Summary
Este protocolo apresenta um modelo de fibrilação ventricular de longa duração em corações de ratos induzida por estimulação contínua com corrente alternada de baixa voltagem. Esse modelo tem alta taxa de sucesso, é estável, confiável e reprodutível, tem baixo impacto na função cardíaca e causa apenas lesão miocárdica leve.
Abstract
A fibrilação ventricular (FV) é uma arritmia fatal com alta incidência em pacientes cardíacos, mas a parada da PV sob perfusão é um método negligenciado de parada intraoperatória no campo da cirurgia cardíaca. Com os recentes avanços da cirurgia cardíaca, a demanda por estudos prolongados de PV sob perfusão tem aumentado. Entretanto, o campo carece de modelos animais simples, confiáveis e reprodutíveis de fibrilação ventricular crônica. Esse protocolo induz a PV de longa duração por meio da estimulação elétrica do epicárdio em corrente alternada (CA). Diferentes condições foram utilizadas para induzir a PV, incluindo estimulação contínua com baixa ou alta voltagem para induzir FV de longa duração e estimulação por 5 min com baixa ou alta voltagem para induzir FV espontânea de longa duração. As taxas de sucesso das diferentes condições, bem como as taxas de lesão miocárdica e recuperação da função cardíaca, foram comparadas. Os resultados mostraram que a estimulação contínua de baixa voltagem induziu FV de longa duração e que 5 min de estimulação de baixa voltagem induziram FV espontânea de longa duração com lesão miocárdica leve e alta taxa de recuperação da função cardíaca. No entanto, o modelo de PV de longa duração continuamente estimulado de baixa voltagem apresentou maior taxa de sucesso. A estimulação de alta voltagem proporcionou maior taxa de indução de FV, mas mostrou baixa taxa de sucesso na desfibrilação, má recuperação da função cardíaca e lesão miocárdica grave. Com base nesses resultados, a estimulação contínua por CA epicárdica de baixa voltagem é recomendada por sua alta taxa de sucesso, estabilidade, confiabilidade, reprodutibilidade, baixo impacto na função cardíaca e leve lesão miocárdica.
Introduction
A cirurgia cardíaca geralmente é realizada por toracotomia, com bloqueio da aorta e perfusão com solução cardioplégica para parada do coração. A repetição da cirurgia cardíaca pode ser mais desafiadora do que a cirurgia inicial, com maiores taxas de complicações e mortalidade 1,2,3. Além disso, a abordagem convencional de esternotomia mediana pode causar danos aos vasos da ponte atrás do esterno, da aorta ascendente, do ventrículo direito e de outras estruturas importantes. Sangramento extenso devido à separação do tecido conjuntivo, infecção da ferida esternal e osteomielite esternal devido à esternotomia são complicações possíveis. A dissecção extensa aumenta o risco de lesões e hemorragia em estruturas cardíacas vitais.
Com o desenvolvimento da cirurgia cardíaca minimamente invasiva, as incisões tornaram-se menores, e a parada cardíaca às vezes é difícil de alcançar. A repetição de cirurgia cardíaca sob fibrilação ventricular (FV)4,5 é segura, factível e pode proporcionar melhor proteção miocárdica. Portanto, este protocolo introduz o método de parada cardíaca de PV em cirurgia com circulação extracorpórea minimamente invasiva. O coração perde contração efetiva durante a PV e, assim, não há necessidade de sutura e bloqueio da aorta ascendente durante a cirurgia, o que simplifica o procedimento. No entanto, mesmo que o coração seja continuamente perfundido, a PV a longo prazo ainda pode ser prejudicial ao coração.
À medida que esse método se torna mais amplamente utilizado, a questão de como proteger o coração durante a PV torna-se cada vez mais relevante. Isso exigirá estudos extensivos e aprofundados utilizando modelos animais de FV de longa duração. No passado, as pesquisas nessa área utilizaram principalmente animais de grande porte6,7 e exigiram cooperação entre cirurgiões, anestesiologistas, perfusionistas e outros pesquisadores. Esses estudos demoraram muito, os tamanhos amostrais foram muitas vezes pequenos, e os estudos geralmente se concentraram na função cardíaca e menos em avaliações mecanicistas e moleculares. Até o momento, nenhum estudo relatou um protocolo detalhado para estabelecer um modelo de PV de longa duração.
Este protocolo, portanto, fornece os detalhes necessários para o desenvolvimento de um modelo de PV de longo prazo em ratos usando o aparelho de Langendorff. O protocolo é simples, econômico, repetível e estável.
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Protocol
Todos os procedimentos e protocolos experimentais utilizados nesta investigação foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral de PLA.
1. Preparação do aparelho de Langendorff
- Prepare o tampão Krebs-Henseleit (K-H). Para preparar o tampão K-H, adicione o seguinte à água destilada: NaCl 118,0 mM, KCl 4,7 mM, MgSO 4 1,2 mM, NaH 2 PO4 1,2 mM, CaCl21,8 mM, NaHCO 3 25,0 mM, glicose 11,1 mM e EDTA 0,5 mM.
- Preparar o sistema de perfusão Langendorff modificado.
- Gaseificar continuamente o balão contendo tampão K-H com 95% O 2 + 5% CO2 a uma pressão de aproximadamente 80 mmHg. Coloque uma extremidade do tubo de perfusão no tampão K-H, passe o meio do tubo de perfusão através do banho-maria e prenda uma agulha romba de 20 G na outra extremidade do tubo de perfusão.
- Suspenda a agulha em um suporte de arame. Ajustar a temperatura do banho-maria de modo a que a temperatura do tampão K-H a partir da extremidade do sistema de perfusão seja de 37,0 °C ± 1,0 °C.
2. Preparação do hardware e software
- Hardware
- Use um gravador de sinais fisiológicos para digitalizar e gravar todos os sinais analógicos. Use dois eletrodos de agulha de aço inoxidável para registrar um eletrocardiograma bipolar (ECG) e use dois eletrodos de agulha de aço inoxidável para estimulação elétrica.
- Conecte uma extremidade dos quatro eletrodos ao registrador de sinais fisiológicos e a outra extremidade próxima à área onde o coração será posicionado após a fixação ao aparelho.
- Software
- Use o software do laptop para reconhecer, ajustar e registrar automaticamente o ECG bipolar e os parâmetros hemodinâmicos. Os parâmetros incluem a diferença de pressão do ventrículo esquerdo (DLVE), a diferença entre a pressão desenvolvida do ventrículo esquerdo (PDVE) e a pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE) e a frequência cardíaca (FC).
- Ajuste os parâmetros do estimulador elétrico para 30 Hz AC, com o grupo de baixa tensão recebendo 2 V e o grupo de alta tensão recebendo 6 V.
3. Preparando o coração isolado
- Prepare o animal.
- Anestesiar ratos Sprague-Dawley (SD) com isoflurano a 2% após injeções intraperitoneais de 0,05 mg/kg de buprenorfina e 1.000 UI/kg de heparina sódica. Certifique-se de que o rato parou de responder ao aperto do dedo do pé.
- Transfira o rato para uma plataforma cirúrgica de pequenos animais, coloque-o em decúbito dorsal e esterilize o tórax com etanol a 75%.
- Excise o coração.
- Com o rato conectado a um ventilador após dissecção cervical e intubação traqueal, levante a pele do processo xifoide com pinça dentada e faça uma incisão transversal de 3 cm na pele com tesoura de tecido. Estenda as incisões da pele e das costelas para as axilas de ambos os lados em forma de V.
- Refletir o esterno cranialmente com pinças de tecido para expor totalmente o coração e os pulmões.
- Isolar e dissecar o timo sem rodeios usando duas pinças curvas. Aperte o tecido tímico e desvie-o lateralmente em ambos os lados para expor a aorta e seus ramos.
- Utilizar pinça curva para realizar uma separação romba da aorta e da artéria pulmonar, facilitando o uso posterior da tesoura oftálmica para remover o coração e suspender o coração uma vez retirado.
Observação : para aqueles que são novos para este procedimento, a etapa 3.2.4 pode ser omitida. - Use dissecção romba para separar o tronco braquiocefálico do tecido circundante. Em seguida, pinça o tronco braquiocefálico com pinça curva para facilitar a remoção do coração. Cortar rapidamente a aorta entre o tronco braquiocefálico e a artéria carótida comum esquerda. O rato morre assim que o coração é removido.
- Corte o tecido redundante e mergulhe imediatamente o coração em uma placa de Petri com tampão K-H a 0-4 °C para lavar e bombear o sangue residual.
OBS: A transecção da aorta entre o tronco braquiocefálico e a artéria carótida comum esquerda é recomendada, pois a preservação do tronco permite a identificação da aorta e a estimativa da profundidade da canulação.
- Suspenda o coração.
- Transfira o coração para uma segunda placa de Petri. Identificar a aorta. Use duas pinças oftálmicas para levantar a aorta e insira a agulha romba no aparelho de Langendorff.
- Ajustar a profundidade da aorta para a posição apropriada. Peça a um assistente que amarre um nó com um fio de sutura 0. Em seguida, ligue o regulador de fluxo de perfusão.
NOTA: Tome cuidado para evitar que bolhas de ar entrem no coração durante todo o procedimento. Além disso, esteja ciente de que o tempo desde o corte da aorta até a perfusão inicial não deve exceder 2 min. - Insira um pequeno balão de látex modificado conectado a um transdutor de pressão no átrio esquerdo e empurre o balão através da valva mitral para o ventrículo esquerdo. Encher o balão com água destilada para atingir uma pressão diastólica final de 5-10 mmHg.
- Conecte o ECG e os eletrodos de estimulação elétrica ao coração. Em seguida, coloque o coração em uma câmara de vidro encamisada para manter uma temperatura interna de 37,0 °C ± 1,0 °C.
OBS: Utilizar os seguintes critérios de exclusão: frequência cardíaca <250 batimentos por minuto; fluxo coronariano (mL/min) <10 mL/min ou >25 mL/min. As posições de conexão do eletrodo de eletrocardiograma e estimulação elétrica são mostradas na Figura 1A, e a câmara de vidro encamisada é mostrada na Figura 1B.
4. Perfundir e estimular eletricamente o coração (Figura 2)
- Estágio de equilíbrio (0-30 min)
- Iniciar a perfusão e manter temperatura de aproximadamente 37 °C até que o coração bata espontaneamente; Em seguida, deixe o coração se equilibrar por 20 min.
- Ajuste a temperatura do banho-maria para manter a temperatura dentro da câmara de vidro encamisada em aproximadamente 30 °C.
NOTA: Todo o processo de resfriamento deve durar aproximadamente 10 min.
- Estágio de estimulação elétrica (30-120 min)
- Depois que a temperatura atingir o nível desejado, ative o interruptor de estimulação elétrica no software do laptop.
NOTA: O ECG bipolar e a pressão ventricular esquerda (PVE) no início da estimulação elétrica são mostrados na Figura 3A. - Se o animal fizer parte do grupo de PV de longa duração continuamente estimulada, permitir 90 min de estimulação elétrica. Se o animal estiver no grupo de FV espontânea induzida de longa duração, permitir 5 min de estimulação elétrica, desligá-la e aguardar 90 min para FV espontânea de longa duração, como mostra a Figura 3B.
OBS: Para os corações do grupo de PV espontânea de longa duração que não desenvolvem PV espontânea dentro de 90 min após a eletroestimulação, a estimulação elétrica é então desligada por não atenderem aos critérios de inclusão.
- Depois que a temperatura atingir o nível desejado, ative o interruptor de estimulação elétrica no software do laptop.
- Estágio de reaquecimento, desfibrilação e batimento (120-180 min)
- Após 90 min de FV, utilizar eletrodos para dar 0,1 J de desfibrilação por corrente contínua, como mostra a Figura 3C.
- Regule simultaneamente a temperatura do banho-maria para permitir que a temperatura suba lentamente dentro da câmara de vidro encamisada para cerca de 37 °C. Continue o processo de aquecimento por aproximadamente 10 min.
- Após a desfibrilação, deixar o coração bater por 60 min e, em seguida, parar o batimento por perfusão lenta com KCl a 10% a aproximadamente 37 °C. Remova o coração para uma análise mais aprofundada.
OBS: Corações que não batem após a desfibrilação não atendem aos critérios de inclusão. Além disso, é importante coletar o derrame coronariano antes do resfriamento (aos 20 min), após a desfibrilação (aos 120 min) e ao final do experimento (aos 180 min).
5. Realização do ensaio de creatina quinase-MB (CK-MB) e análise histológica
- Ensaio CK-MB
- Utilizar um analisador bioquímico automático e um kit comercial de ensaio de CK-MB para determinar o nível de CK-MB no líquido de derrame coronariano coletado8.
- Análise histológica
- Fixe o coração em formalina tamponada a 10%, desidrate o coração e incorpore-o em parafina.
- Use um micrótomo para cortar o tecido embebido em parafina em cortes de 5 μm; em seguida, montar os cortes em lâminas de vidro e corar com hematoxilina e eosina9.
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Representative Results
Foram utilizados 57 ratos nos experimentos, dos quais 30 preencheram os critérios de inclusão. Os animais incluídos foram divididos em cinco grupos, com seis animais em cada grupo: grupo controle (Grupo C), grupo FV de longa duração continuamente estimulada por baixa voltagem (Grupo LC), grupo de FV de longa duração continuamente estimulada de alta voltagem (Grupo HC), grupo de PV espontânea de longa duração induzida por baixa voltagem (Grupo LI) e grupo de FV espontânea de longa duração induzida por alta voltagem (Grupo HI). O processo experimental para cada grupo é mostrado na Figura 2.
Taxa de sucesso dos modelos VF
As taxas de FV, a taxa de sucesso da desfibrilação e a taxa de sucesso do modelo de PV são mostradas na Tabela 1. O Grupo LC e o Grupo HC receberam estimulação elétrica contínua e, assim, a PV ocorreu com 100% de sucesso, mas o Grupo HC demonstrou menores taxas de sucesso para a desfibrilação. O Grupo LI e o Grupo HI, nos quais a estimulação elétrica foi desligada após 5 min, apresentaram diferentes taxas de PV, mas a taxa de PV foi menor em ambos os grupos em comparação com o Grupo LC e o Grupo HC. Enquanto os grupos com voltagens mais altas apresentaram maior incidência de FV, esta foi acompanhada por menor taxa de sucesso da desfibrilação. Tanto o Grupo LC quanto o Grupo LI tiveram melhores taxas de sucesso de desfibrilação, mas no geral, o Grupo LC teve a maior taxa de sucesso do modelo, enquanto o Grupo LI teve uma menor taxa de sucesso do modelo.
Alterações hemodinâmicas
As taxas de recuperação da FC, do fluxo coronariano (FC) e da DPVE dos cinco grupos experimentais são mostradas na Figura 4A-C. A taxa de recuperação indica a percentagem do valor relevante no final da experiência dividida pelo valor no início da experiência. Os dados hemodinâmicos de cada grupo foram comparados com os do grupo controle (Grupo C). A hemodinâmica do Grupo C manteve-se estável durante o experimento e mostrou discreta diminuição da FC, FC e DLVE. Os dois grupos com PV induzida por baixa voltagem apresentaram desempenho semelhante e boa taxa de recuperação. A FC e a PDVE não foram significativamente diferentes nesses grupos em comparação com o Grupo C, mas a taxa de recuperação da FC foi significativamente melhor do que no Grupo C.
Em contraste, a taxa de recuperação hemodinâmica dos dois grupos com FV de longa duração induzida por alta voltagem foi pobre, e o grupo de FV de longa duração continuamente estimulada de alta voltagem apresentou a pior taxa de recuperação.
Resultados do ensaio CK-MB e análise histológica
Os níveis de CK-MB no líquido de derrame coronariano refletem lesão miocárdica. Como mostrado na Figura 4D, a análise do líquido de derrame coronariano coletado ao final do experimento mostrou que os níveis de CK-MB foram maiores em ambos os grupos de alta voltagem. Não foram encontradas diferenças entre os dois grupos de baixa voltagem e o Grupo C. A coloração de hematoxilina e eosina mostrou uma região de queimadura dos eletrodos no Grupo HC (Figura 5).
| Número total de corações de perfusão isolados | Número de FV | Taxa de FV | Número de batimentos após desfibrilação | Taxa de batimento após desfibrilação | Taxa de sucesso do modelo VF | |
| Grupo C | 6 | - | - | - | - | - |
| Grupo LC | 7 | 7 | 100% | 6 | 85.71% | 85.71% |
| Grupo HC | 14 | 14 | 100% | 6 | 42.86% | 42.86% |
| Grupo LI | 16 | 7 | 43.75% | 6 | 85.71% | 37.50% |
| Grupo HI | 14 | 10 | 71.43% | 6 | 60.00% | 42.86% |
Tabela 1: Taxa de sucesso do modelo de PV. Abreviações: FV = fibrilação ventricular; Grupo C = grupo controle; Grupo CL = grupo PV continuamente estimulada de baixa voltagem; Grupo HC = grupo FV estimulada continuamente de alta voltagem; Grupo LI = grupo PV espontânea induzida por baixa voltagem; Grupo HI = grupo FV espontânea induzida por alta voltagem.
Figura 1: Configurações do eletrodo e da câmara de vidro encamisada . (A) Posição dos eletrodos de estimulação elétrica e eletrocardiograma bipolar (ECG) em um coração isolado de rato. A seta branca aponta para os eletrodos de estimulação elétrica. A seta preta aponta para os eletrodos bipolares de ECG. (B) Controle de temperatura com banho-maria e câmara de vidro encamisada durante o experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Procedimento de perfusão cardíaca e estimulação elétrica. Abreviações: a = iniciar o resfriamento; b = iniciar estimulação; c = parar a estimulação; d = iniciar o reaquecimento; e = desfibrilação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Eletrocardiograma (ECG) bipolar e diferença de pressão do ventrículo esquerdo (DLVE). (A) A fibrilação ventricular (FV) ocorreu após o início da estimulação com corrente alternada (CA). (B) A PV espontânea ocorreu após a cessação da estimulação por CA. (C) O coração voltou a bater após a desfibrilação. Abreviações: a = iniciar estimulação; b = parar a estimulação; c = desfibrilação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Taxa de recuperação hemodinâmica e valores de creatina quinase-MB (CK-MB) no líquido de derrame coronariano coletado ao final do experimento. (A) Taxas de recuperação da frequência cardíaca (FC) de cada grupo. (B) Taxas de recuperação do fluxo coronariano (FC) de cada grupo. (C) Taxas de recuperação da diferença de pressão do ventrículo esquerdo (DPVE) de cada grupo. (D) Valores de creatina quinase-MB (CK-MB) de cada grupo. Abreviação: FV = fibrilação ventricular. (A-D) As barras mostram a média ± o desvio padrão (DP). Foi realizada ANOVA one-way utilizando o GraphPad Prism, seguido do teste de comparações múltiplas de Tukey. n = 6 ratos por grupo. *: em comparação com o Grupo C; #: em comparação com o Grupo LC. Valores de p menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. */#: P < 0,05; **/##: P < 0,01; /###: P < 0,001; /####: P < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Coloração hematoxilina e eosina do tecido miocárdico no ápice. O quadrado verde é a região de queima do eletrodo de estimulação elétrica do Grupo HC. Abreviação: Grupo HC = grupo fibrilação ventricular de longa duração continuamente estimulada de alta voltagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo estabelece um modelo animal de FV de longa duração em corações isolados de ratos que não foi relatado anteriormente. Além disso, diferentes condições de estimulação elétrica foram comparadas neste estudo. Este estudo fornece um modelo para estudos relacionados à parada de fibrilação ventricular durante cirurgia cardíaca.
A taxa de sucesso do modelo é um indicador muito importante que está relacionado a pessoal, tempo e custos econômicos. Em modelos de PV, a taxa de sucesso inclui se a FV pode ser induzida no coração e se o coração pode voltar a bater normalmente após a desfibrilação. Além disso, a taxa de recuperação da função cardíaca e a lesão miocárdica devem ser consideradas. Para ser um modelo adequado para a necessidade de cirurgia cardíaca, o tempo de PV do coração precisa atingir 1-2 h em baixas temperaturas, sendo que, nesse protocolo, o tempo de PV é de 90 min.
Sugere-se que o uso de baixa voltagem tenha pouco efeito sobre a função cardíaca e a lesão miocárdica. Portanto, este estudo comparou as taxas de sucesso do uso de baixas e altas voltagens, bem como as taxas de sucesso da estimulação elétrica contínua ou de 5 min para induzir PV em corações de ratos. Foram confeccionados seis modelos de PV elegíveis para cada grupo. Um total de 16 ratos foram testados no Grupo LI, com uma taxa de sucesso do modelo de 37,50%, enquanto apenas 7 ratos foram testados no Grupo LC, com uma taxa de sucesso de 85,71%. Além disso, neste estudo, não houve diferenças significativas na FC, taxa de recuperação da DPVE ou níveis de CK-MB entre o Grupo LC e o Grupo LI.
Uma intensidade suficiente de estimulação elétrica durante o período vulnerável do ciclo cardíaco produz FV10. Neste estudo, o Grupo HC e o Grupo HI apresentaram maior incidência de FV que os demais grupos. Entretanto, a análise de CK-MB e os resultados das colorações de hematoxilina e eosina sugeriram que a estimulação de alta voltagem poderia causar dano miocárdico significativo, levando a uma baixa taxa de desfibrilação. Além disso, a taxa de desfibrilação do coração após FV foi significativamente menor nos grupos de alta voltagem do que nos grupos de baixa voltagem.
Esses dados mostram que a PV de longa duração estimulada continuamente por baixa voltagem foi o melhor modelo, com maior taxa de sucesso do modelo, boa taxa de recuperação da função cardíaca após a desfibrilação e menor lesão miocárdica.
A taxa de recuperação da FC foi melhor nos dois grupos de baixa voltagem do que no Grupo C, consistente com relatos de estudos semelhantes. Em estudo anterior, corações caninos submetidos à circulação extracorpórea (CEC) demonstraram aumento significativo do fluxo via artérias coronáriasdilatadas11, o que aumentou o fluxo subendocárdico três vezes maior que o fluxo epicárdico. Esse aumento do fluxo coronariano pode fornecer oxigênio suficiente para suprir o aumento da demanda metabólica. Portanto, no modelo canino, o ventrículo normal não apresenta comprometimento metabólico, funcional ou alterações histológicas após 30-60 min de FV espontânea. Em outro estudo com CEC em caninos12, a FC foi maior tanto na PV estimulada espontânea quanto continuamente do que em corações normais com batimento vazio.
Para simular a temperatura durante a cirurgia cardíaca, a temperatura do tampão K-H e a temperatura ambiente foram controladas em aproximadamente 30 °C durante a PV neste estudo. A distensibilidade ventricular esquerda diminuiu com a hipotermia nos corações batendo, mas aumentou com a hipotermia nos corações com PV. Em estudo anterior, o consumo miocárdico de oxigênio em corações com PV foi maior do que em corações normais com batimento vazio a 37 °C e menor do que nos corações com batimento vazio a 28 °C13. Portanto, a redução da temperatura traz mais benefícios no coração de PV perfundido.
A posição dos eletrodos pode afetar a ocorrência de FV. Nesse protocolo, os eletrodos da agulha são ancorados na base e no ápice do ventrículo direito para obter estimulação elétrica em todo o coração e obter líquido de derrame coronariano para análise bioquímica. Um estudo anterior ancorou um eletrodo no endocárdio do ventrículo direito, colocou o outro polo no tampão K-H e imergiu o coração no tampão K-H14. Além disso, estudos relataram a colocação de cateter de eletrofisiologia octapolar no endocárdio do ventrículodireito15, fotoestimulação epicárdica multissítio16 e estimulação elétrica epicárdica com arranjo epicárdico multieletrodo (MEA)17.
Em relato anterior, os pesquisadores realizaram 3 min de estimulação elétrica do coração isolado de ratos a 37 °C com 0,05 mA 30 Hz CA para obtenção de 20 min de FV sem perfusão14. Uma CA de 10-30 Hz também tem sido utilizada para induzir FV em corações isolados de furões nãoisquêmicos18. Além disso, 1,5-4,5 V CA 12, 7,5 V CA13 e CA19 de tensão irrestrita têm sido usados em experimentos de circulação extracorpórea em cães. Notadamente, os limiares de voltagem ou corrente para PV induzida diferem entre corações isolados e in vivo, com menores intensidades de estímulo em corações isolados20. Em vários estudos nos quais a PV foi induzida com CA, o principal fator que influenciou os resultados foi a intensidade e não a frequência da estimulação elétrica. A frequência de estimulação elétrica não foi a mesma em nenhum desses estudos, mas também foi observado que 30 Hz produz maior incidência de FV do que 10 Hz21. A corrente contínua (DC) também tem sido utilizada em estudos de PV eletricamente estimulada, mas a corrente contínua é mais comumente usada em PV de curta duração, pois o limiar para a corrente contínua induzir a FV é três vezes maior do que o da CA22. Além disso, a HD pode agravar a lesão miocárdica sob estimulação prolongada e alta energia. A desfibrilação elétrica também pode causar lesão miocárdica, mas estudos têm demonstrado lesão significativa apenas com energia de desfibrilação muito maior do que a utilizada nesse protocolo23.
A atenção a uma série de etapas é essencial para que esse protocolo seja bem-sucedido. O ventilador deve ser ligado após anestesiar os ratos para evitar isquemia causada por parada respiratória, o que pode confundir os resultados experimentais. Depois de remover o coração, ele deve ser imerso, especialmente a raiz da aorta, em um tampão K-H de 0-4 °C, e o coração deve ser suspenso rapidamente antes de se contrair para evitar a entrada de ar no coração. A agulha não deve entrar muito profundamente na aorta, pois isso pode reduzir a perfusão coronariana. Ao suspender o coração, a ligadura de seda da raiz da aorta deve incluir o tronco braquiocefálico; caso contrário, a perfusão coronariana será desviada. Um aumento anormal do fluxo coronariano ajuda a identificar esse problema. A profundidade do eletrodo deve ser de aproximadamente 1 mm; eletrodos colocados muito profundos penetrarão na parede ventricular, e aqueles colocados muito rasos podem ser deslocados.
Para certos estudos, os investigadores podem querer simular um estado de FV espontânea a longo prazo, mas o coração de pequenos mamíferos é caracterizado por uma alta taxa de desfibrilação espontânea24,25. O longo período refratário, a condução rápida e a pequena massa não favorecem a manutenção da PV, e o coração retorna ao ritmo normal em curto espaço de tempo. Estudos semelhantes foram realizados anteriormente em pequenos animais com diferentes condições de FV; no entanto, todos esses estudos avaliaram a PV de curta duração. A PV espontânea não ocorre apenas pelo resfriamento e deve ser induzida por eletroestimulação em diferentes condições, o que é uma limitação deste estudo.
Em suma, a estimulação contínua da CA de baixa voltagem do epicárdio apresentou alta taxa de sucesso, estabilidade, confiabilidade e reprodutibilidade, especialmente por apresentar características de baixo impacto na função cardíaca e baixa lesão miocárdica, tornando-se um modelo escalável de PV prolongada.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi realizado com o apoio da Cirurgia Cardiovascular, First Medical Center, Chinese PLA General Hospital e do Laboratory Animal Center, Chinese PLA General Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Non-absorbable suture | Ethicon, Inc. | Preparation of the isolated heart | |
| 95% O2 + 5% CO2 | Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd. | K-H buffer | |
| AcqKnowledge software | BIOPAC Systems Inc. | Version 4.2.1 | Software |
| Automatic biochemistry analyzer | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | Chemray 800 | CK-MB assay |
| BIOPAC research systems | BIOPAC Systems Inc. | MP150 | Hardware |
| Blunt needle (20 G, TWLB) | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10005861 | K-H buffer |
| CK-MB assay kits | Changchun Huili Biotech Co., Ltd. | C060 | CK-MB assay |
| Curved forcep | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009717 | K-H buffer |
| Electrical stimulator | BIOPAC Systems Inc. | STEMISOC | Hardware |
| Filter | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 63005518 | K-H buffer |
| Heparin sodium | Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd. | H120200505 | Preparation of the isolated heart |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,LTD | 21082201 | Preparation of the isolated heart |
| Magnesium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20025118 | K-H buffer |
| Needle electrodes | BIOPAC Systems Inc. | EL452 | Hardware |
| Ophthalmic clamp | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Perfusion tube | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | K-H buffer |
| Sodium bicarbonate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10018960 | K-H buffer |
| Sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | K-H buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20040718 | K-H buffer |
| Sprague-Dawley (SD) rats | SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd. | Male, 300-350g | Preparation of the isolated heart |
| Thermometer | Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd. | GSP-6 | Modified Langendorff perfusion system |
| Tissueforceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Toothed forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ventilator | Chengdu Instrument Factory | DKX-150 | Preparation of the isolated heart |
| Water bath1 | Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd. | SC-15 | Modified Langendorff perfusion system |
| Water bath2 | Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Modified Langendorff perfusion system |
References
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