Summary
Ici, nous décrivons un protocole général et une conception qui pourraient être appliqués pour identifier des traces et des constituants mineurs dans les formulations complexes de produits naturels (matrices) de la médecine tibétaine.
Abstract
Les médicaments tibétains sont complexes et contiennent de nombreux composés inconnus, ce qui rend cruciale la recherche approfondie sur leurs structures moléculaires. La chromatographie liquide-spectrométrie de masse à temps de vol par ionisation par électrospray (LC-ESI-TOF-MS) est couramment utilisée pour extraire la médecine tibétaine; Cependant, de nombreux composés inconnus imprévisibles subsistent après l’utilisation de la base de données Spectrum. Le présent article a développé une méthode universelle pour identifier les composants de la médecine tibétaine en utilisant la spectrométrie de masse par piège ionique (IT-MS). La méthode comprend des protocoles normalisés et programmés pour la préparation des échantillons, le réglage de la SM, la préexécution LC, l’établissement de la méthode, l’acquisition de la SM, le fonctionnement de la SM en plusieurs étapes et l’analyse manuelle des données. Deux composés représentatifs de la médecine tibétaine Abelmoschus manihot seeds ont été identifiés en utilisant une fragmentation en plusieurs étapes, avec une analyse détaillée des structures composées typiques. En outre, l’article aborde des aspects tels que la sélection du mode ionique, le réglage de phase mobile, l’optimisation de la portée de balayage, le contrôle de l’énergie de collision, le basculement en mode de collision, les facteurs de fragmentation et les limites de la méthode. La méthode d’analyse standardisée développée est universelle et peut être appliquée à des composés inconnus dans la médecine tibétaine.
Introduction
L’analyse qualitative des composants traces en médecine traditionnelle chinoise (MTC) est devenue un sujet crucial dans la recherche. En raison du nombre élevé de composés en MTC, il est difficile de les isoler pour l’analyse par spectromètre par résonance magnétique nucléaire (RMN) ou diffractomètre à rayons X (XRD), ce qui rend de plus en plus populaires les méthodes basées sur la spectrométrie de masse (MS) qui ne nécessitent que de faibles volumes d’échantillons. De plus, la chromatographie liquide (CL) couplée à la SM a été largement utilisée dans la recherche sur la MTC ces dernières années pour améliorer la séparation d’échantillons complexes et l’analyse qualitative des composés chimiques1. Une méthode courante est la chromatographie liquide-spectrométrie de masse à temps de vol par ionisation électrospray (LC-ESI-TOF-MS), qui est largement utilisée dans la recherche qualitative sur la médecine tibétaine2. Avec cette méthode, les composants complexes sont enrichis et séparés dans une colonne LC, et le rapport masse / charge (m / z) des ions adduits est observé à l’aide d’un détecteur MS. La recherche dans les bases de données en tandem MS (MS/MS ou MS2) est actuellement l’approche la plus rapide pour des annotations de composés fiables dans l’analyse de petites molécules à l’aide du temps de vol quadripolaire (Q-TOF) MS et Orbitrap MS3. Cependant, la mauvaise qualité des bases de données et la présence de divers isomères empêchent l’identification de composés inconnus. En outre, les informations fournies par la base de données MS/MS sont limitées 4,5,6,7. Il est important d’étudier les composés chimiques de chaque MTC en utilisant un protocole général qui peut être largement appliqué à d’autres MTC.
IT-MS capture une large gamme d’ions en appliquant différentes tensions de radiofréquence (RF) aux électrodes annulaires8. IT-MS peut effectuer des séries chronologiques d’analyses MS à plusieurs étapes dans divers ordres chronologiques, fournissant une fragmentation MS à plusieurs stades (MS n) des ingrédients, oùn est le nombre d’étapes ioniques du produit9. L’IT-MS linéaire est considéré comme le meilleur pour l’identification de la structure car il peut être utilisé pour des expériences séquentielles MSn 10. Les ions ciblés peuvent être isolés et accumulés dans IT-MSlinéaire 1. Le MS n (n ≥ 3) dans IT-MS fournit plus d’informations fragmentaires que MS/MS dans Q-TOF-MS. Étant donné que l’IT-MS ne peut pas verrouiller l’ion cible et ses ions fragments, c’est un outil puissant pour l’élucidation de la structure de composés inconnus, y compris les isomères1. La technologie MSn a été largement appliquée à l’analyse structurelle de protéines, peptides et polysaccharides inconnus11,12. Le niveau d’abondance des ions fragments dans MSn fournit plus d’informations sur les fragments moléculaires sur les composés ciblés dans les échantillons complexes que MS/MS dans le Q-TOF-MS. Par conséquent, l’application de la technologie MSn à l’identification structurelle en MTC est essentielle.
La médecine tibétaine est une composante importante de la MTC13, et ces médicaments sont principalement dérivés d’animaux, de plantes et de minéraux trouvés dans la zone du plateau14. La médecine tibétaine Abelmoschus manihot seeds (AMS) est la graine d’Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS est un médicament traditionnel à base de plantes utilisé pour traiter des conditions telles que la dermatite atopique, les rhumatismes et la lèpre. Il contient de la chalcone, qui possède des effets antibactériens, antifongiques, anticancéreux, antioxydants et anti-inflammatoires15. Dans la présente étude, les procédures de MS n ont été améliorées et une méthode détaillée a été développée pour identifier les structures composées dans la médecine tibétaine AMS en utilisant IT-MS et MSn. Certains paramètres MS, y compris le mode ionique, la portée de balayage et le mode collision, ont été optimisés pour surmonter les problèmes d’identification des composés traces. Cette étude vise à promouvoir l’identification normalisée de la structure des composés traces dans la MTC.
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Protocol
1. Préparation de l’échantillon
- Peser avec précision 1 g de l’échantillon d’AMS et le placer dans une fiole conique contenant 30 ml de méthanol à 80 %. Transférer le mélange dans un soniateur à bain à ultrasons pendant 30 min d’extraction à 25 °C. Centrifuger l’échantillon à 14 000 x g pendant 5 min.
REMARQUE: La fréquence du sonicateur à bain à ultrasons est de 40 KHz. - Préparez une seringue d’injection et un filtre à membrane microporeuse (0,22 μm, biologique seulement). Filtrer le surnageant dans un flacon d’échantillon de 2 mL.
2. Réglage MS
- Allumez l’interrupteur de la pompe à vide. Ouvrez la soupape principale du cylindre d’argon et la soupape de pression partielle et réglez la pression à environ 0,3 MPa. Ouvrez la valve d’azote.
NOTE: Attendez au moins 8 heures pour assurer un degré de vide suffisant pour les conditions expérimentales. Vérifiez que la pression gazeuse de l’argon et de l’azote est suffisamment élevée avant l’analyse. - Lancez le logiciel de contrôle MS. Cliquez sur Source SEI chauffée dans le panneau du logiciel et entrez les paramètres MS, y compris la température du chauffage (350 °C), le débit de gaz de la gaine (35 arb), le débit de gaz auxiliaire (15 arb), la tension de pulvérisation (3,8 KV pour le mode positif, -2,5 KV pour le mode négatif) et la température capillaire (275 °C). Cliquez sur le bouton Appliquer pour activer la source d’ions.
3. Pré-exécution LC, établissement de la méthode et acquisition MS
- Préparer la phase mobile A et la phase mobile B en utilisant respectivement une solution aqueuse d’acide formique à 0,1 % et de l’acétonitrile pur. Dégazez-les dans un sonicateur à bain d’ultrasons pendant au moins 15 min. Connectez les solutions aux passages de fluide A et B, respectivement (Figure 1A). Préparez une solution de méthanol-eau (1:9 v/v), puis remplissez-la à la main dans les bouteilles de liquide de nettoyage de la pompe et de l’injecteur.
REMARQUE: La fréquence du sonicateur à bain à ultrasons est de 40 KHz. - Lancez le logiciel de contrôle LC-MS.
- Cliquez sur le bouton Contrôle direct pour ouvrir le panneau de configuration LC. Ouvrez la vanne de purge dans le sens inverse des aiguilles d’une montre sur le module de pompe (Figure 1B).
- Cliquez sur le bouton Plus d’options pour ouvrir le réglage de la pompe et réglez les paramètres de purge à 5 mLmin-1 pendant 3 min. Cliquez sur le bouton Purger pour lancer la suppression des bulles. Ensuite, fermez la vanne de purge.
- Cliquez sur les boutons Prime Seringue, Wash Buffer Loop et Wash Needle Externally pour rincer la seringue pendant trois cycles, la boucle pour un cycle et l’aiguille pour un cycle, respectivement. Placez le flacon d’échantillon dans l’échantillonneur (Figure 1C).
- Cliquez sur le bouton Configuration de l’instrument pour ouvrir la fenêtre d’édition de méthodes. Cliquez sur le bouton Nouveau pour créer une nouvelle méthode d’instrument LC-MS.
- Établissez une durée d’exécution totale pour la méthode LC. Ensuite, entrez des valeurs pour définir la limite de pression, le débit total, le gradient d’écoulement, la température de l’échantillon, la température de la colonne et le delta de la température prête dans la fenêtre d’édition de méthode.
NOTE: Le débit total par défaut de la phase mobile est constant à 0,3 mL/min avec 50% A et 50% B et sans température de colonne en l’absence d’une colonne chromatographique. Les valeurs par défaut de la température de l’échantillon et du delta de température prête sont respectivement de 15 °C et 0,1 °C. Les autres réglages dépendent du type de colonne de chromatographie liquide utilisée. - Sélectionnez le type d’expérience MS général ou MS n pour la méthode MS. Entrez des valeurs pour configurer le temps d’acquisition, la polarité, la plage de masse, le nombre de valeurs de déviation et la durée de la valeur de détournement. Cliquez sur le bouton Enregistrer pour configurer les paramètres en tant que méthode instrumentale.
REMARQUE: Les paramètres par défaut sans colonne de chromatographie sont les suivants: temps d’acquisition, 2 min; polarité, positive ou négative; gamme de masse, 100 à 1 200; numéro de valeur de détournement, 2; et la durée de la valeur de détournement, 1,99 min.
4. Utilisation de la spectrométrie de masse à plusieurs étages
- Cliquez sur le bouton Configuration de la séquence pour ouvrir la table des séquences.
- Dans le tableau, entrez les informations suivantes : type d’échantillon, nom de fichier, chemin, ID d’échantillon, méthode de l’instrument, position et volume d’injection.
- Cliquez sur le bouton Enregistrer pour enregistrer la table de séquences, puis cliquez sur le bouton Démarrer l’analyse pour implémenter les paramètres et lancer l’acquisition MS.
Remarque : Le type d’échantillon par défaut est sélectionné comme inconnu. La méthode instrumentale est la méthode enregistrée à l’étape 3.6. Le flacon d’échantillon est placé à son emplacement unique dans la salle d’échantillonnage. Par exemple, RA1 est le premier emplacement de la première rangée de la zone rouge de la salle d’échantillonnage. Le volume d’injection par défaut est généralement de 2 μL, ce qui dépend de la concentration de l’échantillon.
- Double-cliquez sur le fichier brut dans l’explorateur pour charger les données MS dans le logiciel de traitement des données. Dans le chromatogramme de pic de base (BPI), sélectionnez la zone avec la surface maximale sous la courbe (ASC) en cliquant et en faisant glisser la souris. Les spectres MS correspondants seront affichés dans la même fenêtre.
- Sélectionnez un ion ciblé pour la prochaine analyse MS/MS.
- Rouvrez la fenêtre d’édition de méthodes. Dans le tableau MSn Setting , définissez le m/z de l’ion ciblé sur une décimale dans la colonne Masse parente .
- Sélectionnez Mode collision et entrez la valeur de l’énergie de collision (CE). Définissez la plage d’analyse MS/MS. Cliquez sur le bouton Enregistrer pour enregistrer la méthode MS et entrez un nouveau nom de fichier dans la table de séquence. Cliquez sur le bouton Démarrer pour lancer l’acquisition MS/MS.
REMARQUE: La plage de balayage MS / MS était de 40% à 130% de l’ion parent ciblé. La valeur CE par défaut en mode de dissociation induite par collision (CID) est de 35 %.
- Double-cliquez sur le fichier brut dans l’explorateur pour charger le fichier brut MS/MS dans le logiciel de traitement des données.
- Identifiez l’ion fragment le plus fort dans le spectre MS/MS et entrez sa valeur m/z dans la liste des méthodes MSn. Dans le tableau Paramètres MSn, définissez les paramètres MS3, y compris le mode de collision, la valeur CE et la plage de balayage.
- Cliquez sur le bouton Enregistrer pour enregistrer la méthode MS et entrez un nouveau nom de fichier dans la table de séquence. Cliquez sur le bouton Démarrer pour lancer l’acquisition de MS3 .
- Double-cliquez sur le fichier brut dans l’explorateur pour charger le fichier brut MS3 dans le logiciel de traitement des données. Répétez l’étape 4.4 pour obtenir le spectre MS4 .
- Terminez l’expérience MSn lorsqu’aucun ion fragment stable n’est observé dans le spectre.
5. Analyse manuelle des données MSn
- Double-cliquez sur les fichiers bruts pour ouvrir tous les spectres de masse de MS à MSn. Calculez manuellement les valeurs de différence m/z entre l’ion et les ions fragments correspondants.
NOTE: Par exemple, la valeur de différence m/z entre l’ion (m/z 617,25) et les ions fragments correspondants (m/z 571,28) était de 45,97 en MS/MS, la valeur de différence m/z entre l’ion (m/z 571,28) et les ions fragments correspondants (m/z 525,38) était de 45,90 dans MS3, et les valeurs de différence m/z entre l’ion (m/z 525,38) et les ions fragments correspondants (m/z 344,93 et 273,16) étaient de 180,45 et 252,22 dans MS4, respectivement. - Dessinez manuellement la structure « de base » en fonction des résultats MS4 (le dernier niveau de MSn). Dérivez manuellement la structure d’origine à l’aide de groupes fonctionnels ou de segments moléculaires basés sur la valeur de différence m/z. Dessiner manuellement les chemins de clivage moléculaire en fonction de chaque structure moléculaire dans MSn. Des exemples de dérivation moléculaire manuelle sont détaillés dans la section des résultats représentatifs.
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Representative Results
Le cellobiose a été utilisé comme modèle pour vérifier la faisabilité de MSn en mode ion positif. Comme le montre la figure 2A, l’ESI-MS (mode ion positif) du cellobiose [C 12 H22O11]+ a produit la molécule protonée [M+H]+ à m/z 365. Le balayage ionique du produit (CID-MS/MS) de [M+H]+ à m/z 365 a donné le deuxième fragment ionique à m/z 305 (figure 2B), qui a été analysé plus en détail à l’aide d’analyses MS3 et MS4 (figure 2C,D). L’analyse MS3 a abouti au troisième ion fragment à m/z 254, et l’analyse MS4 a abouti au quatrième ion fragment à m/z 185. L’analyse MS/MS (figure 2E) a révélé que l’ion fragment perdu à m/z 60 indiquait une séquence de fragmentation ionique à m/z 365, à savoir l’hydrolyse par ouverture de cycle (marquée en bleu), le clivage de la liaison C-C (marqué en rouge) et la déshydratation (marqué en vert). De même, l’analyse MS3 a révélé que l’ion fragment perdu à m/z 60 indiquait le clivage de la liaison C-C (marqué en rouge) d’un ion à m/z 305. L’analyse MS4 a montré que l’ion fragment perdu à m/z 60 impliquait l’hydrolyse (marquée en bleu) et la déshydratation (marquée en vert), entraînant le clivage de l’ion avec m/z 245 en un ion avec m/z 185. La fracture par étapes dans l’analyse MSn a indiqué que cette méthode était réalisable pour étudier la structure des glucides.
L’analyse qualitative préliminaire de l’AMS à l’aide de LC-Q-TOF-MS a révélé la présence de nombreux composés inconnus. L’un d’eux, un ion à m/z 617, a été sélectionné pour l’analyse MSn en mode négatif. Le balayage ionique produit (CID-MS/MS) du [M-H]− à m/z 617 dans AMS a produit un deuxième ion fragment à m/z 571. L’analyse MS3 de cet ion fragment a produit un troisième ion fragment à m/z 525, et l’analyse MS4 a produit des ions quatrième fragment à m/z 345 et 273 (Figure 3A-D). Le MS3 de m/z 571 a fourni un ion fragment à m/z 525 par la perte de la partieCH2OHsous forme de méthanol (−32 Da) et de la partie OH (−18 Da) sous forme d’eau. Ces résultats MS4 ont été utilisés pour l’identification manuelle de la structure « centrale » du composé, et sa structure originale a été déterminée en comparant les valeurs m/z de l’ion et de ses ions fragments. La structure moléculaire du composé à m/z 617 et ses chemins de clivage dans MSn sont représentés à la figure 3E. Un autre composé inconnu à m/z 365 a été analysé en mode positif en utilisant MSn. Le balayage ionique produit (CID-MS/MS) de l’ion [M+H]+ à m/z 365 dans AMS a produit des ions fragments secondaires à m/z 299, m/z 329 et m/z 347. L’analyse MS3 de ces ions fragments a produit un troisième ion fragment à m/z 231 (Figure 4A-C). La structure moléculaire et le mécanisme de clivage du composé à m/z 365 sont représentés à la figure 4E.
Figure 1: Identification de structures composées inconnues dans la médecine tibétaine à l’aide de l’IT-MS et de l’analyse par spectrométrie de masse en plusieurs étapes. (A) La phase mobile pour la chromatographie liquide. (B) La pompe de chromatographie liquide. (C) La salle d’échantillonnage. (D) La source d’ions pour MS. (E) La structure interne du module piège à ions dans MS. (F) Le spectre MS4 . (G) Les informations sur la structure moléculaire tirées des résultats MS4 . Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Fragmentation en plusieurs étapes du cellobiose via IT-MS en mode ion positif. (A) Spectre de masse original du cellobiose. (B) Fragment d’ions dans le spectre MS/MS. (C) Fragments d’ions dans le spectre MS3. (D) Fragment d’ions dans le spectre MS4. (E) Le mécanisme de clivage et la structure moléculaire du cellobiose. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Fragmentation en plusieurs étapes et analyse structurelle de l’ion composé AMS inconnu à m/z 617 via IT-MS en mode ion négatif. (A) Spectre de masse partiel de l’AMS. (B) Fragment d’ions dans le spectre MS/MS. (C) Fragments d’ions dans le spectre MS3. (D) Fragment d’ions dans le spectre MS4. (E) Le mécanisme de clivage et la structure moléculaire de l’ion composé AMS à m/z 617. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse structurelle par fragmentation en plusieurs étapes de l’ion composé AMS inconnu à m/z 365 via IT-MS en mode ion positif. (A) Spectre de masse partiel d’AMS. (B) Fragment d’ions dans le spectre MS/MS. (C) Fragments d’ions dans le spectre MS3. (D) Le mécanisme de clivage et la structure moléculaire de l’ion composé AMS à m/z 365. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
IT-MS et sa technologie MSn offrent une nouvelle approche pour identifier la structure des composés de MTC à l’état de traces. Contrairement à Q-TOF-MS, qui ne pouvait pas identifier en profondeur les ions fragments, IT-MS avec la technologie MSn excelle en raison de sa capacité à isoler et à accumuler des ions. Cet article décrit une méthode d’identification des composés traces dans la médecine tibétaine en utilisant la technique IT-MS et MSn . La méthode utilise la valeur n en MSn pour déterminer la quantité d’informations sur les ions fragment fournies. Les étapes cruciales de cette méthode comprennent la sélection de la plage de balayage appropriée et l’ajustement de la valeur CE, ce qui conduit à l’identification de fragments précieux.
En général, l’analyse MSn des saccharides est mieux réalisée en modeionique positif 16, tandis que les acides phénoliques et les alcaloïdes sont mieux analysés en mode ion négatif. La réponse du composé dans la source ESI peut être améliorée en ajustant la phase mobile avec des additifs tels que l’acide formique, l’acide acétique et l’acétate d’ammonium17. Une source d’ionisation chimique à pression atmosphérique peut être envisagée pour les composés à faible polarité. Le choix d’une plage de balayage appropriée peut augmenter l’intensité des ions fragments, ce qui est bénéfique pour la prochaine étape de MS n en raison de la désintégration énergétique inévitable dans chaque MSn. Le m/z de l’ion fragment doit être situé dans la région centrale de la plage de balayage pour obtenir la meilleure intensité correspondante. Si un ion a des charges doubles ou multiples, des ions fragments avec des valeurs m/z plus élevées peuvent être obtenus en diminuant le nombre de charge pendant la fragmentation. Dans ce cas, l’extrémité m/z de la plage de balayage doit être définie pour être plus grande. Le mode CID convient à la plupart des composés dans l’analyse MSn 18. Si l’intensité de l’ion fragment est insuffisante, la valeur CE peut être augmentée de 5% à la fois. Lorsqu’il y a plusieurs ions fragments complexes dans MSn, une valeur CE plus faible est nécessaire pour contrôler la dissociation ionique. Le mode de dissociation induite par collision Q pulsé, qui convient aux petites molécules, fournit des informations plus détaillées sur les ions fragments de faible poids moléculaire que le mode CID19. Le modèle de dissociation par transfert d’électrons (ETD) est dominant dans la fracture peptidique et l’identification des protéines, mais est rarement utilisé pour identifier les composants de la MTC20. Le mode ETD peut être utilisé pour étudier des composés inconnus contenant des liaisons disulfure21.
Bien que la méthode MSn présente de nombreux avantages pour l’identification structurelle par rapport à d’autres techniques MS, il existe encore certaines limites. Tout d’abord, aucun des modes de collision ne convient à tous les composés TCM. Un choix raisonnable du mode de collision et un réglage manuel de l’énergie de collision peuvent améliorer les ions fragments. De plus, avec la méthode MSn , il est difficile de distinguer la position des groupes fonctionnels dans les grosses molécules à isomères complexes. L’identification des sites fonctionnels des groupes est une tâche difficile qui nécessite des chercheurs expérimentés. La post-analyse manuelle et le long temps de traitement des données MSn sont également des obstacles importants qui découragent les chercheurs d’utiliser cette technologie. Q-TOF-MS est populaire parmi les chercheurs en raison de sa grande précision de mesure, de sa résolution et de sa facilité d’utilisation avec les bases de données. Cependant, IT-MS est une bonne solution pour les ions non identifiés et les ions traces en raison de sa capacité à isoler et à accumuler des ions et à effectuer plusieurs étapes d’analyse. L’intégration de Q-TOF et IT-MS pourrait fournir une solution optimale pour l’analyse qualitative complète des échantillons de MTC. La technologie MSn est largement utilisée dans des domaines tels que l’alimentation, les sciences de l’environnement et la médecine, et sa popularité et son utilisation dans divers domaines devraient augmenter avec l’amélioration de l’instrumentation IT-MS.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le Xinglin Talent Program de l’Université de TCM de Chengdu (n ° 030058191), la Fondation des sciences de la nature du Sichuan (2022NSFSC1470) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82204765).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Thermo Scientific | CAS 75-05-8 | LC-MS grade |
| Formic Acid | Knowles | CAS 64-18-6 | HPLC grade |
| Linear ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL | |
| liquid chromatograph | Thermo Scientific | U3000 | |
| LTQ Tune | Thermo Scientific | version 2.8.0 | MS control software |
| Methanol | Thermo Scientific | CAS 67-56-1 | LC-MS grade |
| Pure water | Thermo Scientific | CAS 7732-18-5 | LC-MS grade |
| Xcalibur | Thermo Scientific | version 2.0 | LC-IT-MS operational software |
References
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