Visualisering av organeller in situ med kryo-STEM-tomografi

Summary

Kryo-STEM-tomografi ger ett sätt att visualisera organeller av intakta celler utan inbäddning, sektionering eller andra invasiva preparat. Den erhållna 3D-upplösningen ligger för närvarande i intervallet några nanometer, med ett synfält på flera mikrometer och en tillgänglig tjocklek i storleksordningen 1 μm.

Abstract

Kryogen elektronmikroskopi (kryo-EM) bygger på avbildning av biologiska eller organiska prover inbäddade i deras ursprungliga vattenhaltiga medium; Vatten stelnar till ett glas (dvs förglasat) utan kristallisation. Kryo-EM-metoden används ofta för att bestämma strukturen hos biologiska makromolekyler nyligen med en nära atomär upplösning. Tillvägagångssättet har utvidgats till studier av organeller och celler med hjälp av tomografi, men det konventionella sättet för EM-avbildning med brett fält lider av en allvarlig begränsning i provtjockleken. Detta har lett till en praxis att fräsa tunna lameller med hjälp av en fokuserad jonstråle; Den höga upplösningen erhålls genom subtomogram medelvärde från rekonstruktionerna, men tredimensionella relationer utanför det återstående skiktet går förlorade. Tjockleksbegränsningen kan kringgås genom skannad sondavbildning, liknande skannings-EM eller det konfokala laserskanningsmikroskopet. Medan skanningstransmissionselektronmikroskopi (STEM) i materialvetenskap ger atomupplösning i enstaka bilder, kräver känsligheten hos kryogena biologiska prover för elektronbestrålning särskilda överväganden. Detta protokoll presenterar en inställning för kryo-tomografi med STEM. Den grundläggande topikala konfigurationen av mikroskopet beskrivs för både två- och trekondensorsystem, medan automatisering tillhandahålls av den icke-kommersiella SerialEM-programvaran. Förbättringar för batchförvärv och korrelativ anpassning till tidigare förvärvade fluorescenskartor beskrivs också. Som ett exempel visar vi rekonstruktionen av en mitokondrion, pekar ut det inre och yttre membranet och kalciumfosfatgranulerna, såväl som omgivande mikrotubuli, aktinfilament och ribosomer. Kryo-STEM-tomografi utmärker sig i att avslöja organellteatern i cytoplasman och i vissa fall till och med kärnperiferin hos vidhäftande celler i odling.

Introduction

Tredimensionell (3D) visualisering av organeller är en viktig uppgift i modern cellbiologi. Med tanke på de involverade skalorna, allt från tiotals nanometer för sekretoriska vesiklar till många mikron för cellkärnan, är det utmanande att hitta en enda mikroskopiteknik som passar alla applikationer. Medan modern fluorescensmikroskopi kan spänna över mycket av intervallet när det gäller upplösning, visas endast de märkta molekylerna. Den cellulära teatern förblir sfären av elektronmikroskopi. Konventionella metoder för kemisk fixering, plastinbäddning och färgning med tungmetaller är starkt invasiva, så resultaten kan bero på detaljerna i provberedningen. Cryo-EM, å andra sidan, begränsas av behovet av att förglasa det vattenhaltiga mediet; Iskristaller som bildas diffrakterar elektronbelysningen, vilket orsakar kontrastartefakter med högre kontrast än det organiska materialet av intresse.

Det senaste decenniet har sett en spridning av EM-avbildningstekniker utvecklade eller anpassade för cellulära studier¹. Högtrycksfrysning i kombination med iterativ fokuserad jonstråle (FIB) fräsning och seriell ytavbildning med svepelektronmikroskopet (dvs. FIB-SEM) är för närvarande den valda metoden för stora prover². Kryogen mjuk röntgentomografi (kryo-SXT) är lämplig för prover av flera mikron i storlek, begränsad av den karakteristiska absorptionslängden för de mjuka röntgenstrålarna i vatten ^3,4,5. Denna skala innehåller många intakta celltyper, och den kvantitativa karaktären hos röntgenabsorptionskontrasten lägger till en aspekt av koncentrationsmätning⁶ eller spektroskopi⁷. I kombination med subtomogrammedelvärde erbjuder kryotransmissionselektrontomografi (kryo-ET), baserat på faskontrasttransmissionselektronmikroskopi (TEM), den högsta upplösningen för makromolekyler eller komplex ^8,9,10. Det är emellertid sällsynt att intakta organeller är så regelbundna att de i genomsnitt kan hela. Dessutom är det konventionella läget för bredfälts TEM begränsat för provtjocklek till några hundra nanometer genom kombinationen av oelastisk spridning (med energiförlust) i provet och kromatisk aberration i den magnetiska objektivlinsen^11,12. Den stora energispridningen dikterar användningen av ett energifilter för att avlägsna den resulterande diset utanför fokus, men det känsliga provet lider fortfarande av strålningsskador medan bildsignalen blir exponentiellt svagare med ökande tjocklek.

Det alternativa avbildningsläget, skanningsöverföring EM (STEM), kringgår behovet av energifiltrering och behåller de oelastiskt spridda elektronerna för bildbildning, om än för närvarande med en lägre upplösning än för TEM-tomografi (figur 1). Faktum är att ingen riktig bild bildas. Istället, som i en skannings-EM, görs mätningar punkt för punkt, och bilden monteras av datorn. Förstoringen bestäms endast av skanningsstegens storlek utan att ändra linsströmmarna. När den är korrekt konfigurerad kan det användbara intervallet för provtjocklek för kryo-STEM-tomografi (CSTET) nå 1,5 eller till och med 2 μm, även om komfortzonen, där den användbara signalintensiteten förblir en betydande del av belysningen, är cirka 600-900 nm^11,13. Detta är tillräckligt för att se en stor del av cytoplasman, och ibland en kant av cellkärnan. I praktiken finner vi att vitrifiering med standardmetoden att kasta sig i kryogen vätska medför en allvarligare begränsning av tjockleken än STEM-avbildning. Målet med denna videoartikel är att underlätta införlivandet av CSTET i verktygskistan för cell- och organellavbildning i forskningslaboratorier och mikroskopianläggningar.

Den första utmaningen är att mikroskopoperationer i CSTET ännu inte är standardiserade för life science-tillämpningar på samma sätt som de har varit för kryo-TEM-tomografi. STEM-hårdvara har sällan (om någonsin) riktats mot kryo-EM-marknaden. Detta förändras dock med den senaste generationen mikroskop, och många befintliga verktyg kan eftermonteras. STEM som teknik har tagit fart och till stor del tagit över inom materialvetenskapen, där det också finns ett spirande intresse för kryogena och lågdosmetoder^14,15. Materialvetenskaplig litteratur vimlar av akronymer BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM, etc., vilket bidrar till förvirringen. Vi erbjuder här en rekommenderad utgångspunkt som, i vår kollektiva erfarenhet vid Weizmann Institute of Science, ger det mest allmänna protokollet för användbara resultat baserat på ljusfält (BF) STEM-avbildning¹⁶. Det uttömmer eller utforskar inte på något sätt utbudet av möjligheter, men det kommer att tjäna som grund för ytterligare förbättringar. Medan vi betonar kryo-STEM, är det mesta av protokollet lika relevant för rumstemperatur STEM-tomografi av plastinbäddade sektioner.

Kärnan i STEM är att skanna provet med en fokuserad elektronsond (figur 1), belysningskonen och att spela in signaler från diffraktionsplanet (spridningsplanet) i överföring, pixel för pixel, för att producera 2D-bilder^17,18. Amorfa prover, inklusive de flesta cellulära material, kommer att producera ett diffust spridningsmönster vid överföring. Den enklaste praktiska STEM-konfigurationen är att placera en cirkulär detektor för att spela in den centrala skivan (dvs. sondbelysningen som skulle överföras utan prov). Provet sprider elektroner bort från denna belysningskon i den utsträckning att signalen minskar. Detta ger en BF-bild - provet verkar mörkt på en ljus bakgrund. En ringformig detektor kan också (eller istället) användas för att detektera spridningen från provet utanför belysningskonen. Med provet borttaget finns det ingen signal. När ett exemplar är på plats ser objekten ljusa ut på en mörk bakgrund i bilden med mörkt fält (DF). Nomenklaturen för STEM (BF, ringformigt mörkfält [ADF], högvinkelringformigt mörkfält [HAADF], etc.) avser huvudsakligen uppsamlingsvinklarna för detektorerna.

Belysningens konvergensvinkel representerar en väsentlig anpassning av STEM till cellulär tomografi. När högsta prioritet är hög upplösning bör konvergensvinkeln vara så stor som möjligt. (Detta liknar konfokal laserskanningsmikroskopi; upplösningen bestäms av sonddiametern, som skalas som våglängden dividerad med den numeriska bländaren. Observera att vi hänvisar till halvvinkeln eller halvkonvergensvinkeln för EM.) När prioriteten är skärpedjupet, å andra sidan, ger en kompromiss i upplösning en stor fördel, eftersom den fokuserade strålen förblir ungefär parallell för ett avstånd som är lika med dubbelt så stor våglängd dividerat med halvvinkel i kvadrat. Helst förblir hela cellvolymen i fokus¹⁹. Till exempel, vid 300 keV är elektrondeBroglie-våglängden 0, 002 nm, så en konvergens på 1 mrad ger en upplösning på 2 nm och ett skärpedjup på 4 mikron. Under dessa förhållanden kan tomografi utföras även utan att fokusera under datainsamlingsprocessen, men endast en gång i början av förvärvet. En konventionell tomografikapabel STEM kan nå en halvkonvergensvinkel på 7 eller 8 mrad; Därför kunde vi i princip nå en upplösning i storleksordningen 0.25 nm, men då med ett brännvidd på endast 62 nm. Detta är helt klart för tunt för cellulär avbildning. Mer avancerade mikroskop med tre kondensorlinser erbjuder kontinuerlig justering av halvkonvergensvinkeln över ett betydande område. Med den mer traditionella tvåkondensorkonfigurationen fixeras konvergensen diskret av kondensorns (C2) bländare.

För robusta, plastinbäddade prover kan man spela in en fokalserie vid varje lutning och kombinera dem för hög upplösning²⁰, men för kryogena prover är strålningsbudgeten för hårt begränsad. Slutligen, vid vägning av fördelarna med BF- eller DF-avbildning, för tjocka prover, bör man överväga effekterna av multipel elastisk spridning i provet. BF-signalen är mindre skadad av multipel spridning och visar en högre upplösning för tjocka exemplar ^16,21.

En användbar tumregel har varit att ställa in insamlingsvinklar som är flera gånger större än konvergensen. Ju tjockare provet desto större bör uppsamlingsskivan vara. För liten skiva ger en låg signalintensitet; En för stor disk resulterar i dålig bildkontrast, eftersom endast spridning med högsta vinkel bidrar. Uppsamlingsvinklarna bör optimeras för ett givet prov. Detektorvinklarna som en funktion av kamerans (diffraktion) längd måste kalibreras oberoende av varandra. De kan visas bekvämt av mikroskopprogramvaran. I praktiken är en faktor på två till fem i förhållandet mellan insamling och belysningshalvvinklar, θ respektive α (figur 1), en rekommenderad utgångspunkt för CSTET av cellulära prover.

Följande protokoll beskriver STEM-tomografioperation med den populära SerialEM-programvaran för mikroskopkontroll^22,23. SerialEM är inte knutet till en specifik tillverkare, och det används ofta i TEM-tomografi. De flesta operationer vid inrättning för tomografi kan överföras direkt från TEM. SerialEM-strategin är att modellera skanningssystemet som en kamera. Detta möjliggör enkel övergång från TEM till STEM. Man bör dock komma ihåg att parametrar som förstoring och binning är helt artificiella. De viktiga parametrarna är synfältet i mikron, antalet pixlar i synfältet och exponeringstiden. Pixelavståndet, eller samplingen, är det linjära fältet dividerat med antalet pixlar, medan uppehållstiden är antalet pixlar dividerat med exponeringstiden.

Minsta konfiguration för STEM och CSTET innefattar tre funktioner i mikroskopet: en skanningsgenerator, en STEM-detektor och tomografikontrollprogramvara. Protokollet hänvisar till nomenklaturen för FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), men begreppen är generiska. Den proprietära programvaran för TFS har beskrivits i JoVE för TEM²⁴, och STEM-operationen är mycket lika.

Vi antar att mikroskopet har justerats i förväg av serviceteamet eller erfaren personal och att en kolumnjustering kan hämtas genom att ladda en fil. Mindre justeringar kallas direktjusteringar och kan lagras i så kallade FEG-register (TFS-mikroskop). Direkta justeringar inkluderar rotationscentrum, pivotpunkter, diffraktionsjustering och kompensation för kondensatorastigmatism. Justeringar måste utföras iterativt. Observera att TFS-mikroskop implementerar distinkta nanosond (nP) och mikrosond (μP) lägen; För en given kondensoröppning ger dessa ett relativt smalt eller brett synfält med parallell belysning i TEM respektive en mer eller mindre konvergent (tätt fokuserad) elektronstråle i STEM. Andra tillverkare använder andra system för att täcka konvergensvinklarna.

Innan du börjar bör synfältet, L och provtagningen (pixelbredd), l, väljas, beroende på provet som studeras. Till exempel, för l = 1 nm / pixel, bör en 4 000 x 4 000 pixelbild som täcker ett synfält 4 μm² väljas. Upplösningen kommer i bästa fall att vara dubbelt så stor som den rumsliga provtagningen, så 2 nm, och sonddiametern, d, bör matcha det. Kalibrering av sondvinkeln ligger utanför ramen för detta protokoll, så vi antar att en tabell eller en skärmläsning är tillgänglig. Sondens diameter är ungefär elektronvåglängden dividerad med halvkonvergensvinkeln (i radianer): d = λ / θ. Våglängden, λ, är 0,002 nm för 300 keV och 0,0025 nm för 200 keV-elektroner, så θ på 1 mrad ger en spotdiameter på 2 respektive 2,5 nm.

Protokollet presenteras i en progression av ökande komplexitet. Den första uppgiften är att producera en STEM-bild, som beror på mikroskoptillverkarens programvara, och sedan en lutningsserie, för vilken vi använder SerialEM. Många läsare kommer utan tvekan att känna till SerialEM, så de mer komplicerade uppgifterna kommer naturligt. Det finns ingen anledning att följa förfarandena strikt. Utveckling som rör automatisering kan genomföras direkt för STEM såväl som för TEM. Erfarna användare kommer sannolikt att invertera protokollet, som börjar med korrelativ registrering av fluorescenskartor och fortsätter att ställa in batchtomografi. Mer information finns i de omfattande dokumentations- och handledningsbiblioteken för själva SerialEM, inklusive en ny JoVE-artikel om den senaste utvecklingen inom automation²⁵.

Protocol

1. STEM-inställning

1. Preliminära justeringar: Läs in kolumnjusteringsfilen och öppna sedan Kolumnventiler. Om du använder en kryohållare med sidoingång, öppna kryoskölden. Starta i TEM-läge. Strålen ska visas på skärmen. Om inte, sänk förstoringen.
2. Ta mikroskopet till eucentriskt fokus genom att trycka på knappen på kontrollpanelen.
3. Ställ in dekorstorleken till ett bekvämt värde (t.ex. 6) för att visualisera den fluorescerande skärmen, antingen direkt eller med den inbyggda kameran (beroende på mikroskopmodell).
4. Ställ in mikroskopet på STEM-läge och kontrollera att fokus använder kondensorlinserna (intensitet) snarare än målet. Ställ in eucentriskt fokus. Gå sedan ur diffraktionsläget för initiala justeringar.
5. Se till att strålen inte är tom. Minska förstoringen tills strålen visas på skärmen. Justera strålförskjutningen till mitten och öka förstoringen i steg upp till ca 70kx samtidigt som strålen hålls i mitten.
6. Sätt i önskad kondensoröppning, vanligtvis 50 μm. Kontrollera bländarens centrering. När du vrider fokusratten något fram och tillbaka ska punkten expandera och dra ihop sig men förbli på plats, som om ett plan skär ett imaginärt vertikalt timglas. Om bländaren inte är centrerad kommer belysningen att skiftas i sidled, som om timglaset lutades.
7. Sätt strålen i fokus och tryck på Intensitetslistfokus (om tillgängligt) på justeringsfliken, eller återgå till eucentriskt fokus som i 1.2. Justera strålens position till mitten.
8. Justera rotationscentret. Vrid fokussteghjulet till ett minimum eller ett steg ovanför, så att strålen pulserar försiktigt och se till att den förblir stillastående när fokus rör sig upp och ner.
9. Markera pivotpunkterna och för samman de två punkterna med X- och Y-justeringar.
   OBS: Om en fasplatta är installerad på ett TFS-instrument ska endast X-justeringen användas.
10. Fokusera strålen något och justera kondensorns stigmatorer för att göra skivan rund. Gå upp och ner genom fokus för att optimera; Det bör inte finnas någon tendens att förlängas i en eller annan riktning när man passerar fokus.
11. Normalisera linserna. Öka sedan förstoringen gradvis till cirka 240 kx medan du använder strålförskjutningen för att hålla punkten centrerad och upprepa rotationscentrum- och pivotpunktjusteringarna (steg 1.6-1.8).
12. Återgå till diffraktionsläge. Strålen ska visas som en enhetlig skiva på den fluorescerande skärmen. Kameralängden (CL) styr nu effektivt det optiska avståndet till detektorn, som i röntgenkristallografi. Ändra den och se hur skivan dras samman och förstoras, som om skärmens placering skulle röra sig mot eller bort från provet. Denna kon representerar BF-belysningen.
    OBS: För varje CL finns det en diffraktionsinriktning som ska justeras för att föra den projicerade strålen till den centrala axeln. Det finns normalt inget behov av att förfina dem alla, bara den (eller få) som ska användas för upptäckt.
13. Aktivera STEM-läge vid hög förstoring.
    1. Om en BF STEM-detektor är tillgänglig, börja med det. Ta scenen till ett område med ett tomt hål och justera diffraktionsinriktningen för att centrera strålen med önskad CL.
    2. Många mikroskop är endast utrustade med en HAADF-detektor; det finns ett knep för att använda detta som en BF-detektor. Dra först in detektorn, centrera strålen enligt ovan i de direkta justeringarna, sätt in en objektiv bländare, vanligtvis en liten sådan som 20 μm, och justera dess position för att omge strålen jämnt. (Det enklaste sättet att göra detta är att sätta in ett prov eller ett testnät för att se en gloria runt belysningen). Använd sedan diffraktionsinriktningen för att flytta strålen från axeln och till detektorområdet. Sätt in och dra tillbaka detektorn medan du tittar på strålen på skärmen för att bekräfta att strålen är blockerad av detektorn.
    3. Starta en skanning i mikroskopprogrammet och justera inställningarna för ljusstyrka och kontrast (B / C) så att signalen är nära 0 när strålen är tom och nära mättnad när full belysning faller på detektorn. Använd omfångsvisningen för att hjälpa till. Inställningarna kan kopplas på oväntade sätt, så justeringen bör upprepas flera gånger.
14. Återställ mikroskopet till en relativt låg förstoring i högförstoringsregistret (SA-läge), utan att gå in i lågt mag (LM) -läge.
15. Observera skärmströmmen för referens senare (se steg 3.1.1). Strömmen kan ändras med pistollinsen och spotstorleksinställningarna, som i TEM, med ökande antal som motsvarar en reducerad ström.
16. Spara nu ett FEG-register för att underlätta en återgång till standardvärden.
    OBS: Anläggningen kan förbereda en standarduppsättning FEG-register så att användare kan börja från en fungerande konfiguration.

2. Placering av provexemplaret

1. I LM TEM-läge, se till att rutnätet inte är ogenomskinligt. Hitta en rutnätsruta för att göra initiala justeringar. Det är bekvämt att hitta ett tomt område, ett hål eller en sönderriven rutnät. Spela in scenpositionerna för att bekvämt återvända till dem.
2. Ta provet till eucentrisk höjd. Det finns flera metoder för att göra detta. Du kan till exempel använda scenvinglaren för att luta stödrastret medan du flyttar provhöjden längs Z-axeln tills bilden slutar flyttas i sidled. Alternativt kan du markera några funktioner på visningsskärmen och luta scenen till 30 °. Funktionen flyttas i sidled. Justera provhöjden för att återställa den till den ursprungliga positionen. Öka förstoringen eller scenlutningen för att förfina. Återgå till 0° lutning.
3. Återgå till STEM-läge och sätt i STEM-detektorn. Gå till läget för lägsta höga förstoring (SA). Se till att en bild observeras på datorskärmen. Skanna snabbt för att undvika onödig exponering; 1 μs/pixel eller mindre skulle vara normalt. Observera att bilden kan se förvrängd ut vid den vänstra kanten när skanningen är alltför snabb (se bild 2).
4. Tryck på Eucentric Focus, öka förstoringen och förfina fokus medan du skannar. Det är bekvämt att använda fokusluppen som tillhandahålls av mikroskopprogramvaran.
5. Ställ in kondensorns astigmatism. Detta kan göras mest exakt med Ronchigram-metoden. Med strålen över ett tunt provområde, fokusera på den punkt där den överförda strålen blåser upp, mellan skuggbilder av provet på vardera sidan. Justera sedan kondensorns inställning för att göra den centrala disken rund. Detta kräver viss övning, särskilt för kryogena prover.
   OBS: Ett alternativ är att hitta några guldpartiklar (används ofta som fiduciella markörer för inriktning i tomografi). Öka förstoringen och fokusera upp och ner, justera astigmatismen så att partiklarna förblir runda utan töjning i båda riktningarna.
6. Gå till LM STEM-läge och fortsätt skanna för att hitta ett intressant område. Justera detektorns B/C-inställningar vid behov (steg 1.13.3), ungefär vid denna punkt.

3. Spela in en bild

1. Uppskatta dosen för registrering. Som en tumregel, sikta på 100-150 e^-/Ų för hela tomogrammet. Kontrollera dostoleransen per prov. Strömmen i Ampere (A) dividerat med laddningen per elektron representerar ett antal e^-/s, som multipliceras med exponeringstiden, T, i sekunder och divideras med synfältet i Ų. För enkelhets skull, uttrycka strömmen i nanoampere (som läses från skärmen), synfältets bredd i mikrometer och ramexponeringstiden i sekunder, med lämpliga faktorer:
   
   Detta nummer ska multipliceras med antalet lutningar för att få den totala exponeringen i serien. Till exempel, med en ström I = 0,04 nA, ett fält L = 4 μm och en exponeringstid på 12 s, får vi 1,9 e-/Å 2 per lutning, eller cirka 110 e^-/Ų för en serie av 61 projektioner.
2. Sätt tillbaka scenen i ett hål (eller dra in gallret) och justera strålströmmen med hjälp av spotstorlek och/eller pistollinsinställningar för att nå önskad skärmström. Om mätningen visar 0, sätt in en större C2-bländare för att öka strömmen. Korrigera sedan genom att dividera mätningen med kvadraten av förhållandet mellan diametrar och slutligen återgå till den mindre bländaren.
3. Förfina B/C-inställningarna enligt steg 1.13.3 och återställ slutligen scenen till ett intresseområde och kontrollera direkt inriktning och astigmatism under avbildningsförhållandena.
4. Hämta en testbild.

4. Tomografi med SerialEM

1. Starta SerialEM-servern på mikroskopdatorn (SerialEM installeras normalt på en annan). Öppna sedan SerialEM. STEM visas i SerialEM som en kamera, med samma gränssnitt. Kontrollera att kommunikationen fungerar korrekt för konfigurationen. Till exempel bör mikroskopfliken visa rätt förstoring. Om detta inte fungerar, stanna här och felsök.
2. Hitta fliken kamera och skript och öppna Inställningar. Se till att STEM-kameran är vald och välj lämpliga binnings- och uppehållstider för varje läge. Se till att lämplig detektor (eller detektorer) visas i rutan "kanaler att förvärva" längst ner till vänster. Tryck på Skaffa längst ned för att testa. Återigen, fortsätt inte om ingenting händer, eller om strålen inte lossnar. Stanna och kontrollera kommunikationen.
   OBS: Lägena används på ett liknande sätt som TEM-tomografi. Binning är ett knep för kompatibilitet med TEM. Den viktiga parametern är pixelantalet; Olika mikroskopsystem använder olika binning för att nå samma räkning.
   1. Visa och sök bör vara snabba skanningar med relativt få pixlar (t.ex. 512 x 512 pixlar vid 1 s).
   2. Fokus är i allmänhet ett litet område med snabb inspelning. Således, i lågdosläge, välj Fokus för att ha en annan förstoring än inspelningsläge, vilket kan hjälpa till med noggrannhet. Lämna spotstorleken oförändrad.
   3. För inspelningsläge använder du de parametrar som valts ovan i exponeringsuppskattningen. Om det är tillgängligt väljer du även Dynamiskt fokus, som korrigerar fokus rad för rad i en lutad bild.
   4. För enkelhetens skull senare väljer du att grupperingen för förhandsgranskning ska vara identisk med den för Visa (se Förbättring #1, steg 5.5). Bildstorleken (antal pixlar) behöver inte vara densamma.
   5. Använd utvärderingsläget för att hålla inspelningsområdet centrerat under förvärvet. Det kan likna View, men se till att det inte finns några skanningsförvrängningar på vänster sida av ramen (se bild 2 för ett exempel). Återigen, i lågdosläge, kan rättegången ha en annan förstoring än i inspelningsläge.
   6. Använd monteringsläge omedelbart för rutnätssökningen. Det bör vara tillräckligt pixeltätt för att hitta intressanta områden; Rekommendation: 512 x 512 eller 1024 x 1024. Se till att bilden är bra, med ett anständigt dynamiskt omfång (sett i bildvisningskontroller), eftersom det här läget används för att hitta provområdena.
   7. Spara inställningsfilen så att dessa val behålls som standard för nästa session (vilket kan inträffa snart om programmet kraschar).
3. Testa kalibreringarna av bildförskjutning och scenförskjutning. I mikrosondläget (eller nanosond) klickar du på Visa bild, håller muspekaren över den, håller knappen intryckt och drar diagonalt med ungefär en fjärdedel av synfältet. Ta sedan en annan vy. Bilderna ska överlappa perfekt. Upprepa genom att dra igen medan du håller ned skifttangenten (för att framtvinga en scenrörelse). Bilderna bör överlappa varandra väl, men kanske mindre exakt.
4. Gå till LM-läge och testa scenförskjutningen. Om dessa tester misslyckas stoppar du och felsöker. Resten fungerar inte.
5. Gör en LM-montagekarta över hela rutnätet. Detta kan också göras i TEM.
   1. Gå till STEM-läget med lägsta förstoring där bilden inte blockeras av bländare, vanligtvis runt 185x.
   2. Klicka på menyn Navigatör > Öppna. Klicka sedan på menyn Navigatör > Nav. Alternativ > avmarkera Konvertera kartor till byte.
   3. Välj menyn Navigatör > Montage &; Grids > Setup Full Montage. En meny öppnas. Alternativen att kontrollera är: Flytta scen istället för att flytta bild, Gör karta från varje montage om Navigator är öppen och Använd Montagemappning, inte Spela in parametrar. Bildrutnätet bör vara ungefär 6 x 6 eller 7 x 7. Leta efter den totala ytan som ska registreras. Om för många bilder krävs, kanske förstoringen inte läses korrekt från mikroskopet (figur 3). Stanna och kolla.
   4. För att starta Montage-förvärvet, tryck på Start på Montage-kontrollerna eller Montage under Kamera &; Skript. En annan meny öppnas för att välja filparametrar: mrc, lagra som heltal och i ännu en dialogruta väljer du filnamnet för lagring. Se till att lagra data i lämpligt dataområde och inte under SerialEMs egna användarinställningar. Det rekommenderas att inte lagra stora data på C-skivan där systemet finns.
   5. När förvärvet är klart visas montaget i huvudfönstret (figur 4). Man kan nu navigera runt i rutnätet med markören och punkterna på navigatorn, precis som i TEM.
6. Kontrollera astigmatismkorrigeringen igen. Vanligtvis är det tillräckligt att skanna ett litet område snabbt och justera tillsammans med fokus så att punktliknande egenskaper som guldnanopartiklar förblir helt runda när de passerar in och ut ur fokus (som på en SEM) vid hög förstoring. Mer konservativt kan man upprepa de direkta justeringarna av steg 1.5-1.8 innan man fixar astigmatism.
7. Rikta in bilden med hög förstoring mot LM-montaget.
   1. Gå till en position på LM-montaget med någon lätt igenkännlig funktion. Lägg till en punkt, klicka på Navigator-fönstret > Lägg till poäng och klicka på funktionen. Tryck igen (sluta lägga till) för att inaktivera.
   2. Ta en visnings- eller provbild med den lägsta höga magförstoringen (HM) och hitta det angivna objektet. Placera markören där (grönt kors) och med motsvarande punkt markerad i fönstret Navigatör, i menyn Navigatör > Skift till markör..., i dialogrutan som öppnas, välj Alla kartor och Spara skift, som visas i figur 5.
   3. Testa genom att flytta scenen till andra positioner och verifiera att HM-bilden är centrerad på samma platser som valts i LM-montaget. Om funktionen inte är synlig i HM-bilden kan växlingen mellan LM- och HM-lägena vara för stor. Gör i så fall ett polygonmontage över ett större område. Klicka på Navigatörsfönstret > Lägg till polygon, välj några punkter och klicka sedan på Lägg till polygon igen för att stänga. Klicka på menyn Navigatör > Montage och rutnät > Konfigurera polygonmontage och monteringskontroller > Start. Hitta sedan motsvarande punkter som ovan och klicka på Skift till markör ....
8. Ställ in lågdosläge.
   1. Öppna fliken Low Dose Control och markera rutan Low Dose Mode .
   2. Markera Kontinuerlig uppdatering och gå till Visa. Välj mikroskopförstoring för detta läge, vanligtvis den lägsta eller bredvid den lägsta. Välj vart och ett av de följande lägena och ställ in lämplig förstoring. Inspelningen bör ställas in för att uppnå önskad pixelstorlek, och fokusförstoringen bör vara tillräckligt hög för att fiduciella markörer eller andra högkontrastfunktioner för fokusering kommer att lösas tydligt. Avmarkera sedan omedelbart Kontinuerlig uppdatering.
      OBS: Försöksläget kan antingen ställas in på liknande sätt som Record, i vilket fall spårningsområdet måste förskjutas från inspelningsområdet för att minimera exponeringen, eller till låg förstoring, som omfattar mycket av omgivningen.
   3. Ta en Visa-bild och ställ in Trial-positionen med Definiera position för område: Trial.
      OBS: Rekommendation #1: Med tanke på förändringen i det provtagna området och tiden kan den extra exponeringen för en låg mag-studie vara minimal. Så länge rutnätsfältet inte kommer in i synfältet är denna spårningsmetod vanligtvis mer tillförlitlig. Rekommendation #2: Det är också möjligt att uppdatera spotstorleken för att justera dosen för olika lägen, till exempel Focus. För stabilitet i inställningarna för mikroskopoptik rekommenderar vi att du inte gör detta, utan snarare lämnar den punktstorlek som är lämplig för inspelning och sedan justerar exponeringstiden om det behövs för de snabbare skanningslägena.
   4. Klicka på fliken Low Dose Control > Gå till: Rec., klicka sedan på Navigator-menyn > Öppna bildtillstånd > Lägg till aktuellt tillstånd. Ge den ett namn så att den lätt kan återkallas (t.ex. μP STEM för mikrosond-STEM). Olika tillstånd kan definieras för olika uppgifter.
9. Flytta scenen till en plats av intresse för tomografi (mer om användningen av Navigator nedan).
   1. Lägg till en punkt i navigatören genom att klicka på Navigatörsfönstret > Lägg till punkter.
   2. Förfina den eucentriska höjden genom att välja Uppgifter > Eucentricitet > Grov. Navigatörsfönstret > Uppdatera Z.
   3. Ställ in områdena för Fokus och Rättegång. Ta först en Visa bild. På fliken Låg doskontroll , under Definiera områdets position, väljer du Fokus eller Prövning. Justera positionerna för de två områdena längs lutningsaxeln. Fokus får inte överlappa inspelningsområdet.
      OBS: Tänk på att det finns en viss överskjutning, särskilt vid vänster kant, så ingen av dem bör ställas in omedelbart intill inspelningsområdet. Omfattningen av överskridandet kan utvärderas på ett testområde genom att upprepade gånger skanna vid Record förstoring och sedan minska förstoringen för att få en bredare vy.
10. För bra mått (valfritt med erfarenhet), luta scenen till +60° och sedan -60°, varje gång du tar en visnings- eller förhandsgranskningsbild för att säkerställa att rutnätsfältet inte kommer in i visningsfältet för inspelningsområdet som visas i grönt.
11. Ställ in lutningsserien.
    1. Öppna en ny fil för att spara data genom att klicka på Arkiv > Öppna ny och välja ett filnamn. Välj menyn Tilt Series > Inställning av Tilt-serien (bild 6). Felsökning: Om knappen Öppna ny är grå kontrollerar du att den tidigare lutningsserien har avslutats. Om inte, avsluta genom att klicka på Tilt Series > Terminate.
    2. Ställ in de extrema lutningsvinklarna i rutorna Luta till och Sluta vid , vanligtvis -60° respektive +60°, samt steget, vanligtvis 2°.
    3. För det dossymmetriska läget (rekommenderas - se till att lågdosläget fortfarande är aktivt), kontrollera Kör serien i två riktningar från ___. Blindämnet är normalt 0, men kan användas för att kompensera för förlutande FIB-lameller (t.ex. vid 20°).
    4. För enkelhetens skull, markera Håll exponeringstiden konstant. Att ändra detta kräver viss omarbetning av exponeringsberäkningen och kan också störa algebraiska rekonstruktioner (t.ex. ART/SART/SIRT), som jämför projicerade intensiteter med originaldata (se steg 7.1).
    5. Markera Hoppa över autofokusering. En liten halvkonvergensvinkel, till exempel 1 mrad, innebär ett så långt skärpedjup att det kan vara onödigt att fokusera. Som ett test, fokusera på 0 °, luta till 60 ° eller -60 ° och tryck på Record. Att behålla fokus är främst en fråga om exakt eucentrisk höjd. För större konvergens kan det vara nödvändigt att fokusera under serien. Ta i så fall en vy och på fliken Låg doskontroll definierar du områdets och fokusens position och justerar fokusområdet.
    6. Inledande och slutliga åtgärder: Om eucentrisk höjdjustering utfördes korrekt behöver du inte upprepa den. Avmarkera Stäng kolumnventiler i slutet av serien om det inte finns goda skäl att inte göra det.
    7. För att spåra kontrollparametrarna finns det många alternativ. För obevakad datainsamling är högsta prioritet att undvika att programmet stannar för användarinmatning. Använd de rekommenderade inställningarna: upprepa Spela in om procentandelen förlorade fält är mer än 5. Spåra sedan efter och markera Justera med förhandsgranskning innan du hämtar ny spårreferens och Hämta ny spårreferens om postjusteringen skiljer sig med 2 %. För bevakad datainsamling ska du tillämpa strängare parametrar för att undvika risken att förlora timmar av instrumenttid.
    8. När du är redo att starta trycker du på GO längst ned i fönstret. I slutet väljer du Tilt Series > Terminate.

5. Batchförvärv på flera punkter med hjälp av Navigator (Enhancement #1)

OBS: Protokollet är rudimentärt eftersom a) det är identiskt med TEM och b) nya verktyg blir tillgängliga som sannolikt kommer att göra en fullständig beskrivning föråldrad.

1. Ladda hela rutnätsmontaget till huvudfönstret.
2. Välj ett antal områden som ser lovande ut. Klicka på Lägg till punkter och lägg till i mitten av markerade rutnätsrutor. Klicka på Lägg till poäng igen för att inaktivera läget.
3. När lågdosavbildningstillståndet är aktiverat väljer du Navigator-fönstret > markerar Hämta och Ny fil vid objekt för var och en av de valda rutorna. För det första öppnas en dialogruta för filegenskaperna (bild 7) och sedan filnamnet. Välj Monterade bilder och markera sedan Använd visningsparametrar i lågdosläge i dialogrutan Montageinställningar (bild 8) och gör ett rutnät som är tillräckligt stort för att täcka kvadraten (ungefär 100 x 100 μm).
4. Klicka på menyn Navigatör > Hämta vid objekt och välj parametrar för mappning. Viktigast av allt, i Primära åtgärder, markera Gör navigatorkarta, sedan Grov eucentricitet och fin eucentricitet och tryck på Gå (figur 9). För ett rutnät med 200 maskor resulterar detta i en karta över ungefär hela kvadraten (figur 10)
5. Förbered dig för val av tomogramposition. Öppna en ny fil genom att klicka på Arkiv > Öppna ny. Ge den ett filnamn (t.ex. AnchorMaps.mrc).
   1. När lågdosläget är aktivt anger du Camera &; Script > Setup och ser till att View och Preview finns i samma binning (annars kan de inte sparas i samma fil).
   2. Besök punkter i kvadratkartorna genom att klicka på Navigator-fönstret > Gå till XYZ.
   3. Välj en position för det första tomogrammet med markören. Ta en förhandsgranskningsbild och förfina positionen genom att dra med höger musknapp. Välj sedan Navigatörsfönstret > Ny karta och klicka på ja i dialogrutan för att spara. Ta sedan en Visa bild av samma område och spara igen som en ny karta. Kontrollera att Visa karta är markerat och markera För fästpunktstillstånd i fönstret Navigatör längst upp till höger.
   4. Välj den andra positionen, ta igen en förhandsgranskning och förfina platsen enligt ovan, och den här gången trycker du på Ankarkarta i fönstret Navigatör. Då sparas både Förhandsvisning och Vy som nya kartor i navigatorn.
   5. Upprepa steg 5.5.4 för alla önskade platser. Flytta från en rutnätsruta till en annan genom att markera punkten och trycka på Gå till XYZ i fönstret Navigatör.
6. För referensfokus, välj ett tydligt område i rutnätet och fokusera noggrant, för hand eller med autofokus. Tryck på Återställ defokus på mikroskoppanelen. Skapa ett skript i SerialEM genom att klicka på Script > Edit > Edit 15 (eller ett annat gratisnummer) och ange två rader: ScriptName SetDefocus och SetDefocus 0.
7. I fönstret Navigatör markerar du den första platsen (antingen Förhandsgranska eller Visa). Tryck på skift-T och markera sedan den sista platsen och tryck igen på skift-T. Dialogrutan Filegenskaper öppnas. Välj bilder och parametrar med en bildruta att spara, inklusive filnamnet. Redigera filnamnet men lämna objektetiketten i slutet.
   OBS: Filnamn som slutar med siffror uppdateras automatiskt för successiva lutningsserier. Det är bekvämt att använda alternativet Navigatör-menyn > Nav. Alternativ > använda objektetiketter i filnamn.
8. Därefter öppnas inställningsmenyn för Tilt Series automatiskt. Fyll som tidigare (figur 6), men välj inte Förfina eucentricitet. Förhandsgranskningspunkterna i navigatorn markeras nu som TS. Man kan återgå till den här menyn med knappen i fönstret Navigatör ovanför objektlistan.
9. Välj menyn Navigatör > Hämta vid objekt. Den här gången väljer du parametrar för Slutliga data. Välj Primär åtgärd: Hämta lutningsserie och välj Hantera Dewars/Vacuum, Justera till objekt, Fine Eucentricitet och Kör skript före åtgärd, med Script för att köra: SetDefocus. Välj allmänna alternativ: ingen meddelanderuta när fel uppstår och stäng kolumnventilerna i slutet och tryck sedan på GO (Figur 11). SerialEM kommer nu att besöka alla ankarkartor och registrera en lutningsserie vid varje position (figur 12).

6. CLEM kartregistrering (Förbättring #2)

1. Om det inte redan har gjorts, ladda hela rutnätsmontaget i huvudfönstret och skapa sedan ett nytt fönster genom att klicka på Fönster > nytt fönster och ge det ett namn. Observera att hela rutnätsmontaget visas i Registrering 1.
2. Importera CLEM-kartbilden genom att klicka på menyn Navigatör > Importera karta. Det bör gå in i registrering 2. Det kan också tilldelas ett nytt fönster enligt ovan.
3. Kontrollera CLEM-kartan för att bestämma den relativa rotationen med avseende på hela rutnätsmontaget. Det är lättast att göra detta på en karta där rutnätsfälten visas. Observera att kartan också kan vändas. Justera den grovt med hjälp av menyn Navigatör > Rotera karta, med Vänd om det behövs.
   OBS: Följande steg kan också rymma en flip, men att göra det i förväg gör följande mycket enklare. Detta steg kan upprepas tills justeringen ser tillfredsställande ut, men det är inte nödvändigt att vara exakt.
4. Inför registreringspunkter för exakt inriktning. Placera ett antal motsvarande punkter på det ena och sedan det andra fönstret. För varje sådan punkt markerar du Registreringspunkt högst upp i fönstret Navigatör. Motsvarande punkter kommer att märkas med ett stigande index, följt av R1 eller R2 för rutnätsmontage respektive importerad karta.
   OBS: Användning av finder-rutnät gör detta steg mycket enkelt. Annars väljer du heltäckande funktioner som mittmarkören eller hörnen på rutnätsrutor. I princip räcker det med tre punkter för en grov inriktning, men fler punkter hjälper till att kompensera för mindre avvikelser i montagekonstruktionerna.
5. Om flera kanaler i en CLEM-karta önskas, till exempel olika fluorescerande färger eller fluorescens utan ljusfältbakgrund, importerar du dem som i steg 6.2 ovan och ändrar registreringarna till 2. På så sätt ärver de registreringspunkterna från den första kartan.
6. Tvinga registreringen via menyn Navigatör > Transformera objekt. Motsvarande registreringspunkter kommer nu att visas på alla kartor, som kommer att listas i Registrering 1. Om du vill justera visuellt klickar du på menyn Navigatör > Rotera karta. Observera att när en karta läses in från fönstret Navigatör roteras den inte automatiskt om inte rutan Rotera vid inläsning är markerad. Den kan alltid roteras från fönstret Navigatör.
7. Det bör nu vara möjligt att placera markören eller en punkt på fluorescenskartan och flytta scenen till motsvarande plats på rutnätet (figur 13).

7.3D återuppbyggnad

1. Detta omfattar samma grundläggande steg som TEM-tomografi: inriktning av lutningsserien följt vanligtvis av bakprojektion. Flera programvaruplattformar finns tillgängliga, och data kan behandlas på samma sätt som TEM-data, med undantag för att CTF-korrigering ska hoppas över.
2. Tillämpa intensitetsnormaliseringar för att förbättra bidraget från projektioner med hög lutning eller för att balansera en förändring i belysningen under serien, med förbehållet att kvantitativ information påverkas. IMOD²⁶ fungerar till exempel bra, medan AreTomo²⁷ är mycket användbar för fiducial-less justering; där fiduciella partiklar är närvarande kan ClusterAlign²⁸ följa dem som kluster snarare än enskilda fläckar; Detta är särskilt användbart för STEM-data där fläckar kan gå förlorade eller döljas av funktioner med hög kontrast.
3. Följ rekonstruktion med 3D-dekonvolution²⁹ för kontrastförbättring och denoising. När de har rekonstruerats representerar de STEM-volymdata med någon av standardmetoderna, såsom ortoskivor eller isosurface-segmentering. Noterbart är att intensitetsfördelningen är unipolär, utan kontrastinversioner eller Fourierfransar som förekommer i konventionell faskontrast TEM. Ett intressant sätt att representera STEM-tomogram är i allmänhet att invertera det ljusa fältet (figur 14). Effekten är att "röntgenögon" ser de täta föremålen av intresse genom den klarade cellen³⁰.

Representative Results

Ett fullständigt rutnätsmontage förberett i STEM visar områdena med celler av intresse (figur 4). Observera att bilden är i mörkt fält, så tomma hål verkar mörka. Celler verkar delvis ljusa, där elektronerna sprids mot HAADF-detektorn. Vid de tjockaste delarna, vanligtvis centra eller nära gallerstängerna, blir kontrasten mörk igen. Detta beror på multipel spridning, varigenom elektronerna når vinklar som inte fångas av detektorn. I praktiken kommer dessa områden att vara för tjocka för tomografi.

Nästa steg innebär kartor med mellanliggande förstoring (figur 10). Dessa kallas ofta medelstora montagekartor, eller fyrkantiga kartor, med hänvisning till rutnätsrutorna snarare än formen. Även vid det lägsta mikrosonden STEM-läget kommer de också att förvärvas som montagebilder. Om du klickar på objektet i fönstret Navigatör laddas kartbilden i huvudfönstret. Specifika punkter för tomogramförvärv väljs inom detta område. Använd förhandsgranskningsläget för att hitta området vid inspelningens förstoring. Tänk på att det kan finnas en sidoförskjutning mellan förhandsgranskning och inspelning, beroende på skanningshastigheterna. En enda lutningsserie kan spelas in här. Mitokondrier, till exempel, kan ofta identifieras i förhandsgransknings- och inspelningsbilden (figur 12).

För batchtomografi kommer scenen att resa runt nätet och kanske inte återgå till exakt samma plats. Ankarkartor används för att säkerställa att de önskade inspelningsområdena identifieras på ett tillförlitligt sätt genom att matcha förhandsvisningsbilden med en vy med lägre förstoring, även om scenrörelsen har flyttats. PyEM^23,24 erbjuder ett snabbare alternativ som verkligen rekommenderas^, men är ännu inte en del av standardinstallationen.

I CLEM-metoden kan en fluorescenskarta användas för att identifiera de områden som är intressanta för tomografi. Fluorescensen förvärvas externt och måste registreras på hela gallermontage. Det är användbart att ha gallerstängerna och hålen synliga, så en sammanslagen fluorescens + ljusfältskomposit kan förberedas före import, till exempel i GIMP (https://www.gimp.org) eller ImageJ^{31-programvaran} (se till att ImageJ inverterar den vertikala axeln). När fluorescensens dynamiska område är stort kan det vara svårt att skapa en sådan sammanslagning utan mättnad. I detta fall får de två kartorna importeras separat och sedan registreras tillsammans enligt beskrivningen (figur 13). På så sätt tar en punkt på fluorescenskartan i fönstret Navigatör, följt av "Gå till XY", scenen till motsvarande position på rutnätet som monterat i TEM. Se till att små inkonsekvenser i skapandet av montaget (eller fluorescenskartan, om det också är ett montage) kommer att leda till små förskjutningar; För optimal precision bör fluorescensen därför omregistreras specifikt på kvadratkartan. Det är ofta tillräckligt att göra denna registrering med ögat, på grundval av hål i stödfilmen eller funktioner som delas med ljusfältsljusbilden.

Rekonstruktion av lutningsserien resulterar i en 3D-volym (figur 14). Detta exempel har en pixelstorlek på 2,042 nm, vilket resulterar i ett synfält på ~ 4 μm. Kalciumfosfatavlagringar (orange pilspetsar) sticker ut på grund av det högre atomnumret jämfört med omgivningen. Mikrotubuli (röda pilspetsar) kan spåras genom hela synfältet. Dessutom kan de inre och yttre mitokondriella membranen (gröna pilspetsar) tydligt ses. Actin kan observeras som buntar eller som enskilda filament. För att uppnå en mer isotrop upplösning kan rekonstruktionen behandlas genom dekonvolution.

Figur 1: Jämförelse mellan TEM och STEM. I TEM belyses synfältet av en nästan parallell stråle och objektivlinsen bildar en förstorad bild på kameran. För kryo-TEM öppnas den objektiva bländaren för att passera de spridda elektronvågorna (streckad röd linje), som med deskärpa producerar faskontrast genom interferens med de ospridda (gröna) vågorna. STEM, å andra sidan, raster en fokuserad stråle över provet och samlar de spridda elektronerna på ett pixel-för-pixel-sätt. Flera detektorer kan samla elektroner spridda i olika vinklar. Denna siffra har ändrats från³⁰. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Exempel på bildförvrängning på vänster sida på grund av den höga skanningshastigheten. Notera förvrängningen markerad med gula pilspetsar, liksom de förvrängda ovalformade hålen i Quantifoil. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Dialogruta för montageinställning för hela rutnätsmontage. Välj förstoring och antal bitar i X och Y så att den totala ytan når cirka 2 000 μm för att få en karta för större delen av rutnätet. Välj också Flytta scen istället för att flytta bild och Använd Montagemappning, inte Spela in parametrar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Bild 4: GridMap med full låg förstoring inspelad i STEM-läge. Brutna områden ser helt svarta ut i bilden av det mörka fältet. Mörkgrå områden är sannolikt för tjocka och dåligt förglasade. Bra kandidatområden för tomografi är vita eller ljusgrå i denna skanning. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Bild 5: Växla till markörprocess. Ett igenkännbart objekt markeras i kartan med låg upplösning med Lägg till punkter (38 i den här bilden). Observera skiftet mellan kartan med låg upplösning (grön cirkel) och kartan med medelhög upplösning (orange cirkel). Sedan markeras objektet med markören (grönt kors, röd cirkel) och dialogrutan Skift till markör startas. Det valda alternativet flyttar alla kartor med 245x med samma belopp. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Inställningsdialog för lutningsserien för en lutningsserie med STEM. Det dossymmetriska schemat används från -60° till +60° i steg om 2°. Autofokus hoppas över på grund av det höga skärpedjupet när du använder en låg konvergensvinkel. Inget behov av att förfina eucentriciteten som detta har gjorts tidigare. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Bild 7: Dialogruta för filegenskaper för kartor med medelhög upplösning. Spara som en MRC-stackfil, välj heltal och spara extra information i en .mdoc-metadatafil. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 8: Dialogruta för montageinställning för att spara kartor med medelhög upplösning. För en kvadrat på ett 200 masknät, som är 90 μm brett, rekommenderas en total yta på minst 90 μm x 90 μm. Välj Flytta steg istället för att flytta bild och Använd vyparametrar i lågdosläge. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 9: Inspelning av karta med medelhög upplösning. Skaffa vid objekt-dialog för inspelning av kartor med medelhög upplösning. Välj Mappning, Hämta och spara bild eller montage och markera Gör navigatorkarta. I Uppgifter före eller efter Primär väljer du Grov och fin eucentricitet. Om du inte har hjälp kan du välja Ingen meddelanderuta när fel uppstår och Stäng kolumnventiler i slutet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 10: Bild av karta med medelhög upplösning. Karta med medelhög upplösning (Square Map) inspelad i STEM-läge med ett montage på 3 x 3. De två ankarkartorna med medelhög upplösning för datainsamling indikeras med de blå fyrkanterna. Skalstapel = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Bild 11: Seriedata för batchlutning. Skaffa på Items dialog för att samla batch tilt serier. För datainsamling av lutningsserier väljer du Slutliga data och Hämta lutningsserier. Vid Uppgifter före eller efter Primär markerar du Hantera dewars/vakuum (välj lämpliga inställningar i inställningsmenyn), Justera till objekt, Fin eucentricitet och Kör skript före åtgärd. I Allmänna alternativ markerar du rutan Inget meddelande när fel uppstår och Stäng kolumnventiler i slutet (se 5.14). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 12: 0° lutning av en STEM-lutningsserie av en mitokondrion. Orange pilspetsar pekar på kalciumfosfatavlagringar (matrisgranulat), gröna pilspetsar på cristae och röda pilspetsar på 15 nm guldfiduciella markörer. Skalstång = 500 nm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 13: Registrerade kryo-CLEM-kartor. (A) STEM-karta med medelhög upplösning (kvadratisk karta, 26-A) är registrerad på (B) STEM-kartan med låg upplösning, (C) BF-kanalens kryo-FM-karta och (D) GFP-kanalens kryo-FM-karta. De nio registreringspunkterna (etiketterna 4-21) visas i (E) Navigator. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Bild 14: Volymåtergivning. Volymåtergivning av (A) 60 nm och en (B) 40 nm tjock sektion genom ett SIRT-liknande (30 cykler) filtrerat tomogram på olika djup. Pixelstorleken är 2,048 nm, vilket resulterar i ett synfält på cirka 4 μm. Observera den inverterade densiteten jämfört med figur 12, vilket innebär att högintensiva funktioner är ljusa. Orange, vita, röda, gröna och ljusblå pilspetsar pekar på kalciumfosfatavlagringar, ribosomer, mikrotubuli, det inre och yttre mitokondriella membranet respektive aktinfilament. Skalstång = 500 nm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Protokollet ska hjälpa biovetenskapliga mikroskopister som är intresserade av att få en 3D-vy av intracellulära organeller i områden i cellen som inte är tillgängliga för konventionell TEM-tomografi. Samma protokoll kan också användas för STEM-tomografi av plastsnitt, med mildrade begränsningar för exponeringen. Protokollet bör betraktas som en utgångspunkt snarare än en uppsättning hårda regler. Faktum är att kraften i STEM är dess flexibilitet; Det finns inget rätt sätt att använda det.

Vi betonar att STEM i sig endast hänvisar till den skannade sonden och inte definierar bildbildningen. Kontrast beror främst på konfigurationen av detektorer. De enklare metoderna använder detektorer med axiell symmetri, antingen en skiva centrerad på den optiska axeln eller en ringformad som omger den. I allmänhet, när belysningen träffar detektorn direkt, spelar vi in en BF-bild där (elektronspridning) provet verkar mörkt; omvänt, när detektorn bara samlar spridda elektroner, registrerar vi en DF-bild där det täta provet verkar ljust. När lämplig hårdvara finns tillgänglig kan SerialEM hämta och spela in båda dessa signaler samtidigt. Ännu mer sofistikerade konfigurationer finns tillgängliga, allt från detektorer med flera segment till helt pixelerade kameror. Faskontrastavbildning kan uppnås till exempel genom att utvärdera skillnaden mellan off-axis detektorelement^32,33. Att samla in hela 2D-spridningsmönstret (diffraktion) per pixel definierar metoden som kallas 4D STEM³⁴, vilket möjliggör rekonstruktion av flera bildkontraster från samma originaldata. Fyrdimensionell STEM möjliggör elektronptykografi, vilket ger ett annat sätt att erhålla faskontrast³⁵.

Vi har fokuserat på den speciella STEM-modalitet som vi anser vara mest användbar för studier av organeller och intakta celler eller mikrontjocka cellsektioner. Detta innebär specifikt användning av BF-avbildning med en liten halvkonvergensvinkel i belysningen och en relativt stor uppsamlingsvinkel vid detektorn. Den lilla konvergensen ger ett stort skärpedjup så att hela provet förblir i fokus genom hela lutningsserien¹⁹. I praktiken, med ett bra mikroskopsteg, kan det också eliminera behovet av fokusjustering under förvärvet. Priset är en kompromiss i upplösning, som beskrivs i avsnitt 3 i protokollet. Vi har föreslagit 4k-bilder med en sond på ~ 2 nm, som med 1 nm pixelavstånd når ett synfält på 4 μm. Läsaren uppmanas dock starkt att experimentera. Det andra övervägandet är på sidan av detektorn. När belysningsskivan underfyller BF-detektorn på axeln undertrycks faskontrasten och spridningskontrasten (amplituden) dominerar; Detta tillstånd har kallats osammanhängande ljusfältkontrast³⁶. Frågan är med vilken fraktion som ska fyllas på, och svaret beror på provet. Ett mycket tunt prov visar bäst kontrast med detektorn helt fylld (dvs. uppsamlingsvinkeln som matchar belysningens), men ett tjockare prov sprider bort all intensitet och lämnar en bullrig signal med dålig kontrast. En användbar tumregel är att ju tjockare provet är, desto större bör BF-detektorns yttre avskärningsvinkel vara²¹. Detektorns storlek och position är naturligtvis fasta, så diffraktionsskivans storlek justeras med hjälp av kameralängden, som beskrivs i avsnitt 1. Om detektorförstärkarens inställningar är sådana att signalen fyller det dynamiska området men inte mättas under direkt belysning (1.12.3), kan kamerans längd ökas tills en rimlig signalintensitet och kontrast uppnås. Återigen uppmuntras läsaren att experimentera. Konsten är så att säga i vinklarna.

En annan parameter, som inte diskuteras i protokollet, är mikroskopaccelerationsspänningen. Interaktionen mellan de lysande elektronerna och provet blir starkare vid en lägre spänning. Med allt annat lika kan vi förvänta oss högre kontrast vid lägre spänning. Å andra sidan är det uppkomsten av multipel spridning inom provet som begränsar den användbara provtjockleken, så en högre spänning tillåter användning av tjockare prover. Dessa effekter är dock ganska subtila. Våra erfarenheter hittills med 200 kV och 300 kV accelerationer är likartade.

Med tanke på vad som kan förväntas av STEM när det gäller upplösning beror detta återigen på provet och detektorkonfigurationen. Med hjälp av en enda partikelanalysmetod kunde metalljoner på ferritin lokaliseras av ringformigt mörkfält STEM till en precision av några ångström³⁷. På senare tid uppnåddes subnanometerupplösning för virus- och proteinprover med hjälp av bilder erhållna genom integrerad differentialfaskontrast (iDPC) STEM³² samt ptykografi³⁵. För unika föremål i tjocka cellulära prover, och med de metoder som beskrivs här, är en sådan hög upplösning inte realistisk. Den optimala upplösningen är sonddiametern, som relaterar till halvkonvergensvinkeln enligt beskrivningen. Andra faktorer kommer att försämra upplösningen, särskilt en grov pixelprovtagning för att nå ett stort synfält, felinriktningar i lutningsserien och spridning av sondstrålen vid överföring. Bilder jämför bra med plastsektionstomografi. Med den inställning som beskrivs här, till exempel, bör det vara lätt att se den ihåliga kärnan i mikrotubuli, men inte de enskilda protofilamenten.

Sammanfattningsvis är både STEM-metoder och hårdvara i en utvecklingsfas. Vi kan förvänta oss att innovationer inom bildbehandling också kommer att påverka tomografi, vilket leder STEM till domäner som inte har varit tillgängliga med andra tekniker. Vi förväntar oss att en konvergens med korrelativ kryogen fluorescensavbildning baserad på moderna optiska superupplösningsmetoder kommer att vara särskilt fruktbar. Organellskalan, 100-1 000 nm, är ett idealiskt mål för dessa framväxande metoder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SerialEM	University of Colorado	Veriosn 4.0	SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition.
STEM-capable transmission electron microscope			The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well.