JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Chemistry

זיהוי סטנדרטי של מבנה מורכב ברפואה הטיבטית באמצעות ספקטרומטריית מסה של מלכודת יונים וניתוח פיצול רב-שלבי

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/65054
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול כללי ועיצוב שניתן ליישם כדי לזהות כמויות זעירות ומרכיבים קטנים בפורמולציות המוצר הטבעי המורכב (מטריצות) ברפואה הטיבטית.

Abstract

תרופות טיבטיות הן מורכבות ומכילות תרכובות לא ידועות רבות, מה שהופך מחקר מעמיק על המבנים המולקולריים שלהן לחיוני. כרומטוגרפיה נוזלית-אלקטרוספריי יינון זמן טיסה ספקטרומטריית מסה (LC-ESI-TOF-MS) משמשת בדרך כלל לחילוץ רפואה טיבטית; עם זאת, תרכובות בלתי ידועות בלתי צפויות רבות נשארות לאחר השימוש במסד הנתונים ספקטרום. המאמר הנוכחי פיתח שיטה אוניברסלית לזיהוי רכיבים ברפואה הטיבטית באמצעות ספקטרומטריית מסות מלכודת יונים (IT-MS). השיטה כוללת פרוטוקולים סטנדרטיים ומתוכנתים להכנת דגימה, הגדרת MS, ריצת LC, הקמת שיטה, רכישת MS, הפעלת MS מרובת שלבים וניתוח נתונים ידני. שתי תרכובות מייצגות בתרופה הטיבטית Abelmoschus manihot seeds זוהו באמצעות פיצול רב-שלבי, עם ניתוח מפורט של מבנים מורכבים טיפוסיים. בנוסף, המאמר דן בהיבטים כגון בחירת מצב יונים, התאמת פאזה ניידת, אופטימיזציה של טווח הסריקה, בקרת אנרגיית התנגשות, החלפת מצב התנגשות, גורמי פיצול ומגבלות השיטה. שיטת הניתוח הסטנדרטית שפותחה היא אוניברסלית וניתן ליישם אותה על תרכובות לא ידועות ברפואה הטיבטית.

Introduction

הניתוח האיכותני של יסודות קורט ברפואה הסינית המסורתית (TCM) הפך לנושא מכריע במחקר. בשל המספר הגבוה של תרכובות ב- TCM, קשה לבודד אותן לניתוח ספקטרומטר תהודה מגנטית גרעינית (NMR) או דיפרקטומטר קרני רנטגן (XRD), מה שהופך שיטות מבוססות ספקטרומטריית מסה (MS) הדורשות רק נפחי דגימה נמוכים לפופולריות יותר ויותר. בנוסף, כרומטוגרפיה נוזלית (LC) בשילוב עם טרשת נפוצה נמצאת בשימוש נרחב במחקר TCM בשנים האחרונות לשיפור ההפרדה של דגימות מורכבות וניתוח איכותי של תרכובות כימיות1. שיטה נפוצה אחת היא כרומטוגרפיה נוזלית-אלקטרוספריי יינון זמן טיסה ספקטרומטריית מסה (LC-ESI-TOF-MS), אשר נמצאת בשימוש נרחב במחקר איכותני על רפואה טיבטית2. בשיטה זו, רכיבים מורכבים מועשרים ומופרדים בטור LC, ויחס המסה למטען (m/z) של יוני האדוקט נצפה באמצעות גלאי MS. חיפוש במסדי נתונים טנדם MS (MS/MS או MS2) הוא כיום הגישה המהירה ביותר עבור ביאורים מורכבים בטוחים בניתוח מולקולות קטנות באמצעות זמן טיסה מרובע (Q-TOF) MS ו- Orbitrap MS3. עם זאת, האיכות הירודה של מסדי נתונים ונוכחותם של איזומרים שונים מעכבים זיהוי של תרכובות לא ידועות. בנוסף, המידע המסופק על ידי מסד הנתונים MS/MS מוגבל 4,5,6,7. חשוב לחקור את התרכובות הכימיות בכל TCM באמצעות פרוטוקול כללי שניתן ליישם באופן נרחב על TCM אחרים.

IT-MS לוכד מגוון רחב של יונים על ידי הפעלת מתחי תדר רדיו (RF) שונים על אלקטרודות טבעת8. IT-MS יכול לבצע סריקות MS מרובות שלבים מסדרות זמן בסדר כרונולוגי מגוון, ולספק פיצול מרובה שלבים של MS (MS n), כאשרn הוא מספר שלבי יוני המוצר9. IT-MS ליניארי נחשב הטוב ביותר לזיהוי מבנה מכיוון שניתן להשתמש בו לניסויים רציפיםשל MS n 10. ניתן לבודד יונים ממוקדים ולהצטבר ב-IT-MS1 ליניארי. MS n (n ≥ 3) ב- IT-MS מספק יותר מידע מקטע מאשר MS/MS ב- Q-TOF-MS. מכיוון ש- IT-MS אינו יכול לנעול את יון המטרה ואת יוני השבר שלו, זהו כלי רב עוצמה להבהרת מבנה של תרכובות לא ידועות, כולל איזומרים1. טכנולוגייתMS n יושמה באופן נרחב בניתוח מבני של חלבונים, פפטידים ורב-סוכרים לא ידועים11,12. רמת השפע של יוני פרגמנט ב-MSn מספקת יותר מידע על פרגמנטים מולקולריים על תרכובות ממוקדות בדגימות מורכבות מאשר MS/MS ב-Q-TOF-MS. לפיכך, יישום טכנולוגיית MSn לזיהוי מבני ב- TCM הוא חיוני.

הרפואה הטיבטית היא מרכיב משמעותי של TCM13, ותרופות אלה מופקות בעיקר מבעלי חיים, צמחים ומינרלים הנמצאים באזור הרמה14. התרופה הטיבטית Abelmoschus manihot seeds (AMS) היא זרע של Abelmoschus manihot (פשתן) רפואי. AMS היא צמחי מרפא מסורתיים המשמשים לטיפול במצבים כגון אטופיק דרמטיטיס, שיגרון וצרעת. הוא מכיל כלקון, בעל השפעות אנטיבקטריאליות, אנטי פטרייתיות, אנטי סרטניות, נוגדות חמצון ואנטי דלקתיות15. במחקר הנוכחי שופרו הליכי MS n, ופותחה שיטה מפורטת לזיהוי מבנים מורכבים ברפואה הטיבטית AMS באמצעות IT-MSו-MS n. פרמטרים מסוימים של MS, כולל מצב היונים, טווח הסריקה ומצב ההתנגשות, עברו אופטימיזציה כדי להתגבר על בעיות בזיהוי תרכובות עקבות. מחקר זה נועד לקדם את זיהוי המבנה הסטנדרטי של תרכובות קורט ב- TCM.

Protocol

1. הכנת מדגם במדויק לשקול 1 גרם של מדגם AMS, ומניחים אותו בקבוק חרוטי עם 30 מ”ל של 80% מתנול. מעבירים את התערובת לסוניק אמבט אולטרסאונד למשך 30 דקות מיצוי ב-25°C. צנטריפוגה את הדגימה ב 14,000 x גרם במשך 5 דקות.הערה: התדר של סוניק אמבטיה אולטרסאונד הוא 40 KHz. הכינו מזרק הזרקה ומסנן קרום מיקרונקבובי (0.22 מיקרומטר, אורגני בלבד). מסננים את הסופרנאטנט לבקבוק דגימה של 2 מ”ל. 2. הגדרת MS הפעל את המתג של משאבת הוואקום. פתח את השסתום הראשי של גליל הארגון ואת שסתום הלחץ החלקי, והתאם את הלחץ לכ- 0.3 מגפ”ס. פתח את שסתום החנקן.הערה: המתן לפחות 8 שעות כדי להבטיח דרגת ואקום מספקת לתנאי הניסוי. בדוק כי לחץ הגז של ארגון וחנקן גבוה מספיק לפני הניתוח. הפעל את תוכנת הבקרה MS. לחץ על מקור SEI מחומם בלוח התוכנה והזן את הפרמטרים של MS, כולל טמפרטורת המחמם (350 ° C), קצב זרימת גז נדן (35 arb), קצב זרימת גז aux (15 arb), מתח ריסוס (3.8 KV למצב חיובי, -2.5 KV למצב שלילי), וטמפרטורת נימים (275 ° C). לחץ על כפתור החל כדי להפעיל את מקור היונים. 3. ריצה מוקדמת של LC, הקמת שיטה ורכישת טרשת נפוצה הכן שלב A נייד ושלב B נייד באמצעות תמיסה מימית של 0.1% חומצה פורמית ואצטוניטריל טהור, בהתאמה. דגה אותם בסוניקטור אמבטיה אולטרסאונד למשך 15 דקות לפחות. חברו את התמיסות למעברי הנוזלים A ו-B, בהתאמה (איור 1A). הכינו תמיסת מתנול-מים (1:9 v/v), ולאחר מכן מלאו אותה ידנית בבקבוקי נוזל הניקוי של המשאבה והמזרק.הערה: התדר של סוניק אמבטיה אולטרסאונד הוא 40 KHz. הפעל את תוכנת הבקרה LC-MS.לחץ על כפתור הבקרה הישירה כדי לפתוח את לוח הבקרה LC. פתחו את שסתום הטיהור נגד כיוון השעון במודול המשאבה (איור 1B). לחץ על כפתור More Option כדי לפתוח את הגדרת המשאבה, והגדר את פרמטרי הטיהור על 5 mLmin−1 למשך 3 דקות. לחץ על כפתור הטיהור כדי להתחיל בהסרת הבועה. לאחר מכן, סגור את שסתום הטיהור. לחץ על הלחצנים Prime Syringe, Wash Buffer Loop ו-Wash Detle Externally כדי לשטוף את המזרק במשך שלושה מחזורים, את הלולאה למחזור אחד ואת המחט למחזור אחד, בהתאמה. הניחו את בקבוק הדגימה בדוגם (איור 1C). לחץ על כפתור הגדרת המכשיר כדי לפתוח את חלון עריכת השיטה. לחץ על כפתור חדש כדי ליצור שיטת מכשיר LC-MS חדשה. קבע זמן ריצה כולל עבור שיטת LC. לאחר מכן, הזן ערכים להגדרת מגבלת הלחץ, קצב הזרימה הכולל, מעבר הזרימה, טמפרטורת הדגימה, טמפרטורת העמודה והדלתא של הטמפרטורה המוכנה בחלון עריכת השיטה.הערה: קצב הזרימה הכולל המוגדר כברירת מחדל של הפאזה הניידת קבוע ב- 0.3 מ”ל/דקה עם 50% A ו- 50% B וללא טמפרטורת עמודה בהיעדר עמודה כרומטוגרפית. ערכי ברירת המחדל של טמפרטורת הדגימה והדלתא של הטמפרטורה המוכנה הם 15 °C (75 °F) ו- 0.1 °C (70 °F), בהתאמה. הגדרות אחרות תלויות בסוג עמודת הכרומטוגרפיה הנוזלית שבה נעשה שימוש. בחר את סוג הניסוי כללי MS או MS n עבור שיטת MS. הזן ערכים כדי להגדיר את זמן הרכישה, הקוטביות, טווח המסה, מספר ערך ההסטה ומשך ערך ההסטה. לחץ על להציל כפתור כדי להגדיר את ההגדרות כשיטת מכשיר.הערה: הגדרות ברירת המחדל ללא עמודת כרומטוגרפיה הן כדלקמן: זמן רכישה, 2 דקות; קוטביות, חיובית או שלילית; טווח מסה, 100 עד 1,200; מספר ערך הסטה, 2; ומשך ערך ההסטה, 1.99 דקות. 4. הפעלת ספקטרומטריית מסות רב-שלבית לחץ על כפתור הגדרת רצף כדי לפתוח את טבלת הרצפים.בטבלה, הזן את המידע הבא: סוג דגימה, שם קובץ, נתיב, מזהה דגימה, שיטת מכשיר, מיקום ונפח הזרקה. לחץ על להציל כפתור כדי להקליט את טבלת הרצף, ולאחר מכן לחץ על התחל ניתוח כפתור כדי ליישם את ההגדרות וליזום את רכישת MS.הערה: סוג הדגימה המוגדר כברירת מחדל נבחר כלא ידוע. שיטת המכשיר היא השיטה שנשמרה בשלב 3.6. בקבוק הדגימה ממוקם במיקומו הייחודי בחדר הדגימות. לדוגמה, RA1 הוא המיקום הראשון בשורה הראשונה של האזור האדום בחדר המדגם. נפח ההזרקה המוגדר כברירת מחדל הוא בדרך כלל 2 μL, אשר תלוי בריכוז הדגימה. לחץ פעמיים על הקובץ הגולמי ב- Explorer כדי לטעון את נתוני MS לתוכנת עיבוד הנתונים. בכרומטוגרמה של שיא הבסיס (BPI), בחר את האזור עם השטח המרבי מתחת לעקומה (AUC) על-ידי לחיצה וגרירה של העכבר. ספקטרום MS המתאים יוצג באותו חלון. בחר יון יעד לניתוח MS/MS הבא.פתח מחדש את חלון עריכת השיטה. בטבלה MS n Setting, הגדר את m/z של יון היעד למקום עשרוני אחד בעמודה Parent Mass. בחר מצב התנגשות והזן את ערך אנרגיית ההתנגשות (CE). הגדר את טווח הסריקה של MS/MS. לחץ על להציל כפתור כדי להקליט את שיטת MS, והזן שם קובץ חדש בטבלת הרצף. לחץ על לחצן התחל כדי ליזום את רכישת MS/MS.הערה: טווח סריקת MS/MS היה 40%-130% מיון האב הממוקד. ערך ברירת המחדל CE במצב דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות (CID) הוא 35%. לחץ פעמיים על הקובץ הגולמי ב- Explorer כדי לטעון את הקובץ הגולמי MS/MS לתוכנת עיבוד הנתונים.זהה את יון המקטע החזק ביותר בספקטרום MS/MS והזן את ערך m/z שלו ברשימת השיטותMS n . בטבלה MSn Setting , הגדר את הפרמטרים MS3 , כולל מצב התנגשות, ערך CE וטווח סריקה. לחץ על להציל כפתור כדי להקליט את שיטת MS, והזן שם קובץ חדש בטבלת הרצף. לחץ על כפתור התחל כדי ליזום את רכישת MS3 . לחץ פעמיים על הקובץ הגולמי ב- Explorer כדי לטעון את הקובץ הגולמי של MS3 לתוכנת עיבוד הנתונים. חזור על שלב 4.4 כדי לקבל את ספקטרום MS4 . השלם את ניסויMS n כאשר לא נצפים יוני פרגמנט יציבים בספקטרום. 5. ניתוח נתונים ידני של MSn לחץ פעמיים על הקבצים הגולמיים כדי לפתוח את כל ספקטרום המסה מ- MS ל- MSn. חשב ידנית את ערכי ההפרש m/z בין יוני היון לבין יוני השבר המתאימים.הערה: לדוגמה, ערך ההפרש m/z בין היון (m/z 617.25) לבין יוני השבר המתאימים (m/z 571.28) היה 45.97 ב- MS/MS, ערך ההפרש m/z בין היון (m/z 571.28) לבין יוני שבר תואמים (m/z 525.38) היה 45.90 ב- MS3, וערכי ההפרש m/z בין היון (m/z 525.38) לבין יוני השבר המתאימים (m/z 344.93 ו- 273.16) היו 180.45 ו- 252.22 ב- MS4, בהתאמה. צייר ידנית את מבנה “הליבה” על פי תוצאות MS4 (הרמה האחרונה של MSn). גזירה ידנית של המבנה המקורי באמצעות קבוצות פונקציונליות או מקטעים מולקולריים בהתבסס על ערך ההפרש m/z. ציירו ידנית את נתיבי המחשוף המולקולרי בהתאם לכל מבנה מולקולרי ב-MSn. דוגמאות לגזירה מולקולרית ידנית מפורטות בסעיף התוצאות המייצגות.

Representative Results

Cellobiose שימש כמודל כדי לאמת את ההיתכנות של MSn במצב יונים חיוביים. כפי שניתן לראות באיור 2A, ESI-MS (מצב יונים חיוביים) של צלוליוז [C 12 H22O11]+ ייצר את המולקולה הפרוטונית [M+H]+ ב-m/z 365. סריקת יוני המוצר (CID-MS/MS) של [M+H]+ ב-m/z 365 הביאה ליון המקטע השני ב-m/z 30…

Discussion

IT-MS וטכנולוגיית MSn שלה מציעות גישה חדשה לזיהוי המבנה של תרכובות TCM עקבות. בניגוד ל-Q-TOF-MS, שלא הצליח לזהות לעומק את יוני הפרגמנט, IT-MS עם טכנולוגיית MSn מצטיין ביכולתו לבודד ולצבור יונים. מאמר זה מתאר שיטה לזיהוי תרכובות קורט ברפואה הטיבטית באמצעות טכניקת IT-MS ו-MSn . השיטה משתמשת ב…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי תוכנית הכישרונות Xinglin של אוניברסיטת צ’נגדו של TCM (מס ‘030058191), קרן מדעי הטבע של סצ’ואן (2022NSFSC1470), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82204765).

Materials

Acetonitrile Thermo Scientific CAS 75-05-8 LC-MS grade
Formic Acid Knowles CAS 64-18-6 HPLC grade
Linear ion trap mass spectrometer Thermo Scientific LTQ XL
liquid chromatograph Thermo Scientific U3000
LTQ Tune Thermo Scientific version 2.8.0 MS control software
Methanol Thermo Scientific CAS 67-56-1 LC-MS grade
Pure water Thermo Scientific CAS 7732-18-5 LC-MS grade
Xcalibur Thermo Scientific version 2.0 LC-IT-MS operational software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, X. -. F., Wu, H. -. T., Tan, G. -. G., Zhu, Z. -. Y., Chai, Y. -. F. Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines. Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).
  2. Ou, C., et al. Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028 (2020).
  3. Kind, T., et al. Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search. Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).
  4. Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in Callinectes sapidus. Journal of Visualized Experiments. (183), e63322 (2022).
  5. Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments. (184), e64050 (2022).
  6. Karas, B. F., et al. Dose uptake of platinum-and ruthenium-based compound exposure in zebrafish by inductively coupled plasma mass spectrometry with broader applications. Journal of Visualized Experiments. (182), e6358 (2022).
  7. Chang, H. -. L., et al. Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e63089 (2022).
  8. Wang, S., et al. Structural characterization and identification of major constituents in Jitai tablets by high-performance liquid chromatography/diode-array detection coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Molecules. 17 (9), 10470-10493 (2012).
  9. Pang, B., Zhu, Y., Lu, L., Gu, F., Chen, H. The applications and features of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016, 3837270 (2016).
  10. Ichou, F., et al. Comparison of the activation time effects and the internal energy distributions for the CID, PQD and HCD excitation modes. Journal of Mass Spectrometry. 49 (6), 498-508 (2014).
  11. Fu, X., et al. Suppression of oligomer formation in glucose dehydration by CO2 and tetrahydrofuran. Green Chemistry. 19 (14), 3334-3343 (2017).
  12. Fu, X., et al. Solvent effects on degradative condensation side reactions of fructose in its initial conversion to 5-Hydroxymethylfurfural. ChemSusChem. 13 (3), 501-512 (2020).
  13. Yang, S., Wang, Z., Zhao, H., Ren, X. Modern research of Tibetan medicine. World Journal of Traditional Chinese Medicine. 5 (2), 131-138 (2019).
  14. Shang, X., et al. Ethno-veterinary survey of medicinal plants in Ruoergai region, Sichuan province, China. Journal of Ethnopharmacology. 142 (2), 390-400 (2012).
  15. Su, J., et al. Chalcone derivatives from Abelmoschus manihot seeds restrain NLRP3 inflammasome assembly by inhibiting ASC oligomerization. Frontiers in Pharmacology. 13, 932198 (2022).
  16. Fu, X., et al. Mapping out the reaction network of humin formation at the initial stage of fructose dehydration in water. Green Energy & Environment. , (2022).
  17. Hua, Y., Jenke, D. Increasing the sensitivity of an LC-MS method for screening material extracts for organic extractables via mobile phase optimization. Journal of Chromatographic Science. 50 (3), 213-227 (2012).
  18. Kumar, S., Singh, A., Bajpai, V., Kumar, B. Identification characterization and distribution of monoterpene indole alkaloids in Rauwolfia species by Orbitrap Velos Pro mass spectrometer. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 118, 183-194 (2016).
  19. Bayat, P., Lesage, D., Cole, R. B. Tutorial: Ion activation in tandem mass spectrometry using ultra-high resolution instrumentation. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 680-702 (2020).
  20. Wu, S. -. L., et al. Mass spectrometric determination of disulfide linkages in recombinant therapeutic proteins using online LC−MS with electron-transfer dissociation. Analytical Chemistry. 81 (1), 112-122 (2009).
  21. Echterbille, J., Quinton, L., Gilles, N., De Pauw, E. Ion mobility mass spectrometry as a potential tool to assign disulfide bonds arrangements in peptides with multiple disulfide bridges. Analytical Chemistry. 85 (9), 4405-4413 (2013).

Tags

Tibetan MedicineCompound StructureIon Trap Mass SpectrometryMultiple-stage FragmentationAbelmoschus ManihotSample PreparationExtractionUltrasound SonicatorCentrifugeMass SpectrometryESI SourceLiquid ChromatographyLC-MSMobile PhasesFormic AcidAcetonitrile
Standardized Identification of Compound Structure in Tibetan Medicine Using Ion Trap Mass Spectrometry and Multiple-Stage Fragmentation Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fu, X., Pan, Y., Wang, Y., Pei, Z., Xu, B., Zhang, J., Su, J. Standardized Identification of Compound Structure in Tibetan Medicine Using Ion Trap Mass Spectrometry and Multiple-Stage Fragmentation Analysis. J. Vis. Exp. (193), e65054, doi:10.3791/65054 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image