Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kvantificering af globale histonposttranslationelle modifikationer ved hjælp af intranukleær flowcytometri i isoleret musehjernemikroglia

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65080
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Djavad Mowafaghian Centre for Brain Health, University of British Columbia, 2Graduate Program in Neuroscience, Djavad Mowafaghian Centre for Brain Health, University of British Columbia

Summary

Dette arbejde beskriver en protokol til kvantificering af globale histonmodifikationer ved anvendelse af intranukleær flowcytometri i isoleret hjernemikroglia. Arbejdet indeholder også microglia-isolationsprotokollen, der blev brugt til dataindsamling.

Abstract

Genekspressionskontrol sker delvist ved ændringer i kromatinstruktur, herunder tilføjelse og fjernelse af posttranslationelle modifikationer til histonhaler. Histone posttranslationelle modifikationer (HPTM'er) kan enten lette genekspression eller undertrykkelse. For eksempel neutraliserer acetylering af histonhalelysinrester den positive ladning og reducerer interaktioner mellem halen og negativt ladet DNA. Faldet i histonhale-DNA-interaktioner resulterer i øget tilgængelighed af det underliggende DNA, hvilket giver mulighed for øget transkriptionsfaktoradgang. Acetyleringsmærket fungerer også som et genkendelsessted for bromdomæneholdige transkriptionelle aktivatorer, hvilket tilsammen resulterer i forbedret genekspression. Histonmærker kan reguleres dynamisk under celledifferentiering og som reaktion på forskellige cellulære miljøer og stimuli. Mens næste generations sekventeringsmetoder er begyndt at karakterisere genomiske placeringer for individuelle histonmodifikationer, kan kun en ændring undersøges samtidigt. I betragtning af at der er hundredvis af forskellige HPTM'er, har vi udviklet et kvantitativt mål med høj gennemstrømning af globale HPTM'er, der kan bruges til at screene histonmodifikationer, inden der udføres mere omfattende genomsekventeringsmetoder. Denne protokol beskriver en flowcytometribaseret metode til påvisning af globale HPTM'er og kan udføres ved hjælp af celler i kultur eller isolerede celler fra in vivo-væv . Vi præsenterer eksempeldata fra isoleret musehjernemikroglia for at demonstrere analysens følsomhed til at detektere globale skift i HPTM'er som reaktion på en bakterieafledt immunstimulus (lipopolysaccharid). Denne protokol muliggør hurtig og kvantitativ vurdering af HPTM'er og kan anvendes på enhver transkriptionel eller epigenetisk regulator, der kan detekteres af et antistof.

Introduction

Epigenetik er studiet af de mekanismer, der regulerer genekspression uden at ændre den underliggende DNA-sekvens. Epigenetisk regulering af genekspression er dynamisk i celler og kan muliggøre hurtige og koordinerede reaktioner på forskellige miljømæssige stimuli. Den dynamiske regulering sker delvis på grund af ændringer i kromatinstrukturen på nukleosomniveauet, som består af histonproteiner (H2A, H2B, H3, H4) samlet i en oktamerkerne tæt viklet af DNA1. Interaktionerne mellem histonproteinerne og DNA'et kan kontrollere tilgængeligheden af DNA til transkriptionsmaskiner, som i sidste ende kan kontrollere genekspression og andre aspekter af kromatinbiologi2. Histonproteiner har ustrukturerede haler, som indeholder positivt ladede rester, der danner elektrostatiske interaktioner med den negativt ladede DNA-rygrad. Disse interaktioner resulterer i tæt pakning af DNA'et og reduceret DNA-tilgængelighed. Kovalente modifikationer af histonhalerne, kaldet histon posttranslationelle modifikationer (HPTM'er), kan regulere disse interaktioner 3,4. Nogle af de mest velkarakteriserede HPTM'er inkluderer histonhaleacetylering og methylering, som kan ændre affiniteten af elektrostatiske interaktioner mellem histonhalerne og DNA, hvilket resulterer i differentiel tilgængelighed til det underliggende DNA og rekruttering af transkriptionsfaktorer, der genkender disse HPTM'er på bestemte steder. HPTM'er reguleres af tre vigtige klasser af enzymer kaldet læsere - som genkender, forfattere - som deponerer og viskelædere - som fjerner HPTM'er. Således kan rekruttering eller opløsning af læser-, forfatter- eller viskelæderenzymer i sidste ende ændre landskabet for HPTM'er og styre kromatins struktur og funktion, hvilket gør deres regulering og aflæsning afgørende for forståelsen af cellulær biologi og funktion 3,4.

Cellerne i centralnervesystemet (CNS) er epigenetisk fleksible, da de ændrer deres transkriptom for at tilpasse sig miljømæssige stimuli. Akkumulerende beviser tyder på, at ændringer i epigenomet, såsom DNA-methylering, ikke-kodende RNA'er og HPTM'er, spiller en væsentlig rolle i hukommelsesdannelse og synaptisk funktion5. Forstyrrelse af HPTM-dynamik gennem manipulation af de relevante læsere, forfattere eller viskelædere kan blokere eller forbedre associativ læring og langsigtet potensering 6,7,8. Microglia, den residente immuncelle i CNS, regulerer hurtigt deres transkriptom som reaktion på immunstimulering gennem dynamiske ændringer i deres epigenom 9,10,11. Dette høje niveau af tilpasning til deres lokale hjernemiljø gør dem vanskelige at undersøge i en isoleret sammenhæng, da undersøgelser har vist, at epigenomet og transkriptomet af mikroglia ændres efter kun få timer i kulturmedier efter fjernelse fra hjernemiljøet11. Da mikroglia kun udgør 10% af hjernens celler, mangler målinger, der undersøger ændringer på hele vævsniveau, desuden følsomhed og specificitet12,13. Som følge heraf skal mikroglia hurtigt isoleres for at undersøge de epigenetiske ændringer såsom HPTM-niveauer, ex vivo.

De metoder, der almindeligvis anvendes til at undersøge HPTM'er, omfatter kromatin-immunudfældningssekventering (ChIP-seq) og spaltning under mål og tagmentationssekventering (CUT&Tag-seq)4. Selvom disse teknikker er meget specifikke for en individuel HPTM og kan informere tilstedeværelsen af HPTM'er inden for en specifik genomisk sammenhæng, kan de kun undersøge en af de mange mulige HPTM'er inden for et enkelt eksperiment11,14 Før man fortsætter med sådanne eksperimenter, som kræver en betydelig tids- og pengeinvestering, er det derfor meget værdifuldt at indsnævre listen over potentielt interessante HPTM'er til yderligere undersøgelse ved først at undersøge ændringer i globale niveauer af HPTM'er. De to vigtigste tilgange til undersøgelse af globale HPTM-niveauer er immunhistokemi og western blot-analyse, men begge tilgange er kun semikvantitative, lave gennemstrømninger og kræver et stort antal vævssektioner eller isolerede celler 15,16. Derfor sigtede vi mod at udvikle en meget følsom, kvantitativ metode, der kunne bruges til at undersøge de globale HPTM-niveauer hurtigt og på enkeltcelleniveau.

Den præsenterede protokol muliggør hurtig påvisning af globale HPTM-niveauer ved hjælp af intranukleær flowcytometri. Tidligere undersøgelser i kræftceller har retfærdiggjort vigtigheden af at undersøge globale niveauer fra et klinisk perspektiv 17,18. Det er også almindeligt, at undersøgelser bruger globale niveauer som screeningsmetode forud for vurdering af genomisk placering af specifikke HPTM'er af interesse19,20. For mikroglia er det udfordrende at vurdere globale niveauer efter isolering på grund af det lave celleudbytte; Pan et al præsenterer globale HPTM-niveauer fra isoleret mikroglia, hvor mikroglia fra tre dyr blev samlet for at muliggøre påvisning af proteinniveau ved western blot19. Ved hjælp af vores protokol er vi i stand til at registrere globale ændringer med meget lavere celleinput, hvilket muliggør screening af flere mærker pr. dyr og eliminerer behovet for at samle prøver.

Her beskriver vi en protokol til hurtig detektering af HPTM-niveauer via kvantitativ intranukleær flowcytometri i isoleret mikroglia. Mens vi fokuserer specifikt på HPTM-kvantificering for korthedens skyld, kan denne protokol bruges på samme måde til at kvantificere globale niveauer af læser-, forfatter- og viskelæderenzymer. Protokollen leveres i to dele: for det første isolationsmetoden for microglia og for det andet den flowcytometribaserede metode til bestemmelse af HPTM-niveauer. Isolationsmetoden giver celler, der kan bruges til både RNA-isolering og HPTM-niveauvurdering, hvilket muliggør evaluering af genekspression og HPTM-niveauer fra den samme prøve. Derudover kan metoden til HPTM-vurdering anvendes på andre celletyper som angivet i protokollen.

Protocol

Alle dyreplejeprotokoller blev godkendt af University of British Columbia's Animal Care Committee i overensstemmelse med Canadian Council on Animal Care retningslinjer.

1. Hjernefordøjelse til mikrogliaisolering

Figure 1
Figur 1: Simpelt rutediagram over protokollen. Musene perfuseres først transkardialt med HBSS, og hjernen dissekeres. Hjernen adskilles derefter gennem kemisk fordøjelse og mekanisk forstyrrelse for at resultere i et enkelt cellehomogenat. Den immunberigede fraktion opsamles via diskontinuerlig densitetsgradient, hvorefter cellerne farves til P2RY12. Farvede celler sorteres enten 1) via fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS) for at føre til RNA-analyse eller nedstrøms proteinanalyse og / eller 2) fast, permeabel og farvet til intranukleære proteiner. Proteinniveauet kvantificeres ved median fluorescensintensitet i interessekanalen bestemt ved flowcytometri. Kasser farvet i blåt er en del af protokoltrin 1) Hjernens fordøjelse til mikrogliaisolering. Kasser farvet i rødt er en del af protokoltrin 2) Intranukleær strømningsfarvning til proteinekspressionsanalyse. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Fremstilling af reagenser
    BEMÆRK: Hvis du planlægger en ekstraktion til indsamling af både RNA og celler til HPTM-analyse, henvises til afsnit 1.7.1 for ændringer til at omfatte transkriptions- og translationshæmmere. Dette er dog ikke nødvendigt, hvis man blot vurderer proteinsignalet, da cellerne stort set er hvilende, når de holdes på is.
    1. Fluorescensaktiveret cellesorteringsbuffer (FACS) (20 ml pr. prøve): Opløs bovint serumalbumin (BSA) i 1x Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) for at skabe en 2% BSA-opløsning. EDTA opløses til en slutkoncentration på 1 mM i 2% BSA-opløsningen. Filtersteriliser med et 0,2 μm filter og opbevar ved 4 °C i op til 1 uge før brug.
    2. Fordøjelsesbuffer (1 ml pr. prøve): Rekonstituér et hætteglas med papain i HBSS til en slutkoncentration på 20 E/ml i 1 mM L-cystein med 0,5 mM EDTA. Aktiveres ved 37 °C i mindst 10 minutter eller indtil det er klar til at fordøje væv. Lige før brug tilsættes DNase I til den aktiverede papainopløsning til en slutkoncentration på 200 E/ml. Forbered dette på eksperimentets dag og opbevar ikke.
    3. Isotonisk densitetsgradientopløsning (5,5 ml pr. prøve): Tilsæt 10x HBSS til kolddensitetsgradientmedium til en endelig koncentration på 1x HBSS, hvilket resulterer i en endelig densitet på 1,117 g / ml. Vortex blandes i mindst 30 s før brug. Anbring på is indtil brug.
    4. 37% densitetsgradientopløsning (4 ml pr. prøve): Tilføj isotonisk densitetsgradient til 1x HBSS for at opnå en endelig koncentration på 37% med en endelig densitet på 1,043 g / ml. Tilsæt 20 μL phenolrød for hver ml med 37% densitetsgradient for at lave en lyserød opløsning til visualisering under lagdeling. Vortex i mindst 30 s før brug. Anbring på is indtil brug.
    5. 70% densitetsgradientopløsning (2 ml pr. prøve): Tilsæt isotonisk densitetsgradient til 1x HBSS for at opnå en endelig koncentration på 70% med en endelig densitet på 1,082 g / ml. Tilsæt 5 μL trypanblåt for hver ml 70% densitetsmedium for at lave en blå opløsning til visualisering under lagdeling. Vortex i mindst 30 s før brug. Anbring på is indtil brug.
  2. Perfusion og hjernedissektion
    BEMÆRK: Perfusionsprotokollen ligner Posel et al., som indeholder videoskildring af musethoracotomi, transkardieperfusion og hjernefjernelse21. Her bruger vi voksne C57BL/6J han- og hunmus (10-15 uger gamle, 20-30 g), men denne protokol kan bruges til at udføre en thoracotomi for enhver mus. Alle dyreforsøg skal godkendes af den institutionelle etiske komité, inden der udføres forsøg.
    1. Musbedøvelse: Bedøv mus med 4% isofluran i 100% ilt indtil forbi operationsbedøvelsesplanet, hvilket kan bekræftes med en tåklemme eller manglende refleks ved fast klemme musens fod. Placer musen på ryggen og fastgør dens fire poter ned i det kirurgiske dissektionsbræt, der er placeret vippet i en plastikbakke, hvilket sikrer, at næsen er fastgjort i isofluorannæsekeglen. Efter overførsel skal du sikre dig, at dyret stadig er forbi anæstesiens kirurgiske plan, inden du fortsætter.
    2. Musens thoracotamy: Grib og løft mavehuden ved hjælp af tang og lav et lavt snit gennem huden og abdominalvæggen for at udsætte xyphoid uden at beskadige den nedadgående aorta eller underliggende organer.
    3. Tag fat i xyphoiden med tang og lav laterale snit under brystkassen for at udsætte membranen og leveren. Lav forsigtige overfladiske snit gennem membranen langs ribbenburets længde ved hjælp af en fin saks og gennem brystkassen ved hjælp af vævsaks og fastgør brystbenet til den kirurgiske station nær musens hoved for at udsætte hjertet og lungerne for transkardieperfusion.
    4. Transkardial perfusion: Forbered en peristaltisk perfusionspumpe, og fastgør en 26,5 G nål i den ene ende af slangen. Prim slangen til proceduren ved at indsætte den ene ende af slangen i et hætteglas med kold 1x HBSS og tænde pumpen for at fylde slangen helt med 1x HBSS.
    5. Mens du holder hjertet med stump tang, skal du indsætte spidsen af en 26,5 G nål med den vedhæftede perfusionsslange i hjertets venstre ventrikel og lave et lille snit i højre atrium. Tænd perfusionspumpen for forsigtigt at perfusere musen med en hastighed på ~ 2-4 ml / min med mindst 15-20 ml kold 1x HBSS.
      BEMÆRK: En fuldstændig perfusion er ofte indikeret, når leveren begynder at rydde blod og bliver den samme farve som hjertet.
    6. Hjernefjernelse: Halshug musen ved hjælp af vævsdissekerende saks og lav et midterlinjesnit i hovedbunden fra hals til næse. Skræl hudflapperne til siderne for at udsætte kraniet og fjern overskydende væv og knogler i den kaudale ende af kraniet med dissekerende saks.
    7. Skub forsigtigt et blad af saksen under kraniet ind i foramen magnum med den skarpe side mod knoglen og skær forsigtigt midterlinjen op mod næsen. Lav laterale snit i både bunden af kraniet og nær næsen ved hjælp af dissekering saks. Ved hjælp af fine tang lever kraniet fra midterlinjen til ydersiden for at knække kraniestykkerne af og udsætte hjernen. Løft forsigtigt hjernen med en spatel og læg den på dissektionspapir.
    8. Hjernedissektion: Placer hjernen på et stykke dissektionsblotpapir fugtet med 1x HBSS oven på en lukket petriskål fyldt med is. Fjern lillehjernen og skær hjernehalvkuglerne ved hjælp af et rent barberblad.
    9. Fjern hjernestammen, striatum og hvidt stof fra hver halvkugle, mens du holder hippocampus og overlejring cortex intakt. Overfør halvkuglerne indeholdende isoleret cortex og hippocampus væv til et 15 ml rør med 5 ml koldt 1x HBSS og hold på is.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at udføre dissektionerne så hurtigt som muligt, så vævet forbliver koldt med højst 2 min mellem halshugning og endelig placering af dissekeret væv i 1x HBSS på is. Hvis mikroglia isoleres fra flere dyr, kan hjerner opbevares på is i 1x HBSS i ~ 1 time, før man fortsætter med at behandle hele kohorten af dyr til fordøjelse osv.
  3. Hjernens fordøjelse og homogenisering
    1. Mekanisk og kemisk dissociation: Placer hjernevævet fra hver mus og 1 ml fordøjelsesbuffer i individuelle petriskåle på is. Brug et rent skalpelblad til at hugge hjernen grundigt i små stykker (<1 mm).
    2. Skær spidsen af en plastikoverførselspipette og overfør forsigtigt hver af de hakkede hjerner til separate brønde i en 24-brønds plade på is. Dæk pladen med gennemsigtig fleksibel film og inkuber på is i 30 min.
      BEMÆRK: Når det hakkes korrekt, ligner hjernevævet godt hakket hvidløg.
    3. Dounce homogenisering: Overfør fordøjet hjerneopløsning fra hver brønd til individuelle 7 ml glas dounce homogenisatorer på is, hver fyldt med 5 ml kold FACS-buffer. Dounce hver hjerne forsigtigt med den løse støder, ca. 30-40 gange, indtil der opnås en enkelt cellesuspension. Efter douncering med A-støderen drounces forsigtigt med den stramme støder (B) 3-4 gange for at sikre en enkelt cellesuspension.
      BEMÆRK: Skub ikke støderen mere end 3/4 af vejen ned for at undgå at knuse vævet i bunden af homogenisatoren. Den endelige opløsning skal være uigennemsigtig og mælkeagtig.
      BEMÆRK: Hvis du fordøjer flere hjerner i et enkelt eksperiment, skal du time overførslen af hjernefordøjelsen til FACS-buffer, så hver prøve kun er i fordøjelsesbufferen i 30 minutter. Overfordøjelse kan resultere i spaltning af overfladeproteiner, hvilket reducerer nedstrøms antistofbinding og signal.
  4. Opnåelse af immunberiget fragment
    1. Etablering af densitetsgradient: Overfør homogenatet fra hver hjerne til separate 15 ml polypropylenrør og tilsæt 2,125 ml isotonisk densitetsgradient og top til 8,5 ml med FACS-buffer for hver for at opnå en endelig koncentration på 25% densitetsgradient. Vend forsigtigt 15 ml glassene 20x for at blande grundigt.
    2. Brug en smalgradet overførselspipette til forsigtigt at lægge 4 ml med 37% densitetsgradient til hvert rør, og vær meget omhyggelig med at etablere rene lag. Skift overførselspipetter og underlæg forsigtigt 2 ml med 70% densitetsgradient (figur 2A). Overfør til en centrifuge, der er afkølet til 4 °C, og drej ved 500 x g i 20 minutter med bremserampen indstillet til nul.
    3. Opsamling af immunberiget fragment: Brug rene overførselspipetter til forsigtigt at aspirere myelinen fra toppen af volumenet i 15 ml røret ved hjælp af en ren overførselspipette og kassere. Det øverste fragment af densitetsgradienten samles forsigtigt i et rent 15 ml polypropylenrør ved hjælp af en overførselspipette.
    4. Opsaml forsigtigt det immunberigede fragment (1,5 ml over og 1,5 ml under, hvor 70% og 37% densitetsgradientlagene mødes) i et nyt 15 ml polypropylenrør (figur 2B). Der tilsættes 10 ml FACS-buffer til den immunberigede prøve for at fortynde densitetsgradientmediet og vende røret forsigtigt 20x for at blande grundigt.
      BEMÆRK: Da celler har tendens til at klæbe til siderne af røret, skal du sørge for at samle alle celler i prøven under opsamlingstrinnene ved langsomt at cirkle pipetten langs siderne af røret, mens væsken opsamles.
    5. Pellet cellerne i den immunberigede prøve ved centrifugering af 15 ml rørene i en 4 °C centrifuge ved 500 x g i 10 minutter med rampebremsen ned ad bakke indstillet til nul. Umiddelbart efter centrifugeringens afslutning fjernes supernatanten forsigtigt, og der efterlades ca. 300 μL væske i 15 ml glasset, idet man skal passe på ikke at forstyrre pellet (som muligvis ikke er synlig).
    6. Supernatanten opsamles i et andet 15 ml glas for at sikre, at cellerne blev pelleteret i centrifugeringen (denne fraktion kasseres, når celletællingerne for den resuspenderede pellet er udført). Efter resuspendering af cellepelleten i 300 μL volumen ved hjælp af en P1000-pipette tælles celler med et hæmacytometer for at estimere det samlede celleudbytte.

Figure 2
Figur 2: Opnåelse af det immunberigede fragment ved diskontinuerlig densitetsgradient. (A) Hjernehomogenatet er lavet til 25% densitetsmedium, underlag 4 ml 37% densitet medium farvet pink via phenolrød og 2 ml 70% densitet medium farvet blå via trypanblå. B) Efter centrifugering er fraktionerne blevet adskilt. Microglia hviler ved grænsefladen mellem 37% og 70% densitetsmediefragmenter. Myelinfragmentet er øverst i 15 ml røret og vil blive kasseret. Det øverste fragment samles som sikkerhedskopi, hvis spin mislykkes, og ingen celler gendannes. Hvis det sker, kan gradienten gentages ved hjælp af denne brøkdel. Den immunberigede fraktion opsamles nedstrøms. Den nederste fraktion, der indeholder eventuelle røde blodlegemer, forbliver i røret og kasseres. (C) Eksempel på figur, der viser hele lag. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Ekstracellulær antistoffarvning
    1. Blokering: Overfør celler til en rundbundet 96 brøndplade på is og centrifuger ved 500 x g med bremse for at pelletere cellerne. Supernatanten fjernes hurtigt i vasken ved at knipse med pladen for at bortskaffe supernatanten, og cellepillen forbliver intakt i bunden af brønden.
    2. Resuspender cellerne i 50 μL FACS-buffer med anti-mus CD16/32 FC-receptorblokerende reagens ved hjælp af en P200-pipette (slutkoncentration 10 μg/ml, fortyndingsfaktor 1:50) for at forhindre ikke-specifik binding af antistoffer til monocytter eller andre FcR-bærende celler. Inkuber i 10 min på is.
    3. Antistoffarvning: Forbered det passende volumen af en 2x masterblanding indeholdende P2RY12- Allophycocyanin (APC; fortyndingsfaktor 1:50, koncentration 4 μg/ml for en endelig brøndkoncentration på 1:100, koncentration 2 μg/ml) og violet 525 levende død plet (fortyndingsfaktor 1:50 for en endelig brøndkoncentration på 1:100). Der tilsættes 50 μL af farvemasterblandingen til cellesuspensionen (opnået efter blokering i punkt 1.5.1), og pladen inkuberes i 30 minutter i mørke på is.
      BEMÆRK: Til denne protokol præsenterer vi farvning af cellerne med P2RY12. For det første er P2RY12 en homeostatisk markør for mikroglia, der kan nedreguleres i visse sygdomssammenhænge. For eksempel har 5XFAD Alzheimers modelmus nedreguleret P2RY12-niveauer, hvilket kan gøre dem vanskelige at identificere22. Alternative pletter, der kan bruges til isoleringen, inkluderer Tmem119, Cd11b og CD4523. For det andet kan den konjugerede fluorochrom APC justeres, så den passer til det ønskede panel af antistoffer. Valg af en lys fluorochrom, såsom APC eller PE, vil dog bidrage til at sikre, at de positive og negative populationer let kan skelnes24.
    4. Efter farvning tilsættes 200 μL FACS-buffer direkte til hvert hul for at vaske cellerne. Der centrifugeres ved 500 x g ved 4 °C for at fjerne supernatanten ved at svirpe. Cellerne resuspenderes i 200 μL FACS-buffer med en P200-pipette, centrifugeres ved 500 x g ved 4 °C, og knipsepladen for at fjerne bufferen fra hullerne.
    5. Forberedelse af flowstyring: Før farvning adskilles nødvendige mængder celler fra hver prøve efter blokering i trin 1.5.1 for de krævede flowkontroller.
      BEMÆRK: Der kræves flowkontrol for hvert eksperiment for at etablere portene. Strømningskontrollerne kan tages fra et ekstra dyr eller fra en brøkdel af hver af forsøgsbrøndene. Ved opdeling af celler skal du sørge for at tildele nok celler pr. kontrol, da der kræves 10.000-30.000 celler pr. kontrol for at etablere porte med stor tillid.
      1. Der er tre relevante flowkontroller: ingen plet, levende død og P2RY12 isotypekontrol. For ingen pletkontrol må du ikke tilføje noget antistof. I P2RY12-isotypekontrollen behandles celler med levedygtighedsfarvestof (1:100) og et isotypekontrolantistof konjugeret til APC (1:100).
      2. For at forberede den levende døde kontrol skal alikvote celler i en separat brønd og flytte halvdelen af cellevolumenet ind i et 500 μL rør. Anbring 500 μL røret i -80 °C fryseren i 5 minutter, hvorefter det anbringes i 37 °C inkubator i 5 minutter for at dræbe cellerne. Returner alikvoten af døde celler i den levende døde kontrolbrønd og pletter med et aminbindende levedygtighedsfarvestof på violet 525 (fortyndingsfaktor 1:100) for at markere døde celler.
        BEMÆRK: Protokollen er skrevet til pladefarvning med en svipmetode til fjernelse af supernatant. Dette kræver dog, at supernatanten fjernes umiddelbart efter, at centrifugeringen er afsluttet, og svirpet skal udføres med tilstrækkelig kraft til hurtigt at fjerne supernatanten uden at forstyrre pelletten. Alternativt kan 1,5 ml RNAse/DNase-frie rør anvendes til farvningen med følgende modifikationer: Overfør celler til 1,5 ml mikrocentrifugerør og pellet ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C. Aspirat supernatant med pipetter. Tip: For hastighed kan en 5 ml overførselspipette med en P200-spids hurtigt og præcist opsuge supernatanten. Når du aspirerer, skal du kontrollere pillen. Hvis pellet ikke er synligt, efterlades 50 μL supernatant, og beregningerne justeres i overensstemmelse hermed. Ved afvaskning af antistoffer tilsættes yderligere FACS for at øge fortyndingen af antistoffer (1000 μl i stedet for 200 μl) for at tage højde for ufuldstændig fjernelse af supernatant. Afhængigt af cytometeret skal du bruge 1,5 ml rør til sortering, hvilket reducerer mængden af nødvendige forsyninger.
  2. FACS-sortering til microglia
    1. Forberedelse: Hvert hul resuspenderes i 200 μL FACS-buffer med en P200-pipette og overføres til mærkede flowsorteringsrør, og der tilsættes FACS-buffer til i alt 500 μL i en koncentration på ca. 5 x 105 hændelser pr. ml. Opbevares på is i mørke indtil analyse. Forbered postsorteringsrør ved at tilføje 100 μL FACS-buffer som pude til celler i 1,5 ml RNAse-frie rør.
    2. Cytometerindstillinger: Sorter celler på en flowcytometricellesorterer, der er oprettet med 100 μm dysen. Sorter celler ved hjælp af 18-20 psi.
    3. Gating: På cytometeret, gate for cellestørrelse ved hjælp af side-scatter (SSC) område versus fremad scatter (FSC) højde ved hjælp af ingen pletkontrol for at hjælpe med at skelne snavs, sæt SSC-A på en logakse for at visualisere en cellepopulation og gate tæt for at vælge for celler (gate S1; Figur 3). For at fjerne eventuelle dubletter skal du plotte FSC-H vs FSC-W og gate tæt omkring cellepopulationen og fjerne snavs og dubletter (gate S2). Brug P2RY12-isotypekontrollen til at undersøge cellerne i APC-kanalen og indstille porten til autofluorescens for at bestemme P2RY12+ celler. Ved hjælp af ingen plet og levende døde kontroller, gate for de celler, der ikke er fluorescerende på violet 525 nm som levende celler.
    4. Sortering: Plot violet 525 nm vs APC og bestem populationen, der er P2RY12+ og lever af FMO'er (MG). Sorter disse celler i det mærkede postsorteringsrør (figur 3). Den endelige sorteringsprocent er ca. 50% af de samlede hændelser, hvor størstedelen af begivenhedens samlede tab er affald, der fjernes i gate S1 (~ 70% af begivenhederne er celler; Tabel 1).
  3. RNA-isolering og analyse
    1. Transskriptions- og translationshæmmere: Hvis man planlægger RNA-ekstraktion, for at eliminere risikoen for isolationsassocierede transkriptomiske signaturer, skal man inkludere hæmmere af translation og transkription i buffertrinnene. Forbered inhibitorcocktailen som beskrevet af Marsh et al., herunder actinomycin D, anisomycin og triptolid25.
      1. Inhibitorpræparat: Rekonstituer inhibitorstammerne og opbevar dem på følgende måde: Actinomycin D rekonstitueres i dimethylsulfoxid (DMSO) til 5 mg/ml og opbevares ved -20 °C. Triptolid rekonstitueres i DMSO til 10 mM og opbevares ved -20 °C, beskyttet mod lys. Anisomycin rekonstitueres i DMSO til 10 mg/ml og opbevares ved 4 °C, beskyttet mod lys. Opbevar alle inhibitorlagre i højst 1 måned efter rekonstitution.
      2. Buffermodifikationer: Tilføj inhibitorer i fire forskellige buffere i protokollen som følger: Når transkardieperfusionen udføres, fremstilles HBSS med actinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 fra lager) og triptolid (10 μM, 1:1000 fra lager). Efter perfusion transporteres hjerner til laboratoriet i HBSS indeholdende actinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 fra lager), triptolid (10 μM, 1:1000 fra lager) og anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 fra lager). Forbered FACS-buffer med actinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 fra lager), triptolid (10 μM, 1:1000 fra lager) og anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 fra lager). Forbered fordøjelsesbufferen med actinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 fra lager), triptolid (10 μM, 1:1000 fra lager) og anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 fra lager). Forbered buffer til eftersortering med HBSS indeholdende actinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 fra lager), triptolid (10 μM, 1:1000 fra lager) og anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 fra lager).
        BEMÆRK: Når du tilføjer hæmmerne, skal du sørge for at tilføje dem umiddelbart før brug og beskytte eventuelle forberedte buffere mod lys, mens de er i brug. Undgå fryseoptøning af stamopløsninger.
    2. Eftersorteringsvask: Fordi cellerne er blevet sorteret i 1,5 ml RNase-frie rør i FACS-buffer, hvilket vil forstyrre RNA-isolering, er det nødvendigt at vaske cellerne. Centrifuger cellerne ved 1000 x g ved 4 °C i 5 minutter, og fjern supernatanten, så der er ca. 50 μl væske tilbage.
    3. Der tilsættes 200 μL 1x HBSS indeholdende actinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 fra lager), triptolid (10 μM, 1:1000 fra lager) og anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 fra lager) og blandes grundigt. Centrifugeringen gentages, og supernatanten fjernes, så der efterlades 50 μl væske (vask 1). Der tilsættes 200 μL buffer til eftersortering, blandes grundigt, centrifugeringen gentages, og supernatanten fjernes, så der efterlades 25 μl væske (vask 2).
    4. RNA-ekstraktion: Til RNA-isolering fra mikrogliaceller skal du bruge et RNA-isolationssæt med lavt input til høje og konsistente RNA-udbytter og RIN-score over 9 (se nedenfor og materialetabel for produktanbefalinger). Til cellepillen tilsættes 350 μL lysisbuffer fra anbefalet kit + β-mercaptoethanol (1:100) og blandes godt.
      BEMÆRK: Om nødvendigt kan protokollen suspenderes på dette tidspunkt. Prøver kan opbevares i lysisbufferen i -80 °C indtil RNA-ekstraktion. Hvis RNA ekstraheres efter opbevaring, optø lysatet på is og fortsæt med de kitspecifikke instruktioner til isoleringen.
    5. Overfør lysat til kolonnebaseret cellemakulator (se materialetabellen for produktanbefalinger) og centrifuger ved maksimal hastighed ved 4 °C i 2 min. Eluer i mindst 14 μL RNasefrit vand og bestemmer koncentrationen efter behov. RNA kan bruges til enhver downstream-applikation efter dette punkt.

Figure 3
Figur 3: Gating strategi for flow sortering. Hændelser er lukket for cellestørrelse på SSC-A vs FSC-H (S1). Derefter lukkes celler til at være singlets på FSC-H vs FSC-W (S2). Singlet-celler sorteres som levende, hvis de er negative på Comp-FL8-A::405-526-52 (violet 525 levende døde pletter) og som P2RY12+, hvis de er positive på Comp-FL32-A::640-671_30 (P2RY12-APC) ved hjælp af P2RY12-isotype-kontrollen. Celler mærkes som MG og sorteres, hvis de både er levende og P2RY12+. Klik her for at se en større version af denne figur.

GATED POPULATION Hyppighed af forælder Hyppighed af total Tælle
S1 68.10% 68.10% 162186
S2>S1 93.59% 63.70% 151707
P2Ry12+ (670+) > S2 > S1 83.05% 52.90% 125986
Live (525-) > S2 > S1 92.78% 59.10% 140752
MG (P2RY12+ Live) >S2>S1 78.96% 50.30% 119794

Tabel 1: Eksempel på eksempelafstamningstabel med gatingprocenter og forventede hændelsesnumre.

2. Intranuklear strømningsfarvning til proteinekspressionsanalyse

BEMÆRK: Andre celletyper kan startes på dette tidspunkt, denne protokol testes med dyrkede celler, herunder HEK293-celler, BV2-mikroglialignende celler og human IPSC-afledt mikroglia.

  1. Fastgørelse og farvning af celler
    BEMÆRK: For følgende protokol skal du bruge et intracellulært farvningssæt, der er optimeret til nuklear farvning. Se Tabel over materialer for produktanbefalinger.
    1. Alikvote ekstracellulært farvede celler fra punkt 1.5.2 til 96 brøndplade (5 x 104-1 x 106 celler). Spin celler i 5 minutter ved 500 x g ved 4 °C og svip for at fjerne FACS-buffer.
      BEMÆRK: For at opnå data med høj sikkerhed for medianniveauer skal der anvendes mindst 10.000 celler pr. Brønd. Selvom der ikke er noget anbefalet maksimum, er det bedst at holde antallet af celler konsistent gennem hele eksperimentet for at sikre, at der ikke er nogen signifikant effekt af forskellige variationskoefficienter (CV).
    2. Fiksering og permeabilisering: Tilsæt 200 μL 1x fikseringskoncentrat og bland forsigtigt med P200-pipette for at resuspendere celler. Inkuber i mørke i 45-60 min. Centrifuger pladen i 5 minutter ved 500 x g ved stuetemperatur (RT) og svip for at kassere supernatanten.
      BEMÆRK: Om nødvendigt kan protokollen suspenderes på dette tidspunkt. Efter kassering af supernatanten genopslæmmes cellerne i langtidsopbevaringsbufferen for immunceller (produktanbefalinger findes i materialetabellen ). Prøverne kan opbevares ved 4 °C i 12-18 timer, beskyttes mod lys og dækkes af gennemsigtig film for at beskytte bufferfordampningen.
    3. Der tilsættes 200 μL 1x permeabiliseringsbuffer til hvert hul og pipetteres med en P200 for at blande. Centrifuger pladen i 5 minutter ved 500 x g ved RT og svip for at kassere supernatanten. Gentag permeabiliseringsbuffervask i alt 3x.
    4. Forberedelse af flowstyring: Opdelt volumen af celler fra hver prøve til de krævede flowkontroller (10.000-30.000 celler pr. kontrolbrønd er tilstrækkelig).
      1. For at forberede ingen pletkontrol skal du fastgøre ingen pletceller fra sorteringen eller alikvote ufarvede celler i en separat brønd, der ikke modtager noget antistof.
      2. For at forberede fluorescensen minus en (FMO) kontrol, alikvote celler for hvert af antistofferne på panelet undtagen det i den kanal.
      3. For de relevante kanaler skal isotypekontrolantistoffet medtages i FMO'en til gating. For eksempel skal der i et panel, der indeholder P2RY12-APC og H3K27Ac-AlexaFluor568 - være to FMOS: (1) APC-FMO, som kun indeholder H3K27Ac-AlexaFluor568 og P2RY12 isotypekontrolantistoffet og (2) 568-FMO, som kun indeholder P2RY12-APC og isotypekontrollen primær og 568 sekundær.
        BEMÆRK: Denne protokol præsenteres for at teste en enkelt HPTM, men der kan etableres paneler, der indeholder mange HPTM'er konjugeret til forskellige fluoroforer.
    5. Primær antistoffarvning: Tilsæt 50 μL 1x permeabiliseringsbuffer med den passende koncentration af primært antistof til hvert hul. Inkuber i 30 minutter ved RT i mørke. Vask 2x med 200 μL 1x permeabiliseringsbuffer.
      BEMÆRK: Koncentrationen af antistoffer, der anvendes til hver HPTM, er inkluderet i materialetabellen. Koncentrationen bestemmes ved at teste forskellige koncentrationer af antistofferne på dyrkede celler behandlet med et stimulerende middel, der ville forårsage en dramatisk stigning, f.eks. en HDAC-hæmmer for acetyleringsmærker og sikre, at både ubehandlede og behandlede celler var godt inden for detektionsområdet (over isotypekontrollen og under cytometerets maksimale detektionsområde). Den optimale antistofkoncentration for HPTM'er bør have en gennemsnitlig median fluorescerende intensitet i fluoroforkanalen mellem 5 x 104 og 1 x 105.
    6. Sekundær antistoffarvning: Bloker med 200 μL 1x permeabiliseringsbuffer med 2% normalt æselserum (NDS) i 10 minutter ved RT. Spin i 5 minutter ved 500 x g ved RT og svip for at fjerne supernatant.
    7. Der tilsættes 50 μL 1x permeabiliseringsbuffer med 2% NDS og den passende koncentration af sekundært antistof og inkuberes i 30 minutter ved RT i mørke. Der tilsættes 200 μL 1x permeabiliseringsbuffer til hullerne for at fortynde, pladen centrifugeres i 5 minutter ved 500 x g ved RT, og svirp for at kassere supernatanten. Vask celler 2x med 200 μL 1x permeabiliseringsbuffer.
      BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, suspender protokollen på dette tidspunkt. Resuspender celler i 200 μL langtidsopbevaringsbuffer til immunceller med P200-pipette (se materialetabel for anbefalinger) og opbevares ved 4 °C i 12-24 timer beskyttet mod lys.
    8. Forberedelse til flowcytometri: Centrifuger pladen i 5 minutter ved 500 x g ved RT og svip for at kassere supernatanten. Resuspender celler i 200 μL FACS-buffer ved hjælp af en P200-pipette til flowcytometri. Forsegl med gennemsigtig film til transport til cytometeret.
  2. Flow cytometri
    1. For at analysere det foreslåede antistofpanel skal du sikre dig, at cytometeret er udstyret med mindst fire lasere, herunder violet (405 nm), blå (488 nm), gul (561 nm) og rød (633 nm). Cytometeret har brug for filtre til at detektere FITC (blå-525 nm), KRO (violet-525 nm), PE (gul-585 nm) og APC (rød-660 nm). Tilsæt yderligere antistoffer afhængigt af det valgte cytometer.
    2. Kalibrering og standardisering: I starten af hvert eksperiment skal du køre regnbuefluorescerende perler og justere fotomultiplikatorrørets (PMT) spænding, indtil perletoppene er sammenlignelige med de målværdier, der blev kørt for tidligere eksperimenter. Denne standardiseringsmetode giver mulighed for indkvartering af udstyr, der driver over tid.
    3. Kompensation: Når PMT-spændingen og forstærkningen er indstillet til eksperimentet, skal du bruge antistoffangede kompensationsperler til at etablere kompensationsmatrixen for panelet af antistoffer. Denne beregning sikrer, at fluoroforerne ikke bidrager til signalændringer i andre kanaler. Dette er i stigende grad nødvendigt ved multiplexing af flere antistoffer.
    4. Størrelsesgating: I et prikplot skal du plotte SSC-A på log vs FSC-H på lineær. Gate ud snavs og vælg for cellestørrelse ved hjælp af S1 gate. Vælg for singlet-celler i et prikplot af FSC-W vs FSC-H og gate som S2. (Figur 4).
    5. Etablering af fluoroforporte: Brug den relevante FMO for hver fluoroforkanal til at etablere portene for at bestemme, hvad der er et positivt signal i hver kanal ved hjælp af enkeltparameterhistogrammer (figur 4).
    6. Måling af prøverne: Optag omhyggeligt prøverne ved hjælp af den etablerede gating-strategi. Identificer mikroglia ved hjælp af P2RY12+ signal, bestem kun ekspressionen af proteinet i de respektive kanaler for mikroglia.
  3. Analyse af flowcytometridata
    1. Etablering af analyseporte: Brug ovenstående trin til cytometeret på analysesoftwarens brugergrænseflade til at bruge de samme porte, der bruges til optagelse til analyse.
    2. Få MFI-værdier ved hjælp af flowcytometrianalysesoftware (se materialetabel for anbefalinger): Rekapituler cytometergatingstrategien til flowanalyse. Brug funktionen Tilføj statistik til at vælge median for den relevante population (f.eks. 568+) på den kompenserede kanalhøjde. Brug tabeleditoren til at eksportere medianfluorescerende intensitetsværdier (MFI) for de respektive kanaler til et regneark for at fortsætte med statistisk analyse (tabel 2).
      BEMÆRK: Supplerende fil S1 indeholder eksempeldata fra lipopolysaccharid (LPS) og fosfatbufferet saltvand (PBS) injicerede mus og en eksempelanalysefil med gating-strategien og MFI-værdierne.
    3. Analyse af MFI-værdier til proteinfoldændring: Efter opnåelse af MFI-værdierne beregnes foldændringen af MFI'en i forhold til den kontrollerede eller ubehandlede population (ligning 1). MFI-foldændringen afspejler foldændringen i proteinniveauer. Brug foldændringsværdierne til at vurdere ændringen i udtryk og beregne den statistiske signifikans ved hjælp af en t-test eller ANOVA.
      Equation 1Ligning 1

Figure 4
Figur 4: Gating strategi for protein MFI vurdering. Hændelser lukkes først for cellestørrelse på SSC-A vs FSC-H (S1). Cellerne lukkes derefter for singlets på FSC-H vs FSC-W (S2). Singletceller identificeres derefter som microglia ved P2RY12-APC-signal (APC +) med porten etableret baseret på fluorescens i en APC-FMO-kontrol, der indeholder et isotypekontrolantistof. Celler lukkes derefter for H3K27Ac-AlexaFluor568-signal på Comp-FL5-A::Y610-mCherry. Den fluorescerende intensitet af de 610+ celler bestemmes som en proxy for proteinekspression. Klik her for at se en større version af denne figur.

Representative Results

Voksne mus blev transkardialt perfunderet og ofret til mikrogliaisolering. Microglia blev isoleret på is og farvet med P2RY12-APC og violette 525 levende døde antistoffer. Celler, der blev bestemt til at være positive for P2RY12 og negative for violet 525 levende døde pletter, blev sorteret som levende mikroglia. Det gennemsnitlige udbytte af mikroglia fra en dissekeret musehjerne var 1,28 x 105 ± 0,05 (gennemsnit ± standardfejl af middelværdi (SEM), N = 100). Der er ingen forskel i udbyttet af microglia fra hunmus (1,25 x 105 ± 0,09 [gennemsnit ± SEM, N=46]) og hanmus (1,32 x 105 ± 0,07 [gennemsnit ± SEM, N=54]) mus (t(98)=0,6365, p=0,526). Ved isolering fra specifikke hjerneområder er det gennemsnitlige udbytte af mikroglia fra musekortiker 8,3 x 104 ± 0,08 (gennemsnit ± SEM, N = 15) og fra musehippocampus er 4,1 x 104 ± 0,02 (gennemsnit ± SEM, N = 16). Som forventet er der en signifikant forskel i udbyttet af mikroglia fra hvert hjerneområde (F(2, 128)=25,25, P<0,0001). Efter mikroglia-isolering blev RNA ekstraheret fra de isolerede celler ved hjælp af et RNA-isolationssæt med lavt input. Konsekvent var RNA-integritetsscoren (RIN) over 9,0 (9,62 ± 0,05), og det gennemsnitlige udbytte af RNA pr. celle var 0,25 ± 0,01 pg (gennemsnit ± SEM, N = 32; Supplerende fil S2).

Voksne mus blev intraperitonealt injiceret med 1 mg/kg lipopolysaccharid (LPS) 24 timer før ofring. Musene blev transkardialt perfunderet med HBSS og mikroglia isoleret fra hele hjernen i henhold til den beskrevne protokol (figur 5A). For hver plet blev 20.000-30.000 celler allokeret til hvert panel af antistoffer. De globale niveauer af histon 3 lysin 27 acetylering (H3K27Ac) blev vurderet i isoleret mikroglia via flowcytometri. For han- og hunmus inducerede LPS-behandling stigning i H3K27Ac, når MFI'en normaliseres inden for køn (t (6) = 9,676, p<0,0001; Figur 5B). Når histogrammerne for de farvede celler undersøges, forbliver populationerne normalt fordelt med lignende variation; cellerne er imidlertid skiftet til øget fluorescens, hvilket resulterer i stigningen i MFI (figur 5C). Ved undersøgelse af H3K9Ac i samme behandling er der en lignende stigning i H3K9Ac (t (6) = 7,299, p = 0,0003; Figur 5D, E) foldændringen af LPS i forhold til PBS af H3K9Ac signal er imidlertid mindre end H3K27Ac signal.

Figure 5
Figur 5: Globale ændringer i histonacetylering i isoleret mikroglia. (A) Mus injiceres intraperitonealt med fosfatbufret saltvand (PBS) eller 1 mg/kg lipopolysaccharid (LPS) 24 timer før ofring. Mikroglia opsamles fra den immunberigede fraktion og fastgøres til flowcytometri og global histon post translationel modifikationsvurdering. Den mediane fluorescerende intensitet vurderes som en proxy for proteinekspression. Oprettet med BioRender.com. (B) De globale niveauer af H3K27Ac steg som reaktion på LPS-behandling. Fold ændring til PBS normaliseret inden for eksperiment og køn. Uparret tohalet t-test, t(6)=9,676, p<0,0001. Søjlediagram viser gennemsnittet ± SEM. N=8 dyr; 2 pr. betingelse i 2 uafhængige forsøg. (C) Eksempel på histogrammer, der viser forskydning af H3K27Ac fluorescerende intensitet. Modal viser histogrammer fra PBS-injicerede versus LPS-injicerede mus. (D) Eksempel på histogrammer, der viser forskydning af H3K9Ac fluorescerende intensitet. Modal viser histogrammer fra PBS-injicerede versus LPS-injicerede mus. (E) De globale niveauer af H3K9Ac steg som reaktion på LPS-behandling. Fold ændring til PBS normaliseret inden for eksperiment og køn. Uparret tohalet t-test, t(6)=7,299, p=0,0003. Søjlediagram viser gennemsnittet ± SEM. N=8 dyr; 2 pr. betingelse i 2 uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af denne figur.

For at bekræfte, at den beskrevne metode var sammenlignelig med andre tidligere anvendte metoder til kvantificering af global histonmodifikation, sigtede vi mod at bruge immunoblot som et komparativt værktøj. Imidlertid er udbyttet fra den isolerede mikroglia simpelthen for lavt til at muliggøre en rimelig vurdering. Derfor brugte vi dyrkede BV2-celler til at sammenligne den intracellulære flowcytometrimetode med en Western blot (WB). BV2-celler blev dyrket i komplette medier (DMEMF12, 10% FBS, 1x penicillin / streptamycin og 1x L-glutamin) ved 37 ° C, 5% CO2. Celler blev passeret med 0,25% trypsin-EDTA og belagt med en densitet på 250.000 celler / brønd og behandlet i reducerede serummedier (DMEM F12, 2% FBS, 1x penicillin / streptamycin og 1x L-glutamin) og fik lov til at komme sig i 12 timer ved 37 ° C, 5% CO2. Celler blev behandlet med 25 ng/ml LPS i 24 timer før fiksering som beskrevet ovenfor eller lysis med en WB-lysisbuffer. Signal af H3K27Ac blev udført ved begge metoder med GAPDH anvendt som belastningskontrol for WB. Analyse af den normaliserede fluorescerende intensitet sammenlignet med PBS-kontrollen blev bestemt for hver gruppe (figur 6A). Ved undersøgelse af ændringen i normaliseret H3K27Ac-signal af WB var der en 1,527 gange stigning i LPS-behandlet tilstand i forhold tilH2O-kontrollen, som blev bestemt til at være signifikant ved uparret t-test (t = 3,024, df = 5; p = 0,0293). Ved undersøgelse af ændringen ved hjælp af flowcytometri var der en 1,482 gange stigning i den LPS-behandlede tilstand, som blev bestemt til at være signifikant (t = 7,843, df = 10; p<0,0001). Ved hjælp af en 2-vejs ANOVA til sammenligning af metoderne blev der bestemt til at være en signifikant effekt af behandlingen (F(1,15)=45,21,p<0,0001), men ikke metoden (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) eller interaktion (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Derudover verificerer vi her, at der ikke er nogen ændring i histon H3-niveauer ved både Western blot og flowcytometri, da 2-vejs ANOVA ikke afslørede nogen signifikant effekt af LPS-behandlingen (F(1,7)=0,02170,p=0,8870), metoden (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) eller interaktionen (F(1,7=0,01191, p=0,9162; Figur 6B). Eksempler på blots og histogramskift for disse data vises også (figur 6C, D).

Figure 6
Figur 6: Metodesammenligning til kvantificering af global histonmodifikationsændring mellem flowcytometri og western blot. (A) BV2-celler behandles med 25 ng/ml lipopolysaccharid (LPS) ellerH2Oi 24 timer før analyse. Den fluorescerende intensitet af H3K27Ac er afbildet som foldændring til køretøjets kontrol, fosfatbufret saltvand (PBS), for både flowcytometri og western blot. 2-vejs ANOVA afslørede signifikant effekt af LPS-behandlingen (F(1,15)=45,21, p<0,0001), men ikke metoden (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) eller interaktion (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Tukeys korrektion for multiple hypotesetest blev anvendt for resterne. * præsenterer 0,0332, ** præsenterer 0,0021. (B) Den fluorescerende intensitet for histon H3 er afbildet som foldændring til PBS for både flowcytometri og western blot. 2-vejs ANOVA afslørede ingen signifikant effekt af LPS-behandlingen (F(1,7)=0,02170, p=0,8870) eller metoden (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) eller interaktionen (F(1,7=0,01191, p=0,9162). (C) Eksempler på blots og (D) flowcytometriskift er portrætteret. Histogramstørrelsen normaliseres til procent baseret på antallet af celler, der er til stede i tilstanden fluorescerende intensitet. Søjlediagram viser den gennemsnitlige SEM. n = 2 uafhængige eksperimenter, 2 pr. betingelse pr. eksperiment. Klik her for at se en større version af denne figur.

Alt i alt viser disse resultater, at denne teknik kan bruges til kvantitativt at vurdere de globale HPTM-niveauer i isolerede mikroglia. Desuden viste metoden sig at være sammenlignelig med tidligere teknikker, men krævede meget lavere celleinput. Derudover, selvom den ikke er vist, med korrekt kompensation, kan den nuværende teknik anvendes med flere antistoffer på det samme panel, der vurderer forskellige HPTM'er.

Supplerende fil S1: Eksempel på analysefiler. Denne fil indeholder en wsp analyse fil og 7 fcs filer, herunder ingen plet, P2RY12FMO, 568FMO, to PBS behandlede dyr og to LPS behandlede dyr farvet med H3K27Ac. Formålet med denne fil er at demonstrere analysen og gatingen på et eksperiment, der kunne skildre, hvordan et vellykket eksperiment så ud. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil S2: Isolationsdata. Den inkluderede fil indeholder de relevante data efter microglia-sortering, som indeholder mikroglia- og RNA-udbyttet fra den beskrevne protokol. Klik her for at downloade denne fil.

GATED POPULATION Hyppighed af forælder Hyppighed af total Tælle
S1 89.00% 89.00% 25672
S2>S1 88.73% 78.97% 22779
APC+ > S2 > S1 76.61% 60.50% 17452
610+ > APC+ > S2 > S1 99.56% 60.24% 17376

Tabel 2: Eksempel på prøveafstamningsdiagram viser procentdel og hændelsestal, der kræves til nøjagtig proteindetektion.

Discussion

Den præsenterede protokol muliggør kvantitativ vurdering af globale HPTM-niveauer gennem flowcytometri. Mens denne protokol præsenterer en ny metode, har tidligere undersøgelser foretaget kvantitativ vurdering af proteiner ved hjælp af en lignende tilgang26. Tidligere metoder, der anvendes til at vurdere globale niveauer af HPTM'er, omfatter immunhistokemi og western blot 16,17,19,20. Den fremlagte flowcytometribaserede metode er en let kvantificerbar metode, mens western blot og immunhistokemi er semikvantitative og har lavere gennemstrømning. Western blot er afhængig af cellelyse og kræver således både proteinnormalisering og et belastningskontrolprotein, der antages at være uændret ved den eksperimentelle tilstand27. Immunhistokemi er semikvantitativ og meget lav gennemstrømning, da det er vanskeligt kvantitativt at vurdere mængden af protein uden at undersøge på et enkelt celleniveau16. På samme måde er der for den isolerede mikroglia en fordel ved at bruge flowcytometrimetoden på grund af det begrænsede udbytte, da western blot kræver meget større proteininput19. De lave cellenummerkrav gør det muligt at køre flere farvningspaneler fra det samme dyr.

Som med enhver anden metode er der imidlertid begrænsninger for denne teknik, herunder antistofomkostninger og tilgængelighed, da ikke alle antistoffer fungerer godt i en flowcytometriindstilling. Derudover er koncentrationen af det krævede antistof sammenlignet med immunoblot meget højere. Mens multiplexing gør det muligt at anvende flere antistoffer på det samme panel af celler, kan celler ikke fjernes fra antistoffet efter analyse, hvilket begrænser celleforbruget til en pr. Antistofart. Dette adskiller sig fra immunoblot, hvor den samme plet kan anvendes gentagne gange. Afhængigt af tilgængeligheden af antistoffer og antallet af detektionskanaler på et cytometer ville det imidlertid være muligt at undersøge op til et dusin mærker samtidigt.

Den nuværende metode fanger kun globale niveauer af proteinekspression og ikke den specifikke genomiske placering, og ændringer i globale niveauer afspejler muligvis ikke ændringer på individuelle genomiske loci. På samme måde betyder manglende ændring i globale niveauer muligvis ikke, at ingen genomiske loci undergår ændringer, blot at de globale ændringer summerer til ingen forskelle mellem behandlinger. Som sådan er denne teknik beregnet til at blive brugt som en skærm til at identificere HPTM'er af interesse for genomisk analyse. Desuden giver denne metode ikke mulighed for sammenligning på tværs af forskellige proteinmærker, undtagen når den vurderes som en foldændring til kontrol. Derfor er dette begrænset sammenlignet med en standardkurvebaseret metode som ELISA til proteinbestemmelse.

Den præsenterede protokol tilbyder en strategi til isolering af levende hjernemikroglia. Denne protokol er afhængig af P2RY12-proteinekspression til mikrogliaisolering. P2RY12 er imidlertid en homeostatisk markør i mikroglia og kan nedreguleres i sygdomsmodeller, såsom 5XFAD22. Når du bruger et sygdomsmodeldyr, skal du derfor sørge for at vælge andre markørproteiner såsom TMEM119, CD11b eller CD45 for at hjælpe med isolering af microglia23. På samme måde præsenterer vi denne protokol som isolering fra hippocampus og / eller cortex. Denne protokol ville arbejde for at isolere mikroglia fra andre hjerneområder, herunder hvide substansområder, men flere dyr kan være nødvendige for at få nok mikroglia afhængigt af størrelsen af de interessante regioner.

Den præsenterede protokol kan robust isolere levende hjernemikroglia, men der er flere trin, beskrevet nedenfor, i isolationsfasen, der kan reducere celleudbyttet, hvis det udføres forkert.

Perfusioner for denne protokol resulterer i en højere procentdel af mikroglia i det immunberigede fragment, hvilket vil reducere mængden af tid ved sorteringen. Perfusion er dog ikke påkrævet, og andre metoder til eutanasi kan anvendes, hvis det kræves.

Under mikrogliaisolering skal myelin fjernes fuldstændigt. Flowcytometre er afhængige af, at celler er i stand til at rejse gennem smalle slanger i et hurtigt tempo. På grund af sin viskositet og tendens til klumpning forårsager myelin problemer med cytometre, hvilket ofte forårsager tilstopninger, som både kan beskadige udstyret og ødelægge prøven, hvilket reducerer udbyttet drastisk. Vær forsigtig med at fjerne al myelin under indsamling af immunberigede fragmenter for at undgå problemer nedstrøms.

Pladefarvning versus rørfarvning: I denne protokol beskrev vi to muligheder for farvning af celler i enten 1,5 ml rør eller en 96 brøndplade. Brugssagen for hver afhænger af eksperimentet; Generelt er rørfarvning dog lavere risiko for at påvirke udbyttet end pladefarvning, da svirp risikerer tab af celler, hvis det gøres forkert. Pladefarvning er meget hurtigere, da det er tidskrævende at opsuge supernatanten for hvert rør. Før fiksering (til sortering osv.) Brug rørfarvning for at maksimere udbyttet og reducere risikoen for tab. Til HPTM-analyse, når cellerne er fastgjort til intranuklear farvning, er pelleten imidlertid mere stabil, og der er reduceret risiko for tab ved svipning.

Etablering af den diskontinuerlige densitetsgradient: Ved etablering af lagdelingen er det vigtigt at opsætte lagene korrekt for at opnå den immunberigede fraktion. Hvis lagene forstyrres eller blandes og virker uklare, vil cellerne ikke sortere til deres ønskede placering, og der vil være vanskeligheder med at opnå den immunberigede cellefraktion. Hvis dette sker, centrifugeres med densitetsmediet for at fjerne myelin og derefter samle alle de resterende fraktioner, fortyndes med 3 ml FACS-buffer til 1 ml densitetsmedium og blandes godt (dette kræver flere rør). Drej ved 500 x g i 10 min med bremsen på 0. Supernatanten kasseres, og der er kun ~300 μL opløsning tilbage. Saml hele prøven og pletten. Dette vil give reducerede sorteringsprocenter og en højere mængde tid brugt ved cytometeret, men udbyttet kan stadig være sammenligneligt.

Ved anvendelse af isolationsmetoden er det fordelagtigt at kunne indsamle celler til RNA og til HPTM-evaluering fra samme musehjerne. I denne situation kan celler efter sortering af den levende mikroglia opdeles for at allokere en del til RNA-evaluering (minimum inputantal celler for at opnå et anstændigt RNA-udbytte er 75.000 celler) og en del til yderligere flowcytometrianalyse (minimum 10.000 celler pr. Brønd for god bestemmelse af MFI). I dette tilfælde kræves flowcytometersortering. Men når man kun planlægger at bruge cellerne til HPTM-analyse, er sortering ikke påkrævet, og immunfraktionen kan farves med P2RY12-antistoffet og HPTM-antistoffet. Gating på cytometeret kan derefter indstilles til P2RY12+ microglia, som det ville blive gjort for flowsortering, for kun at analysere HPTM-signal inden for microglia. Eliminering af sorteringen gør det muligt for protokollen at være hurtigere og mere omkostningseffektiv. Hvis HPTM'er evalueres fra dyrkede celler, er det desuden tilstrækkeligt at starte ved farvningsprotokollen, og der kræves ingen cellemarkørantistoffer som vist i figur 6. HPTM-evalueringsprotokollen kan bruges til mange celletyper, herunder dyrkede, primære og IPSC-afledte celler.

Endelig, mens vi kun har præsenteret to potentielle anvendelser af mikroglia nedstrøms for isolation, er der mange andre, herunder epigenetiske teknikker som ChIP, CUT & Tag og CUT &RUN. I tilfælde af genomiske epigenetiske teknikker, hvor karakterisering af ændringer på specifikke loci er af interesse, skal du vælge specifikke hæmmere til forfattere og viskelædere af kromatinmærker11 , der er skræddersyet til eksperimenterne for at sikre, at eventuelle mikrogliale epigenetiske modifikationer, der er profileret, ikke er tekniske artefakter fra nogen trin i isolationsproceduren, såsom enzymatisk fordøjelse. Ved vurdering af ændringer i globale niveauer af epigenetiske mærker, såsom ved anvendelse af kvantitativ flowcytometri, forventes eventuelle procedureinducerede ændringer ikke at være så store, at de detekteres på globalt plan.

Samlet set giver de diskuterede metoder en ny, enkeltcellemetode til kvantificering af globale niveauer af histonmodifikationer og andre epigenetiske ændringer ved flowcytometri. Vi demonstrerede, at denne metode er tilstrækkelig følsom til at detektere globale ændringer i forstærkermarkøren H3K27ac i mikroglia som reaktion på LPS in vivo. Dette er i overensstemmelse med tidligere ChIP-sekventering af H3K27ac efter LPS-stimulering, der viser dramatisk ombygning af forstærkere, der reagerer på LPS28. Anvendelse af denne metode vil muliggøre undersøgelse af globale epigenetiske ændringer på tværs af forskellige hjernecelletyper i udvikling og sygdom.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Tak til Yanyang Bai for at hjælpe med immunoblottet i figur 5. Dette arbejde blev støttet af Canadian Institutes for Health Research [CRC-RS 950-232402 til AC]; Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 til AC]; Scottish Rite Charitable Foundation [21103 til AC] og Brain Canada Foundation [AWD-023132 til AC]; University of British Columbia Aboriginal Graduate Fellowship (6481 til MT); British Columbia Graduate Scholarship (6768 til MT); Canadian Open Neuroscience Platform Student Scholar Award (10901 til JK); University of British Columbia fireårigt ph.d.-stipendium (6569 til JK). Bidragyderne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om udgivelse eller udarbejdelse af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5M EDTA Invitrogen AM9260G
15 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile  Falcon 352196
24-well Clear Not Treated Plates Costar 3738
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
96 Well Clear Polystyrene Microplate, clear round bottom, non treated surface Corning 3788
Acetyl Histone 3 K9 (C5B11) Cell Signalling Technology 9649S Dilution: 1:100
Acetyl Histone H4 K8 (2594) Cell Signalling Technology 2594S Dilution: 1:100
Acetyl-Histone H3 K27 (D5E4) Cell Signalling Technology 8173S Dilution: 1:100
Acetyl-Histone H3 Lys27 (MA523516) Invitrogen MA523516 Dilution: 1:100
Actinomycin D New England Biolabs 15021S
Anisomycin New England Biolabs 2222S
Anti-Histone H3 (tri methyl K4)  Abcam ab213224 Dilution: 1:100
Anti-Lactyl-Histone H4 (Lys 12) Rabbit mAb PTM Biolabs PTM-1411RM Dilution: 1:250
Anti-L-Lactyllysine Rabbit pAb PRM Biolabs PTM-1401RM Dilution: 1:250
Apc anti-P2RY12 Antibody, Clone: S16007D BioLegend 848006
BSA Tocris 5217
Cyto-Last Buffer BioLegend 422501
dimethylsulfoxide, sterile Cell Signalling Technology 12611S
DNAse I STEMCELL Technologies 07900
Donkey Anti Mouse AlexaFluor488 Jackson ImmunoResearch 715-546-150 Dilution: 1:500
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor488 ABclonal AS035 Dilution: 1:500
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568 Invitrogen A10042 Dilution: 1:500
Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421 BioLegend 406410 Dilution: 1:500
Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisherbrand 13-711-9AM
Fisherbrand Disposable PES Filter Unit, 250mL  Fisherbrand FB12566502
H3K18ac Polyclonal Antibody Invitrogen 720095 Dilution: 1:100
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14185052
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175103
Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002) Abcam ab6002 Dilution: 1:100
KONTES Dounce Tissue Grinders 125mm 7mL  VWR 885300-0007
Lactyl-Histone H3 (Lys 18) Rabbit mAb PTM BIolabs PTM-1406RM Dilution: 1:250
Lipopolysacharide  Sigma-Aldrich L5418
Normal Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
OneComp eBeads Compensation Beads Invitrogen 01-1111-41
PDS Kit, Papain Vial - Worthington Biochemical Cedarlane LK003178
Percoll Sigma-Aldrich GE17-0891-02
Phenol Red VWR RC57004
QIAshredder Qiagen  79656
Rainbow Fluorescent Particles, 1 peak (3.0-3.4 uM - Mid Range Intensity BioLegend 422905
RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL Invitrogen AM12400
Rneasy Plus Micro Kit Qiagen  74034
Round Bottom Polypropylene Tubes with Caps, 5 mL Corning 352063
Triptolide New England Biolabs 97539
True Nuclear Transcription Factor Buffer Set BioLegend 424401
TruStain FcX PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody BioLegend 156604
Trypan Blue VWR 97063-702
Zombie Aqua Fixable Viability Kit BioLegend 423102

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, J. L., Grant, P. A. The Role of DNA Methylation and Histone Modifications in Transcriptional Regulation in Humans. Epigenetics: Development and Disease. 61, 289-317 (2013).
  2. Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  3. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  4. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  5. Vogel Ciernia, A., LaSalle, J. The landscape of DNA methylation amid a perfect storm of autism aetiologies. Nature Reviews. Neuroscience. 17 (7), 411-423 (2016).
  6. Keiser, A. A., et al. Systemic HDAC3 inhibition ameliorates impairments in synaptic plasticity caused by simulated galactic cosmic radiation exposure in male mice. Neurobiology of Learning and Memory. 178, 107367 (2021).
  7. McQuown, S. C., et al. HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31 (2), 764-774 (2011).
  8. Barrett, R. M., et al. Hippocampal Focal Knockout of CBP Affects Specific Histone Modifications, Long-Term Potentiation, and Long-Term Memory. Neuropsychopharmacology. 36 (8), 1545-1556 (2011).
  9. Datta, M., et al. Histone Deacetylases 1 and 2 Regulate Microglia Function during Development, Homeostasis, and Neurodegeneration in a Context-Dependent Manner. Immunity. 48 (3), 514.e6-529.e6 (2018).
  10. Belhocine, S., et al. Context-dependent transcriptional regulation of microglial proliferation. Glia. 70 (3), 572-589 (2022).
  11. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science (New York, N.Y.). 356 (6344), eaal3222 (2017).
  12. Kettenmann, H., Hanisch, U. -K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of Microglia. Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).
  13. Sullivan, O., Ciernia, A. V. Work hard, play hard: how sexually differentiated microglia work to shape social play and reproductive behavior. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 989011 (2022).
  14. Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. BioTechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Crowe, A., Yue, W. Semi-quantitative Determination of Protein Expression Using Immunohistochemistry Staining and Analysis: An Integrated Protocol. BIO-PROTOCOL. 9 (24), (2019).
  17. Seligson, D. B., et al. Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence. Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).
  18. Liu, B., et al. Global Histone Modification Patterns as Prognostic Markers to Classify Glioma Patients. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 19 (11), 2888-2896 (2010).
  19. Pan, R. Y., et al. Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease. Cell Metabolism. 34 (4), 634.e6-648.e6 (2022).
  20. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  21. Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. Journal of Visualized Experiments. (108), 53658 (2016).
  22. Oblak, A. L., et al. Comprehensive Evaluation of the 5XFAD Mouse Model for Preclinical Testing Applications: A MODEL-AD Study. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 713726 (2021).
  23. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), e70 (2019).
  24. McKinnon, K. M. Multiparameter Conventional Flow Cytometry. Flow Cytometry Protocols. 1678, 139-150 (2018).
  25. Marsh, S. E., et al. Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain. Nature Neuroscience. 25 (3), 306-316 (2022).
  26. Wang, L., Gaigalas, A. K., Marti, G., Abbasi, F., Hoffman, R. A. Toward quantitative fluorescence measurements with multicolor flow cytometry. Cytometry Part A. 73A (4), 279-288 (2008).
  27. Rumbaugh, G., Miller, C. A. Epigenetic changes in the brain: measuring global histone modifications. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 670, 263-274 (2011).
  28. Xavier, A. M., et al. Systematic delineation of signaling and epigenomic mechanisms underlying microglia inflammatory activity in acute and chronic brain pathologies. BioRvix. , (2022).

Tags

Kvantificering Global histon posttranslationelle modifikationer intranukleær flowcytometri isoleret musehjernemikroglia genekspressionskontrol kromatinstruktur posttranslationelle modifikationer histonhaler acetylering lysinrester DNA-interaktioner transkriptionsfaktoradgang bromdomæneholdige transkriptionsaktivatorer forbedret genekspression dynamisk regulering celledifferentiering cellulære miljøer stimuli næste generations sekventeringsmetoder høj Kapacitet kvantitativ måling
Kvantificering af globale histonposttranslationelle modifikationer ved hjælp af intranukleær flowcytometri i isoleret musehjernemikroglia
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Towriss, M., Kim, J., Vogel Ciernia, … More

Towriss, M., Kim, J., Vogel Ciernia, A. Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia. J. Vis. Exp. (199), e65080, doi:10.3791/65080 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter