Biology

Cryo-STEM 단층촬영에 의한 세포 소기관 In Situ 의 시각화

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65052

Peter Kirchweger¹, Debakshi Mullick¹, Sharon Grayer Wolf², Michael Elbaum¹

¹Department of Chemical and Biological Physics, Weizmann Institute of Sciences, ²Department of Chemical Research Support, Weizmann Institute of Sciences

Summary

Cryo-STEM 단층촬영은 임베딩, 절편 또는 기타 침습적 제제 없이 손상되지 않은 세포의 세포 소기관을 시각화하는 수단을 제공합니다. 얻어진 3D 해상도는 현재 수 나노미터 범위이며, 시야는 수 마이크로미터이고 접근 가능한 두께는 1μm 정도입니다.

Abstract

극저온 전자 현미경(Cryo-EM)은 기본 수성 매질에 내장된 생물학적 또는 유기 표본의 이미징에 의존합니다. 물은 결정화 없이 유리로 고형화(즉, 유리화)됩니다. Cryo-EM 방법은 최근 원자 분해능에 가까운 생물학적 거대분자의 구조를 측정하는 데 널리 사용되고 있습니다. 이 접근법은 단층 촬영을 이용한 세포 소기관 및 세포 연구로 확장되었지만 기존의 광시야 투과 EM 이미징 모드는 표본 두께에 심각한 제한을 겪고 있습니다. 이것은 집중된 이온 빔을 사용하여 얇은 라멜라를 밀링하는 관행으로 이어졌습니다. 고해상도는 재구성에서 평균을 내는 서브토모그램에 의해 얻어지지만 나머지 층 외부의 3차원 관계는 손실됩니다. 두께 제한은 스캐닝 EM 또는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경과 유사한 스캔된 프로브 이미징으로 우회할 수 있습니다. 재료 과학의 주사 투과 전자 현미경(STEM)은 단일 이미지에서 원자 분해능을 제공하지만 전자 조사에 대한 극저온 생물 표본의 민감도는 특별한 고려 사항이 필요합니다. 이 프로토콜은 STEM을 사용한 극저온 단층 촬영을 위한 설정을 제공합니다. 현미경의 기본 국소 구성은 2개 및 3개 콘덴서 시스템 모두에 대해 설명되며, 자동화는 비상업적 SerialEM 소프트웨어를 통해 제공됩니다. 배치 획득 및 이전에 획득한 형광 맵에 대한 상관 정렬에 대한 개선 사항도 설명되어 있습니다. 예를 들어, 우리는 미토콘드리아의 재구성을 보여주고, 내막과 외막, 인산칼슘 과립뿐만 아니라 주변의 미세소관, 액틴 필라멘트 및 리보솜을 지적합니다. Cryo-STEM 단층 촬영은 세포질의 세포 소기관 극장을 드러내는 데 탁월하며, 경우에 따라 배양 중인 부착 세포의 핵 주변부까지 드러내는 데 탁월합니다.

Introduction

세포 소기관의 3차원(3D) 시각화는 현대 세포 생물학에서 가장 중요한 작업입니다. 분비 소포의 경우 수십 나노미터에서 세포핵의 경우 수 미크론에 이르는 규모를 감안할 때 모든 응용 분야에 적합한 단일 현미경 기술을 찾는 것은 어렵습니다. 현대의 형광 현미경은 분해능 측면에서 많은 범위에 걸쳐 있을 수 있지만 표지된 분자만 나타납니다. 세포 극장은 전자 현미경의 영역으로 남아 있습니다. 기존의 화학적 고정, 플라스틱 임베딩 및 중금속 염색 방법은 강력하게 침습적이므로 결과는 샘플 준비의 세부 사항에 따라 달라질 수 있습니다. 반면에 Cryo-EM은 수성 매질을 유리화해야 할 필요성에 의해 제약을 받습니다. 전자 조명을 회절시키는 얼음 결정은 관심있는 유기 물질보다 더 높은 대비의 대비 인공물을 유발합니다.

지난 10년 동안 세포 연구를 위해 개발되거나 적용된 EM 이미징 기술이 확산되었습니다¹. 주사 전자 현미경 (즉, FIB-SEM)을 사용한 반복 집속 이온 빔 (FIB) 밀링 및 직렬 표면 이미징과 결합 된 고압 동결은 현재 대형 시편²에 선택되는 방법입니다. 극저온 연질 X선 단층촬영(cryo-SXT)은 수 미크론 크기의 시료에 적합하며, 물에서 연질 X선의 특성 흡수 길이에 의해 제한됩니다 ^3,4,5. 이 척도는 많은 온전한 세포 유형을 포함하며, X선 흡수 대비의 정량적 특성은 농도 측정⁶ 또는 분광법⁷의 측면을 추가한다. 위상차 투과 전자 현미경(TEM)을 기반으로 하는 초저온 투과 전자 단층 촬영(cryo-ET)은 서브토모그램 평균화와 결합할 때 거대분자 또는 복합체에 대해 가장 높은 분해능을 제공합니다 ^8,9,10. 그러나 온전한 세포 소기관이 너무 규칙적이어서 전체를 평균화할 수 있는 경우는 드뭅니다. 더욱이, 광시야 TEM의 종래의 모드는 시편의 비탄성 산란(에너지 손실 포함)과 자기 대물렌즈(^11,12)의 색수차의 조합에 의해 시편 두께를 수백 나노미터로 제한한다. 에너지 확산이 크면 에너지 필터를 사용하여 초점이 맞지 않는 연무를 제거해야 하지만, 민감한 시편은 여전히 방사선 손상을 입고 이미지 신호는 두께가 증가함에 따라 기하급수적으로 약해집니다.

대체 이미징 모드인 주사 투과 EM(STEM)은 에너지 필터링의 필요성을 피하고 이미지 형성을 위해 비탄성적으로 산란된 전자를 유지하지만, 현재 TEM 단층 촬영보다 해상도가 낮습니다(그림 1). 사실, 실제 이미지는 형성되지 않습니다. 대신 스캐닝 EM에서와 같이 포인트별로 측정이 이루어지고 이미지가 컴퓨터에 의해 조립됩니다. 배율은 렌즈 전류를 변경하지 않고 스캔 단계의 크기에 의해서만 결정됩니다. 적절하게 구성되면 cryo-STEM 단층 촬영(CSTET)에 유용한 표본 두께 범위는 1.5 또는 2 μm에 도달할 수 있지만, 유용한 신호 강도가 조명의 상당 부분을 차지하는 컴포트 존은 약 600-900 nm^11,13입니다. 이것은 세포질의 많은 부분과 때로는 세포핵의 가장자리를 보기에 충분합니다. 실제로, 우리는 극저온 유체에 뛰어드는 표준 방법에 의한 유리화가 STEM 이미징보다 두께에 더 심각한 제약을 가한다는 것을 발견했습니다. 이 비디오 기사의 목표는 연구실 및 현미경 시설에서 세포 및 세포 소기관 이미징을 위한 도구 상자에 CSTET를 쉽게 통합하는 것입니다.

첫 번째 과제는 CSTET의 현미경 작업이 Cryo-TEM 단층 촬영과 같은 방식으로 생명 과학 응용 분야에 대해 아직 표준화되지 않았다는 것입니다. STEM 하드웨어가 Cryo-EM 시장을 겨냥한 적이 거의 없습니다. 그러나 이것은 최신 세대의 현미경으로 변화하고 있으며 많은 기존 도구를 개조할 수 있습니다. 기술로서의 STEM은 극저온 및 저선량 방법에 대한 관심이 싹트고 있는 재료 과학 분야에서 크게 자리를 잡았습니다^14,15. 재료 과학 문헌에는 BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM 등의 약어가 풍부하여 혼란을 가중시킵니다. 여기서는 Weizmann Institute of Science에서의 집단적 경험을 바탕으로 명시야(BF) STEM 이미징을 기반으로 한 유용한 결과를 위한 가장 일반적인 프로토콜을 제공하는 권장 출발점을 제공합니다¹⁶. 가능성의 범위를 소진하거나 탐색하지는 않지만 추가 개선을 위한 기초가 될 것입니다. Cryo-STEM을 강조하지만 대부분의 프로토콜은 플라스틱 내장 섹션의 실온 STEM 단층 촬영과 동등하게 관련이 있습니다.

STEM의 핵심은 집속 전자 프로브(그림 1), 조명 원뿔로 표본을 스캔하고 전송 시 회절(산란) 평면의 신호를 픽셀 단위로 기록하여 2D 이미지^17,18을 생성하는 것입니다. 대부분의 세포 물질을 포함한 비정질 표본은 전달 시 확산 산란 패턴을 생성합니다. 가장 간단한 실용적인 STEM 구성은 원형 검출기를 배치하여 중앙 디스크(즉, 표본 없이 전송되는 프로브 조명)를 기록하는 것입니다. 표본은 신호가 감소하는 정도까지 이 조명 원뿔에서 전자를 산란시킵니다. 이렇게 하면 BF 이미지가 생성되며 표본이 밝은 배경에서 어둡게 나타납니다. 환형 검출기는 또한 (또는 대신에) 조명 원뿔 외부의 시편으로부터의 산란을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 시편을 제거하면 신호가 없습니다. 표본이 제자리에 있으면 암시야(DF) 이미지의 어두운 배경에 물체가 밝게 나타납니다. STEM(BF, 환형 암시야[ADF], 고각 고리형 암시야[HAADF] 등)의 명명법은 주로 검출기의 수집 각도 범위를 나타냅니다.

조명의 수렴 각도는 세포 단층 촬영에 대한 STEM의 필수적인 적응을 나타냅니다. 최우선 순위가 고해상도인 경우 수렴 각도는 가능한 한 커야 합니다. (이것은 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경과 유사합니다. 해상도는 프로브 직경에 의해 결정되며, 프로브 직경은 파장을 개구수로 나눈 값으로 조정됩니다. EM의 경우 반각 또는 반수렴각을 지칭합니다.) 반면에 우선 순위가 피사계 심도인 경우 해상도의 절충안은 집중된 빔이 파장의 두 배에 해당하는 거리에 대해 대략 평행하게 유지되기 때문에 큰 이점을 제공합니다. 이상적으로는, 전체 세포 부피가 초점(¹⁹)에 유지된다. 예를 들어, 300keV에서 전자 deBroglie 파장은 0.002nm이므로 1mrad의 수렴은 2nm의 분해능과 4미크론의 피사계 심도를 산출합니다. 이러한 조건 하에서, 단층 촬영은 데이터 수집 과정에서 초점을 맞추지 않고도 수행 될 수 있지만, 획득 초기에는 한 번만 수행 할 수 있습니다. 기존의 단층 촬영 가능 STEM은 7 또는 8mrad의 반 수렴 각도에 도달 할 수 있습니다. 따라서 원칙적으로 0.25nm 정도의 해상도에 도달 할 수 있지만 초점 깊이는 62nm에 불과합니다. 이것은 세포 이미징을 하기에는 분명히 너무 얇습니다. 3개의 콘덴서 렌즈가 있는 고급 현미경은 상당한 범위에서 반수렴 각도를 지속적으로 조정할 수 있습니다. 보다 전통적인 2 콘덴서 구성에서는 컨버전스가 콘덴서(C2) 조리개에 의해 개별적으로 고정됩니다.

견고한 플라스틱 내장 샘플의 경우 각 기울기에서 초점 시리즈를 기록하고 결합하여 고해상도²⁰을 만들 수 있지만 극저온 샘플의 경우 방사선 예산이 너무 심하게 제한됩니다. 마지막으로, BF 또는 DF 이미징의 장점을 평가할 때 두꺼운 표본의 경우 표본에서 다중 탄성 산란의 영향을 고려해야 합니다. BF 신호는 다중 산란에 의해 덜 손상되고 두꺼운 시편^16,21에 대해 더 높은 분해능을 나타낸다.

유용한 경험 법칙은 수렴보다 몇 배 더 큰 수집 각도를 설정하는 것입니다. 표본이 두꺼울수록 수집 디스크가 커야 합니다. 디스크가 너무 작으면 신호 강도가 낮아집니다. 디스크가 너무 크면 가장 높은 각도의 산란만 발생하므로 이미지 대비가 나빠집니다. 채취 각도는 주어진 샘플에 맞게 최적화되어야 합니다. (회절) 카메라 길이의 함수로서의 검출기 각도는 독립적으로 보정되어야 합니다. 현미경 소프트웨어로 편리하게 표시할 수 있습니다. 실제로, 조명 반각에 대한 수집 비율에서 각각 θ 대 α의 비율에서 2에서 5의 계수(그림 1)는 세포 표본의 CSTET에 권장되는 시작점입니다.

다음 프로토콜은 현미경 제어를 위해 널리 사용되는 SerialEM 소프트웨어를 사용한 STEM 단층 촬영 작업을 설명합니다^22,23. SerialEM은 특정 제조업체에 얽매이지 않으며 TEM 단층 촬영에 널리 사용됩니다. 단층 촬영 설정과 관련된 대부분의 작업은 TEM에서 직접 수행할 수 있습니다. SerialEM 전략은 스캐닝 시스템을 카메라로 모델링하는 것입니다. 이를 통해 TEM에서 STEM으로의 간단한 크로스오버가 가능합니다. 그러나 확대 및 비닝과 같은 매개변수는 완전히 인공적이라는 점을 명심해야 합니다. 중요한 매개변수는 미크론 단위의 시야, 시야의 픽셀 수 및 노출 시간입니다. 픽셀 간격 또는 샘플링은 선형 필드를 픽셀 수로 나눈 값이고 체류 시간은 픽셀 수를 노출 시간으로 나눈 값입니다.

STEM 및 CSTET의 최소 구성에는 스캔 발생기, STEM 검출기 및 단층 촬영 제어 소프트웨어의 세 가지 기능이 포함됩니다. 이 프로토콜은 FEI/Thermo Fisher Scientific(TFS)의 명명법을 참조하지만 개념은 일반적입니다. TFS의 독점 소프트웨어는 TEM²⁴용 JoVE에 설명되어 있으며 STEM 작업은 매우 유사합니다.

우리는 현미경이 서비스 팀이나 숙련된 직원에 의해 미리 정렬되었으며 파일을 로드하여 컬럼 정렬을 호출할 수 있다고 가정합니다. 사소한 조정을 직접 정렬이라고 하며 소위 FEG 레지스터(TFS 현미경)에 저장할 수 있습니다. 직접 정렬에는 회전 중심, 피벗 점, 회절 정렬 및 콘덴서 난시에 대한 보상이 포함됩니다. 조정은 반복적으로 수행되어야 합니다. TFS 현미경은 별개의 나노프로브(nP) 및 마이크로프로브(μP) 모드를 구현합니다. 주어진 콘덴서 조리개에 대해, 이들은 각각 TEM의 평행 조명과 STEM의 다소 수렴 (밀접하게 초점이 맞춰진) 전자빔으로 상대적으로 좁거나 넓은 시야를 제공합니다. 다른 제조업체는 수렴 각도 범위를 다루기 위해 다른 방식을 사용합니다.

시작하기 전에 연구 중인 샘플에 따라 시야 L과 샘플링(픽셀 너비) l을 선택해야 합니다. 예를 들어, l = 1nm/픽셀의 경우 4,000μm2의 시야를 커버하는 4,000 x 4,000픽셀 이미지를 선택해야 합니다. 분해능은 기껏해야 공간 샘플링의 두 배이므로 2nm이고 프로브 직경 d는 이와 일치해야 합니다. 프로브 각도의 교정은 이 프로토콜의 범위를 벗어나므로 테이블 또는 화면 판독을 사용할 수 있다고 가정합니다. 프로브 직경은 대략 전자 파장을 반수렴각(라디안 단위)으로 나눈 값: d = λ/θ입니다. 파장 λ는 300keV의 경우 0.002nm이고 200keV 전자의 경우 0.0025nm이므로 1mrad의 θ는 각각 2 또는 2.5nm의 스폿 직경을 제공합니다.

프로토콜은 복잡성이 증가하는 진행으로 제공됩니다. 첫 번째 작업은 현미경 제조업체의 소프트웨어에 따라 달라지는 STEM 이미지를 생성한 다음 SerialEM을 사용하는 틸트 시리즈를 생성하는 것입니다. 많은 독자들이 SerialEM에 익숙할 것이므로 더 복잡한 작업이 자연스럽게 이루어질 것입니다. 절차를 엄격하게 따를 필요가 없습니다. 자동화와 관련된 개발은 TEM뿐만 아니라 STEM을 위해 직접 구현될 수 있습니다. 숙련된 사용자는 형광 맵의 상관 등록부터 시작하여 배치 단층 촬영을 계속 설정하는 프로토콜을 뒤집을 것입니다. 자세한 내용은 Automation²⁵의 최신 개발에 대한 최근 JoVE 기사를 포함하여 SerialEM 자체에 대한 광범위한 문서 및 자습서 라이브러리에서 찾을 수 있습니다.

Protocol

1. STEM 설정

예비 정렬: 컬럼 정렬 파일을 로드한 다음 컬럼 밸브를 엽니다. 측면 입구 크라이오 홀더를 사용하는 경우 크라이오 쉴드를 엽니다. TEM 모드에서 시작합니다. 빔이 화면에 나타나야 합니다. 그렇지 않은 경우 배율을 낮추십시오.
제어판의 버튼을 눌러 현미경을 유센트릭 초점으로 가져옵니다.
스폿 크기를 편리한 값(예: 6)으로 설정하여 직접 또는 내장 카메라(현미경 모델에 따라 다름)를 사용하여 형광 화면을 시각화합니다.
현미경을 STEM 모드로 설정하고 초점이 대물렌즈가 아닌 콘덴서 렌즈(강도)를 사용하는지 확인합니다. 유센트릭 포커스를 설정합니다. 그런 다음 초기 조정을 위해 회절 모드를 종료합니다.
빔이 비어 있지 않은지 확인하십시오. 빔이 화면에 나타날 때까지 배율을 줄입니다. 빔 이동을 중앙으로 조정하고 빔을 중앙에 유지하면서 최대 약 70kx까지 배율을 높입니다.
원하는 콘덴서 조리개(일반적으로 50μm)를 삽입합니다. 조리개 센터링을 확인하십시오. 초점 노브를 앞뒤로 약간 돌리면 스폿이 팽창 및 수축해야 하지만 비행기가 가상의 수직 모래시계를 자르는 것처럼 제자리에 남아 있어야 합니다. 조리개가 중앙에 있지 않으면 모래시계가 기울어진 것처럼 조명이 측면으로 이동합니다.
빔에 초점을 맞추고 정렬 탭에서 Intensity List Focus (사용 가능한 경우)를 누르거나 1.2에서와 같이 유센트릭 초점으로 돌아갑니다. 빔 위치를 중앙으로 재조정합니다.
회전 중심을 조정합니다. 초점 스텝 휠을 최소 또는 한 단계 위로 돌려 빔이 부드럽게 펄스되도록 하고 초점이 위아래로 움직일 때 고정된 상태를 유지하도록 합니다.
피벗 포인트를 선택하고 X 및 Y 조정과 함께 두 포인트를 가져옵니다.
참고: 위상판이 TFS 계측기에 설치된 경우 X 조정만 사용해야 합니다.
빔의 초점을 약간 흐리게 하고 콘덴서 스티그메이터를 조정하여 디스크를 둥글게 만듭니다. 최적화를 위해 초점을 통해 위아래로 이동합니다. 초점을 통과할 때 한 방향 또는 다른 방향으로 늘어나는 경향이 없어야 합니다.
렌즈를 표준화합니다. 그런 다음 빔 시프트를 사용하여 스폿을 중앙에 유지하면서 배율을 약 240kx로 점진적으로 늘리고 회전 중심 및 피벗 포인트 조정을 반복합니다(1.6-1.8단계).
회절 모드로 돌아갑니다. 빔은 형광 스크린에 균일한 디스크로 나타나야 합니다. 카메라 길이(CL)는 이제 X선 결정학에서와 같이 검출기까지의 광학 거리를 효과적으로 제어합니다. 이를 변경하고 화면 위치가 표본 쪽으로 또는 표본에서 멀어지는 것처럼 디스크가 수축 및 확대되는 것을 관찰합니다. 이 원뿔은 BF 조명을 나타냅니다.
참고: 각 CL에 대해 투사된 빔을 중심 축으로 가져오기 위해 조정해야 하는 회절 정렬이 있습니다. 일반적으로 모두 구체화할 필요는 없으며 탐지에 사용할 하나(또는 몇 개)만 구체화할 필요가 있습니다.
고배율에서 STEM 모드를 사용합니다.
1. BF STEM 검출기를 사용할 수 있다면 그것으로 시작하십시오. 빈 구멍이 있는 영역으로 스테이지를 가져오고 원하는 CL을 사용하여 빔을 중앙에 배치하도록 회절 정렬을 조정합니다.
2. 많은 현미경에는 HAADF 검출기만 장착되어 있습니다. 이것을 BF 감지기로 사용하는 트릭이 있습니다. 먼저 검출기를 집어넣고 위와 같이 빔을 직접 정렬하여 중앙에 배치하고 대물렌즈 조리개(일반적으로 20μm와 같은 작은 구멍)를 삽입하고 빔을 균일하게 둘러싸도록 위치를 조정합니다. (가장 쉬운 방법은 시편이나 테스트 그리드를 삽입하여 조명 주변의 후광을 확인하는 것입니다.) 그런 다음 회절 정렬을 사용하여 빔을 축에서 벗어나 검출기 영역으로 이동합니다. 빔이 검출기에 의해 차단되는지 확인하기 위해 화면의 빔을 보면서 검출기를 삽입하고 집어넣습니다.
3. 현미경 소프트웨어에서 스캔을 시작하고 밝기 및 대비(B/C) 설정을 조정하여 빔이 가려지면 신호가 0에 가깝고 전체 조명이 검출기에 떨어질 때 포화에 가까워지도록 합니다. 스코프 디스플레이를 사용하여 지원하십시오. 설정이 예기치 않은 방식으로 결합될 수 있으므로 조정을 여러 번 반복해야 합니다.
현미경을 저배율(LM) 모드로 전환하지 않고 고배율 레지스터(SA 모드)에서 상대적으로 낮은 배율로 되돌립니다.
나중에 참조할 수 있도록 현재 화면을 기록해 두십시오(3.1.1단계 참조). 전류는 TEM에서와 같이 건 렌즈 및 스폿 크기 설정으로 변경할 수 있으며 감소된 전류에 해당하는 숫자가 증가합니다.
이 시점에서 FEG 레지스터를 저장하여 표준 값으로의 복귀를 용이하게 합니다.
참고: 기능은 사용자가 작업 구성에서 시작할 수 있도록 기본 FEG 레지스터 세트를 준비할 수 있습니다.

2. 시편 배치

LM TEM 모드에서 그리드가 불투명하지 않은지 확인합니다. 초기 조정을 위한 그리드 사각형을 찾습니다. 빈 공간, 구멍 또는 찢어진 격자 사각형을 찾는 것이 편리합니다. 편리하게 돌아갈 수 있도록 무대 위치를 기록하십시오.
샘플을 유센트릭 높이로 가져옵니다. 이를 수행하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 예를 들어, 스테이지 워블러를 사용하여 그리드를 기울이면서 이미지가 측면 이동을 멈출 때까지 Z축을 따라 시편 높이를 이동합니다. 또는 viewing 화면에 일부 기능을 표시하고 s를 기울입니다.tage 30°로. 피쳐가 측면으로 이동합니다. 시편 높이를 조정하여 원래 위치로 되돌립니다. 확대 또는 스테이지 기울기를 높여 다듬습니다. 0° 기울기로 돌아갑니다.
STEM 모드로 돌아가 STEM 검출기를 삽입합니다. 가장 낮은 고배율(SA) 모드로 이동합니다. 컴퓨터 화면에 이미지가 관찰되는지 확인합니다. 불필요한 노출을 피하기 위해 빠르게 스캔하십시오. 1μs/픽셀 이하가 일반적입니다. 스캔 속도가 너무 빠르면 왼쪽 테두리에서 이미지가 왜곡되어 나타날 수 있습니다( 그림 2 참조).
Eucentric Focus를 누르고, 배율을 높이고, 스캔하는 동안 초점을 미세 조정합니다. 현미경 소프트웨어에서 제공하는 초점 확대경을 사용하는 것이 편리합니다.
콘덴서 난시를 조정하십시오. 이것은 Ronchigram 방법으로 가장 정확하게 수행 할 수 있습니다. 얇은 샘플 영역 위에 빔을 놓고 양쪽에 있는 샘플의 그림자 이미지 사이에서 투과된 빔이 폭발하는 지점에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 콘덴서 튜닝을 조정하여 중앙 디스크를 둥글게 만듭니다. 이를 위해서는 특히 극저온 샘플의 경우 약간의 연습이 필요합니다.
참고: 대안은 일부 금 입자(종종 단층 촬영에서 정렬을 위한 기준 마커로 사용됨)를 찾는 것입니다. 배율을 높이고 위아래로 초점을 맞추고 난시를 조정하여 입자가 어느 방향으로든 늘어나지 않고 둥글게 유지되도록 합니다.
LM STEM 모드로 이동하여 스캔을 계속하여 관심 있는 영역을 찾습니다. 필요한 경우 대략적으로 이 시점에서 감지기 B/C 설정을 다시 조정합니다(1.13.3단계).

3. 이미지 녹화

녹음을 위한 선량을 추정합니다. 일반적으로 전체 단층 촬영에 대해 100-150 e^-/Å² 를 목표로 합니다. 검체당 선량 허용 오차를 확인하십시오. 암페어(A)의 전류를 전자당 전하로 나눈 값은 e^-/s의 수를 나타내며, 여기에 노출 시간 T(초)를 곱하고 Å²의 시야로 나눕니다. 편의를 위해 전류를 나노암페어 단위(화면에서 읽은 대로), 시야 너비(마이크로미터), 프레임 노출 시간(초)을 적절한 요소로 표현합니다.

이 숫자에 기울기 수를 곱하여 시리즈의 총 노출을 얻어야 합니다. 예를 들어, 전류 I = 0.04 nA, 필드 L = 4 μm, 노출 시간 12 초, 틸트 당 1.9 e / Å 2 또는 일련의 61 개 투영에 대해 약 110 ^{e /} Å²를 얻습니다.
스테이지를 구멍으로 되돌리고(또는 그리드를 후퇴) 스폿 크기 및/또는 건 렌즈 설정을 사용하여 빔 전류를 조정하여 원하는 화면 전류에 도달합니다. 측정값이 0이면 더 큰 C2 조리개를 삽입하여 전류를 증가시킵니다. 그런 다음 측정값을 직경 비율의 제곱으로 나누어 수정하고 마지막으로 더 작은 조리개로 돌아갑니다.
1.13.3 단계에 따라 B/C 설정을 수정하고 마지막으로 스테이지를 관심 영역으로 되돌리고 이미징 조건에서 직접 정렬 및 난시를 다시 확인합니다.
테스트 이미지를 획득합니다.

4. SerialEM을 이용한 단층 촬영

현미경 컴퓨터에서 SerialEM 서버를 시작합니다(SerialEM은 일반적으로 다른 서버에 설치됨). 그런 다음 SerialEM을 엽니다. STEM은 동일한 인터페이스로 카메라처럼 SerialEM에 나타납니다. 통신이 설정에 맞게 적절하게 실행되고 있는지 확인합니다. 예를 들어, 현미경 탭에 올바른 배율이 표시되어야 합니다. 그래도 문제가 해결되지 않으면 여기서 멈추고 문제를 해결하십시오.
카메라 및 스크립트 탭을 찾아 설정을 엽니다. STEM 카메라가 선택되어 있는지 확인하고 각 모드에 대해 적절한 비닝 및 체류 시간을 선택합니다. 적절한 감지기(또는 감지기)가 왼쪽 하단의 "획득할 채널" 상자에 나타나는지 확인합니다. 아래쪽에 있는 Acquire 를 눌러 테스트합니다. 다시 말하지만, 아무 일도 일어나지 않거나 빔이 비워지지 않으면 계속하지 마십시오. 통신을 중지하고 확인합니다.
참고: 모드는 TEM 단층 촬영과 유사한 방식으로 사용됩니다. 비닝은 TEM과의 호환성을 위한 기교입니다. 중요한 매개변수는 픽셀 수입니다. 서로 다른 현미경 시스템은 동일한 개수에 도달하기 위해 서로 다른 비닝을 사용합니다.
1. 보기 및 검색은 비교적 적은 픽셀(예: 1초에서 512 x 512픽셀)로 빠르게 스캔해야 합니다.
2. 초점은 일반적으로 빠른 기록이 있는 작은 영역입니다. 따라서 저선량 모드에서는 초점을 선택하여 기록 모드와 다른 배율로 설정하면 정확도에 도움이 될 수 있습니다. 스폿 크기는 변경하지 않고 그대로 둡니다.
3. Record mode(녹화 모드)의 경우 노출 추정에서 위에서 선택한 파라미터를 사용합니다. 사용 가능한 경우 기울어진 이미지에서 초점을 한 줄씩 보정하는 Dynamic Focus도 선택합니다.
4. 나중에 편의를 위해 미리 보기에 대한 범주닝을 보기에 대한 범주닝과 동일하게 선택합니다(개선 사항 #1, 5.5단계 참조). 이미지 크기(픽셀 수)가 같을 필요는 없습니다.
5. 평가판 모드를 사용하여 획득하는 동안 레코드 영역을 중앙에 유지합니다. 보기와 비슷할 수 있지만 프레임 왼쪽에 스캔 왜곡이 나타나지 않도록 주의해야 합니다(예를 들어 그림 2 참조). 다시 말하지만, 저용량 모드에서 시험은 기록 모드와 다른 배율을 가질 수 있습니다.
6. 그리드 스캔을 위해 몽타주 모드를 즉시 사용하십시오. 관심 영역을 찾을 수 있을 만큼 픽셀 밀도가 높아야 합니다. 권장 사항: 512 x 512 또는 1024 x 1024. 이 모드는 표본 영역을 찾는 데 사용되므로 적절한 다이내믹 레인지(이미지 디스플레이 컨트롤에서 볼 수 있음)로 이미지가 양호한지 확인하십시오.
7. 이러한 선택 사항이 다음 세션(프로그램이 충돌하는 경우 곧 발생할 수 있음)에 대해 기본값으로 유지되도록 설정 파일을 저장합니다.
이미지 시프트 및 스테이지 시프트 보정을 테스트합니다. 마이크로프로브(또는 나노프로브) 모드에서 View Image(이미지 보기)를 클릭하고 마우스로 마우스를 가져간 다음 버튼을 누른 상태에서 대각선으로 약 1/4 정도 끕니다. 그런 다음 다른 보기를 가져옵니다. 이미지가 완벽하게 겹쳐야 합니다. Shift 키를 누른 상태에서 다시 드래그하여 반복합니다(스테이지 이동을 적용하기 위해). 이미지는 잘 겹쳐야 하지만 정확하지는 않을 수 있습니다.
LM 모드로 이동하여 스테이지 이동을 테스트합니다. 이러한 테스트가 실패하면 중지하고 문제를 해결하십시오. 나머지는 작동하지 않습니다.
전체 그리드의 몽타주 LM 맵을 만듭니다. 이것은 TEM에서도 수행할 수 있습니다.
1. 이미지가 조리개(일반적으로 약 185x)에 의해 차단되지 않는 최저 배율 STEM 모드로 이동합니다.
2. 네비게이터(Navigator) 메뉴를 클릭하고 열기(Open> 클릭합니다. 그런 다음 내비게이터(Navigator) 메뉴 > 내비게이션 옵션(Nav. Options)을 클릭하고 맵을 바이트로 변환(Convert Maps to Bytes)> 선택 해제합니다.
3. 내비게이터(Navigator) 메뉴 > Montaging & Grids(몽타주 및 격자) > 전체 몽타주 설정(Setup Full Montage)을 선택합니다. 메뉴가 열립니다. 확인할 옵션은 이미지를 이동하는 대신 스테이지 이동, 내비게이터가 열려 있는 경우 각 몽타주에서 맵 만들기, 파라미터 기록이 아닌 몽타주 매핑 사용입니다. 이미지 그리드는 대략 6 x 6 또는 7 x 7이어야 합니다. 기록할 전체 영역을 찾습니다. 너무 많은 이미지가 필요한 경우 현미경에서 배율을 올바르게 판독하지 못할 수 있습니다(그림 3). 중지하고 확인하십시오.
4. 몽타주 획득을 시작하려면 몽타주 컨트롤에서 시작을 누르거나 카메라 및 스크립트에서 몽타주를 누릅니다. 파일 매개 변수 : mrc, 정수로 저장, 또 다른 대화 상자에서 저장할 파일 이름을 선택하는 또 다른 메뉴가 열립니다. SerialEM의 자체 사용자 설정이 아닌 적절한 데이터 영역에 데이터를 저장해야 합니다. 시스템이 상주하는 C 디스크에 대용량 데이터를 저장하지 않는 것이 좋습니다.
5. 수집이 완료되면 몽타주가 기본 창에 나타납니다(그림 4). 이제 TEM에서와 같이 네비게이터의 마커와 포인트를 사용하여 그리드를 탐색할 수 있습니다.
난시 교정을 다시 확인하십시오. 일반적으로 작은 영역을 빠르게 스캔하고 초점과 함께 조정하여 금 나노 입자와 같은 점과 같은 특징이 고배율에서 초점 안팎으로 통과 할 때 완전히 둥글게 유지되도록하는 것으로 충분합니다 (SEM에서와 같이). 보다 보수적으로 난시를 고치기 전에 1.5-1.8 단계의 직접 정렬을 반복 할 수 있습니다.
고배율 이미징을 LM 몽타주에 맞춥니다.
1. 쉽게 알아볼 수 있는 기능이 있는 LM 몽타주의 위치로 이동합니다. 포인트를 추가하고 네비게이터 창 > 포인트 추가를 클릭한 다음 피처를 클릭합니다. 비활성화하려면 다시 누르세요(추가 중지).
2. 가장 낮은 고배율(HM) 배율로 View 또는 Trial 이미지를 촬영하고 표시된 항목을 찾습니다. 그림 5와 같이 마커를 배치하고(녹색 십자 표시) 네비게이터 창에서 해당 점을 강조 표시한 상태에서 네비게이터 메뉴에서 마커로 이동...> Shift 키를 누른 채 열리는 대화 상자에서 모든 맵과 Shift 저장을 선택합니다.
3. 스테이지를 다른 위치로 이동하고 HM 이미지가 LM 몽타주에서 선택한 동일한 위치의 중앙에 있는지 확인하여 테스트합니다. HM 이미지에 피쳐가 표시되지 않으면 LM 모드와 HM 모드 간의 전환이 너무 클 수 있습니다. 이 경우 더 넓은 영역에 다각형 몽타주를 만듭니다. 탐색기 창 > 다각형 추가를 클릭하고 몇 가지 점을 선택한 다음 다각형 추가를 다시 클릭하여 닫습니다. 내비게이터(Navigator) >메뉴를 클릭하여 몽타주 및 격자(Montaging and Grids) > 폴리곤 몽타주 설정(Setup Polygon Montage)을 클릭하고 시작(Start)> 몽타주 컨트롤(Montage Controls)을 클릭합니다. 그런 다음 위와 같이 해당 지점을 찾아 Shift to Marker....
저용량 모드를 설정합니다.
1. Low Dose Control(저 용량 제어 ) 탭을 열고 Low Dose Mode(저용량 모드 ) 상자를 선택합니다.
2. 연속 업데이트를 선택하고 보기로 이동합니다. 이 모드에 대한 현미경 배율(일반적으로 가장 낮거나 가장 낮은 배율)을 선택합니다. 다음 모드를 각각 선택하고 적절한 배율을 설정합니다. 원하는 픽셀 크기를 달성하도록 녹화를 설정해야 하며, 초점 배율은 초점을 맞추기 위한 기준 마커 또는 기타 고대비 기능이 명확하게 해결될 만큼 충분히 높아야 합니다. 그런 다음 즉시 연속 업데이트의 선택을 취소합니다.
  알림: 평가판 모드는 녹화와 유사하게 설정할 수 있으며, 이 경우 노출을 최소화하기 위해 추적 영역을 녹화 영역에서 이동하거나 주변의 대부분을 포함하는 낮은 배율로 이동해야 합니다.
3. 뷰 이미지를 촬영하고 영역 위치 정의: 시도를 사용하여 시행 위치를 설정합니다.
  참고: 권장 사항 #1: 샘플링된 영역과 시간의 변화를 감안할 때 저mag 시험에 대한 추가 노출은 최소화될 수 있습니다. 그리드 막대가 시야에 들어가지 않는 한, 이 추적 방법은 일반적으로 더 안정적입니다. 권장 사항 #2: 초점과 같은 다양한 모드에 대한 선량을 조정하기 위해 스팟 크기를 업데이트할 수도 있습니다. 현미경 광학 설정의 안정성을 위해 이렇게 하지 말고 스폿 크기를 기록에 적합한 상태로 두고 더 빠른 스캔 모드를 위해 필요한 경우 노출 시간을 조정하는 것이 좋습니다.
4. Low Dose Control(저선량 조절) >탭을 클릭하고 Rec.(녹화)로 이동한 다음 Navigator(네비게이터) 메뉴를 클릭하고 Open Imaging States(이미징 상태 열기> 현재 상태 추가(Add Current State)> 클릭합니다. 쉽게 불러올 수 있도록 이름을 지정합니다(예: 마이크로프로브 STEM의 경우 μP STEM). 서로 다른 작업에 대해 다양한 상태를 정의할 수 있습니다.
스테이지를 단층 촬영을 위해 관심 위치로 이동합니다(내비게이터 사용에 대한 자세한 내용은 아래 참조).
1. 네비게이터(Navigator) 창을 클릭하고 포인트 추가(Add Points)를 클릭하여 네비게이터에 포인트를 추가합니다>.
2. 작업(Tasks) > 유중심도(Eucentricity) > 거칠기(Rough)를 선택하여 유센트릭 높이를 미세 조정합니다. 탐색기 창 > Z 업데이트.
3. 집중 및 시도 영역을 설정합니다. 먼저 뷰 이미지를 촬영합니다. 그런 다음 Low Dose Control(저용량 제어 ) 탭의 Define position of area(영역 위치 정의)에서 Focus(초점) 또는 Trial(시도)을 선택합니다. 기울기 축을 따라 두 영역의 위치를 조정합니다. 초점이 녹화 영역과 겹치지 않아야 합니다.
  알림: 특히 왼쪽 가장자리에 약간의 오버슈트가 있으므로 둘 다 레코드 영역 바로 옆에 설정해서는 안 됩니다. 오버슛의 정도는 기록 배율에서 반복적으로 스캔한 다음 배율을 줄여 더 넓은 시야를 확보하여 테스트 영역에서 평가할 수 있습니다.
좋은 측정을 위해(경험에 따라 선택 사항) 스테이지를 +60°로 기울인 다음 -60°로 기울입니다. View 또는 Preview 이미지를 촬영할 때마다 그리드 막대가 녹색으로 표시된 레코드 영역 필드 필드에 들어가지 않도록 합니다.
틸트 시리즈를 설정합니다.
1. 파일 > 새로 열기 를 클릭하여 데이터를 저장할 새 파일을 열고 파일 이름을 선택합니다. Tilt Series 설정(Tilt Series Setup)> Tilt Series 메뉴를 선택합니다(그림 6). 문제 해결: 새로 열기 버튼이 회색이면 이전 틸트 시리즈가 종료되었는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 Tilt Series > Terminate를 클릭하여 종료합니다.
2. 기울기 및 끝 상자에서 극단적인 기울기 각도(일반적으로 각각 -60° 및 +60°)와 증분(일반적으로 2°)을 설정합니다.
3. 선량 대칭 모드(권장 - 저선량 모드가 여전히 활성화되어 있는지 확인)의 경우 ___에서 두 방향으로 시리즈 실행을 선택합니다. 블랭크는 일반적으로 0이지만 미리 기울어 진 FIB 라멜라 (예 : 20 °)를 보상하는 데 사용할 수 있습니다.
4. 단순화를 위해 노출 시간을 일정하게 유지를 선택합니다. 이를 변경하려면 노출 계산을 일부 재작업해야 하며 예상 강도를 원본 데이터와 비교하는 대수적 재구성(예: ART/SART/SIRT)을 방해할 수도 있습니다(7.1단계 참조).
5. 자동 초점 건너뛰기를 선택합니다. 1mrad와 같은 작은 반수렴각은 초점을 맞출 필요가 없을 정도로 긴 피사계 심도를 의미합니다. 테스트로 0°에 초점을 맞추고 60° 또는 -60°로 기울인 다음 녹화를 누릅니다. 초점을 유지하는 것은 주로 정확한 유센트릭 높이의 문제입니다. 더 큰 수렴을 위해서는 시리즈 중에 초점을 맞춰야 할 수도 있습니다. 이 경우 보기를 하고 Low Dose Control 탭에서 영역과 초점의 위치를 정의하고 초점 영역을 조정합니다.
6. 초기 및 최종 조치: 유센트릭 높이 조정이 정확하게 수행되었다면 반복할 필요가 없습니다. 그렇게 하지 말아야 할 합당한 이유가 없는 한 Close column valves at end of series(시리즈 끝에서 컬럼 밸브 닫기 )를 선택 취소합니다.
7. 제어 매개 변수를 추적하기 위해 많은 옵션이 있습니다. 무인 데이터 수집의 경우 최우선 순위는 사용자 입력을 위해 프로그램이 중지되지 않도록 하는 것입니다. 권장 설정 사용: 손실된 필드의 백분율이 5보다 큰 경우 기록을 반복합니다. 그런 다음 다음 트랙을 선택하고 새 트랙 참조를 가져오기 전에 미리 보기로 정렬 및 레코드 정렬이 2% 다른 경우 새 트랙 참조 가져오기 를 선택합니다. 유인 데이터 수집의 경우 기기 시간 손실 위험을 방지하기 위해 보다 엄격한 파라미터를 적용합니다.
8. 시작할 준비가 되면 창 하단에 있는 GO 를 누릅니다. 마지막에 Tilt Series(틸트 시리즈) > Terminate(종료)를 선택합니다.

5. 네비게이터를 사용하여 여러 지점에서 일괄 획득 (개선 사항 # 1)

참고: 이 프로토콜은 a) TEM과 동일하고 b) 전체 설명을 쓸모 없게 만드는 새로운 도구를 사용할 수 있게 되었기 때문에 초보적입니다.

전체 그리드 몽타주를 주 창에 로드합니다.
유망해 보이는 여러 영역을 선택하십시오. 점 추가(Add Points )를 클릭하고 선택한 격자선 사각형의 중심에 추가합니다. 포인트 추가를 다시 클릭하여 모드를 비활성화합니다.
저선량 이미징 상태가 활성화된 상태에서 네비게이터 창(Navigator window)을 선택하고 선택한 각 사각형>에 대해 항목에서 획득(Acquire) 및 새 파일(New File at Item)을 선택합니다. 첫 번째로 파일 속성(그림 7)과 파일 이름에 대한 대화 상자가 열립니다. Montaged images(몽타주 이미지)를 선택한 다음 Montage Setup(몽타주 설정) 대화 상자(그림 8)에서 Use View parameters in Low Dose mode(저선량 모드에서 뷰 매개변수 사용)를 선택하고 정사각형(약 100 x 100μm)을 덮을 수 있을 만큼 큰 그리드를 만듭니다.
Navigator 메뉴를 클릭하고 항목에서 획득> 매핑을 위한 매개변수를 선택합니다. 가장 중요한 것은 기본 작업에서 Make Navigator Map(네비게이터 맵 만들기)을 선택한 다음 Rough Eucentricity(대략적인 Eucentricity) 및 Fine Eucentricity(미세 유중심성)를 선택하고 Go(이동)를 누르는 것입니다(그림 9). 200 메시 그리드의 경우 대략 전체 정사각형의 맵이 생성됩니다 (그림 10)
단층 촬영 위치 선택을 준비합니다. 파일 > 새로 열기를 클릭하여 새 파일을 엽니다. 파일 이름(예: AnchorMaps.mrc)을 지정합니다.
1. Low Dose 모드가 활성화된 상태에서 Camera & Script > Setup 으로 들어가 View와 Preview가 동일한 비닝에 있는지 확인합니다(그렇지 않으면 동일한 파일에 저장할 수 없음).
2. 네비게이터 창을 클릭하고 XYZ로 이동> 정사각형 맵의 포인트를 방문합니다.
3. 마커가 있는 첫 번째 단층 촬영의 위치를 선택합니다. 미리보기 이미지를 찍고 마우스 오른쪽 버튼으로 드래그하여 위치를 구체화합니다. 그런 다음 새 맵> 네비게이터 창을 선택하고 대화 상자에서 예를 클릭하여 저장합니다. 그런 다음 동일한 지역의 뷰 이미지를 찍고 다시 새 지도로 저장합니다. View map이 강조 표시되어 있는지 확인하고 오른쪽 상단의 Navigator 창에서 For anchor state 를 선택합니다.
4. 두 번째 위치를 선택하고 다시 미리보기를 수행하고 위와 같이 위치를 구체화한 다음 이번에는 네비게이터 창에서 앵커 맵을 누릅니다. 이렇게 하면 미리보기와 뷰가 모두 네비게이터에 새 맵으로 저장됩니다.
5. 원하는 모든 위치에 대해 5.5.4단계를 반복합니다. 점을 선택하고 네비게이터 창에서 XYZ로 이동 을 눌러 한 그리드 사각형에서 다른 그리드 사각형으로 이동합니다.
참조 초점의 경우 격자의 명확한 영역을 선택하고 손으로 또는 자동 초점으로 조심스럽게 초점을 맞춥니다. 현미경 패널에서 Reset defocus 를 누릅니다. 스크립트 > 편집 > 편집 15 (또는 다른 무료 번호)를 클릭하고 ScriptName, SetDefocus 및 SetDefocus 0의 두 줄을 입력하여 SerialEM에서 스크립트를 만듭니다.
네비게이터 창에서 첫 번째 위치(미리보기 또는 보기)를 강조 표시합니다. Shift-T 를 누른 다음 마지막 위치를 강조 표시하고 Shift-T를 다시 누릅니다. 파일 속성 대화 상자가 열립니다. 파일 이름을 포함하여 저장할 단일 프레임 이미지와 매개 변수를 선택합니다. 파일 이름을 편집하되 항목 레이블은 끝에 그대로 둡니다.
참고: 숫자로 끝나는 파일 이름은 연속적인 틸트 시리즈에 대해 자동으로 업데이트됩니다. 네비게이터(Navigator) 메뉴 > 내비게이션(Nav) 옵션을 사용하는 것이 편리합니다. 파일 이름에 항목 레이블 사용> 옵션입니다.
다음으로 Tilt Series Setup 메뉴가 자동으로 열립니다. 이전과 같이 채우기(그림 6)를 채우되 Refine eucentricity(eucentricity 미세 조정)를 선택하지 마십시오. 이제 네비게이터의 미리보기 포인트가 TS로 표시됩니다. 항목 목록 위에 있는 네비게이터 창의 버튼을 사용하여 이 메뉴로 돌아갈 수 있습니다.
Navigator 메뉴 > Acquire at items를 선택합니다. 이번에는 최종 데이터에 대한 매개 변수를 선택합니다. 기본 작업 선택: 틸트 시리즈를 획득하고 듀어/진공 관리, 항목에 다시 정렬, 미세 유심도 및 작업 전 스크립트 실행을 선택하고 Script to run: SetDefocus를 선택합니다. 일반 옵션 선택: 오류 발생 시 메시지 상자 없음, 마지막에 컬럼 밸브를 닫은 다음 GO를 누르십시오(그림 11). 이제 SerialEM은 모든 앵커 맵을 방문하여 각 위치에서 틸트 시리즈를 기록합니다(그림 12).

6. CLEM 맵 등록 (Enhancement #2)

아직 완료하지 않은 경우 전체 그리드 몽타주를 주 창에 로드한 다음 창 > 새 창을 클릭하고 이름을 지정하여 새 창을 만듭니다. 전체 그리드 몽타주는 등록 1에 나타납니다.
Import map의 Navigator 메뉴를 클릭하여 CLEM 맵 이미지를 가져옵니다> 등록 2에 들어가야 합니다. 위와 같이 새 창을 할당할 수도 있습니다.
CLEM 맵을 검사하여 전체 그리드 몽타주에 대한 상대적 회전을 결정합니다. 그리드 막대가 나타나는 맵에서 이 작업을 수행하는 것이 가장 쉽습니다. 지도가 뒤집힐 수도 있습니다. Navigator 메뉴 > Rotate Map을 사용하여 대략적으로 정렬하고 필요한 경우 Flip을 사용합니다.
참고: 다음 단계에서도 플립을 수용할 수 있지만 미리 수행하면 다음이 훨씬 쉬워집니다. 이 단계는 정렬이 만족스러워 보일 때까지 반복될 수 있지만 정확할 필요는 없습니다.
정확한 정렬을 위해 등록 포인트를 소개합니다. 한 창에 해당하는 여러 점을 배치한 다음 다른 창에 배치합니다. 이러한 각 지점에 대해 네비게이터 창의 맨 위에 있는 등록 지점을 선택합니다. 해당 포인트에는 오름차순 인덱스가 표시되고, 그리드 몽타주 또는 가져온 맵에 대해 각각 R1 또는 R2가 표시됩니다.
알림: 파인더 그리드를 사용하면 이 단계가 매우 간단해집니다. 그렇지 않으면 중심 마커 또는 격자선 사각형의 모서리와 같은 솔리드 피쳐를 선택합니다. 원칙적으로 조잡한 정렬에는 3개의 점이면 충분하지만 더 많은 점이 몽타주 구성의 사소한 불일치를 보상하는 데 도움이 됩니다.
CLEM 맵의 여러 채널이 필요한 경우(예: 다른 형광 색상 또는 명시야 배경이 없는 형광) 위의 6.2단계에서와 같이 해당 채널을 가져오고 등록을 2로 변경합니다. 이렇게 하면 첫 번째 맵에서 등록 포인트를 상속받게 됩니다.
Transform items(항목 변환) 메뉴 > Navigator 메뉴로 등록을 적용합니다. 이제 해당 등록 지점이 모든 맵에 나타나며 등록 1에 나열됩니다. 시각적으로 정렬하려면 Navigator 메뉴 > Rotate Map을 클릭합니다. 네비게이터 창에서 맵을 로드할 때 로드 시 회전 상자를 선택하지 않으면 자동으로 회전되지 않습니다. 네비게이터 창에서 항상 회전할 수 있습니다.
이제 형광 맵에 마커 또는 점을 배치하고 스테이지를 그리드의 해당 위치로 이동할 수 있습니다(그림 13).

7.3D 재건

여기에는 TEM 단층 촬영과 동일한 기본 단계가 포함됩니다 : 틸트 시리즈의 정렬 후 일반적으로 백 프로젝션이 뒤 따릅니다. 몇몇 소프트웨어 플랫폼들이 이용가능하고, 데이터는 TEM 데이터와 유사하게 처리될 수 있지만, CTF 보정은 스킵되어야 한다.
강도 정규화를 적용하여 높은 기울기 투영의 기여도를 높이거나 시리즈 중 조명 변화의 균형을 맞추기 위해 정량적 정보가 영향을 받는다는 경고와 함께 적용합니다. 예를 들어, IMOD²⁶ 은 잘 작동하는 반면 AreTomo²⁷ 은 신탁이 없는 정렬에 매우 유용합니다. 기준 입자가 있는 경우 ClusterAlign²⁸ 은 개별 스폿이 아닌 클러스터로 입자를 따라갈 수 있습니다. 이는 고대비 기능에 의해 스팟이 손실되거나 숨겨질 수 있는 STEM 데이터에 특히 유용합니다.
콘트라스트 향상 및 노이즈 제거를 위해 3D 디콘볼루션²⁹ 로 재구성을 따르십시오. 재구성되면 orthoslices 또는 isosurface segmentation과 같은 표준 방법으로 STEM 부피 데이터를 나타냅니다. 특히, 강도 분포는 기존의 위상차 TEM에서 나타나는 대비 반전 또는 푸리에 프린지가 없는 단극입니다. 일반적으로 STEM 단층 촬영을 표현하는 흥미로운 방법은 명시야를 반전시키는 것입니다(그림 14). 그 효과는 "X선 눈"의 효과로, 정화된 셀⁽³⁰)을 통해 조밀한 관심 물체를 볼 수 있다.

Representative Results

STEM에서 준비된 전체 그리드 몽타주는 관심 세포가 있는 영역을 보여줍니다(그림 4). 이미지가 어두운 필드에 있으므로 빈 구멍이 어둡게 나타납니다. 세포는 부분적으로 밝게 나타나며 전자는 HAADF 검출기를 향해 산란됩니다. 가장 두꺼운 부분, 일반적으로 중앙 또는 그리드 막대 근처에서 대비가 다시 어두워집니다. 이는 전자가 검출기에 포착되지 않은 각도에 도달하는 다중 산란 때문입니다. 실제로이 영역은 단층 촬영에 너무 두껍습니다.

다음 단계는 중간 배율 맵입니다(그림 10). 이들은 종종 중간 몽타주 맵 또는 정사각형 맵이라고 불리며, 모양보다는 그리드 사각형을 나타냅니다. 가장 낮은 마이크로프로브 STEM 모드에서도 몽타주 이미지로 획득됩니다. 네비게이터 창에서 항목을 클릭하면 맵 이미지가 기본 창에 로드됩니다. 이 영역 내에서 단층 촬영 획득을 위한 특정 포인트가 선택됩니다. 미리보기 모드를 사용하여 녹화 배율에서 영역을 찾습니다. 스캔 속도에 따라 Preview(미리 보기)와 Record(녹화) 사이에 측면 이동이 있을 수 있습니다. 여기에 단일 틸트 시리즈를 기록할 수 있습니다. 예를 들어, 미토콘드리아는 미리보기 및 기록 이미지에서 종종 식별될 수 있습니다(그림 12).

배치 단층 촬영의 경우 스테이지가 그리드 주위를 이동하며 정확히 동일한 위치로 돌아가지 않을 수 있습니다. 앵커 맵은 스테이지 이동이 이동된 경우에도 미리 보기 이미지를 더 낮은 배율 뷰와 일치시켜 원하는 레코드 영역이 안정적으로 다시 식별되도록 하는 데 사용됩니다. PyEM^23,24는 확실히 권장되지만 아직 표준 설치의 일부가 아닌 더 빠른 대안을 제공합니다.

CLEM 접근법에서, 형광 맵은 단층 촬영을 위한 관심 영역을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 형광은 외부에서 획득되며 전체 그리드 몽타주에 등록되어야 합니다. 예를 들어 김프(https://www.gimp.org) 또는 ImageJ³¹ 소프트웨어(ImageJ가 세로 축을 반전시키도록 주의)에서 가져오기 전에 병합된 형광 + 명시야 합성물을 준비할 수 있도록 그리드 막대와 구멍을 표시하는 것이 유용합니다. 형광의 다이내믹 레인지가 클 때, 포화 없이 이러한 병합을 생성하는 것이 어려울 수 있다. 이 경우 두 맵을 별도로 가져온 다음 설명된 대로 함께 등록할 수 있습니다(그림 13). 이렇게 하면 네비게이터 창의 형광 맵에 있는 한 점과 "XY로 이동"이 차례로 표시되며, 스테이지는 TEM에 장착된 그리드의 해당 위치로 이동합니다. 몽타주(또는 몽타주인 경우 형광 지도)를 만들 때 작은 불일치가 작은 변위로 이어진다는 점에 유의하십시오. 따라서 최적의 정밀도를 위해 형광을 정사각형 맵에 구체적으로 다시 등록해야 합니다. 지지체 필름의 구멍 또는 명시야 광 이미지와 공유되는 특징에 기초하여 눈으로 이러한 등록을 수행하는 것으로 충분합니다.

틸트 시리즈를 재구성하면 3D 볼륨이 생성됩니다(그림 14). 이 예제의 픽셀 크기는 2.042nm이므로 시야각은 ~4μm입니다. 인산 칼슘 침전물 (주황색 화살촉)은 주변에 비해 원자 번호가 높기 때문에 두드러집니다. 미세소관(빨간색 화살촉)은 전체 시야에서 추적할 수 있습니다. 또한 내부 및 외부 미토콘드리아 막 (녹색 화살촉)을 명확하게 볼 수 있습니다. 액틴은 다발 또는 개별 필라멘트로 관찰 될 수 있습니다. 보다 등방성 분해능을 달성하기 위해, 재구성은 디콘볼루션에 의해 처리될 수 있다.

그림 1: TEM과 STEM의 비교. TEM에서 시야는 거의 평행한 빔에 의해 조명되고 대물 렌즈는 카메라에 확대된 이미지를 형성합니다. cryo-TEM의 경우 대물렌즈 조리개가 열려 산란된 전자파(빨간색 점선)를 통과시키며, 초점이 흐려지면 산란되지 않은(녹색) 파동과의 간섭으로 위상차가 생성됩니다. 반면에 STEM은 표본을 가로질러 집중된 빔을 래스터화하고 산란된 전자를 픽셀 단위로 수집합니다. 다중 검출기는 다른 각도로 산란된 전자를 수집할 수 있습니다. 이 수치는³⁰에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 높은 스캔 속도로 인한 왼쪽의 이미지 왜곡의 예. 노란색 화살촉으로 표시된 왜곡과 Quantifoil의 왜곡 된 타원형 구멍에 주목하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 전체 그리드 몽타주에 대한 몽타주 설정 대화 상자. X와 Y의 배율과 조각 수를 선택하여 전체 면적이 약 2,000μm에 도달하도록 하여 대부분의 그리드에 대한 지도를 얻습니다. 또한 [이미지를 이동하는 대신 스테이지 이동]을 선택하고 [파라미터 기록]이 아닌 [몽타주 매핑 사용]을 선택합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: STEM 모드에서 기록된 전체 저배율 GridMap. 깨진 영역은 암시야 이미지에서 완전히 검은색으로 나타납니다. 짙은 회색 영역은 너무 두껍고 유리화가 잘 되지 않을 수 있습니다. 단층 촬영에 적합한 후보 영역은 이 스캔에서 흰색 또는 밝은 회색입니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 마커 프로세스로 이동합니다. 인식 가능한 객체는 저해상도 맵에서 Add Points(이 이미지에서는 38)로 표시됩니다. 저해상도 맵(녹색 원)과 중간 해상도 맵(주황색 원) 사이의 이동에 유의하십시오. 그런 다음 개체가 마커(녹색 십자 표시, 빨간색 원)로 표시되고 [마커로 이동] 대화 상자가 시작됩니다. 선택한 옵션은 모든 맵을 245배로 같은 양만큼 이동합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: STEM 틸트 시리즈에 대한 틸트 시리즈 설정 대화 상자. 용량 대칭 방식은 -60°에서 +60°까지 2° 단위로 사용됩니다. 낮은 수렴각을 사용할 때 초점 심도가 높기 때문에 자동 초점을 건너뜁니다. 이전에 수행된 것처럼 eucentricity를 개선할 필요가 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 중간 해상도 맵에 대한 파일 속성 대화 상자Figure 7: File properties dialog for medium resolution maps. MRC 스택 파일로 저장하고, 정수를 선택하고, .mdoc 메타데이터 파일에 추가 정보를 저장합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 중간 해상도 맵을 저장하기 위한 몽타주 설정 대화 상자. 너비가 90μm인 200메쉬 그리드의 정사각형의 경우 총 면적이 최소 90μm x 90μm인 것이 좋습니다. 이미지 이동 대신 스테이지 이동(Move stage)을 선택하고 저선량 모드에서 뷰 파라미터 사용(Use View parameters in Low Dose mode)을 선택합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: 기록 매체 해상도 맵. Acquire at Items 대화 상자에서 매체 해상도 맵을 기록하기 위한 것입니다. Mapping(매핑), Acquire and save image or montage(이미지 또는 몽타주 획득 및 저장)를 선택하고 Make Navigator map(내비게이터 맵 만들기)을 선택합니다. Tasks before or after primary(기본 작업 이전 또는 이후의 작업)에서 Rough and Fine Eucentricity(거칠고 미세한 Eucentricity)를 선택합니다. 도움이 없는 경우 필요에 따라 오류 발생 시 메시지 상자 없음 및 끝에서 컬럼 밸브 닫기를 선택합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10: 중간 해상도 맵의 이미지. 중간 해상도 맵(정사각형 맵)은 3 x 3의 몽타주로 STEM 모드에서 기록되었습니다. 데이터 수집을 위한 두 개의 중간 해상도 앵커 맵은 파란색 사각형으로 표시됩니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 11: 배치 틸트 계열 데이터. 배치 틸트 시리즈를 수집하기 위한 아이템 대화상자에서 획득합니다. 틸트 계열 데이터 수집의 경우 최종 데이터 및 기울기 계열 수집을 선택합니다. Tasks before or after Primary 에서 Manage Dewars/Vacuum(튜어/진공 관리)(Setup(설정) 메뉴에서 적절한 설정 선택), Realign to Item(항목에 재정렬), Fine Eucentricity(미세 중심성) 및 Run Script before Action(작업 전 스크립트 실행)을 선택합니다. 일반 옵션에서 오류 발생 시 메시지 상자 없음 및 끝에서 컬럼 밸브 닫기를 선택합니다(5.14 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 12: 미토콘드리아의 STEM 기울기 계열의 0° 기울기. 주황색 화살촉은 인산칼슘 침전물(매트릭스 과립), 녹색 화살촉은 크리스타에, 빨간색 화살촉은 15nm 금 기준점 마커를 가리킵니다. 스케일 바 = 500 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 13: 등록된 cryo-CLEM 맵. (A) 중간 해상도 STEM 맵(Square map, 26-A)은 (B) 저해상도 STEM 맵, (C) BF 채널 cryo-FM 맵 및 (D) GFP 채널 cryo-FM 맵에 등록됩니다. 9개의 등록 포인트(레이블 4-21)가 (E) 네비게이터에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 14: 볼륨 렌더링. 서로 다른 깊이에서 SIRT와 같은(30 사이클) 필터링된 단층 촬영을 통해 (A) 60nm 및 (B) 40nm 두께 섹션의 볼륨 렌더링. 픽셀 크기는 2.048nm이며, 이로 인해 약 4μm의 시야가 생성됩니다. 그림 12와 비교한 반전된 밀도에 유의하십시오, 이는 고강도 특징이 밝다는 것을 의미합니다. 주황색, 흰색, 빨간색, 녹색 및 하늘색 화살촉은 각각 인산 칼슘 침전물, 리보솜, 미세 소관, 내부 및 외부 미토콘드리아 막, 액틴 필라멘트를 가리 킵니다. 스케일 바 = 500 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 프로토콜은 기존의 TEM 단층 촬영에 접근할 수 없는 세포 영역에서 세포 내 소기관의 3D 보기를 얻는 데 관심이 있는 생명 과학 현미경 전문가를 지원해야 합니다. 플라스틱 절편의 STEM 단층 촬영에도 동일한 프로토콜을 사용할 수 있으며 노출에 대한 제약이 완화됩니다. 프로토콜은 일련의 엄격한 규칙이 아닌 출발점으로 간주되어야 합니다. 실제로 STEM의 힘은 유연성입니다. 그것을 운영하는 올바른 방법은 없습니다.

우리는 STEM 자체가 스캔된 프로브만을 참조하고 이미지 형성을 정의하지 않는다는 점을 강조합니다. 대비는 주로 감지기의 구성에 따라 다릅니다. 보다 간단한 방법은 축 대칭을 가진 검출기, 즉 광축을 중심으로 한 디스크 또는 이를 둘러싸고 있는 고리를 사용하는 것입니다. 일반적으로 조명이 검출기에 직접 충돌하면 (전자 산란) 표본이 어둡게 나타나는 BF 이미지를 기록합니다. 반대로, 검출기가 산란된 전자만 수집할 때 밀도가 높은 표본이 밝게 보이는 DF 이미지를 기록합니다. 적절한 하드웨어를 사용할 수 있는 경우 SerialEM은 이 두 신호를 동시에 수집하고 기록할 수 있습니다. 여러 세그먼트가 있는 감지기에서 완전히 픽셀화된 카메라에 이르기까지 훨씬 더 정교한 구성을 사용할 수 있습니다. 위상차 이미징은 예를 들어, 축외 검출기 요소들(³²^, ³³) 사이의 차이를 평가함으로써 달성될 수 있다. 픽셀당 전체 2D 산란(회절) 패턴을 수집하는 것은 4D STEM⁽³⁴)으로 알려진 방법을 정의하며, 이는 동일한 원본 데이터로부터 다중 이미지 대비의 재구성을 가능하게 한다. 4차원 STEM은 전자 ptychography를 가능하게 하며, 이는 위상차³⁵를 얻는 또 다른 수단을 제공합니다.

우리는 세포 소기관 및 온전한 세포 또는 미크론 두께의 세포 절편 연구에 가장 유용하다고 생각되는 특정 STEM 양식에 초점을 맞췄습니다. 이것은 특히 조명에서 작은 반 수렴 각도와 검출기에서 상대적으로 큰 수집 각도를 가진 BF 이미징의 사용을 수반합니다. 작은 수렴은 큰 피사계 심도를 제공하여 전체 샘플이 틸트 시리즈⁽¹⁹) 전체에 걸쳐 초점을 유지하도록 합니다. 실제로 좋은 현미경 단계를 사용하면 획득 중에 초점을 조정할 필요도 없앨 수 있습니다. 가격은 프로토콜의 섹션 3에 설명된 대로 해상도의 절충안입니다. 우리는 1nm 픽셀 간격이 4μm의 시야에 도달하는 ~2nm의 프로브를 가진 4k 이미지를 제안했습니다. 그러나 독자는 실험을 강력히 권장합니다. 두 번째 고려 사항은 감지기 측면에 있습니다. 조명 디스크가 축상 BF 검출기를 언더필하면 위상차가 억제되고 산란(진폭) 대비가 우세합니다. 이 상태를 비간섭성 명시야 대비(incoherent bright field contrast)^{라고 한다 36}. 문제는 언더필할 비율에 따라 다르며 답은 샘플에 따라 다릅니다. 매우 얇은 샘플은 검출기가 완전히 채워진 상태에서 최상의 대비를 나타내지만(즉, 조명의 수집 각도와 일치함) 두꺼운 샘플은 모든 강도를 산란시켜 대비가 좋지 않은 잡음 신호를 남깁니다. 유용한 경험 법칙은 샘플이 두꺼울수록 BF 검출기의 외부 컷오프 각도가²¹이 되어야 한다는 것입니다. 검출기 크기와 위치는 물론 고정되어 있으므로 회절 디스크 크기는 섹션 1에 설명된 대로 카메라 길이를 사용하여 조정됩니다. 감지기 증폭기 설정이 신호가 다이내믹 레인지를 채우지만 직접 조명(1.12.3)에서 포화되지 않는 경우 적절한 신호 강도와 대비에 도달할 때까지 카메라 길이를 늘릴 수 있습니다. 다시 말하지만, 독자는 실험하는 것이 좋습니다. 말하자면 예술은 각도에 있습니다.

프로토콜에서 논의되지 않은 또 다른 매개변수는 현미경 가속 전압입니다. 조명 전자와 표본의 상호 작용은 더 낮은 전압에서 더 강해집니다. 다른 모든 조건이 동일하면 더 낮은 전압에서 더 높은 대비를 기대할 수 있습니다. 반면에, 사용 가능한 시편 두께를 제한하는 것은 시편 내에서 다중 산란이 시작되므로 전압이 높을수록 더 두꺼운 샘플을 사용할 수 있습니다. 그러나 이러한 효과는 다소 미묘합니다. 200 kV 및 300 kV 가속에 대한 지금까지의 경험은 비슷합니다.

분해능 측면에서 STEM에서 기대할 수 있는 것을 고려할 때 이는 다시 표본과 검출기 구성에 따라 다릅니다. 단일 입자 분석 접근법을 사용하여 페리틴의 금속 이온은 환형 암시야 STEM에 의해 수 옹스트롬³⁷의 정밀도로 국소화될 수 있습니다. 보다 최근에는 iDPC(Integrated Differential Phase Contrast) STEM(³² )과 ptychography(³⁵)로 얻은 이미지를 사용하여 바이러스 및 단백질 샘플에 대해 나노미터 미만의 분해능을 달성했습니다. 두꺼운 세포 표본의 독특한 물체와 여기에 설명 된 방법을 사용하면 이러한 고해상도가 현실적이지 않습니다. 최적의 분해능은 프로브 직경이며, 이는 설명된 바와 같이 반수렴 각도와 관련이 있습니다. 다른 요인, 특히 넓은 시야에 도달하기 위한 거친 픽셀 샘플링, 틸트 시리즈의 정렬 불량 및 전송 시 프로브 빔의 확산과 같은 분해능이 저하됩니다. 이미지는 플라스틱 단면 단층 촬영과 잘 비교됩니다. 예를 들어, 여기에 설명된 설정을 사용하면 미세소관의 속이 빈 코어를 쉽게 볼 수 있지만 개별 프로토필라멘트는 볼 수 없습니다.

요약하자면, STEM 방법과 하드웨어는 모두 개발 단계에 있습니다. 이미징의 혁신은 단층 촬영에도 영향을 미쳐 STEM을 다른 기술로는 접근할 수 없는 영역으로 이끌 것으로 예상할 수 있습니다. 우리는 현대의 광학 초해상도 방법을 기반으로 하는 상관 극저온 형광 이미징과의 수렴이 특히 유익할 것으로 기대합니다. 세포 소기관의 규모인 100-1,000nm는 이러한 새로운 방법의 이상적인 표적입니다.

Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

SerialEM 소프트웨어 패키지의 작성자이자 유지 관리자인 David Mastronade와 Günther Resch의 지속적이고 지속적인 지원에 매우 감사드립니다. P.K.는 오스트리아 과학 기금(FWF)의 지원을 받아 슈뢰딩거 펠로우십 J4449-B를 통해 지원받았습니다. 오픈 액세스를 위해 저자는 이 제출로 인해 발생하는 모든 저자 수락 원고 버전에 CC-BY 공개 저작권 라이선스를 적용했습니다. M.E. 및 SGW는 이스라엘 과학 재단, 보조금 번호 1696/18 및 유럽 연합 Horizon 2020 자매 결연 프로젝트 인 ImpaCT (보조금 번호 857203)의 자금 지원을 인정합니다. ME는 CryoSTEM 프로젝트 (보조금 번호 101055413)에서 ERC의 자금 지원을 인정합니다. M.E.는 Sam and Ayala Zacks 교수 의장이자 Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging의 책임자입니다. M.E.의 실험실은 Harold Perlman 가족의 역사적 관대함으로부터 혜택을 받았습니다. 우리는 또한 유럽 연합의 자금 지원을 인정합니다. 그러나 표현된 견해와 의견은 저자의 견해일 뿐이며 반드시 유럽 연합 또는 유럽 연구 위원회 집행 기관의 견해와 의견을 반영하는 것은 아닙니다. 유럽 연합이나 부여 기관은 이에 대해 책임을 지지 않습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SerialEM	University of Colorado	Veriosn 4.0	SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition.
STEM-capable transmission electron microscope			The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well.

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Biology

Cryo-STEM 단층촬영에 의한 세포 소기관 In Situ 의 시각화

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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