Summary
Aqui, descrevemos um protocolo geral e um projeto que podem ser aplicados para identificar quantidades residuais e constituintes menores nas formulações complexas de produtos naturais (matrizes) na medicina tibetana.
Abstract
Os medicamentos tibetanos são complexos e contêm numerosos compostos desconhecidos, tornando crucial a pesquisa aprofundada sobre suas estruturas moleculares. Cromatografia líquida-espectrometria de massa por tempo de voo por ionização por eletrospray (LC-ESI-TOF-MS) é comumente usada para extrair medicamentos tibetanos; No entanto, muitos compostos desconhecidos imprevisíveis permanecem após o uso do banco de dados Spectrum. O presente artigo desenvolveu um método universal para identificação de componentes na medicina tibetana usando espectrometria de massas com armadilha iônica (IT-MS). O método inclui protocolos padronizados e programados para preparação de amostras, configuração de EM, pré-execução de LC, estabelecimento de métodos, aquisição de EM, operação de EM em múltiplos estágios e análise manual de dados. Dois compostos representativos na medicina tibetana Abelmoschus manihot sementes foram identificados usando fragmentação de múltiplos estágios, com uma análise detalhada de estruturas compostas típicas. Além disso, o artigo discute aspectos como seleção do modo de íon, ajuste de fase móvel, otimização da faixa de varredura, controle de energia de colisão, comutação do modo de colisão, fatores de fragmentação e limitações do método. O método de análise padronizado desenvolvido é universal e pode ser aplicado a compostos desconhecidos na medicina tibetana.
Introduction
A análise qualitativa de componentes traço na medicina tradicional chinesa (MTC) tornou-se um tópico crucial na pesquisa. Devido ao alto número de compostos na MTC, é difícil isolá-los para análise de espectrômetro de ressonância magnética nuclear (RMN) ou difratômetro de raios X (DRX), tornando cada vez mais populares métodos baseados em espectrometria de massa (MS) que requerem apenas baixos volumes de amostras. Adicionalmente, a cromatografia líquida (CL) acoplada à EM tem sido amplamente utilizada na pesquisa em MTC nos últimos anos para a melhor separação de amostras complexas e análise qualitativa de compostosquímicos1. Um método comum é a cromatografia líquida-espectrometria de massas por tempo de voo por ionização por eletrospray (LC-ESI-TOF-MS), que é amplamente utilizada em pesquisas qualitativas em medicina tibetana2. Com este método, componentes complexos são enriquecidos e separados em uma coluna LC, e a relação massa-carga (m/z) dos íons adutos é observada usando um detector MS. A busca em bancos de dados tandem MS (MS/MS ou MS2) é atualmente a abordagem mais rápida para anotações de compostos confiáveis em análises de pequenas moléculas usando o tempo de voo quadrupolo (Q-TOF) MS e o Orbitrap MS3. No entanto, a baixa qualidade dos bancos de dados e a presença de vários isômeros dificultam a identificação de compostos desconhecidos. Além disso, as informações fornecidas pelo banco de dados do MS/MS são limitadas 4,5,6,7. É significativo investigar os compostos químicos em cada MTC usando um protocolo geral que pode ser amplamente aplicado a outros MTC.
O IT-MS captura uma ampla gama de íons aplicando diferentes tensões de radiofrequência (RF) aos eletrodos do anel8. O IT-MS pode realizar varreduras de MS de vários estágios de séries temporais em diversas ordens cronológicas, fornecendo fragmentação de MS de múltiplos estágios (MS n) de ingredientes, onden é o número de estágios de íons do produto9. O IT-MS linear é considerado o melhor para identificação de estruturas, pois pode ser utilizado para experimentos sequenciais de MSn 10. Íons alvo podem ser isolados e acumulados em IT-MSlinear 1. O MS n (n ≥ 3) em IT-MS fornece mais informações fragmentadas do que MS/MS em Q-TOF-MS. Uma vez que IT-MS não pode bloquear o íon alvo e seus íons fragmentos, é uma ferramenta poderosa para a elucidação da estrutura de compostos desconhecidos, incluindo isômeros1. A tecnologia MSn tem sido amplamente aplicada na análise estrutural de proteínas, peptídeos e polissacarídeos desconhecidos11,12. O nível de abundância de íons fragmentos em MSn fornece mais informações de fragmentos moleculares sobre compostos alvo em amostras complexas do que MS/MS em Q-TOF-MS. Assim, a aplicação da tecnologia MSn na identificação estrutural na MTC é essencial.
A medicina tibetana é um componente significativo da MTC13, e esses medicamentos são principalmente derivados de animais, plantas e minerais encontrados na área do planalto14. O medicamento tibetano Abelmoschus manihot seeds (AMS) é a semente de Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS é um fitoterápico tradicional usado para tratar condições como dermatite atópica, reumatismo e hanseníase. Contém chalcona, que possui efeitos antibacterianos, antifúngicos, anticancerígenos, antioxidantes e anti-inflamatórios15. No presente estudo, os procedimentos de MS n foram aprimorados, e um método detalhado foi desenvolvido para identificar estruturas compostas na medicina tibetana AMS usando IT-MS e MSn. Certos parâmetros do MS, incluindo o modo de íons, o alcance de varredura e o modo de colisão, foram otimizados para superar problemas na identificação de compostos traços. Este estudo tem como objetivo promover a identificação padronizada da estrutura de compostos traço na MTC.
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Protocol
1. Preparação da amostra
- Pesar com precisão 1 g da amostra de AMS e colocá-la num balão cónico com 30 ml de metanol a 80%. Transfira a mistura para um sonicador de banho de ultrassom por 30 min de extração a 25 °C. Centrifugar a amostra a 14.000 x g por 5 min.
NOTA: A frequência do sonicador de banho de ultrassom é de 40 KHz. - Prepare uma seringa de injeção e um filtro de membrana microporosa (0,22 μm, apenas orgânico). Filtrar o sobrenadante num frasco de amostra de 2 ml.
2. Configuração de EM
- Ligue o interruptor da bomba de vácuo. Abra a válvula principal do cilindro de argônio e a válvula de pressão parcial e ajuste a pressão para aproximadamente 0,3 MPa. Abra a válvula de nitrogênio.
NOTA: Aguarde pelo menos 8 h para garantir um grau de vácuo suficiente para as condições experimentais. Verifique se a pressão do gás de argônio e nitrogênio é alta o suficiente antes da análise. - Inicie o software de controle MS. Clique em Fonte SEI aquecida no painel do software e insira os parâmetros MS, incluindo a temperatura do aquecedor (350 °C), a taxa de fluxo de gás da bainha (35 arb), a taxa de fluxo de gás auxiliar (15 arb), a tensão de pulverização (3,8 KV para o modo positivo, -2,5 KV para o modo negativo) e a temperatura capilar (275 °C). Clique no botão Aplicar para ativar a fonte de íons.
3. Pré-execução de LC, estabelecimento do método e aquisição de MS
- Preparar a fase A móvel e a fase B móvel usando solução aquosa de ácido fórmico a 0,1% e acetonitrila pura, respectivamente. Desgaseifique-os em um sonicador de banho de ultrassom por pelo menos 15 min. Conecte as soluções às passagens de fluido A e B, respectivamente (Figura 1A). Prepare uma solução de metanol-água (1:9 v/v) e, em seguida, encha-a nos frascos de fluido de limpeza da bomba e do injetor manualmente.
NOTA: A frequência do sonicador de banho de ultrassom é de 40 KHz. - Inicie o software de controle LC-MS.
- Clique no botão Controle direto para abrir o painel de controle LC. Abra a válvula de purga no sentido anti-horário no módulo da bomba (Figura 1B).
- Clique no botão Mais opção para abrir a configuração da bomba e defina os parâmetros de purga em 5 mLmin−1 por 3 min. Clique no botão Purge para iniciar a remoção da bolha. Em seguida, feche a válvula de purga.
- Clique nos botões Seringa Prime, Wash Buffer Loop e Wash Needle Externamente para enxaguar a seringa por três ciclos, o laço por um ciclo e a agulha por um ciclo, respectivamente. Coloque o frasco de amostra no amostrador (Figura 1C).
- Clique no botão Configuração do instrumento para abrir a janela de edição de método. Clique no botão Novo para criar um novo método de instrumento LC-MS.
- Estabeleça um tempo de execução total para o método LC. Em seguida, insira valores para definir o limite de pressão, a taxa de fluxo total, o gradiente de fluxo, a temperatura da amostra, a temperatura da coluna e o delta de temperatura pronto na janela de edição do método.
NOTA: O caudal total predefinido da fase móvel é constante a 0,3 ml/min com 50% A e 50% B e sem temperatura da coluna na ausência de uma coluna cromatográfica. Os valores padrão de temperatura da amostra e delta de temperatura pronta são 15 °C e 0,1 °C, respectivamente. Outras configurações dependem do tipo de coluna de cromatografia líquida utilizada. - Selecione o tipo de experimento MS geral ou MS n para o método MS. Insira valores para configurar o tempo de aquisição, a polaridade, o intervalo de massa, o número do valor de desvio e a duração do valor de desvio. Clique no botão Salvar para definir as configurações como um método de instrumento.
NOTA: As configurações padrão sem uma coluna de cromatografia são as seguintes: tempo de aquisição, 2 min; polaridade, positiva ou negativa; faixa de massa, 100 a 1.200; número do valor de desvio, 2; e duração do valor de desvio, 1,99 min.
4. Operação de espectrometria de massas de múltiplos estágios
- Clique no botão Sequence Setup para abrir a tabela de sequência.
- Na tabela, insira as seguintes informações: tipo de amostra, nome do arquivo, caminho, ID da amostra, método do instrumento, posição e volume de injeção.
- Clique no botão Salvar para gravar a tabela de sequência e, em seguida, clique no botão Iniciar análise para implementar as configurações e iniciar a aquisição de MS.
Observação : O tipo de exemplo padrão é selecionado como desconhecido. O método do instrumento é o método salvo na etapa 3.6. O frasco de amostra é colocado em seu local exclusivo na sala de amostras. Por exemplo, RA1 é o primeiro local na primeira linha da área vermelha na sala de amostra. O volume de injeção padrão é geralmente de 2 μL, que depende da concentração da amostra.
- Clique duas vezes no arquivo raw no explorer para carregar os dados do MS no software de processamento de dados. No cromatograma de pico de base (BPI), selecione a área com a área máxima sob a curva (AUC) clicando e arrastando o mouse. Os espectros MS correspondentes serão exibidos na mesma janela.
- Selecione um íon direcionado para a próxima análise do MS/MS.
- Reabra a janela de edição de método. Na tabela MSn Setting , defina o m/z do íon de destino com uma casa decimal na coluna Massa pai .
- Selecione Modo de colisão e insira o valor de energia de colisão (CE). Defina o intervalo de varredura do MS/MS. Clique no botão Salvar para registrar o método MS e insira um novo nome de arquivo na tabela de sequência. Clique no botão Iniciar para iniciar a aquisição do MS/MS.
Observação : O intervalo de varredura MS/MS foi 40%-130% do íon pai de destino. O valor CE padrão no modo de dissociação induzida por colisão (CID) é 35%.
- Clique duas vezes no arquivo raw no explorer para carregar o arquivo raw do MS/MS no software de processamento de dados.
- Identifique o íon de fragmento mais forte no espectro MS/MS e insira seu valor m/z na lista de métodos MSn. Na tabela MS n Setting, defina os parâmetros do MS3, incluindo modo de colisão, valor CE e intervalo de varredura.
- Clique no botão Salvar para registrar o método MS e insira um novo nome de arquivo na tabela de sequência. Clique no botão Iniciar para iniciar a aquisição do MS3 .
- Clique duas vezes no arquivo raw no explorer para carregar o arquivo raw do MS3 no software de processamento de dados. Repita a etapa 4.4 para obter o espectro MS4 .
- Completar o experimento MSn quando nenhum íon fragmento estável for observado no espectro.
5. Manual MSn análise de dados
- Clique duas vezes nos arquivos raw para abrir todos os espectros de massa de MS para MSn. Calcule manualmente os valores de diferença m/z entre o íon e os íons de fragmento correspondentes.
NOTA: Por exemplo, o valor da diferença m/z entre o íon (m/z 617,25) e os íons fragmentos correspondentes (m/z 571,28) foi de 45,97 em MS/MS, o valor da diferença m/z entre o íon (m/z 571,28) e os íons fragmentos correspondentes (m/z 525,38) foi de 45,90 em MS3, e os valores de diferença m/z entre o íon (m/z 525,38) e os íons fragmentos correspondentes (m/z 344,93 e 273,16) foram 180,45 e 252,22 no MS4, respectivamente. - Desenhe manualmente a estrutura "core" de acordo com os resultados do MS4 (o último nível do MSn). Derive manualmente a estrutura original usando grupos funcionais ou segmentos moleculares com base no valor da diferença m/z. Desenhar manualmente os caminhos de clivagem molecular de acordo com cada estrutura molecular em MSn. Exemplos de derivação molecular manual são detalhados na seção de resultados representativos.
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Representative Results
A celobiose foi utilizada como modelo para verificar a viabilidade don MS no modo iônico positivo. Como mostrado na Figura 2A, o ESI-MS (modo iônico positivo) da celobiose [C 12 H22O11]+ produziu a molécula protonada [M+H]+ em m/z 365. A varredura de íons do produto (CID-MS/MS) de [M+H]+ em m/z 365 resultou no segundo íon fragmento em m/z 305 (Figura 2B), que foi posteriormente analisado usando as análises MS3 e MS4 (Figura 2C,D). A análise MS3 resultou no terceiro íon fragmento em m/z 254, e a análise MS4 resultou no quarto íon fragmento em m/z 185. A análise MS/MS (Figura 2E) revelou que o íon fragmento perdido em m/z 60 indicou uma sequência de fragmentação de íons em m/z 365, ou seja, hidrólise de abertura de anel (marcada em azul), clivagem da ligação C-C (marcada em vermelho) e desidratação (marcada em verde). Da mesma forma, a análise MS3 revelou que o íon fragmento perdido em m/z 60 indicou a clivagem da ligação C-C (marcada em vermelho) de um íon em m/z 305. A análise MS4 mostrou que o íon fragmento perdido em m/z 60 implicou hidrólise (marcado em azul) e desidratação (marcado em verde), resultando na clivagem do íon com m/z 245 em um íon com m/z 185. A fratura do degrau na análise do MSn indicou que este método foi viável para investigar a estrutura dos carboidratos.
A análise qualitativa preliminar da AMS usando LC-Q-TOF-MS revelou a presença de numerosos compostos desconhecidos. Um deles, um íon a m/z 617, foi selecionado para análise deMS n no modo negativo. O produto de varredura de íons (CID-MS/MS) do [M-H]− em m/z 617 em AMS produziu um segundo íon fragmento em m/z 571. A análise MS3 deste íon fragmento produziu um terceiro íon fragmento em m/z 525, e a análise MS4 produziu o quarto íon fragmento em m/z 345 e 273 (Figura 3A-D). O MS3 de m/z 571 proporcionou um íon fragmentado em m/z 525 pela perda da porção CH2OH como metanol (−32 Da) e da porção OH (−18 Da) como água. Estes resultados de MS4 foram utilizados para a identificação manual da estrutura "core" do composto, e sua estrutura original foi determinada comparando-se os valores m/z do íon e seus íons fragmentos. A estrutura molecular do composto em m/z 617 e suas trajetórias de clivagem em MSn são mostradas na Figura 3E. Outro composto desconhecido em m/z 365 foi analisado no modo positivo usando MSn. A varredura de íons do produto (CID-MS/MS) do íon [M+H]+ em m/z 365 em AMS produziu íons de segundo fragmento em m/z 299, m/z 329 e m/z 347. A análise MS3 desses íons fragmentos produziu um terceiro íon fragmento a m/z 231 (Figura 4A-C). A estrutura molecular e o mecanismo de clivagem do composto em m/z 365 são mostrados na Figura 4E.
Figura 1: Identificação de estruturas compostas desconhecidas na medicina tibetana usando IT-MS e análise por espectrometria de massa de múltiplos estágios . (A) A fase móvel para cromatografia líquida. (B) A bomba de cromatografia líquida. (C) A sala de amostras. (D) A fonte de íons para MS. (E) A estrutura interna do módulo de armadilha de íons em MS. (F) O espectro MS4 . (G) As informações de estrutura molecular dos resultados do MS4 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fragmentação em múltiplos estágios da celobiose via IT-MS no modo iônico positivo . (A) Espectro de massa original da celobiose. (B) Íons fragmentados no espectro MS/MS. (C) Íons fragmentados no espectro MS3 . (D) Íons fragmentados no espectro MS4 . (E) O mecanismo de clivagem e a estrutura molecular da celobiose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fragmentação em múltiplos estágios e análise estrutural do íon composto AMS desconhecido em m/z 617 via IT-MS em modo iônico negativo . (A) Espectro de massa parcial de AMS. (B) Íons fragmentados no espectro MS/MS. (C) Íons fragmentados no espectro MS3 . (D) Íons fragmentados no espectro MS4 . (E) O mecanismo de clivagem e a estrutura molecular do íon composto AMS em m/z 617. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise estrutural de fragmentação em múltiplos estágios do íon composto AMS desconhecido em m/z 365 via IT-MS em modo de íon positivo . (A) Espectro de massa parcial da AMS. (B) Íons fragmentados no espectro MS/MS. (C) Íons fragmentados no espectro MS3 . (D) O mecanismo de clivagem e a estrutura molecular do íon composto AMS em m/z 365. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
IT-MS e sua tecnologia MSn oferecem uma nova abordagem para identificar a estrutura de compostos TCM traço. Ao contrário do Q-TOF-MS, que não conseguiu identificar profundamente os íons fragmentados, o IT-MS com tecnologia MSn se destaca devido à sua capacidade de isolar e acumular íons. Este artigo descreve um método para identificar compostos traço na medicina tibetana usando a técnica IT-MS e MSn . O método utiliza o valor de n em MSn para determinar a quantidade de informações de íons fragmentados fornecidas. As etapas cruciais neste método incluem a seleção da faixa de varredura apropriada e o ajuste do valor CE, o que leva à identificação de fragmentos valiosos.
Em geral, a análise MSn de sacarídeos é melhor realizada no modo iônico positivo16, enquanto ácidos fenólicos e alcaloides são melhor analisados no modo íon negativo. A resposta do composto na fonte de ESI pode ser melhorada ajustando-se a fase móvel com aditivos como ácido fórmico, ácido acético e acetato de amônio17. Uma fonte de ionização química de pressão atmosférica pode ser considerada para compostos com polaridade fraca. A escolha de uma faixa de varredura apropriada pode aumentar a intensidade dos íons fragmentados, o que é benéfico para o próximo estágio de MS n devido ao inevitável decaimento de energia em cadaMS n. O m/z do íon fragmento deve estar localizado na região central da faixa de varredura para obter a melhor intensidade correspondente. Se um íon tem cargas duplas ou múltiplas, íons fragmentados com valores mais altos de m/z podem ser obtidos diminuindo o número de carga durante a fragmentação. Nesse caso, o final m/z do intervalo de varredura deve ser definido para ser maior. O modo CID é adequado para a maioria dos compostos na análise de MSn 18. Se a intensidade do íon fragmento for insuficiente, o valor CE pode ser aumentado em 5% de cada vez. Quando há múltiplos íons fragmentos complexos em MSn, um valor CE mais baixo é necessário para controlar a dissociação de íons. O modo de dissociação induzido por colisão pulsed-Q, que é adequado para moléculas pequenas, fornece informações mais detalhadas sobre íons fragmentados de baixo peso molecular do que o modo CID19. O modelo de dissociação por transferência de elétrons (DTE) é dominante na fratura peptídica e identificação de proteínas, mas raramente é usado para identificar os componentes da MTC20. O modo ETD pode ser usado para investigar compostos desconhecidos contendo ligações dissulfeto21.
Embora o método MSn tenha muitas vantagens para identificação estrutural em comparação com outras técnicas de EM, ainda existem algumas limitações. Primeiro, nenhum dos modos de colisão é adequado para todos os compostos TCM. Uma escolha razoável de modo de colisão e ajuste manual da energia de colisão pode melhorar os íons de fragmento. Além disso, com o método MSn , é difícil distinguir a posição de grupos funcionais em moléculas grandes com isômeros complexos. Identificar os locais dos grupos funcionais é uma tarefa desafiadora que requer pesquisadores experientes. A pós-análise manual e o longo tempo de processamento dos dados MSn também são barreiras significativas que desencorajam os pesquisadores a utilizar essa tecnologia. O Q-TOF-MS é popular entre os pesquisadores devido à sua alta precisão de medição, resolução e facilidade de uso com bancos de dados. No entanto, IT-MS é uma boa solução para íons não identificados e íons traços devido à sua capacidade de isolar e acumular íons e realizar múltiplas etapas de análise. A integração de Q-TOF e IT-MS poderia fornecer uma solução ideal para a análise qualitativa completa de amostras de MTC. A tecnologia MSn é amplamente utilizada em campos como alimentos, ciência ambiental e medicina, e espera-se que sua popularidade e uso em vários campos aumentem com a melhoria da instrumentação IT-MS.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Programa de Talentos Xinglin da Universidade de Chengdu da TCM (No. 030058191), pela Nature Science Foundation of Sichuan (2022NSFSC1470) e pela National Natural Science Foundation of China (82204765).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Thermo Scientific | CAS 75-05-8 | LC-MS grade |
| Formic Acid | Knowles | CAS 64-18-6 | HPLC grade |
| Linear ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL | |
| liquid chromatograph | Thermo Scientific | U3000 | |
| LTQ Tune | Thermo Scientific | version 2.8.0 | MS control software |
| Methanol | Thermo Scientific | CAS 67-56-1 | LC-MS grade |
| Pure water | Thermo Scientific | CAS 7732-18-5 | LC-MS grade |
| Xcalibur | Thermo Scientific | version 2.0 | LC-IT-MS operational software |
References
- Chen, X. -F., Wu, H. -T., Tan, G. -G., Zhu, Z. -Y., Chai, Y. -F. Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines. Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).
- Ou, C., et al. Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028 (2020).
- Kind, T., et al. Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search. Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).
- Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in Callinectes sapidus. Journal of Visualized Experiments. (183), e63322 (2022).
- Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments. (184), e64050 (2022).
- Karas, B. F., et al. Dose uptake of platinum-and ruthenium-based compound exposure in zebrafish by inductively coupled plasma mass spectrometry with broader applications. Journal of Visualized Experiments. (182), e6358 (2022).
- Chang, H. -L., et al. Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e63089 (2022).
- Wang, S., et al. Structural characterization and identification of major constituents in Jitai tablets by high-performance liquid chromatography/diode-array detection coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Molecules. 17 (9), 10470-10493 (2012).
- Pang, B., Zhu, Y., Lu, L., Gu, F., Chen, H. The applications and features of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016, 3837270 (2016).
- Ichou, F., et al. Comparison of the activation time effects and the internal energy distributions for the CID, PQD and HCD excitation modes. Journal of Mass Spectrometry. 49 (6), 498-508 (2014).
- Fu, X., et al. Suppression of oligomer formation in glucose dehydration by CO2 and tetrahydrofuran. Green Chemistry. 19 (14), 3334-3343 (2017).
- Fu, X., et al. Solvent effects on degradative condensation side reactions of fructose in its initial conversion to 5-Hydroxymethylfurfural. ChemSusChem. 13 (3), 501-512 (2020).
- Yang, S., Wang, Z., Zhao, H., Ren, X.
- Shang, X., et al. Ethno-veterinary survey of medicinal plants in Ruoergai region, Sichuan province, China. Journal of Ethnopharmacology. 142 (2), Sichuan province, China. 390-400 (2012).
- Su, J., et al. Chalcone derivatives from Abelmoschus manihot seeds restrain NLRP3 inflammasome assembly by inhibiting ASC oligomerization. Frontiers in Pharmacology. 13, 932198 (2022).
- Fu, X., et al. Mapping out the reaction network of humin formation at the initial stage of fructose dehydration in water. Green Energy & Environment. , In Press (2022).
- Hua, Y., Jenke, D. Increasing the sensitivity of an LC-MS method for screening material extracts for organic extractables via mobile phase optimization. Journal of Chromatographic Science. 50 (3), 213-227 (2012).
- Kumar, S., Singh, A., Bajpai, V., Kumar, B. Identification characterization and distribution of monoterpene indole alkaloids in Rauwolfia species by Orbitrap Velos Pro mass spectrometer. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 118, 183-194 (2016).
- Bayat, P., Lesage, D., Cole, R. B. Tutorial: Ion activation in tandem mass spectrometry using ultra-high resolution instrumentation. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 680-702 (2020).
- Wu, S. -L., et al. Mass spectrometric determination of disulfide linkages in recombinant therapeutic proteins using online LC−MS with electron-transfer dissociation. Analytical Chemistry. 81 (1), 112-122 (2009).
- Echterbille, J., Quinton, L., Gilles, N., De Pauw, E. Ion mobility mass spectrometry as a potential tool to assign disulfide bonds arrangements in peptides with multiple disulfide bridges. Analytical Chemistry. 85 (9), 4405-4413 (2013).
