverweefsel (figuur 3A). Sirius Rode kleuring toonde een kleine toename van de afzetting van collageen in het portaalgebied op dag 12 na de RRV-injectie. Bovendien werden geen significante veranderingen waargenomen in collageenexpressie na behandeling met het anti-Ly6g-antilichaam, maar de collageenexpressie in BA-weefselmonsters op dag 42 was significant verhoogd (figuur 3B). Bij onderzoek onder een gepolariseerde lichtmicroscoop werd waargenomen dat collageenvezels zich hadden opgehoopt in het aangrenzende leverweefsel. Een aanzienlijke afzetting van collageen, overwegend groen, werd gezien in de BA-weefselmonsters op dag 42 (figuur 3C) en de collageenafzetting nam verder toe bij muizen die 42 dagen overleefden zonder gewichtstoename. Met de vermindering van portale ontsteking werden CK19+ galwegcellen waargenomen op dag 12. Op dag 42 waren volwassen galwegen echter nauwelijks waarneembaar, hoewel een toename van CK19+ galwegcellen werd gezien (figuur 4A, rode pijlen geven galwegepitheelcellen aan). In het geval van extrahepatische galwegen bij muizen met chronische BA, onthulde seriële dissectie van het portale gebied van muizen dat de extrahepatische galwegen geblokkeerd waren en inflammatoire infiltraten van macrofagen hadden (figuur 4B, zwarte pijlen geven macrofagen aan).
In vergelijking met RRV alleen, verminderde behandeling met een lage dosis anti-Ly6G-antilichaam leverbeschadiging in termen van leverenzymspiegels op dag 12 na RRV-inenting. De alanineaminotransferase- en alkalische fosfatasespiegels in de lever waren hoger in de chronische BA-groep dan in de normale controlegroep. De meest uitgesproken veranderingen werden gevonden in de bilirubinespiegels, waarbij RRV + anti-Ly6G-muizen verminderde TBIL-, DBIL- en IBIL-niveaus vertoonden in acute BA in tegenstelling tot RRV alleen. Bij muizen met chronische BA waren de niveaus van TBIL, DBIL en IBIL verhoogd (figuur 5), wat aangeeft dat de leverfunctie significant verminderd was in het chronische fibrosestadium van BA.
Figuur 1: De effecten van anti-Ly6G-antilichaambehandeling in een muismodel van galatresie geïnfecteerd met RRV. (A) Schematische illustratie van lage doses antilichamen om acute en chronische fase BA bij muizen te induceren met pijlen die het tijdstip van injectie van het antilichaam en RRV aangeven. (B) Overlevingscurven van de muizen in de normale controlegroep (Vervolg), rhesusrotavirus (RRV)-groep en RRV + anti-Ly6G-antilichaamgroep. (C) Lichaamsgewichtscurven van de muizen in elke groep. (D) Representatieve beelden van de muizen en hun uitwerpselen en urine in elke groep op dag 12. (E) Representatieve beelden van de muizen en hun uitwerpselen en urine in elke groep op dag 42. De blauwe pijlen geven de gele oren en staart aan. Deze figuur is met toestemming overgenomen van Zhang et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De effecten van anti-Ly6G antilichaambehandeling op de lever in een muismodel van galatresie geïnfecteerd met RRV . (A) Vergelijking van leveranatomie en extrahepatische galwegfluorescentieangiografie tussen chronische BA-muizen (rechts) en normale muizen op dag 42. (B) Vergelijking van de levergrootte tussen chronische BA-muizen en normale muizen. De zwarte driehoek duidt op levernecrose bij muizen met chronische BA. Het witte sterretje duidt op extrahepatische galatresie. Deze figuur is met toestemming overgenomen van Zhang et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Leverweefselplakken van de muizen in de normale controlegroep (Vervolg), rhesusrotavirus (RRV)-groep en RRV + anti-Ly6G-antilichaamgroep op dag 12 en dag 42. (A) Afbeeldingen van leverweefselsecties gekleurd met hematoxyline en eosine (H &E). (B) Sirius Rode kleuring toonde collageenafzetting (PSR). (C) Verdere observatie van de plakjes met behulp van gepolariseerde lichtmicroscopie (Pol. Light). Afkorting: PV = poortader. Schaalbalk = 50 μm. Dit cijfer is aangepast van Zhang et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Immunohistochemische kleuring van plakjes leverweefsel uit de normale controlegroep (Vervolg), rhesusrotavirus (RRV)-groep en RRV + anti-Ly6G-antilichaamgroep op dag 12 en dag 42 . (A) De expressie van galwegepitheelcellen marker (CK19) in verschillende behandelingsgroepen. (B) Inflammatoire celinfiltratie van macrofagen werd aangetoond in verschillende behandelingsgroepen. Afkorting: PV = poortader. De rode pijl geeft galwegepitheelcellen aan. De zwarte pijl geeft macrofagen aan. Schaalbalk = 50 μm. Dit cijfer is aangepast van Zhang et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Vergelijking van de leverfunctie bij muizen in verschillende behandelingsgroepen. Muizenbloed werd na het experiment afgenomen en getest op de laboratoriumafdeling van het ziekenhuis. Elke groep bevatte drie tot vijf muizen. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Afkortingen: ALT = alanineaminotransferase; ASAT = aspartaataminotransferase; ALP = alkalische fosfatase; TBIL = totaal bilirubine; DBIL = direct bilirubine; IBIL = indirect bilirubine. Dit cijfer is aangepast van Zhang et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
In onze studie gebruikten we anti-Ly6G-antilichamen om Gr-1 + -cellen te elimineren of te verminderen in een muismodel van galatresie geïnfecteerd met RRV om het acute BA-syndroom te verbeteren, de overlevingskans te verlengen en BA-muizen in staat te stellen de chronische fase in te gaan. Het verlagen van de antilichaamdosis kan leiden tot chronische BA met leverfibrose, wat aangeeft dat het aantal Gr-1+ cellen het resultaat van BA in de acute en chronische fase verandert. In onze vorige studie werden Gr-1+ cellen verminderd na toediening van anti-Ly6G-antilichamen en was de algehele overlevingsstatus van de BA-muizen verbeterd15. Tegelijkertijd is gemeld dat Gr-1+ macrofagen 19, Gr-1+ neutrofielen 20, Gr-1+ myeloïde cellen21 en Gr-1+ granulocyten fibrose kunnen verbeteren in sommige diermodellen22. In deze studie waren Gr-1 + -cellen bij muizen echter gedeeltelijk uitgeput met lage doses anti-Ly6G-antilichaam en bleven er collageenafzettingen achter. Als gevolg hiervan kan er meer tijd nodig zijn om de ziekte grondiger aan te pakken.
De toepassing van het anti-Ly6G-antilichaam verminderde de ontsteking, bewaarde gedeeltelijk de galwegen en voorkwam acute BA-geïnduceerde dood bij muizen. Slechts 20% tot 30% van de muizen kwam echter in de chronische fase van BA; dit kan te maken hebben met het tijdstip en het aantal injecties van anti-Ly6G-antilichamen. We moeten dit belangrijke punt verder onderzoeken om het slagingspercentage te verbeteren. Daarnaast zijn we van mening dat niet alleen Gr-1+ cellen, maar ook andere immuuncellen een belangrijke rol kunnen spelen, zoals NK-cellen, T-cellen, B-cellen en macrofagen.
Wat het protocol betreft, moeten enkele details worden opgemerkt. (i) Om het lekken van geïnjecteerde geneesmiddelen te voorkomen, gebruiken we een insulinespuit van 1 ml met een naald met een diameter van 0,33 mm, omdat de naalddiameter klein is en het naaldgat in de spuit klein is, wat bevorderlijk is voor het verminderen van de kans op medicijnverlies. (ii) Vóór de injectie moet de muis worden gefixeerd om te voorkomen dat deze beweegt, drugslekkage te voorkomen en zo het experimentele effect verder te waarborgen. (iii) Tijdens de injectie van het geneesmiddel injecteerden we het geneesmiddel zo ver mogelijk in het oppervlak of de onderste marge van de muizenlever, zodat het geneesmiddel de buik binnendrong en volledig contact maakte met de lever om effect te hebben. (iv) De injectie wordt meestal gemaakt vanaf de rechterbovenbeen van de muis, omdat de maag en milt van de pasgeboren muis zich in de linkerbuik bevinden en de maag vol melk zit. Als de naald vanaf de linkerkant wordt ingebracht, kan deze gemakkelijk de maag doorboren, waardoor melk in de buik stroomt of de milt doorboren, waardoor bloedingen ontstaan.
CD177 is een homoloog van Ly6G en de expressie van CD177 bij BA-patiënten is onderzocht. CD177 kan worden gebruikt als een marker voor de vroege diagnose van BA bij kinderen, wat aangeeft dat CD177+ cellen een belangrijke rol spelen in het verloop van BA23. Door de RNA-sequencinggegevens te analyseren, ontdekte ons team dat CD177-cellen de dominante populatie van Gr-1 + -cellen waren; ondertussen vertoonden Cd177−/− BALB/ c-muizen gevaccineerd met RRV een vertraagd begin van BA en verminderde morbiditeit en mortaliteit18. Ons chronische BA-muismodel heeft dus duidelijke voordelen voor het bestuderen van de pathogenese en ziekteprogressie van BA; het biedt ook een geschikt diermodel voor het bestuderen van mogelijke behandelingen voor BA.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81974056) aan R.Z. en van de National Nature Youth Foundation of China (82101808) en Science and Technology Planning Project van Guangzhou (nr. 202102020196) aan Z.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mouse | Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD | 20221000112 | |
| rat anti-mouse Ly6G | Bio X Cell | clone 1A8 | West Lebanon, NH |
| rat anti-mouse cytokeratin 19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | clone TROMA III | Iowa City, IA |
| rat anti-mouse F4/80 | R&D Systems | MAB5580 | Minneapolis, MN |
| RRV strain | ATCC | MMU 18006 | Manassas, VA |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX7 | |
| Leica light microscopy | Leica Microsystems | Leica DMI8+DFC7000T | Wetzlar, Germany |
| Hitachi Pre-Analytical Process Automation System | Hitachi | 7600 Clinical Analyzer | Tokyo, Japan |
| Isoflurane anesthetic | RWD | R510-22-10 | |
| Rhodamine 123 | Sigma-Aldrich | 83702 | |
| sirius red dye | Leagene | DC0041 | |
| paraffin microtome | Leica Microsystems | RM2235 | |
| neutral gum | Solarbio | G8590 |
References
- Lakshminarayanan, B., Davenport, M. Biliary atresia: A comprehensive review. Journal of Autoimmunity. 73, 1-9 (2016).
- Bassett, M. D., Murray, K. F.
- Bezerra, J. A., et al. Biliary atresia: Clinical and research challenges for the twenty-first century. Hepatology. 68 (3), 1163-1173 (2018).
- Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A.
- Lee, W. S., Looi, L. M. Usefulness of a scoring system in the interpretation of histology in neonatal cholestasis. World Journal of Gastroenterology. 15 (42), 5326-5333 (2009).
- Russo, P., et al. Key histopathologic features of liver biopsies that distinguish biliary atresia from other causes of infantile cholestasis and their correlation with outcome: A multicenter study. The American Journal of Surgical Pathology. 40 (12), 1601-1615 (2016).
- Fickert, P., et al. Characterization of animal models for primary sclerosing cholangitis (PSC). Journal of Hepatology. 60 (6), 1290-1303 (2014).
- Sonoda, S., et al. Biliary atresia-specific deciduous pulp stem cells feature biliary deficiency. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 582 (2021).
- Xiao, Y., et al. Long noncoding RNA H19 contributes to cholangiocyte proliferation and cholestatic liver fibrosis in biliary atresia. Hepatology. 70 (5), 1658-1673 (2019).
- Desmet, V. J., Krstulović, B., Van Damme, B. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
- Luo, Z., Shivakumar, P., Mourya, R., Gutta, S., Bezerra, J. A. Gene expression signatures associated with survival times of pediatric patients with biliary atresia identify potential therapeutic agents. Gastroenterology. 157 (4), 1138-1152 (2019).
- Mariotti, V., Strazzabosco, M., Fabris, L., Calvisi, D. F. Animal models of biliary injury and altered bile acid metabolism. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1254-1261 (2018).
- Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40 (1), 35-48 (2008).
- McDermott, A. J., et al. The role of Gr-1(+) cells and tumour necrosis factor-α signalling during Clostridium difficile colitis in mice. Immunology. 144 (4), 704-716 (2015).
- Zhang, R., et al. The role of neonatal Gr-1(+) myeloid cells in a murine model of rhesus-rotavirus-induced biliary atresia. The American Journal of Pathology. 188 (11), 2617-2628 (2018).
- Fu, M., et al. A silver nanoparticle method for ameliorating biliary atresia syndrome in mice. Journal of Visualized Experiments. (140), e58158 (2018).
- Sy, J., Ang, L. C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Methods in Molecular Biology. 1897, 269-278 (2019).
- Zhang, R., et al. CD177(+) cells produce neutrophil extracellular traps that promote biliary atresia. Journal of Hepatology. 77 (5), 1299-1310 (2022).
- Engel, D. R., et al. CX3CR1 reduces kidney fibrosis by inhibiting local proliferation of profibrotic macrophages. Journal of Immunology. 194 (4), 1628-1638 (2015).
- Liang, M., et al. A modified murine model of systemic sclerosis: Bleomycin given by pump infusion induced skin and pulmonary inflammation and fibrosis. Laboratory Investigation. 95 (3), 342-350 (2015).
- Chen, Y., et al. Differential effects of sorafenib on liver versus tumor fibrosis mediated by stromal-derived factor 1 alpha/C-X-C receptor type 4 axis and myeloid differentiation antigen-positive myeloid cell infiltration in mice. Hepatology. 59 (4), 1435-1447 (2014).
- Tomasson, M. H., et al. Fatal myeloproliferation, induced in mice by TEL/PDGFbetaR expression, depends on PDGFbetaR tyrosines 579/581. Journal of Clinical Investigation. 105 (4), 423-432 (2000).
- Zhang, R., Huang, J., Shan, J., Chen, Y., Xia, H. Peripheral blood CD177(+) cells as an early diagnostic marker for biliary atresia: A prospective multicentre study in pediatric patients with cholestasis. Journal of Hepatology. 77 (6), 1714-1716 (2022).
