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Biology

Visualisierung von Organellen in situ mittels Kryo-STEM-Tomographie

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65052
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Chemical and Biological Physics, Weizmann Institute of Sciences, 2Department of Chemical Research Support, Weizmann Institute of Sciences

Summary

Die Kryo-STEM-Tomographie bietet eine Möglichkeit, Organellen intakter Zellen ohne Einbettung, Schnitt oder andere invasive Präparate sichtbar zu machen. Die erzielte 3D-Auflösung liegt derzeit im Bereich von wenigen Nanometern, mit einem Sichtfeld von mehreren Mikrometern und einer zugänglichen Dicke in der Größenordnung von 1 μm.

Abstract

Die kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) beruht auf der Bildgebung biologischer oder organischer Proben, die in ihr natives wässriges Medium eingebettet sind. Wasser wird ohne Kristallisation zu einem Glas verfestigt (d. h. verglast). Die Kryo-EM-Methode wird häufig verwendet, um die Struktur biologischer Makromoleküle in jüngster Zeit mit einer nahezu atomaren Auflösung zu bestimmen. Der Ansatz wurde auf die Untersuchung von Organellen und Zellen mittels Tomographie ausgeweitet, aber die konventionelle Methode der Weitfeld-Transmissions-EM-Bildgebung weist eine starke Einschränkung in der Probendicke auf. Dies hat dazu geführt, dass dünne Lamellen mit einem fokussierten Ionenstrahl gefräst werden. Die hohe Auflösung wird durch Subtomogramm-Mittelung aus den Rekonstruktionen erreicht, aber dreidimensionale Beziehungen außerhalb der verbleibenden Schicht gehen verloren. Die Dickenbegrenzung kann durch gescannte Sondenbildgebung umgangen werden, ähnlich wie beim Raster-EM oder dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop. Während die Rastertransmissionselektronenmikroskopie (STEM) in den Materialwissenschaften eine atomare Auflösung in Einzelbildern liefert, erfordert die Empfindlichkeit kryogener biologischer Proben gegenüber Elektronenbestrahlung besondere Überlegungen. Dieses Protokoll stellt einen Aufbau für die Kryotomographie mit STEM dar. Die grundsätzliche topische Konfiguration des Mikroskops wird sowohl für Zwei- als auch für Drei-Kondensor-Systeme beschrieben, während die Automatisierung durch die nicht-kommerzielle SerialEM-Software erfolgt. Verbesserungen bei der Batch-Erfassung und der korrelativen Ausrichtung auf zuvor erfasste Fluoreszenzkarten werden ebenfalls beschrieben. Als Beispiel zeigen wir die Rekonstruktion eines Mitochondriums, wobei wir auf die innere und äußere Membran und die Calciumphosphat-Granula sowie auf die umgebenden Mikrotubuli, Aktinfilamente und Ribosomen hinweisen. Die Kryo-STEM-Tomographie zeichnet sich dadurch aus, dass sie das Theater der Organellen im Zytoplasma und in einigen Fällen sogar die Kernperipherie der adhärenten Zellen in Kultur aufdeckt.

Introduction

Die dreidimensionale (3D) Visualisierung von Organellen ist eine überragende Aufgabe in der modernen Zellbiologie. Angesichts der Skalen, die von Dutzenden von Nanometern für sekretorische Vesikel bis zu vielen Mikrometern für den Zellkern reichen, ist es schwierig, eine einzige Mikroskopietechnik zu finden, die für alle Anwendungen geeignet ist. Während die moderne Fluoreszenzmikroskopie einen Großteil des Bereichs in Bezug auf die Auflösung abdecken kann, erscheinen nur die markierten Moleküle. Das zelluläre Theater bleibt das Reich der Elektronenmikroskopie. Herkömmliche Methoden der chemischen Fixierung, der plastischen Einbettung und der Färbung mit Schwermetallen sind stark invasiv, so dass die Ergebnisse von den Details der Probenvorbereitung abhängen können. Die Kryo-EM hingegen ist durch die Notwendigkeit eingeschränkt, das wässrige Medium zu verglasen; Eiskristalle, die sich bilden, beugen die Elektronenbeleuchtung und verursachen Kontrastartefakte mit höherem Kontrast als das interessierende organische Material.

In den letzten zehn Jahren hat sich die Zahl der EM-Bildgebungstechniken, die für zelluläre Studien entwickelt oder angepasst wurden, stark verbreitet1. Das Hochdruckgefrieren in Kombination mit iterativem fokussiertem Ionenstrahlfräsen (FIB) und serieller Oberflächenbildgebung mit dem Rasterelektronenmikroskop (d. h. FIB-REM) ist derzeit die Methode der Wahl für große Proben2. Die kryogene weiche Röntgentomographie (Kryo-SXT) eignet sich für Proben mit einer Größe von mehreren Mikrometern, begrenzt durch die charakteristische Absorptionslänge der weichen Röntgenstrahlen in Wasser 3,4,5. Diese Skala umfasst viele intakte Zelltypen, und die quantitative Natur des Röntgenabsorptionskontrasts fügt einen Aspekt der Konzentrationsmessung6 oder Spektroskopie7 hinzu. In Kombination mit der Subtomogramm-Mittelung bietet die Kryo-Transmissionselektronentomographie (Kryo-ET), die auf der Phasenkontrast-Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) basiert, die höchste Auflösung für Makromoleküle oder -komplexe 8,9,10. Es ist jedoch selten, dass intakte Organellen so regelmäßig sind, dass sie im Ganzen gemittelt werden können. Darüber hinaus ist der konventionelle Modus der Weitfeld-TEM für die Probendicke auf einige hundert Nanometer begrenzt, und zwar durch die Kombination von inelastischer Streuung (mit Energieverlust) in der Probe und chromatischer Aberration in der magnetischen Objektivlinse11,12. Die große Energieverteilung erfordert die Verwendung eines Energiefilters, um den resultierenden unscharfen Dunst zu entfernen, aber die empfindliche Probe erleidet immer noch Strahlungsschäden, während das Bildsignal mit zunehmender Dicke exponentiell schwächer wird.

Der alternative Bildgebungsmodus, Scanning Transmission EM (STEM), umgeht die Notwendigkeit der Energiefilterung und behält die inelastisch gestreuten Elektronen für die Bilderzeugung zurück, wenn auch derzeit mit einer geringeren Auflösung als bei der TEM-Tomographie (Abbildung 1). Tatsächlich entsteht kein wirkliches Bild. Stattdessen werden wie bei einem scannenden EM Punkt für Punkt Messungen durchgeführt und das Bild vom Computer zusammengesetzt. Die Vergrößerung wird nur durch die Größe der Scanschritte bestimmt, ohne die Objektivströme zu verändern. Bei richtiger Konfiguration kann der nutzbare Bereich der Probendicke für die Kryo-STEM-Tomographie (CSTET) 1,5 oder sogar 2 μm erreichen, obwohl die Komfortzone, in der die Nutzsignalintensität einen signifikanten Bruchteil der Beleuchtung ausmacht, bei etwa 600-900 nm liegt11,13. Dies reicht aus, um einen großen Teil des Zytoplasmas und gelegentlich einen Rand des Zellkerns zu sehen. In der Praxis stellen wir fest, dass die Vitrifikation mit der Standardmethode des Eintauchens in eine kryogene Flüssigkeit eine strengere Beschränkung der Dicke darstellt als die STEM-Bildgebung. Das Ziel dieses Videoartikels ist es, die Integration von CSTET in den Werkzeugkasten für die Bildgebung von Zellen und Organellen in Forschungslabors und Mikroskopieeinrichtungen zu erleichtern.

Die erste Herausforderung besteht darin, dass die Mikroskopoperationen im CSTET für Life-Science-Anwendungen noch nicht so standardisiert sind wie für die Kryo-TEM-Tomographie. STEM-Hardware wurde selten (wenn überhaupt) auf den Kryo-EM-Markt ausgerichtet. Dies ändert sich jedoch mit der neuesten Generation von Mikroskopen, und viele bestehende Werkzeuge können nachgerüstet werden. MINT als Technik hat sich in den Materialwissenschaften durchgesetzt, wo auch das Interesse an kryogenen und niedrig dosierten Methoden aufkeimt14,15. Die materialwissenschaftliche Literatur ist reich an Akronymen BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM usw., die zur Verwirrung beitragen. Wir bieten hier einen empfohlenen Ausgangspunkt, der nach unserer gemeinsamen Erfahrung am Weizmann Institute of Science das allgemeinste Protokoll für brauchbare Ergebnisse auf der Grundlage der Hellfeld-STEM-Bildgebung (BF) bietet16. Es erschöpft oder lotet die Bandbreite der Möglichkeiten keineswegs aus, sondern dient als Grundlage für weitere Erweiterungen. Während wir den Schwerpunkt auf Kryo-STEM legen, ist der größte Teil des Protokolls gleichermaßen relevant für die Raumtemperatur-STEM-Tomographie von in Kunststoff eingebetteten Abschnitten.

Das Wesen von STEM besteht darin, die Probe mit einer fokussierten Elektronensonde (Abbildung 1), dem Beleuchtungskegel, abzutasten und Signale aus der Beugungsebene (Streuung) in der Transmission Pixel für Pixel aufzuzeichnen, um 2D-Bilder zu erzeugen17,18. Amorphe Proben, einschließlich der meisten zellulären Materialien, erzeugen bei der Übertragung ein diffuses Streumuster. Die einfachste praktische STEM-Konfiguration besteht darin, einen kreisförmigen Detektor zu platzieren, um die zentrale Scheibe (d. h. die Sondenbeleuchtung, die ohne Probe übertragen würde) aufzuzeichnen. Die Probe streut Elektronen von diesem Beleuchtungskegel so weit weg, dass das Signal abnimmt. Dadurch entsteht ein BF-Bild - die Probe erscheint dunkel auf einem hellen Hintergrund. Ein ringförmiger Detektor kann auch (oder stattdessen) verwendet werden, um die Streuung der Probe außerhalb des Beleuchtungskegels zu detektieren. Wenn die Probe entfernt wird, gibt es kein Signal. Wenn eine Probe an Ort und Stelle ist, erscheinen Objekte im Dunkelfeldbild (DF) hell auf dunklem Hintergrund. Die Nomenklatur für STEM (BF, ringförmiges Dunkelfeld [ADF], hochwinkliges ringförmiges Dunkelfeld [HAADF] usw.) bezieht sich hauptsächlich auf die Bereiche der Sammelwinkel für die Detektoren.

Der Konvergenzwinkel der Beleuchtung stellt eine wesentliche Anpassung der STEM an die zelluläre Tomographie dar. Wenn eine hohe Auflösung oberste Priorität hat, sollte der Konvergenzwinkel so groß wie möglich sein. (Dies ist vergleichbar mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie; die Auflösung wird durch den Sondendurchmesser bestimmt, der als Wellenlänge geteilt durch die numerische Apertur skaliert. Beachten Sie, dass wir uns auf den Halbwinkel- oder Halbkonvergenzwinkel für EM beziehen.) Wenn die Schärfentiefe im Vordergrund steht, bietet ein Kompromiss bei der Auflösung hingegen einen großen Vorteil, da der fokussierte Strahl über eine Entfernung, die dem Doppelten der Wellenlänge geteilt durch den Halbwinkel im Quadrat entspricht, ungefähr parallel bleibt. Im Idealfall bleibt das gesamte Zellvolumen im Fokus19. Bei 300 keV beträgt die Elektronen-deBroglie-Wellenlänge beispielsweise 0,002 nm, so dass eine Konvergenz von 1 mrad eine Auflösung von 2 nm und eine Schärfentiefe von 4 Mikrometern ergibt. Unter diesen Bedingungen kann die Tomographie auch ohne Fokussierung während des Datenerfassungsprozesses durchgeführt werden, sondern nur einmal zu Beginn der Erfassung. Ein herkömmliches, tomographiefähiges STEM kann einen Semikonvergenzwinkel von 7 oder 8 mrad erreichen; Daher könnten wir prinzipiell eine Auflösung in der Größenordnung von 0,25 nm erreichen, dann aber mit einer Brenntiefe von nur 62 nm. Das ist eindeutig zu dünn für die zelluläre Bildgebung. Fortschrittlichere Mikroskope mit drei Kondensorlinsen bieten eine stufenlose Einstellung des Semikonvergenzwinkels über einen beträchtlichen Bereich. Bei der traditionelleren Konfiguration mit zwei Kondensatoren wird die Konvergenz diskret durch die Kondensoröffnung (C2) festgelegt.

Für robuste, in Kunststoff eingebettete Proben kann man bei jeder Neigung eine Fokusreihe aufzeichnen und sie für eine hohe Auflösung20 kombinieren, aber für kryogene Proben ist das Strahlungsbudget zu stark eingeschränkt. Schließlich sollte man bei der Abwägung der Vorteile der BF- oder DF-Bildgebung für dicke Proben die Auswirkungen der mehrfachen elastischen Streuung in der Probe berücksichtigen. Das BF-Signal wird durch Mehrfachstreuung weniger verfälscht und zeigt eine höhere Auflösung für dicke Proben16,21.

Eine nützliche Faustregel war, Sammelwinkel festzulegen, die um ein Vielfaches größer sind als die Konvergenz. Je dicker die Probe, desto größer sollte die Auffangscheibe sein. Eine zu kleine Scheibe führt zu einer geringen Signalintensität. Eine zu große Scheibe führt zu einem schlechten Bildkontrast, da nur die Streuung mit dem höchsten Winkel dazu beiträgt. Die Sammelwinkel sollten für eine bestimmte Probe optimiert werden. Die Detektorwinkel in Abhängigkeit von der (Beugungs-)Kameralänge müssen unabhängig voneinander kalibriert werden. Sie können bequem von der Mikroskop-Software angezeigt werden. In der Praxis ist ein Faktor von zwei bis fünf im Verhältnis von Sammel- zu Beleuchtungshalbwinkeln, θ bzw. α (Abbildung 1), ein empfohlener Ausgangspunkt für das CSTET zellulärer Proben.

Das folgende Protokoll beschreibt den STEM-Tomographie-Betrieb mit der beliebten SerialEM-Software zur Mikroskopsteuerung22,23. SerialEM ist nicht an einen bestimmten Hersteller gebunden und wird häufig in der TEM-Tomographie eingesetzt. Die meisten Vorgänge beim Einrichten der Tomographie können direkt aus TEM übernommen werden. Die Strategie von SerialEM besteht darin, das Scansystem als Kamera zu modellieren. Dies ermöglicht den einfachen Übergang von TEM zu STEM. Man sollte jedoch bedenken, dass Parameter wie Vergrößerung und Binning völlig künstlich sind. Wichtige Parameter sind das Sichtfeld in Mikrometern, die Anzahl der Pixel im Sichtfeld und die Belichtungszeit. Der Pixelabstand oder das Sampling ist das lineare Feld geteilt durch die Anzahl der Pixel, während die Verweilzeit die Anzahl der Pixel geteilt durch die Belichtungszeit ist.

Die Mindestkonfiguration für MINT und CSTET umfasst drei Funktionen des Mikroskops: einen Scan-Generator, einen STEM-Detektor und eine Tomographie-Steuerungssoftware. Das Protokoll bezieht sich auf die Nomenklatur von FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), aber die Konzepte sind generisch. Die proprietäre Software von TFS wurde in JoVE für TEM24 beschrieben, und die STEM-Bedienung ist sehr ähnlich.

Wir gehen davon aus, dass das Mikroskop vorab durch das Serviceteam oder erfahrenes Personal ausgerichtet wurde und eine Säulenausrichtung durch Laden einer Datei aufgerufen werden kann. Kleinere Anpassungen werden als direkte Ausrichtungen bezeichnet und können in sogenannten FEG-Registern (TFS-Mikroskopen) gespeichert werden. Zu den direkten Ausrichtungen gehören Rotationsmittelpunkt, Drehpunkte, Beugungsausrichtung und Kompensation von Kondensator-Astigmatismus. Anpassungen müssen iterativ durchgeführt werden. Beachten Sie, dass TFS-Mikroskope unterschiedliche Nanosonden- (nP) und Mikrosondenmodi (μP) implementieren. Für eine gegebene Kondensoröffnung bieten diese ein relativ enges oder weites Sichtfeld mit paralleler Beleuchtung in TEM bzw. einem mehr oder weniger konvergenten (eng fokussierten) Elektronenstrahl in STEM. Andere Hersteller verwenden andere Schemata, um den Bereich der Konvergenzwinkel abzudecken.

Bevor Sie beginnen, sollten das Sichtfeld L und die Abtastung (Pixelbreite) l in Abhängigkeit von der untersuchten Probe ausgewählt werden. Beispielsweise sollte für l = 1 nm/Pixel ein Bild mit 4.000 x 4.000 Pixeln gewählt werden, das ein Sichtfeld von 4 μm2 abdeckt. Die Auflösung wird bestenfalls doppelt so hoch sein wie die räumliche Abtastung, also 2 nm, und der Sondendurchmesser d sollte damit übereinstimmen. Die Kalibrierung des Sondenwinkels würde den Rahmen dieses Protokolls sprengen, daher gehen wir davon aus, dass eine Tabelle oder ein Bildschirmmesswert verfügbar ist. Der Sondendurchmesser entspricht in etwa der Elektronenwellenlänge dividiert durch den Halbkonvergenzwinkel (im Bogenmaß): d = λ/θ. Die Wellenlänge λ beträgt 0,002 nm für 300 keV und 0,0025 nm für 200 keV-Elektronen, so dass θ von 1 mrad einen Spotdurchmesser von 2 bzw. 2,5 nm ergibt.

Das Protokoll wird in einer Abfolge von zunehmender Komplexität präsentiert. Die erste Aufgabe besteht darin, ein STEM-Bild zu erstellen, das von der Software des Mikroskopherstellers abhängt, und dann eine Tilt-Serie, für die wir SerialEM verwenden. Viele Leser werden zweifellos mit SerialEM vertraut sein, so dass die komplizierteren Aufgaben von selbst kommen. Es besteht keine Notwendigkeit, die Verfahren strikt zu befolgen. Entwicklungen im Bereich der Automatisierung können sowohl für MINT als auch für TEM direkt umgesetzt werden. Erfahrene Anwender werden das Protokoll wahrscheinlich invertieren, beginnend mit der korrelativen Registrierung von Fluoreszenzkarten und der weiteren Einrichtung der Batch-Tomographie. Weitere Details finden Sie in der umfangreichen Dokumentation und den Tutorial-Bibliotheken für SerialEM selbst, einschließlich eines kürzlich erschienenen JoVE-Artikels über die neuesten Entwicklungen in der Automatisierung25.

Protocol

1. MINT-Einrichtung

  1. Vorläufige Ausrichtungen: Laden Sie die Stützenausrichtungsdatei, und öffnen Sie dann Spaltenventile. Wenn Sie einen Kryo-Halter mit seitlichem Einstieg verwenden, öffnen Sie das Kryoschild. Starten Sie im TEM-Modus. Der Strahl sollte auf dem Bildschirm erscheinen. Wenn nicht, verringern Sie die Vergrößerung.
  2. Bringen Sie das Mikroskop in den euzentrischen Fokus, indem Sie die Taste auf dem Bedienfeld drücken.
  3. Stellen Sie die Spotgröße auf einen geeigneten Wert (z. B. 6) für die Visualisierung des fluoreszierenden Bildschirms ein, entweder direkt oder mit der eingebauten Kamera (je nach Mikroskopmodell).
  4. Stellen Sie das Mikroskop auf den STEM-Modus ein und stellen Sie sicher, dass der Fokus die Kondensorlinsen (Intensität) und nicht das Objektiv verwendet. Stellen Sie den euzentrischen Fokus ein. Verlassen Sie dann den Beugungsmodus für erste Einstellungen.
  5. Stellen Sie sicher, dass der Träger nicht ausgeblendet ist. Verringern Sie die Vergrößerung, bis der Strahl auf dem Bildschirm angezeigt wird. Stellen Sie die Strahlverschiebung in die Mitte ein und erhöhen Sie die Vergrößerung in Schritten bis zu etwa 70 kx, während Sie den Strahl in der Mitte halten.
  6. Setzen Sie die gewünschte Kondensatoröffnung ein, typischerweise 50 μm. Überprüfen Sie die Blendenzentrierung. Wenn Sie den Fokusknopf leicht hin und her drehen, sollte sich der Spot ausdehnen und zusammenziehen, aber an Ort und Stelle bleiben, als ob ein Flugzeug eine imaginäre vertikale Sanduhr schneiden würde. Wenn die Blende nicht zentriert ist, verschiebt sich die Beleuchtung seitlich, als ob die Sanduhr geneigt wäre.
  7. Bringen Sie den Strahl in den Fokus und drücken Sie auf der Registerkarte "Ausrichtungen" auf " Intensitätslistenfokus" (falls verfügbar) oder kehren Sie wie in 1.2 zum euzentrischen Fokus zurück. Stellen Sie die Strahlposition auf die Mitte ein.
  8. Passen Sie den Rotationsmittelpunkt an. Drehen Sie das Fokusstufenrad auf das Minimum oder eine Stufe darüber, so dass der Strahl sanft pulsiert, und stellen Sie sicher, dass es stationär bleibt, wenn sich der Fokus auf und ab bewegt.
  9. Wählen Sie die Drehpunkte aus und bringen Sie die beiden Punkte mit X- und Y-Anpassungen zusammen.
    HINWEIS: Wenn eine Phasenplatte an einem TFS-Gerät installiert ist, sollte nur die X-Einstellung verwendet werden.
  10. Defokussieren Sie den Strahl leicht und stellen Sie die Kondensator-Stigmatoren so ein, dass die Scheibe rund wird. Gehen Sie durch den Fokus auf und ab, um zu optimieren; Es sollte keine Tendenz geben, sich beim Passieren des Fokus in die eine oder andere Richtung zu dehnen.
  11. Normalisieren Sie die Linsen. Erhöhen Sie dann die Vergrößerung schrittweise auf etwa 240 kx, während Sie die Strahlverschiebung verwenden, um den Punkt zentriert zu halten, und wiederholen Sie die Einstellungen des Rotationsmittelpunkts und des Drehpunkts (Schritte 1.6-1.8).
  12. Kehren Sie in den Beugungsmodus zurück. Der Strahl sollte als gleichmäßige Scheibe auf dem fluoreszierenden Bildschirm erscheinen. Die Kameralänge (CL) steuert nun effektiv den optischen Abstand zum Detektor, wie in der Röntgenkristallographie. Wechseln Sie es und beobachten Sie, wie sich die Scheibe zusammenzieht und vergrößert, als ob sich die Bildschirmposition auf die Probe zu oder von ihr weg bewegen würde. Dieser Kegel stellt die BF-Beleuchtung dar.
    HINWEIS: Für jeden CL muss eine Beugungsausrichtung angepasst werden, um den projizierten Strahl auf die Mittelachse zu bringen. Normalerweise müssen sie nicht alle verfeinert werden, sondern nur die eine (oder wenige), die für die Erkennung verwendet werden sollen.
  13. Aktivieren Sie den STEM-Modus bei hoher Vergrößerung.
    1. Wenn ein BF STEM-Detektor verfügbar ist, beginnen Sie damit. Bringen Sie den Tisch in einen Bereich mit einem leeren Loch und passen Sie die Beugungsausrichtung an, um den Strahl mit der gewünschten CL zu zentrieren.
    2. Viele Mikroskope sind nur mit einem HAADF-Detektor ausgestattet. Es gibt einen Trick, um dies als BF-Detektor zu verwenden. Ziehen Sie zunächst den Detektor zurück, zentrieren Sie den Strahl wie oben in den direkten Ausrichtungen, setzen Sie eine Objektivblende ein, typischerweise eine kleine wie 20 μm, und passen Sie seine Position an, um den Strahl gleichmäßig zu umgeben. (Der einfachste Weg, dies zu tun, besteht darin, eine Probe oder ein Testgitter einzufügen, um einen Halo um die Beleuchtung herum zu sehen). Verwenden Sie dann die Beugungsausrichtung, um den Strahl von der Achse auf den Detektorbereich zu bewegen. Setzen Sie den Melder ein und ein, während Sie den Strahl auf dem Bildschirm beobachten, um zu bestätigen, dass der Strahl vom Melder blockiert wird.
    3. Starten Sie einen Scan in der Mikroskopsoftware und passen Sie die Helligkeits- und Kontrasteinstellungen (B/C) so an, dass das Signal nahe 0 liegt, wenn der Strahl ausgeblendet ist, und nahe der Sättigung, wenn die volle Beleuchtung auf den Detektor fällt. Verwenden Sie die Oszilloskopanzeige, um zu helfen. Die Einstellungen können auf unerwartete Weise gekoppelt sein, daher sollte die Anpassung mehrmals wiederholt werden.
  14. Bringen Sie das Mikroskop im Register für hohe Vergrößerung (SA-Modus) auf eine relativ niedrige Vergrößerung zurück, ohne in den Modus mit niedriger Vergrößerung (LM) zu wechseln.
  15. Notieren Sie sich den aktuellen Bildschirm, um später darauf zurückgreifen zu können (siehe Schritt 3.1.1). Der Strom kann mit den Einstellungen für das Pistolenobjektiv und die Spotgröße wie bei TEM geändert werden, wobei steigende Zahlen einem reduzierten Strom entsprechen.
  16. Speichern Sie an dieser Stelle ein FEG-Register, um die Rückkehr zu Standardwerten zu erleichtern.
    HINWEIS: Die Einrichtung kann einen Standardsatz von FEG-Registern vorbereiten, so dass Benutzer von einer funktionierenden Konfiguration ausgehen können.

2. Platzieren der Probe

  1. Stellen Sie im LM TEM-Modus sicher, dass das Raster nicht undurchsichtig ist. Suchen Sie ein Rasterquadrat, um erste Anpassungen vorzunehmen. Es ist praktisch, einen leeren Bereich, ein Loch oder ein zerrissenes Gitterquadrat zu finden. Notieren Sie die Bühnenpositionen, um bequem zu ihnen zurückzukehren.
  2. Bringen Sie die Probe auf euzentrische Höhe. Es gibt mehrere Methoden, dies zu tun. Verwenden Sie z. B. den Tischwobbler, um das Raster zu neigen, während Sie die Probenhöhe entlang der Z-Achse verschieben, bis sich das Bild nicht mehr seitlich verschiebt. Markieren Sie alternativ einige Merkmale auf dem Bildschirm und neigen Sie die Bühne um 30°. Das Feature wird seitlich verschoben. Passen Sie die Probenhöhe an, um sie wieder in die ursprüngliche Position zu bringen. Erhöhen Sie die Vergrößerung oder die Neigung des Tisches, um sie zu verfeinern. Kehren Sie zu 0° Neigung zurück.
  3. Kehren Sie in den STEM-Modus zurück und setzen Sie den STEM-Detektor ein. Wechseln Sie in den niedrigsten SA-Modus (High Magnification). Stellen Sie sicher, dass ein Bild auf dem Computerbildschirm angezeigt wird. Scannen Sie schnell, um unnötige Belichtung zu vermeiden; 1 μs/Pixel oder weniger wäre typisch. Beachten Sie, dass das Bild am linken Rand verzerrt erscheinen kann, wenn der Scan übermäßig schnell ist (siehe Abbildung 2).
  4. Drücken Sie Euzentrischer Fokus, erhöhen Sie die Vergrößerung und verfeinern Sie den Fokus während des Scannens. Es ist bequem, die von der Mikroskopsoftware bereitgestellte Fokuslupe zu verwenden.
  5. Stellen Sie den Kondensator-Astigmatismus ein. Dies kann am genauesten durch die Ronchigram-Methode erreicht werden. Wenn sich der Strahl über einem dünnen Probenbereich befindet, fokussieren Sie sich auf den Punkt, an dem der transmittierte Strahl aufbläst, dazwischen Schattenbilder der Probe auf beiden Seiten. Stellen Sie dann die Kondensatorabstimmung so ein, dass die zentrale Scheibe rund wird. Dies erfordert etwas Übung, insbesondere bei kryogenen Proben.
    HINWEIS: Eine Alternative besteht darin, einige Goldpartikel zu finden (die häufig als Passermarken für die Ausrichtung in der Tomographie verwendet werden). Erhöhen Sie die Vergrößerung und fokussieren Sie nach oben und unten, indem Sie die Hornhautverkrümmung so einstellen, dass die Partikel rund bleiben, ohne sich in beide Richtungen zu dehnen.
  6. Gehen Sie in den LM STEM-Modus und fahren Sie mit dem Scannen fort, um einen interessanten Bereich zu finden. Stellen Sie die B/C-Einstellungen des Melders ggf. neu ein (Schritt 1.13.3), ungefähr an dieser Stelle.

3. Aufnehmen eines Bildes

  1. Schätzen Sie die Dosis für die Aufnahme. Als Faustregel gilt: 100-150 e-/Å2 für das gesamte Tomogramm. Überprüfen Sie die Dosistoleranz pro Probe. Der Strom in Ampere (A) geteilt durch die Ladung pro Elektron stellt eine Anzahl von e-/s dar, die mit der Belichtungszeit T in Sekunden multipliziert und durch das Gesichtsfeld in Å2 geteilt wird. Der Einfachheit halber drücken Sie den Strom in Nanoampere (wie auf dem Bildschirm abgelesen), die Breite des Sichtfelds in Mikrometern und die Bildbelichtungszeit in Sekunden mit geeigneten Faktoren aus:
    Equation 1
    Diese Zahl sollte mit der Anzahl der Neigungen multipliziert werden, um die Gesamtbelichtung in der Serie zu erhalten. Bei einem Strom I = 0,04 nA, einem Feld L = 4 μm und einer Belichtungszeit von 12 s erhalten wir beispielsweise 1,9 e-/Å 2 pro Neigung oder etwa 110 e-/Å2 für eine Reihe von 61 Projektionen.
  2. Setzen Sie den Tisch wieder in ein Loch (oder ziehen Sie das Gitter ein) und passen Sie den Strahlstrom mithilfe der Spotgröße und/oder der Pistolenobjektiveinstellungen an, um den gewünschten Bildschirmstrom zu erreichen. Wenn die Messung 0 anzeigt, setzen Sie eine größere C2-Blende ein, um den Strom zu erhöhen. Korrigieren Sie dann, indem Sie die Messung durch das Quadrat des Durchmesserverhältnisses dividieren, und kehren Sie schließlich zur kleineren Öffnung zurück.
  3. Verfeinern Sie die B/C-Einstellungen gemäß Schritt 1.13.3 und bringen Sie schließlich den Tisch in einen Bereich von Interesse zurück und überprüfen Sie erneut die direkte Ausrichtung und den Astigmatismus unter den Bildgebungsbedingungen.
  4. Erfassen Sie ein Testbild.

4. Tomographie mit SerialEM

  1. Starten Sie den SerialEM-Server auf dem Mikroskoprechner (SerialEM ist normalerweise auf einem anderen Rechner installiert). Öffnen Sie dann SerialEM. STEM erscheint in SerialEM wie eine Kamera mit der gleichen Schnittstelle. Stellen Sie sicher, dass die Kommunikation für das Setup ordnungsgemäß ausgeführt wird. Zum Beispiel sollte die Registerkarte "Mikroskop" die richtige Vergrößerung anzeigen. Wenn dies nicht funktioniert, hören Sie hier auf und beheben Sie das Problem.
  2. Suchen Sie die Registerkarte Kamera und Skript und öffnen Sie Setup. Stellen Sie sicher, dass die STEM-Kamera ausgewählt ist, und wählen Sie für jeden Modus geeignete Binning- und Verweilzeiten aus. Stellen Sie sicher, dass der entsprechende Detektor (oder die entsprechenden Detektoren) im Feld "Zu erfassende Kanäle" unten links angezeigt wird. Drücken Sie unten auf Erfassen , um zu testen. Auch hier gilt: Fahren Sie nicht fort, wenn nichts passiert oder wenn der Strahl nicht ausgeblendet wird. Halten Sie an und überprüfen Sie die Kommunikation.
    HINWEIS: Die Modi werden in ähnlicher Weise wie bei der TEM-Tomographie verwendet. Binning ist ein Kunstgriff für die Kompatibilität mit TEM. Der wichtige Parameter ist die Pixelanzahl; Verschiedene Mikroskopsysteme verwenden unterschiedliche Binnings, um die gleiche Anzahl zu erreichen.
    1. Ansicht und Suche sollten schnelle Scans mit relativ wenigen Pixeln sein (z. B. 512 x 512 Pixel bei 1 s).
    2. Der Fokus ist in der Regel ein kleiner Bereich mit schneller Aufnahme. Wählen Sie daher im Modus mit niedriger Dosis den Fokus, um eine andere Vergrößerung als den Aufnahmemodus zu haben, was die Genauigkeit verbessern kann. Lassen Sie die Spotgröße unverändert.
    3. Verwenden Sie für den Aufnahmemodus die oben in der Belichtungsschätzung ausgewählten Parameter. Falls verfügbar, wählen Sie auch Dynamischer Fokus, der den Fokus in einem geneigten Bild Zeile für Zeile korrigiert.
    4. Der Einfachheit halber wählen Sie später das Binning für die Vorschau so aus, dass es mit dem für die Ansicht identisch ist (siehe Erweiterung #1, Schritt 5.5). Die Bildgröße (Anzahl der Pixel) muss nicht gleich sein.
    5. Verwenden Sie den Testmodus, um den Datensatzbereich während der Erfassung zentriert zu halten. Es kann ähnlich wie View sein, aber achten Sie darauf, dass auf der linken Seite des Rahmens keine Scanverzerrungen erkennbar sind (siehe Abbildung 2 für ein Beispiel). Auch hier kann der Versuch im Low-Dose-Modus eine andere Vergrößerung haben als im Aufnahmemodus.
    6. Verwenden Sie den Montagemodus sofort für den Rasterscan. Es sollte eine ausreichende Pixeldichte aufweisen, um interessante Bereiche zu finden. Empfehlung: 512 x 512 oder 1024 x 1024. Stellen Sie sicher, dass das Bild gut ist und einen angemessenen Dynamikbereich aufweist (siehe Bildanzeigesteuerung), da dieser Modus zum Auffinden der Probenbereiche verwendet wird.
    7. Speichern Sie die Einstellungsdatei, damit diese Auswahl als Standard für die nächste Sitzung beibehalten wird (was bald der Fall sein kann, falls das Programm abstürzt).
  3. Testen Sie die Kalibrierungen der Bildverschiebung und der Stufenverschiebung. Klicken Sie im Mikrosonden- (oder Nanosonden-) Modus auf Bild anzeigen, bewegen Sie den Mauszeiger darüber, halten Sie die Taste gedrückt und ziehen Sie diagonal um etwa ein Viertel des Sichtfelds. Nehmen Sie dann eine andere Ansicht ein. Die Bilder sollten sich perfekt überlappen. Wiederholen Sie den Vorgang, indem Sie erneut ziehen, während Sie die Umschalttaste gedrückt halten (um eine Bühnenbewegung zu erzwingen). Die Bilder sollten sich gut überlappen, wenn auch vielleicht weniger präzise.
  4. Gehen Sie in den LM-Modus und testen Sie die Stufenverschiebung. Wenn diese Tests fehlschlagen, beenden Sie die Tests, und führen Sie eine Fehlerbehebung durch. Der Rest wird nicht funktionieren.
  5. Erstellen Sie eine Montage-LM-Karte des gesamten Gitters. Dies kann auch in TEM geschehen.
    1. Gehen Sie zum STEM-Modus mit der niedrigsten Vergrößerung, bei dem das Bild nicht durch Blenden blockiert wird, normalerweise um das 185-fache.
    2. Klicken Sie auf das Menü "Navigator" > "Öffnen". Klicken Sie dann > Navigationsoptionen auf das Menü Navigator > deaktivieren Sie die Option Karten in Bytes konvertieren.
    3. Wählen Sie das Menü "Navigator" > "Montage & Raster" > "Vollständige Montage einrichten". Es öffnet sich ein Menü. Die Optionen, die Sie überprüfen sollten, sind: Bühne verschieben statt Bild verschieben, Karte aus jeder Montage erstellen, wenn der Navigator geöffnet ist, und Montage-Mapping verwenden, nicht Aufnahmeparameter. Das Bildraster sollte ungefähr 6 x 6 oder 7 x 7 betragen. Suchen Sie nach der Gesamtfläche, die aufgezeichnet werden soll. Wenn zu viele Bilder benötigt werden, kann es sein, dass die Vergrößerung nicht richtig vom Mikroskop abgelesen wird (Abbildung 3). Halten Sie an und überprüfen Sie.
    4. Um die Montage zu starten, drücken Sie Start in den Montage-Steuerelementen oder Montage unter Kamera &; Skript. Es öffnet sich ein weiteres Menü, in dem Sie die Dateiparameter auswählen können: mrc, als Ganzzahlen speichern und in einem weiteren Dialog den Dateinamen für die Speicherung auswählen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Daten im geeigneten Datenbereich und nicht unter den eigenen Benutzereinstellungen von SerialEM speichern. Es wird empfohlen, keine großen Datenmengen auf der C-Festplatte zu speichern, auf der sich das System befindet.
    5. Wenn die Aufnahme abgeschlossen ist, wird die Montage im Hauptfenster angezeigt (Abbildung 4). Man kann nun mit den Markierungen und Punkten auf dem Navigator durch das Raster navigieren, genau wie in TEM.
  6. Überprüfen Sie die Astigmatismuskorrektur erneut. In der Regel reicht es aus, einen kleinen Bereich schnell abzutasten und zusammen mit dem Fokus so einzustellen, dass punktförmige Merkmale wie Gold-Nanopartikel beim Ein- und Ausblenden (wie bei einem REM) bei hoher Vergrößerung völlig rund bleiben. Konservativer kann man die direkten Ausrichtungen der Schritte 1.5-1.8 wiederholen, bevor der Astigmatismus behoben wird.
  7. Richten Sie die Bildgebung mit hoher Vergrößerung an der LM-Montage aus.
    1. Gehen Sie zu einer Position in der LM-Montage mit einem leicht erkennbaren Merkmal. Fügen Sie einen Punkt hinzu, klicken Sie auf das Navigator-Fenster > Punkte hinzufügen und klicken Sie auf das Feature. Drücken Sie erneut (fügen Sie nicht mehr hinzu), um die Funktion zu deaktivieren.
    2. Nehmen Sie ein Ansichts- oder Testbild mit der niedrigsten Vergrößerung mit hoher Helligkeit (HM) auf und suchen Sie das angegebene Objekt. Platzieren Sie die Markierung dort (grünes Kreuz), und wählen Sie bei markiertem Punkt im Navigatorfenster im Menü Navigator > Shift to Marker... im daraufhin geöffneten Dialogfeld die Option Alle Maps und Shift speichern aus, wie in Abbildung 5 dargestellt.
    3. Testen Sie, indem Sie den Tisch an andere Positionen verschieben und sicherstellen, dass das HM-Bild an denselben Stellen zentriert ist, die in der LM-Montage ausgewählt wurden. Wenn das Feature im HM-Bild nicht sichtbar ist, ist die Verschiebung zwischen LM- und HM-Modus möglicherweise zu groß. Erstellen Sie in diesem Fall eine Polygonmontage über eine größere Fläche. Klicken Sie auf das Navigatorfenster > Polygon hinzufügen, wählen Sie einige Punkte aus und klicken Sie dann erneut auf Polygon hinzufügen , um das Fenster zu schließen. Klicken Sie auf das Menü Navigator > Montaging und Raster > Einrichten der Polygonmontage und Montagesteuerelemente > Start. Suchen Sie dann die entsprechenden Punkte wie oben und klicken Sie auf Shift to Marker....
  8. Richten Sie den Niedrigdosis-Modus ein.
    1. Öffnen Sie die Registerkarte Niedrigdosissteuerung und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Niedrigdosismodus.
    2. Aktivieren Sie Kontinuierliche Aktualisierung und gehen Sie zu Ansicht. Wählen Sie die Mikroskopvergrößerung für diesen Modus, in der Regel die niedrigste oder die niedrigste. Wählen Sie jeden der nächsten Modi und stellen Sie die entsprechende Vergrößerung ein. Die Aufnahme sollte eingestellt werden, um die gewünschte Pixelgröße zu erreichen, und die Fokusvergrößerung sollte hoch genug sein, damit Passermarken oder andere kontrastreiche Funktionen für die Fokussierung klar aufgelöst werden. Deaktivieren Sie dann sofort Kontinuierliches Update.
      HINWEIS: Der Testmodus kann entweder ähnlich wie der Aufnahmemodus eingestellt werden, in diesem Fall muss der Tracking-Bereich aus dem Aufnahmebereich verschoben werden, um die Belichtung zu minimieren, oder mit einer geringen Vergrößerung, die einen Großteil der Umgebung umfasst.
    3. Nehmen Sie ein Ansichtsbild auf und legen Sie die Testposition mit Position des Bereichs definieren: Versuch fest.
      HINWEIS: Empfehlung #1: Angesichts der Änderung des beprobten Gebietes und der Zeit kann die zusätzliche Exposition für einen Versuch mit niedriger Luftfeuchtigkeit minimal sein. Solange die Rasterleiste nicht in das Sichtfeld eindringt, ist diese Methode der Nachverfolgung in der Regel zuverlässiger. Empfehlung #2: Es ist auch möglich, die Spotgröße zu aktualisieren, um die Dosis für verschiedene Modi, wie z. B. Fokus, anzupassen. Aus Gründen der Stabilität in den Einstellungen der Mikroskopoptik empfehlen wir, dies nicht zu tun, sondern die Spotgröße so zu belassen, wie es für Record angemessen ist, und dann die Belichtungszeit gegebenenfalls für die schnelleren Scan-Modi anzupassen.
    4. Klicken Sie auf die Registerkarte "Low Dose Control" > Gehe zu: Rec., und klicken Sie dann auf das Menü "Navigator" > " Bildgebungszustände öffnen" > "Aktuellen Zustand hinzufügen". Geben Sie ihm einen Namen, damit er leicht abgerufen werden kann (z. B. μP STEM für Mikrosonde STEM). Für unterschiedliche Aufgaben können verschiedene Zustände definiert werden.
  9. Verschieben Sie den Tisch an einen Ort, der für die Tomographie von Interesse ist (mehr zur Verwendung des Navigators weiter unten).
    1. Fügen Sie einen Punkt im Navigator hinzu, indem Sie auf Navigator-Fenster > Punkte hinzufügen klicken.
    2. Verfeinern Sie die euzentrische Höhe, indem Sie Aufgaben > Euzentrizität > Grob auswählen. Navigator-Fenster > Update Z.
    3. Legen Sie die Bereiche für "Fokus" und "Test" fest. Nehmen Sie zunächst ein Ansichtsbild auf. Wählen Sie dann auf der Registerkarte " Niedrigdosissteuerung " unter " Position des Bereichs definieren" die Option " Fokus" oder "Versuch" aus. Passen Sie die Positionen für die beiden Bereiche entlang der Neigungsachse an. Der Fokus sollte den Aufnahmebereich nicht überlappen.
      HINWEIS: Denken Sie daran, dass es insbesondere am linken Rand zu einem gewissen Überschwingen kommt, daher sollte keines der beiden unmittelbar neben dem Aufnahmebereich eingestellt werden. Das Ausmaß des Überschwingens kann in einem Testbereich bewertet werden, indem wiederholt mit der Aufnahmevergrößerung gescannt und dann die Vergrößerung verringert wird, um eine breitere Ansicht zu erhalten.
  10. Neigen Sie zur Sicherheit (optional mit Erfahrung) die Bühne auf +60° und dann auf -60°, wobei Sie jedes Mal ein Ansichts- oder Vorschaubild aufnehmen, um sicherzustellen, dass die Rasterleiste nicht in das grün dargestellte Sichtfeld des Aufnahmebereichs eintritt.
  11. Richten Sie die Tilt-Serie ein.
    1. Öffnen Sie eine neue Datei, um die Daten zu speichern, indem Sie auf Datei > Neu öffnen klicken und einen Dateinamen auswählen. Wählen Sie das Menü "Tilt Series" > "Tilt Series Setup" (Tilt Series Setup ) (Abbildung 6). Fehlerbehebung: Wenn die Schaltfläche Neu öffnen grau ist, überprüfen Sie, ob die vorherige Neigungsserie beendet wurde. Ist dies nicht der Fall, beenden Sie den Vorgang mit einem Klick auf Tilt Series > Beenden.
    2. Legen Sie die extremen Neigungswinkel in den Feldern " Neigen zu " und "Ende bei " (in der Regel -60° bzw. +60°) sowie das Inkrement (in der Regel 2°) fest.
    3. Aktivieren Sie für den dosissymmetrischen Modus (empfohlen - stellen Sie sicher, dass der Modus für niedrige Dosis noch aktiv ist) die Option Serien in zwei Richtungen von ___ ausführen. Der Rohling ist normalerweise 0, kann aber verwendet werden, um vorgekippte FIB-Lamellen (z. B. bei 20°) zu kompensieren.
    4. Aktivieren Sie der Einfachheit halber die Option Belichtungszeit konstant halten. Dies zu ändern, erfordert eine Überarbeitung der Belichtungsberechnung und kann auch algebraische Rekonstruktionen (z. B. ART/SART/SIRT) stören, die projizierte Intensitäten mit Originaldaten vergleichen (siehe Schritt 7.1).
    5. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Autofokus überspringen. Ein kleiner Halbkonvergenzwinkel, z. B. 1 mrad, impliziert eine so große Schärfentiefe, dass eine Fokussierung möglicherweise unnötig ist. Fokussieren Sie testweise auf 0°, neigen Sie auf 60° oder -60° und drücken Sie die Aufnahmetaste. Die Aufrechterhaltung des Fokus ist in erster Linie eine Frage der präzisen euzentrischen Höhe. Für eine größere Konvergenz kann es erforderlich sein, während der Reihe zu fokussieren. Nehmen Sie in diesem Fall eine Ansicht ein, definieren Sie auf der Registerkarte Niedrigdosissteuerung die Position des Bereichs und des Fokus und passen Sie den Fokusbereich an.
    6. Anfängliche und letzte Aktionen: Wenn die euzentrische Höhenverstellung genau durchgeführt wurde, muss sie nicht wiederholt werden. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Säulenventile am Ende der Reihe schließen , es sei denn, es gibt gute Gründe, dies nicht zu tun.
    7. Für die Nachverfolgung der Steuerungsparameter gibt es viele Möglichkeiten. Bei der unbeaufsichtigten Datenerfassung besteht die oberste Priorität darin, zu vermeiden, dass das Programm aufgrund von Benutzereingaben angehalten wird. Verwenden Sie die empfohlenen Einstellungen: Wiederholen Sie die Aufzeichnung, wenn der Prozentsatz der verlorenen Felder mehr als 5 beträgt. Verfolgen Sie dann nach und aktivieren Sie An Vorschau ausrichten, bevor Sie eine neue Spurreferenz erhalten, und Neue Spurreferenz abrufen , wenn die Datensatzausrichtung um 2 % abweicht. Wenden Sie für die beaufsichtigte Datenerfassung strengere Parameter an, um das Risiko zu vermeiden, stundenlange Gerätezeit zu verlieren.
    8. Wenn Sie zum Starten bereit sind, drücken Sie GO am unteren Rand des Fensters. Wählen Sie am Ende Tilt Series > Terminate aus.

5. Batch-Erfassung an mehreren Punkten mit dem Navigator (Erweiterung #1)

ANMERKUNG: Das Protokoll ist rudimentär, weil es a) identisch mit TEM ist und b) neue Werkzeuge zur Verfügung stehen, die eine vollständige Beschreibung wahrscheinlich obsolet machen werden.

  1. Laden Sie die vollständige Rastermontage in das Hauptfenster.
  2. Wählen Sie eine Reihe von Bereichen aus, die vielversprechend aussehen. Klicken Sie auf Punkte hinzufügen und zu den Mittelpunkten der ausgewählten Rasterquadrate hinzufügen . Klicken Sie erneut auf Punkte hinzufügen , um den Modus zu deaktivieren.
  3. Wenn der Bildgebungsstatus mit niedriger Dosis aktiviert ist, wählen Sie das Navigator-Fenster > aktivieren Sie für jedes der ausgewählten Quadrate die Option Erfassen und Neue Datei bei Element . Im ersten Fall wird ein Dialogfeld für die Dateieigenschaften (Abbildung 7) und dann für den Dateinamen geöffnet. Wählen Sie "Montagierte Bilder" aus, aktivieren Sie dann im Dialogfeld " Montage Setup " (Abbildung 8) die Option "Ansichtsparameter im Modus "Niedrige Dosis verwenden" und erstellen Sie ein Raster, das groß genug ist, um das Quadrat abzudecken (ca. 100 x 100 μm).
  4. Klicken Sie auf das Navigator-Menü > Elemente erfassen und wählen Sie die Parameter für das Mapping aus. Am wichtigsten ist, dass Sie unter Primäre Aktionen die Optionen Navigator-Karte erstellen, dann Grobe Euzentrizität und Feinzentrierung aktivieren und auf Go klicken (Abbildung 9). Bei einem Raster mit 200 Maschen ergibt sich eine Karte mit ungefähr dem gesamten Quadrat (Abbildung 10)
  5. Bereiten Sie sich auf die Auswahl der Tomogrammposition vor. Öffnen Sie eine neue Datei, indem Sie auf Datei > Neu öffnen klicken. Geben Sie ihm einen Dateinamen (z. B. AnchorMaps.mrc).
    1. Wenn der Modus "Niedrige Dosis" aktiv ist, geben Sie " Kamera & Skript" > "Setup " ein und stellen Sie sicher, dass "Ansicht" und "Vorschau" dasselbe Binning aufweisen (andernfalls können sie nicht in derselben Datei gespeichert werden).
    2. Besuchen Sie Punkte in den quadratischen Karten, indem Sie auf das Navigator-Fenster > Gehe zu XYZ.
    3. Wählen Sie eine Position für das erste Tomogramm mit dem Marker. Nehmen Sie ein Vorschaubild auf und verfeinern Sie die Position durch Ziehen mit der rechten Maustaste. Wählen Sie dann Navigator-Fenster > Neue Karte aus, und klicken Sie im Dialogfeld auf Ja , um es zu speichern. Nehmen Sie als Nächstes ein Ansichtsbild desselben Gebiets auf und speichern Sie es erneut als neue Karte. Stellen Sie sicher, dass die Karte anzeigen markiert ist, und aktivieren Sie im Navigatorfenster oben rechts die Option Für Ankerstatus .
    4. Wählen Sie die zweite Position, nehmen Sie erneut eine Vorschau und verfeinern Sie die Position wie oben und drücken Sie dieses Mal auf Ankerkarte im Navigator-Fenster. Dadurch werden sowohl die Vorschau als auch die Ansicht als neue Karten im Navigator gespeichert.
    5. Wiederholen Sie Schritt 5.5.4 für alle gewünschten Positionen. Wechseln Sie von einem Rasterquadrat zum anderen, indem Sie den Punkt auswählen und im Navigatorfenster auf Gehe zu XYZ klicken.
  6. Wählen Sie für den Referenzfokus einen freien Bereich des Rasters und fokussieren Sie sorgfältig, von Hand oder durch Autofokus. Drücken Sie Defokus zurücksetzen auf dem Mikroskopfeld. Erstellen Sie ein Skript in SerialEM, indem Sie auf Script > Edit > Edit 15 (oder eine andere freie Zahl) klicken, und geben Sie zwei Zeilen ein: ScriptName, SetDefocus und SetDefocus 0.
  7. Markieren Sie im Fenster Navigator die erste Position (entweder Vorschau oder Ansicht). Drücken Sie Umschalttaste-T, markieren Sie die letzte Position und drücken Sie erneut Umschalttaste-T. Das Dialogfeld "Dateieigenschaften" wird geöffnet. Wählen Sie Einzelbilder und Parameter aus, die gespeichert werden sollen, einschließlich des Dateinamens. Bearbeiten Sie den Dateinamen, aber lassen Sie die Elementbezeichnung am Ende.
    HINWEIS: Dateinamen, die auf Zahlen enden, werden automatisch für aufeinanderfolgende Neigungsreihen aktualisiert. Es ist zweckmäßig, die Option Navigator-Menü > Navigationsoptionen zu verwenden> Elementbeschriftungen in Dateinamen zu verwenden.
  8. Als nächstes öffnet sich automatisch das Setup-Menü der Tilt-Serie. Füllen Sie wie zuvor (Abbildung 6), wählen Sie jedoch nicht Euzentrizität verfeinern. Die Vorschaupunkte im Navigator werden nun als TS markiert. Sie können zu diesem Menü zurückkehren, indem Sie die Schaltfläche im Navigator-Fenster über der Elementliste verwenden.
  9. Wählen Sie das Menü Navigator > Abrufen bei Elementen. Wählen Sie dieses Mal die Parameter für die endgültigen Daten aus. Wählen Sie " Primäre Aktion: Neigungsreihen erfassen " und wählen Sie " Dewars/Vakuum verwalten", " Auf Element neu ausrichten", "Feinzentrizität" und "Skript vor Aktion ausführen", wobei Script ausgeführt werden soll: SetDefocus. Wählen Sie allgemeine Optionen: kein Meldungsfeld, wenn ein Fehler auftritt , und schließen Sie die Säulenventile am Ende, und drücken Sie dann GO (Abbildung 11). SerialEM wird nun alle Ankerkarten besuchen und an jeder Position eine Neigungsreihe aufzeichnen (Abbildung 12).

6. CLEM-Kartenregistrierung (Erweiterung #2)

  1. Wenn dies noch nicht geschehen ist, laden Sie die vollständige Rastermontage in das Hauptfenster und erstellen Sie dann ein neues Fenster, indem Sie auf Fenster > neues Fenster klicken und ihm einen Namen geben. Beachten Sie, dass die vollständige Rastermontage in Registrierung 1 angezeigt wird.
  2. Importieren Sie das CLEM-Kartenbild, indem Sie > Karte importieren auf das Menü Navigator klicken. Es sollte in Registrierung 2 aufgenommen werden. Es kann auch ein neues Fenster wie oben zugewiesen werden.
  3. Überprüfen Sie die CLEM-Map, um die relative Drehung in Bezug auf die gesamte Rastermontage zu bestimmen. Am einfachsten ist es, dies auf einer Karte zu tun, auf der die Rasterbalken angezeigt werden. Beachten Sie, dass die Karte auch gespiegelt werden kann. Richten Sie es grob über das Menü "Navigator" > "Karte drehen" aus, bei Bedarf mit "Spiegeln".
    HINWEIS: Der folgende Schritt kann auch einen Flip aufnehmen, aber dies im Voraus zu tun, macht das Folgende viel einfacher. Dieser Schritt kann wiederholt werden, bis die Ausrichtung zufriedenstellend aussieht, aber es ist nicht notwendig, genau zu sein.
  4. Führen Sie Registrierungspunkte für eine präzise Ausrichtung ein. Platzieren Sie eine Anzahl entsprechender Punkte auf dem einen und dann auf dem anderen Fenster. Aktivieren Sie für jeden dieser Punkte den Registrierungspunkt ganz oben im Navigator-Fenster. Entsprechende Punkte werden mit einem aufsteigenden Index beschriftet, gefolgt von R1 bzw. R2 für die Rastermontage bzw. die importierte Karte.
    HINWEIS: Die Verwendung von Sucherrastern macht diesen Schritt sehr einfach. Andernfalls wählen Sie Volumenkörper-Features wie die Mittelmarkierung oder die Ecken von Rasterquadraten. Prinzipiell reichen drei Punkte für eine grobe Ausrichtung aus, aber mehr Punkte helfen, kleinere Fehlanpassungen in den Montagekonstruktionen auszugleichen.
  5. Wenn mehrere Kanäle einer CLEM-Karte gewünscht sind, z. B. unterschiedliche Fluoreszenzfarben oder Fluoreszenz ohne Hellfeldhintergrund, importieren Sie diese wie in Schritt 6.2 oben und ändern Sie die Registrierungen auf 2. Auf diese Weise erben sie die Registrierungspunkte der ersten Karte.
  6. Erzwingen Sie die Registrierung über das Menü Navigator > Elemente transformieren. Die entsprechenden Registrierungspunkte erscheinen nun auf allen Karten, die in Registrierung 1 aufgeführt werden. Um die Karte visuell auszurichten, klicken Sie auf das Menü "Navigator" > "Karte drehen". Beachten Sie, dass eine Karte, die aus dem Navigator-Fenster geladen wird, nicht automatisch gedreht wird, es sei denn, das Kontrollkästchen Beim Laden drehen ist aktiviert. Es kann jederzeit aus dem Navigator-Fenster heraus gedreht werden.
  7. Es sollte nun möglich sein, den Marker oder einen Punkt auf der Fluoreszenzkarte zu platzieren und den Tisch an die entsprechende Stelle im Raster zu verschieben (Abbildung 13).

7.3D Wiederaufbau

  1. Dies beinhaltet die gleichen grundlegenden Schritte wie bei der TEM-Tomographie: Ausrichtung der Neigungsreihe, gefolgt von einer Rückprojektion. Es stehen mehrere Softwareplattformen zur Verfügung, und die Daten können ähnlich wie TEM-Daten behandelt werden, mit der Ausnahme, dass die CTF-Korrektur übersprungen werden sollte.
  2. Wenden Sie Intensitätsnormalisierungen an, um den Beitrag von Projektionen mit hoher Neigung zu verbessern oder um eine Änderung der Beleuchtung während der Serie auszugleichen, mit der Einschränkung, dass quantitative Informationen beeinträchtigt werden. IMOD26 funktioniert zum Beispiel gut, während AreTomo27 sehr nützlich für die Ausrichtung ohne Passermarken ist. Wenn Fiducial-Partikel vorhanden sind, kann ClusterAlign28 ihnen als Cluster und nicht als einzelne Punkte folgen. Dies ist besonders nützlich für MINT-Daten, bei denen Flecken durch kontrastreiche Merkmale verloren gehen oder verdeckt werden können.
  3. Anschließende Rekonstruktion mit 3D-Entfaltung29 zur Kontrastverstärkung und Rauschunterdrückung. Nach der Rekonstruktion werden die STEM-Volumendaten mit einer der Standardmethoden wie Orthesen oder Isoflächensegmentierung dargestellt. Bemerkenswert ist, dass die Intensitätsverteilung unipolar ist, ohne Kontrastinversionen oder Fourier-Streifen, die bei herkömmlichem Phasenkontrast-TEM auftreten. Ein interessantes Darstellungsmittel von STEM-Tomogrammen im Allgemeinen ist die Invertierung des hellen Feldes (Abbildung 14). Der Effekt ist der von "Röntgenaugen", die die dichten Objekte von Interesse durch die geklärte Zelle30 sehen.

Representative Results

Eine vollständige Rastermontage, die in MINT erstellt wurde, zeigt die Bereiche mit den interessierenden Zellen (Abbildung 4). Beachten Sie, dass sich das Bild im Dunkelfeld befindet, sodass leere Löcher dunkel erscheinen. Die Zellen erscheinen teilweise hell, wo die Elektronen in Richtung des HAADF-Detektors gestreut werden. An den dicksten Stellen, typischerweise in der Mitte oder in der Nähe der Rasterbalken, wird der Kontrast wieder dunkel. Dies ist auf die Mehrfachstreuung zurückzuführen, bei der die Elektronen Winkel erreichen, die vom Detektor nicht erfasst werden. In der Praxis sind diese Bereiche für die Tomographie zu dick.

Der nächste Schritt umfasst Karten mit mittlerer Vergrößerung (Abbildung 10). Diese werden oft als Medium-Montage-Maps oder Quadrat-Maps bezeichnet und beziehen sich eher auf die Rasterquadrate als auf die Form. Selbst im niedrigsten Mikrosonden-STEM-Modus werden sie auch als Montagebilder aufgenommen. Ein Klick auf das Element im Navigator-Fenster lädt das Kartenbild in das Hauptfenster. Innerhalb dieses Bereichs werden spezifische Punkte für die Tomogrammaufnahme ausgewählt. Verwenden Sie den Vorschaumodus, um den Bereich bei der Aufnahmevergrößerung zu lokalisieren. Beachten Sie, dass es je nach Scangeschwindigkeit zu einer seitlichen Verschiebung zwischen Vorschau und Aufnahme kommen kann. Hier kann eine einzelne Kippreihe aufgezeichnet werden. Mitochondrien können beispielsweise häufig im Vorschau- und Aufzeichnungsbild identifiziert werden (Abbildung 12).

Bei der Batch-Tomographie bewegt sich der Tisch um das Gitter herum und kehrt möglicherweise nicht an genau dieselbe Stelle zurück. Anker-Maps werden verwendet, um sicherzustellen, dass die gewünschten Datensatzbereiche zuverlässig neu identifiziert werden, indem das Vorschaubild mit einer Ansicht mit geringerer Vergrößerung abgeglichen wird, auch wenn sich die Bühnenbewegung verschoben hat. PyEM23,24 bietet eine schnellere Alternative, die sicherlich empfehlenswert ist, aber noch nicht Teil der Standardinstallation ist.

Beim CLEM-Ansatz kann eine Fluoreszenzkarte verwendet werden, um die Bereiche zu identifizieren, die für die Tomographie von Interesse sind. Die Fluoreszenz wird extern erfasst und muss auf die Vollrastermontage registriert werden. Es ist nützlich, die Rasterbalken und Löcher sichtbar zu haben, so dass vor dem Import ein zusammengeführtes Fluoreszenz- + Hellfeld-Komposit erstellt werden kann, z. B. in GIMP (https://www.gimp.org) oder ImageJ31-Software (achten Sie darauf, dass ImageJ die vertikale Achse invertiert). Wenn der Dynamikbereich der Fluoreszenz groß ist, kann es schwierig sein, eine solche Verschmelzung ohne Sättigung zu erzeugen. In diesem Fall können die beiden Karten separat importiert und dann wie beschrieben zusammen registriert werden (Abbildung 13). Auf diese Weise bringt ein Punkt auf der Fluoreszenzkarte im Navigator-Fenster, gefolgt von "Gehe zu XY", den Tisch an die entsprechende Position auf dem Raster, wie er im TEM montiert ist. Achten Sie darauf, dass kleine Inkonsistenzen bei der Erstellung der Montage (oder der Fluoreszenzkarte, falls es sich auch um eine Montage handelt) zu kleinen Verschiebungen führen. Um eine optimale Präzision zu erzielen, sollte die Fluoreszenz daher speziell für die quadratische Karte neu registriert werden. Oft reicht es aus, diese Registrierung mit dem Auge vorzunehmen, auf der Grundlage von Löchern in der Trägerfolie oder Merkmalen, die mit dem Hellfeldlichtbild geteilt werden.

Die Rekonstruktion der Neigungsreihe ergibt ein 3D-Volumen (Abbildung 14). Dieses Beispiel hat eine Pixelgröße von 2.042 nm, was ein Sichtfeld von ~4 μm ergibt. Calciumphosphat-Ablagerungen (orangefarbene Pfeilspitzen) fallen durch die höhere Ordnungszahl im Vergleich zur Umgebung auf. Mikrotubuli (rote Pfeilspitzen) können über das gesamte Sichtfeld verfolgt werden. Auch die inneren und äußeren mitochondrialen Membranen (grüne Pfeilspitzen) sind deutlich zu sehen. Aktin kann als Bündel oder als einzelne Filamente beobachtet werden. Um eine isotropere Auflösung zu erreichen, kann die Rekonstruktion durch Entfaltung verarbeitet werden.

Figure 1
Abbildung 1: Vergleich von TEM und STEM. Bei TEM wird das Sichtfeld durch einen nahezu parallelen Strahl beleuchtet und die Objektivlinse bildet ein vergrößertes Bild auf der Kamera. Bei Kryo-TEM wird die Objektivblende geöffnet, um die gestreuten Elektronenwellen (gestrichelte rote Linie) durchzulassen, die bei Unschärfe durch Interferenz mit den ungestreuten (grünen) Wellen einen Phasenkontrast erzeugen. STEM hingegen rastert einen fokussierten Strahl über die Probe und sammelt die gestreuten Elektronen Pixel für Pixel. Mehrere Detektoren können Elektronen sammeln, die in verschiedenen Winkeln gestreut werden. Diese Zahl wurde von30 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Beispiel für eine Bildverzerrung auf der linken Seite aufgrund der hohen Abtastrate. Man beachte die Verzerrung, die durch gelbe Pfeilspitzen markiert ist, sowie die verzerrten ovalen Löcher im Quantifoil. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Montage-Setup-Dialog für die gesamte Rastermontage. Wählen Sie die Vergrößerung und die Anzahl der Teile in X und Y so, dass die Gesamtfläche etwa 2.000 μm erreicht, um eine Karte für den größten Teil des Rasters zu erhalten. Wählen Sie außerdem "Bühne verschieben" anstelle von "Bild verschieben" und "Montage-Mapping verwenden, nicht Aufnahmeparameter". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: GridMap bei voller Vergrößerung bei geringer Vergrößerung, aufgenommen im STEM-Modus. Gebrochene Bereiche erscheinen im Dunkelfeldbild komplett schwarz. Dunkelgraue Bereiche sind wahrscheinlich zu dick und schlecht verglast. Gute Kandidatenbereiche für die Tomographie sind in diesem Scan weiß oder hellgrau. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Wechsel zum Marker-Prozess. Ein erkennbares Objekt wird in der Karte mit niedriger Auflösung durch Punkte hinzufügen markiert (38 in diesem Bild). Beachten Sie den Wechsel zwischen der Karte mit niedriger Auflösung (grüner Kreis) und der Karte mit mittlerer Auflösung (orangefarbener Kreis). Anschließend wird das Objekt durch die Markierung (grünes Kreuz, roter Kreis) markiert und der Dialog Zu Marker wechseln wird gestartet. Die gewählte Option verschiebt alle Karten mit 245x um den gleichen Betrag. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Dialog zum Einrichten der Neigungsserie für eine STEM-Neigungsserie. Das dosissymmetrische Schema wird von -60° bis +60° in 2°-Schritten verwendet. Der Autofokus wird aufgrund der hohen Tiefenschärfe bei Verwendung eines niedrigen Konvergenzwinkels übersprungen. Es besteht keine Notwendigkeit, die Euzentrizität zu verfeinern, wie dies zuvor der Fall war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Dialogfeld "Dateieigenschaften" für Karten mit mittlerer Auflösung. Speichern Sie als MRC-Stack-Datei, wählen Sie Ganzzahlen aus, und speichern Sie zusätzliche Informationen in einer .mdoc-Metadatendatei. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: Montage-Setup-Dialog zum Speichern von Karten mittlerer Auflösung. Für ein Quadrat auf einem 200-Maschen-Raster, das 90 μm breit ist, ist eine Gesamtfläche von mindestens 90 μm x 90 μm ratsam. Wählen Sie "Bühne verschieben", anstatt das Bild zu verschieben, und "Ansichtsparameter im Modus "Niedrige Dosis verwenden". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 9
Abbildung 9: Karte mit mittlerer Auflösung. Erfassen bei Elementen-Dialog zum Aufzeichnen von Karten mit mittlerer Auflösung. Wählen Sie "Mapping", "Bild oder Montage erfassen und speichern" und aktivieren Sie "Navigator-Karte erstellen". Wählen Sie in den Aufgaben vor oder nach Primär die Option Grob- und Feinzentrizität aus. Wenn Sie keine Hilfe benötigen, wählen Sie optional Kein Meldungsfeld, wenn ein Fehler auftritt und Schließen Sie die Säulenventile am Ende aus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 10
Abbildung 10: Bild einer Karte mit mittlerer Auflösung. Karte mit mittlerer Auflösung (Square Map), aufgenommen im STEM-Modus durch eine Montage von 3 x 3. Die beiden mittelauflösenden Ankerkarten für die Datenerfassung sind durch die blauen Quadrate gekennzeichnet. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 11
Abbildung 11: Daten der Batch-Tilt-Reihe. Erwerben bei Gegenständen Dialog zum Sammeln von Stapel-Tilt-Serien. Wählen Sie für die Neigungsreihen-Datenerfassung die Option Endgültige Daten und Neigungsreihen erfassen aus. Aktivieren Sie unter Aufgaben vor oder nach der Primärfunktion die Optionen Dewars/Vakuum verwalten (wählen Sie die entsprechenden Einstellungen im Setup-Menü), Auf Element neu ausrichten, Feinzentrizität und Skript vor Aktion ausführen. Aktivieren Sie in den allgemeinen Optionen das Kontrollkästchen Keine Meldung, wenn ein Fehler auftritt und schließen Sie die Säulenventile am Ende (siehe 5.14). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 12
Abbildung 12: 0°-Neigung einer STEM-Kippreihe eines Mitochondriums. Orangefarbene Pfeilspitzen deuten auf Calciumphosphat-Ablagerungen (Matrix-Granulate) hin, grüne Pfeilspitzen auf Cristae und rote Pfeilspitzen auf 15 nm Gold-Fiducial-Markierungen. Maßstabsbalken = 500 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 13
Abbildung 13: Registrierte Kryo-CLEM-Karten. (A) Die STEM-Karte mittlerer Auflösung (Quadratkarte, 26-A) ist für die (B) niedrig aufgelöste STEM-Karte, (C) die Kryo-FM-Karte des BF-Kanals und (D) die Kryo-FM-Karte des GFP-Kanals registriert. Die neun Registrierungspunkte (Beschriftungen 4-21) werden im (E) Navigator angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 14
Abbildung 14: Volumen-Rendering. Volumendarstellung von (A) 60 nm und (B) 40 nm dicken Schnitten durch ein SIRT-ähnliches (30 Zyklen) gefiltertes Tomogramm in verschiedenen Tiefen. Die Pixelgröße beträgt 2,048 nm, woraus sich ein Sichtfeld von ca. 4 μm ergibt. Bitte beachten Sie die invertierte Dichte im Vergleich zu Abbildung 12, was bedeutet, dass hochintensive Merkmale hell sind. Orange, weiße, rote, grüne und hellblaue Pfeilspitzen deuten auf Kalziumphosphatablagerungen, Ribosomen, Mikrotubuli, die innere und äußere Mitochondrienmembran bzw. Aktinfilamente hin. Maßstabsbalken = 500 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Das Protokoll soll biowissenschaftlichen Mikroskopikern helfen, die daran interessiert sind, eine 3D-Ansicht von intrazellulären Organellen in Regionen der Zelle zu erhalten, die für die konventionelle TEM-Tomographie nicht zugänglich sind. Das gleiche Protokoll kann auch für die STEM-Tomographie von Kunststoffschnitten verwendet werden, wobei die Belichtungsbeschränkungen gelockert werden. Das Protokoll sollte als Ausgangspunkt und nicht als eine Reihe harter Regeln betrachtet werden. In der Tat liegt die Stärke von MINT in seiner Flexibilität; Es gibt nicht den einen richtigen Weg, es zu bedienen.

Wir betonen, dass sich STEM per se nur auf die gescannte Sonde bezieht und nicht die Bildentstehung definiert. Der Kontrast hängt in erster Linie von der Konfiguration der Detektoren ab. Die einfacheren Methoden verwenden Detektoren mit axialer Symmetrie, entweder eine Scheibe, die auf der optischen Achse zentriert ist, oder einen Ring, der sie umgibt. Im Allgemeinen nehmen wir, wenn die Beleuchtung direkt auf den Detektor trifft, ein BF-Bild auf, bei dem die (elektronenstreuende) Probe dunkel erscheint; Umgekehrt, wenn der Detektor nur gestreute Elektronen sammelt, nehmen wir ein DF-Bild auf, in dem die dichte Probe hell erscheint. Wenn geeignete Hardware verfügbar ist, kann SerialEM diese beiden Signale gleichzeitig erfassen und aufzeichnen. Es stehen noch ausgefeiltere Konfigurationen zur Verfügung, die von Detektoren mit mehreren Segmenten bis hin zu vollständig pixeligen Kameras reichen. Eine Phasenkontrastbildgebung kann beispielsweise durch die Auswertung der Differenz zwischen außeraxialen Detektorelementen32,33 erreicht werden. Die Erfassung des gesamten 2D-Streumusters (Beugung) pro Pixel definiert die als 4D STEM34 bekannte Methode, die die Rekonstruktion mehrerer Bildkontraste aus denselben Originaldaten ermöglicht. Das vierdimensionale STEM ermöglicht die Elektronenptychographie, die eine weitere Möglichkeit bietet, den Phasenkontrast35 zu erhalten.

Wir haben uns auf die spezielle STEM-Modalität konzentriert, die wir für die Untersuchung von Organellen und intakten Zellen oder mikrometerdicken Zellabschnitten für am nützlichsten halten. Dies beinhaltet insbesondere den Einsatz von BF-Bildgebung mit einem kleinen Semikonvergenzwinkel in der Beleuchtung und einem relativ großen Sammelwinkel am Detektor. Die kleine Konvergenz sorgt für eine große Schärfentiefe, so dass die gesamte Probe während der gesamten Neigungsreihe19 scharf bleibt. In der Praxis kann mit einem guten Mikroskoptisch auch die Notwendigkeit einer Fokuseinstellung während der Aufnahme entfallen. Der Preis ist ein Kompromiss bei der Auflösung, wie in Abschnitt 3 des Protokolls beschrieben. Wir haben 4k-Bilder mit einer Sonde von ~2 nm vorgeschlagen, die bei 1 nm Pixelabstand ein Sichtfeld von 4 μm erreicht. Der Leser wird jedoch nachdrücklich zum Experimentieren aufgefordert. Die zweite Überlegung betrifft die Seite des Detektors. Wenn die Beleuchtungsscheibe den BF-Detektor auf der Achse nicht ausfüllt, wird der Phasenkontrast unterdrückt und der Streukontrast (Amplitudenkontrast) dominiert. Dieser Zustand wurde als inkohärenter Hellfeldkontrast36 bezeichnet. Die Frage ist, mit welchem Anteil untergefüllt werden soll, und die Antwort hängt von der Stichprobe ab. Eine sehr dünne Probe zeigt den besten Kontrast, wenn der Detektor vollständig gefüllt ist (d. h. der Erfassungswinkel entspricht dem der Beleuchtung), aber eine dickere Probe streut die gesamte Intensität weg und hinterlässt ein verrauschtes Signal mit schlechtem Kontrast. Eine nützliche Faustregel lautet: Je dicker die Probe, desto größer sollte der äußere Grenzwinkel des BF-Detektors21 sein. Die Größe und Position des Detektors sind natürlich festgelegt, so dass die Größe der Beugungsscheibe anhand der Kameralänge angepasst wird, wie in Abschnitt 1 beschrieben. Wenn der Detektorverstärker so eingestellt ist, dass das Signal den Dynamikbereich ausfüllt, aber bei direkter Beleuchtung nicht sättigt (1.12.3), kann die Kameralänge erhöht werden, bis eine angemessene Signalintensität und ein angemessener Kontrast erreicht sind. Auch hier wird der Leser zum Experimentieren angeregt. Die Kunst liegt sozusagen in den Winkeln.

Ein weiterer Parameter, der im Protokoll nicht behandelt wird, ist die Beschleunigungsspannung des Mikroskops. Die Wechselwirkung der Leuchtelektronen mit der Probe ist bei einer niedrigeren Spannung stärker. Wenn alles andere gleich ist, können wir einen höheren Kontrast bei niedrigerer Spannung erwarten. Andererseits ist es das Einsetzen von Mehrfachstreuung innerhalb der Probe, das die nutzbare Probendicke begrenzt, so dass eine höhere Spannung die Verwendung dickerer Proben ermöglicht. Diese Effekte sind jedoch eher subtil. Ähnlich sind unsere bisherigen Erfahrungen mit 200 kV und 300 kV Beschleunigungen.

Wenn man bedenkt, was von STEM in Bezug auf die Auflösung zu erwarten ist, hängt dies wiederum von der Probe und der Detektorkonfiguration ab. Mit Hilfe eines Einzelpartikelanalyseansatzes konnten Metallionen auf Ferritin mittels ringförmigem Dunkelfeld-STEM mit einer Genauigkeit von wenigen Ångström lokalisiert werden37. In jüngerer Zeit wurde eine Sub-Nanometer-Auflösung für Virus- und Proteinproben mit Hilfe von Bildern erreicht, die mit integriertem differentiellem Phasenkontrast (iDPC) STEM32 sowie Ptychographie35 gewonnen wurden. Für einzigartige Objekte in dickzelligen Proben und mit den hier beschriebenen Methoden ist eine so hohe Auflösung nicht realistisch. Die optimale Auflösung ist der Sondendurchmesser, der sich auf den beschriebenen Semikonvergenzwinkel bezieht. Andere Faktoren verschlechtern die Auflösung, insbesondere eine grobe Pixelabtastung, um ein großes Sichtfeld zu erreichen, Fehlausrichtungen in der Neigungsreihe und die Ausbreitung des Sondenstrahls bei der Übertragung. Die Bilder lassen sich gut mit der Kunststoffschnitttomographie vergleichen. Mit dem hier beschriebenen Aufbau sollte es zum Beispiel gut sein, den hohlen Kern der Mikrotubuli zu erkennen, nicht aber die einzelnen Protofilamente.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich sowohl MINT-Methoden als auch Hardware in einer Entwicklungsphase befinden. Wir können davon ausgehen, dass sich Innovationen in der Bildgebung auch auf die Tomographie auswirken und MINT in Bereiche führen werden, die mit anderen Techniken bisher nicht zugänglich waren. Wir gehen davon aus, dass eine Konvergenz mit korrelativer kryogener Fluoreszenzbildgebung auf Basis moderner optischer Superauflösungsmethoden besonders fruchtbar sein wird. Die Skala der Organellen von 100-1.000 nm ist ein ideales Ziel für diese neuen Methoden.

Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Wir sind sehr dankbar für die kontinuierliche und konstante Unterstützung durch den Autor und Betreuer des SerialEM-Softwarepakets, David Mastronade, und Günther Resch. P.K. wurde vom Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung (FWF) durch ein Schrödinger-Stipendium J4449-B gefördert. Zum Zwecke des Open Access haben die Autoren eine CC-BY-Lizenz für das öffentliche Urheberrecht auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergibt. M.E. und S.G.W. würdigen die Förderung durch die Israel Science Foundation, Grant Nr. 1696/18, und durch das Horizon 2020 Twinning-Projekt der Europäischen Union, ImpaCT (Grant Nr. 857203). M.E. bedankt sich für die Förderung durch den ERC im Projekt CryoSTEM (Grant Nr. 101055413). M.E. ist Inhaber des Sam and Ayala Zacks Professorial Chair und Leiter des Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. Das Labor von M.E. hat von der historischen Großzügigkeit der Familie Harold Perlman profitiert. Wir bedanken uns auch für die Förderung durch die Europäische Union. Die geäußerten Ansichten und Meinungen sind jedoch nur die des Autors/der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die der Europäischen Union oder der Exekutivagentur des Europäischen Forschungsrats wider. Weder die Europäische Union noch die Bewilligungsbehörde können dafür verantwortlich gemacht werden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 SerialEM University of Colorado Veriosn 4.0 SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition. 
STEM-capable transmission electron microscope The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well.

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Biologie Heft 196
Visualisierung von Organellen <em>in situ</em> mittels Kryo-STEM-Tomographie
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Kirchweger, P., Mullick, D., Wolf, S. G., Elbaum, M. Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography. J. Vis. Exp. (196), e65052, doi:10.3791/65052 (2023).

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