Summary
골격근 기능은 전통적으로 힘들고 처리량이 적은 접근법을 사용하여 분리된 근육 섬유의 수축성을 정량화하여 평가할 수 있습니다. 여기에서는 하이드로겔에 내장된 근육 섬유의 수축성을 정량화하기 위한 광학 기반의 고처리량 방법을 설명합니다. 이 접근법은 약물 스크리닝 및 치료제 개발에 적용됩니다.
Abstract
체외 세포 배양은 세포 과정을 평가하고 치료 전략을 테스트하는 강력한 도구입니다. 골격근의 경우 가장 일반적인 접근 방식은 근형성 전구 세포를 미성숙 근관으로 분화하거나 분리된 개별 근섬유의 단기 생체 외 배양을 포함합니다. in vitro에 비해 생체 외 배양의 주요 이점은 복잡한 세포 구조와 수축 특성을 유지하는 것입니다. 여기에서 우리는 생쥐에서 온전한 굴근 손가락 브레비스 근육 섬유를 분리하고 후속 생체 외 배양을 위한 실험 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에서 근육 섬유는 섬유를 고정하고 수축 기능을 유지하기 위해 피브린 기반 및 기저막 매트릭스 하이드로겔에 내장되어 있습니다. 그런 다음 광학 기반의 고처리량 수축성 시스템을 사용하여 근섬유 수축 기능을 평가하는 방법을 설명합니다. 내장된 근육 섬유는 수축을 유도하기 위해 전기적으로 자극되며, 그 후 육종 단축 및 수축 속도와 같은 기능적 특성은 광학 기반 정량화를 사용하여 평가됩니다. 이 시스템과 근육 섬유 배양을 결합하면 수축 기능에 대한 약리학적 제제의 효과에 대한 고처리량 테스트와 유전적 근육 장애에 대한 생체 외 연구가 가능합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 생세포 현미경을 사용하여 근섬유의 동적 세포 과정을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다.
Introduction
체외 세포 배양 기술의 발전은 잘 통제된 조건에서 포유류 조직을 사용하면서 조직 재생 능력, 병태생리학적 세포 메커니즘 및 후속 치료 전략을 연구할 수 있는 새로운 가능성을 열었습니다 1,2,3. 체외 배양 시스템의 사용은 근육 연구 분야 4,5 내에서 잘 확립되어 있습니다. 일반적으로, 시험관내 분화된 미성숙 근관은 근형성 전구세포로부터 사용된다 2,6,7,8. 보다 성숙한 근섬유를 생성하기 위한 분화 프로토콜이 진전되었지만9, 이들의 미성숙은 여전히 연구 결과의 번역을 생체 내 설정1,10으로 제한한다. 근육 생물학 분야의 한 가지 핵심 쟁점은 체외 분화된 근관이 천연 근육 조직에서 관찰되는 복잡한 세포 내 구조, 세포 신호 전달 과정 및 세포외 상호작용을 완전히 요약할 수 없다는 것이며, 중요하게는 근육 섬유에 의해 생성된 수축력을 요약할 수 없다는 것입니다 1,2,10,11,12 . 또한, 분화 과정 동안 근관의 조정되지 않은 수축은 종종 배양 접시에서 자발적으로 분리되는 결과를 초래하여 시험관 내 분화된 근관의 수축 평가를 어렵게 만들고 정성적 또는 반정량적 평가로 제한합니다 8,11,12,13. 이러한 한계로 인해 동물을 대상으로 한 정기적인 생체 내 실험이 필요한 경우가 많으며, 특히 근육 수축성이 주요 실험 결과인 경우 더욱 그렇다1.
시험관 내 분화된 근관 배양에 대한 대안은 분리된 성숙 근섬유의 생체 외 배양이다 1,14. 생체 외 배양 동안, 발달적으로 성숙한 근육 조직을 체외로 절제하고, 실험실 조건에서 배양을 위한 단세포 분리를 실시한다 1,14. 분리된 성숙 근육 섬유는 천연 조직 내에서 관찰되는 복잡한 세포 구조를 유지하며(14,15), 이 방법은 잘 정의되고 제어 가능한 배양 환경에서 유전자 조작 및 약물 스크리닝과 같은 직접적인 개입의 가능성을 열어줍니다. 골격근 섬유 분리 및 생체 외 배양에 관한 첫 번째 보고서 중 하나는 1930년대로 거슬러 올라갑니다. 그러나, 이 프로토콜로부터 생존 가능한 섬유의 수율은 낮았다16. 분리 절차 및 배양 조건의 지속적인 최적화로 생존 가능하고 기능적인 근육 섬유의 양이 크게 개선되었습니다 14,15,17,18,19. 배양 조건에서의 이러한 개선 중 하나는 배양 접시에 단리된 근육 섬유의 부착을 촉진하기 위해 세포외 기질 단백질로 배양 접시를 코팅하는 것을 포함한다(15,18,20). 일반적으로 라미닌 코팅이 사용되는데, 라미닌은 근육의 세포 외 기질 내에서 가장 풍부한 요소 중 하나이기 때문입니다20,21. 배양 접시의 코팅과 결합된 분리 절차의 최적화는 근육 연구 분야가 단기간 동안 배양에서 손상되지 않은 세포 구조와 수축 기능을 가진 분리된 생존 가능한 근육 섬유를 유지할 수 있게 해주었다 1,15,18,22.
힘 및 수축 능력을 측정하기 위해 근육 필드 내에서 사용되는 가장 통상적인 접근법은 길이 드라이버 모터와 힘 트랜스듀서(23, 24) 사이에 개별 근육 섬유를 장착하는 것이다. 일반적으로, 이러한 모터 구동 설정에 사용되는 근섬유는 급속 냉동 또는 신선한 조직에서 해부된 후 투과화 또는 "스키닝"이 수행되며, 이는 외부 칼슘 활성화를 허용하며, 여기서 다양한 칼슘 농도가 근육 섬유 수축을 유도하는 데 사용된다24. 이 방법은 근섬유 수축성 측정의 황금 표준이지만, 한 번에 하나의 근섬유만 측정할 수 있기 때문에 이 기법은 힘들고 시간이 많이 소요된다25. 또한, 근섬유의 분리 및 스키닝 절차는 흥분-수축 결합(즉, 칼슘 방출 및 이후 근질 세망으로의 재흡수)과 관련된 다양한 구조를 방해하여 이완 동역학 및 이 과정에 영향을 미칠 수 있는 질병에 대한 연구를 허용하지 않습니다26,27. 피부 섬유 제제에 대한 대안은 기계적 해부를 사용하여 온전한 근육 섬유를 분리하는 것이며, 여기서 수축력은 전기적 활성화에 대한 반응으로 측정될 수 있다28; 그러나 이 접근 방식은 기술적으로 까다롭고 시간이 많이 소요되므로 처리량이 낮은 측정이 발생합니다. 마지막으로, 피부가 벗겨진 제제와 온전한 제제 모두에서 근육 세포는 수축 측정 24 동안 세포외 환경에서 완전히 제거되어 근육 섬유 수축에 대한 세포외 기질 구성/강성의 영향에 대한 조사가 불가능하게 된다24. 그 결과, 분리된 온전한 근섬유의 근섬유 수축성 측정을 고처리량 방식으로 가능하게 하는 동시에 근섬유와 세포외 기질 사이의 연결을 재현할 수 있는 대체 방법의 개발이 필요합니다.
최근에는 고처리량 근섬유 수축성 측정을 위한 새로운 광학 기반 접근법이 개발되었습니다29. 이 광학 기반 시스템은 고속 이미징을 사용하여 수축 중 육종 길이를 평가하기 위해 근관의 주기성을 측정합니다. 이 시스템 내에서, 광학계가 이동하는 동안 세포는 배양 접시 내에 머물러 있어, 다수의 세포(29)의 측정 사이에 필요한 시간을 최소화한다. 이 고처리량 광학 기반 접근 방식을 사용하는 주요 이점은 기본 조직과 유사한 배양 조건을 개발할 수 있다는 것입니다. 천연 생체 내 조건을 모방하는 데 사용되는 접근법은 하이드로겔30에 세포를 매립하는 것입니다. 전형적으로, 하이드로겔은 그 부피 및 형상을 유지할 수 있는 점탄성 물질이며, 하이드로겔은 고체 및 액체 물질 모두의 성질을 갖는다31. 고체 부분은 서로 가교 결합 된 폴리머 사슬로 구성되어 그물30,31과 유사한 구조를 만듭니다. 히드로겔의 재료 특성은 근육(30, 31)의 매트릭스 침착을 모방하도록 조정될 수 있다. 따라서 고처리량 광학 기반 시스템과 하이드로겔에 내장된 세포의 조합은 세포외 기질 구성 및 기계적 특성이 근섬유 기능에 미치는 영향을 평가할 수 있는 새로운 가능성을 열어줍니다.
이 논문의 전반적인 목표는 1) 천연 조직 환경을 모방한 조건에서 근육 섬유의 효소 분리 및 생체 외 배양 방법론을 설명하고 2) 고처리량 접근 방식을 사용하여 근육 섬유 수축성을 평가하는 것입니다. 우리는 효소 분해를 사용하여 FDB(flexor digitorum brevis) 근육에서 많은 수의 단일 근육 섬유를 쉽게 분리하는 상세한 방법론을 설명합니다. 또한, 근육의 본래 환경을 모방하고 근섬유 생존력과 수축력을 향상시키기 위해 분리된 근섬유를 피브린계 하이드로겔에 매립하는 기술을 기술한다. 그런 다음 최근에 개발된 이 시스템을 사용하여 시험관 내에서 살아있는 근육 섬유 수축을 측정하는 고처리량 방법을 간략하게 설명합니다. 이 임베딩 절차의 또 다른 이점은 수축 동안 섬유를 고정시키는 것이며, 이는 이러한 측정의 신호 대 잡음비를 향상시킬 수 있습니다. 이 겔 포매 방법은 단일 폴리머 및 복합 겔 캡슐화 절차 모두에 적용할 수 있어 근육 섬유 수축성에 대한 세포외 기질 조성의 효과 평가를 용이하게 합니다.
Protocol
생체 외 수축 연구의 경우, 네덜란드 동물 연구법의 허가에 따라 유럽 이사회 지침(2010/63/EU)에 따라 VU 대학의 다른 승인된 연구 프로젝트 및/또는 번식 잉여를 위해 희생된 동물에서 사후 조직을 얻었습니다.
1. 재료 준비
- 분쇄를 위해 피펫을 준비합니다(사용할 때까지 플로우 캐비닛에 70% 에탄올에 보관). 두 개의 P1,000 팁의 끝을 잘라 다른 구멍 크기를 만듭니다. 구멍이 피펫을 막지 않고 근육이 통과할 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인하십시오. 절단된 끝을 화염에 통과시켜 매끄럽게 만듭니다.
- 다른 곳(32)에 기술된 바와 같이 실가드 접시를 준비하고, 격리 동안 발과 근육을 고정하는 데 사용하기 위해 미리 70% 에탄올로 살균한다.
알림: Sylgard 접시는 탈이온수와 70% 에탄올로 철저히 세척한 후 재사용할 수 있습니다. - 분리 절차 전에 해부 배지, 피브린 배양 배지 및 근육 소화 배지( 표 1 참조)와 같은 용액을 준비합니다.
알림: 근육 소화 배지는 0.22μm 필터를 사용하여 필터 멸균해야 합니다. 준비된 모든 용액은 사용 전 최소 30분 동안 37°C 및 5% CO2의 표준 세포 배양 배양기에서 평형을 이루어야 합니다. - 근육 소화 후, 하이드로겔을 캐스팅하기 위해 다음 용액을 준비한다: 세포 믹스 및 매트릭스 믹스( 표 2 참조). 세포 혼합물과 매트릭스 혼합물을 1:1의 비율로 결합하여 최종 피브린 농도가 2.5mg/mL가 되도록 합니다.
알림: 얼음 위에 매트릭스를 준비하고 기저막 매트릭스의 조기 중합을 방지하기 위해 미리 냉각된 피펫 팁을 사용하십시오. 여기에 사용된 트롬빈:피브리노겐 비율은 1:10(피브리노겐 mg당 단위)으로 30분의 중합 시간에 최적화되어 있습니다. 겔이 30분 이내에 중합되면 더 낮은 트롬빈 농도를 사용해야 합니다. 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.
2. FDB 근육 해부
- 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시킵니다. 뒷다리를 70 % 알코올로 소독하십시오.
- 발목 위의 뒷다리를 잘라냅니다. 발가락 쪽으로 발의 등쪽 피부를 자릅니다.
알림: 나중에 필요할 경우 하지 근육과 경골의 손상을 방지하기 위해 발목 관절에서 아래쪽 뒷다리를 잘라냅니다. - 발가락 쪽으로 피부를 조심스럽게 떼어냅니다. 근육이 손상되지 않도록주의하십시오. FDB는 발의 복부 쪽에서 가장 표면적인 근육입니다.
- 해부된 발을 37°C에서 예열 해부 배지 10mL와 함께 Sylgard 접시에 넣습니다. 발가락에 붙어있는 피부를 통해 발을 고정하고 발목 너머로 다리를 고정합니다.
- 근육 상단의 결합 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 발 뒤꿈치의 힘줄을 자르고 힘줄로 근육을 들어 올립니다.
- 결합 조직을 통해 근육의 옆과 아래를 자릅니다. 발가락 힘줄이 노출될 때까지 계속 절단하십시오.
- 세 개의 힘줄 길이의 절반이 노출되면 힘줄을 자르고 발에서 근육을 떼어냅니다. 선택 사항: 네 번째 측면 힘줄과 근육 섬유를 잘라냅니다.
- 근육에서 결합 조직을 청소하고 예열 된 해부 매체가 들어있는 튜브로 옮깁니다.
3. FDB 근육 소화
- 표 1에 따라 근육 소화 배지를 준비한다.
- 혈청학적 피펫을 사용하여 FDB 근육을 근육 소화 배지로 옮깁니다. 조직 배양 인큐베이터에서 37°C 및 5%CO2 에서 80분 동안 인큐베이션한다.
참고: 이 시간은 각 콜라게나제 배치에 대해 최적화되어야 합니다. 근육이 닳기 시작하고 확대 될 때 소화가 완료됩니다. 소화 시간 최적화에 대한 논의를 참조하십시오. - 소화 후 근육을 3mL의 해부 배지가 들어 있는 15mL 튜브로 옮기고 분쇄하기 전에 30분 동안 배양합니다.
4. FDB 근육 분쇄 및 중력 침강
- 근육을 피펫팅하여 미리 준비된 분쇄 팁(1.1단계)을 사용하여 가장 큰 크기에서 가장 작은 크기로 근육을 분쇄합니다. 이 단계가 5분 이상 걸리면 근육을 인큐베이터에 5분 동안 넣어 휴식을 취합니다.
- 근육 섬유가 힘줄에서 대부분 떨어져 나가고 힘줄이 P200 팁을 통과할 수 있을 때까지 분쇄합니다. 힘줄을 제거하십시오.
- 해리된 FDB 섬유를 10mL의 해부 배지가 들어 있는 15mL 튜브에 넣고 섬유가 20분 동안 인큐베이터에 가라앉도록 합니다. 펠릿이 형성되는 것을 관찰하십시오.
- 선택 사항: 상단에서 배지 10mL를 제거하고 4.3단계를 반복합니다. 이 단계는 과도한 파편 및 관련 단핵 세포의 제거를 용이하게합니다.
5. FDB 섬유 임베딩
- 섬유 펠릿 상단에서 모든 매체를 조심스럽게 제거합니다. FDB 근육당 875μL의 세포 혼합물(얼음 위)에서 세포를 재현탁합니다.
참고: 하나의 FDB 근육은 24웰 플레이트의 7웰에 충분한 섬유를 생성합니다. 이 밀도는 실험의 필요에 따라 조정할 수 있습니다. 다음 겔 부피(250μL)는 24웰 형식에 최적화되어 있지만 다른 형식에 맞게 조정할 수 있습니다. - 125 μL의 세포 혼합을 단일 미세 원심분리기 튜브에 분취합니다.
- 한 번에 하나의 웰에서 125 μL의 매트릭스 혼합물을 세포 현탁액 분취액에 첨가하고 기포가 형성되지 않도록 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
- 최종 혼합물을 즉시 우물로 옮깁니다.
알림: 혼합물을 우물 중앙에 피펫으로 고정하십시오. 각 웰에 대해 5.3단계와 5.4단계를 반복합니다. - 인큐베이터에서 30-45 분 동안 젤을 고형화하십시오. 응고 후, 배양 배지를 조심스럽게 웰에 첨가한다.
알림: 빠른 피펫팅은 웰에서 하이드로겔을 분리할 수 있습니다. 이 시점부터 섬유를 자극하고 측정할 수 있습니다. 그러나 우리의 경험에 따르면 섬유가 24시간 동안 배양 조건에 적응하도록 하면 섬유 수축성이 향상될 수 있습니다. - 더 긴 배양을 위해서는 2 일마다 반 씩 배양 배지를 보충하십시오. 이렇게하려면 배양 배지의 절반을 제거하고 동일한 양의 신선한 배지로 교체하십시오.
6. 광학 기반 수축 측정
- 광학 기반 수축 측정 시스템( 재료 표 참조), 형광 램프, 전기 셀 페이서 및 컴퓨터를 켭니다. 전기 자극기를 1.0Hz, 10.0V, 펄스 지속 시간을 5.00ms 로 설정하여 분리된 근육 섬유를 자극합니다.
- 플레이트를 측정 시스템에 삽입합니다. 페이서를 페이싱 인서트에 연결하고 배양 플레이트에 삽입합니다.
- IonWizard 프로그램을 열고 파일(화면 왼쪽 상단)을 클릭하여 새 파일을 엽니다. 새로운.
- 프로그램이 올바른 실험에 있는지 확인하십시오., 골격 Sarcomere, 새로 만들기 | 실험을 수집합니다. 실험을 변경하려면 원하는 실험을 클릭하고 추가를 누릅니다. 골격 육종 실험의 경우 Sarc 20x, 평균 선, 단일 FFT, 250Hz 샘플링 속도 및 10초의 획득 시간 설정을 적용합니다.
참고: 실험 설정은 실험 전에 준비해야 합니다. 실험의 필요에 따라 설정을 조정할 수 있습니다. - 측정 시스템의 온도를 25°C로 조정합니다. 도구 모음 아래의 셀 찾기 열기 를 클릭하고 새 화면이 나타날 때까지 기다립니다. 이 화면의 오른쪽 상단에서 플레이트 유형과 활성 웰을 선택합니다.
참고: 측정은 빠르게 경련하는 FDB 근육 섬유의 수축 속도를 줄이기 위해 25°C에서 수행되어 수축 이벤트의 언더샘플링을 방지합니다. - 초점 슬라이더 막대를 조정하여 섬유에 초점을 맞춥니다. 또는 이 초점 기능에 W 키와 S 키를 사용합니다.
- 페이싱을 활성화하여 전기 자극을 시작합니다. 이제 섬유가 경련을 일으키는 것을 관찰하십시오.
알림: 섬유가 경련을 일으키지 않으면 모든 전선이 연결되어 있고 페이서가 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오. 이 후에도 여전히 움직임이 없으면 분쇄 중 과소화 또는 과도한 손상으로 인해 섬유가 반응하지 않을 수 있습니다. - sarcomeres가 수직으로 달릴 수 있도록 섬유 끝에 측정 영역을 집중시킵니다. sarcomeres가 초점이 맞는지 확인하십시오. 근관에 초점이 맞춰져 있으면 도구 모음에 단일 피크가 표시됩니다. 수축하는 동안 이 피크는 근관이 짧아짐에 따라 오른쪽으로 이동합니다.
알림: 보라색 측정 영역은 실험을 시작하기 전에 조정할 수 있습니다. 적절한 측정을 위해 ~20개의 sarcomeres를 포함하십시오. 수축 중에 이 피크의 모양이 변하면 수축 중에 근관이 가려지거나 초점이 맞지 않아 노이즈가 발생한다는 것을 나타낼 수 있습니다. - 도구 모음에서 시작을 클릭하여 실험을 시작합니다. Q 키를 눌러 측정을 시작하고 프로그램이 10개의 수축 과도 현상을 측정할 때까지 기다립니다. 4개 이상의 과도 현상이 노이즈가 없는 것처럼 보이면 Z 키를 눌러 측정을 수락합니다. 과도 현상에 노이즈가 너무 많으면 X 키를 눌러 측정을 거부합니다.
- 조건당 10개에서 20개 사이의 섬유를 측정합니다. 이전에 측정된 섬유의 위치는 유지됩니다.
- 선택 사항: 화합물을 추가하면 이 시점에서 섬유를 다시 측정할 수 있습니다.
- 실험이 완료되면 아래쪽 도구 모음의 중지 버튼을 눌러 세포 찾기 창을 닫습니다. 파일을 저장하고 새 파일을 시작합니다.
- 데이터를 분석하려면 "Cytosolver desktop"프로그램을여십시오. 가져오기를 클릭하고 분석할 파일을 선택합니다.
- 프로그램에서 분석을 완료한 후 파란색, 빨간색 및 회색 피크를 찾습니다. 파란색 피크는 프로그램에서 허용하는 과도 현상입니다. 빨간색 피크는 프로그램에서 거부된 과도 현상이고 회색 피크는 사용자가 거부한 과도 현상입니다.
참고: 거부 기준은 분석 소프트웨어에서 조정할 수 있습니다. 일반적으로, 값이 최대 미분 한계를 초과하면 값이 기각되고, 과도 값은 곡선 적합도R2 값 <0.95에 기초하여 기각된다. - 내보내기를 클릭합니다. 다음 상자를 선택합니다: Averaged transient data and export to excel.
- 완료되면 모든 기계를 끕니다. 배양 접시를 꺼내 폐기하십시오. 페이서 전극을 탈이온수와 70% 에탄올로 청소합니다.
Representative Results
이 프로토콜을 사용하여 단일 FDB 근육 섬유를 분리하고 하이드로겔에 매립했습니다. 근육 해부 절차의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. FDB 근육은 온전한 힘줄로 노출되고 근막에서 느슨해집니다. 근육의 힘줄을 고정 지점으로 유지하면 격리 절차 동안 근육 섬유의 잠재적 손상을 최소화할 수 있습니다. 과도한 결합 조직은 파편과 2차 세포 유형의 성장을 줄이기 위해 잘라낼 수 있습니다. 근육이 절제되고 충분히 세척되면 콜라겐 분해 효소를 사용하여 근육을 효소로 소화하고 분리 된 세포를 하이드로 겔에 매립하기 전에 분쇄하여 단일 근육 섬유를 방출합니다. FDB 근섬유의 분리는 비교적 짧은 근섬유를 제공하여 쉽게 조작할 수 있다는 장점이 있습니다. 크기 때문에 FDB 근섬유는 엉킴으로 인한 손상 없이 안전하게 피펫팅할 수 있으며 하이드로겔 내에 쉽게 삽입됩니다. 단일 근섬유는 배양 플레이트에 잘 부착되지 않기 때문에 하이드로겔에 섬유를 내장하면 세포 배양 및 수축 측정 중에 섬유가 그대로 유지됩니다. 또한, 피브린 겔에 기저막 매트릭스를 추가하면 근육 섬유와 매트릭스 사이의 상호 작용이 가능하여 기본 생체 내 환경을 모방합니다. 분리된 단일 근육 섬유는 분리 후 며칠 동안 배양에서 조작 및 유지될 수 있습니다. 그림 2에는 하이드로겔 매트릭스에 내장된 분리된 FDB 섬유의 예가 나와 있습니다. 건강한 섬유는 눈에 띄는 근섬유가 있고 직선으로 뻗어 있는 반면(파란색 화살표), 구부러진 섬유는 일반적으로 손상되거나 생존할 수 없으므로(노란색 화살표) 측정에서 제외해야 합니다. 과수축된 섬유는 매트릭스에서 어두운 뭉툭한 물체로 나타납니다(빨간색 화살표). 격리 절차가 성공적이라면 건강한 섬유의 비율은 ~75%가 되어야 합니다. 과수축 섬유의 비율이 높을수록 일반적으로 격리 절차 중 손상을 나타냅니다. 근육 섬유의 막은 근육의 과다 소화 또는 분쇄 중 섬유 손상으로 인해 손상 될 수 있습니다. 파열 손상은 주로 근육이 소화가 잘 되지 않아 쉽게 분해되지 않는 경우에 발생합니다.
섬유 기능과 생존력은 광학 기반의 고처리량 수축 측정 시스템을 사용하여 근육 섬유의 수축 측정을 통해 평가되었습니다. 시스템은 근사 길이, 근사 단축 백분율, 수축 속도, 이완 속도와 같은 여러 파라미터를 출력합니다. 수축 측정 시스템을 사용하여 근섬유당 육근 수축을 측정할 수 있습니다. 그림 3 은 측정 시스템을 사용하여 측정된 근섬유 수축의 예를 보여줍니다. 단일 수축 과도에서 기준선에서의 근종 길이, 수축 기간, 최대 수축에서의 육종 길이 및 이완 기간과 같은 매개변수가 얻어집니다(그림 3A). 이 매개변수는 육종 단축, 수축 및 이완 속도의 백분율을 계산하는 데 사용됩니다. 필요한 경우 지속 시간 및 절대 단축 값에서 평균 속도 값을 계산할 수도 있습니다. 유효한 수축 측정은 직선 기준선, 피크로의 하락 및 기준선으로의 복귀를 특징으로 합니다(그림 3A). 노이즈, 초점이 맞지 않는 근혜 또는 광섬유의 비정상적인 움직임은 과도 측정에 영향을 줄 수 있으며(그림 3B, C) 이러한 측정은 수동으로 폐기하거나 분석 프로그램에 의해 거부될 수 있습니다. 이 접근 방식에서는 육종의 명확한 시각화가 수축을 측정하는 데 중요합니다. 따라서 sarcomeres의 가시성을 감소시키는 것은 소음을 유발할 수 있습니다. 이것은 수축하는 동안 초점면 외부에서 육근의 움직임이 있는 경우에 발생할 수 있습니다. 일련의 수축이 속도 또는 깊이가 다른 측정도 데이터 세트에서 제외해야 합니다.
이 시스템으로 얻은 단일 근육 섬유의 수축 데이터는 다양한 배양 조건을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 시스템의 효율성은 그림 4에 나와 있습니다. 여기에서 우리는 2D(라미닌 코팅 배양 플레이트) 및 3D(피브린 하이드로겔) 배양 형식 모두에서 FDB 근육 섬유의 수축을 측정했습니다. 3D에서 사용 가능한 측정의 비율이 더 높았는데, 이는 겔에 섬유를 내장하면 측면 이동 및 기타 이동 아티팩트가 측정에 영향을 미치는 것을 방지할 수 있기 때문입니다(그림 4A). 섬유를 매립하는 것은 2D 배양된 섬유와 비교하여 근종 단축 또는 최대 수축 속도 값에 큰 영향을 미치지 않았습니다(그림 4B). 서로 다른 매트릭스가 FDB 근섬유의 수축에 어떤 영향을 미치는지 설명하기 위해 이 피브린 하이드로겔을 순수한 기저막 매트릭스(4mg/mL)와 비교했습니다(그림 4C). 순수한 기저막 매트릭스에서 관찰된 감소된 수축성은 겔의 강성 또는 증가된 세포-매트릭스 상호작용 때문일 가능성이 높습니다. 최대 7mg/mL의 피브린 농도도 테스트되었으며 수축 속도 및 단축에 큰 영향을 미치지 않습니다(미공개 데이터). 이 피브린 기반 하이드로겔을 사용하면 수축 매개변수에 대한 간섭을 최소화할 수 있습니다.
그림 1: FDB 근육 해부 절차의 개요. (A) 뒷다리를 발목 위로 절단하고(빨간색 점선), (B) 파란색 점선을 따라 발 상단을 절단하여 피부를 제거합니다. (C) 발은 발목과 발가락의 피부를 통해 고정됩니다. (D) 노출된 근육과 주변 결합 조직의 현미경 관찰. 근막은 혈관 구조가 통과하는 흰색 불투명 층으로 보입니다. (E) 근막이 근육에서 제거되고 힘줄이 빨간색 점선을 따라 절단됩니다. (F) FDB 근육은 근육 아래 및 근육을 따라 들어 올리고 절단하여 기본 조직에서 분리됩니다. (G) 발가락의 힘줄이 선명하게 보이면 FDB가 빨간색 점선을 따라 느슨해집니다. (H) FDB는 힘줄에 의해 고정되고 네 번째 측면 힘줄과 그 섬유는 빨간색 점선을 따라 절단하여 제거할 수 있습니다. 이제 과도한 근막을 제거할 수 있습니다. (I) 세척 후 FDB 근육을 콜라게나제 용액으로 옮깁니다. 스케일 바 = (D-I) 2mm. 약어: FDB = flexor digitorum brevis. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 배양 24시간 후 하이드로겔에 박힌 FDB 근섬유의 현미경 이미지. 파란색 화살표: 생존 가능한 FDB 근섬유의 예. 노란색 화살표: 꼬인 FDB 근섬유의 예. 꼬인 근육 섬유는 생존력이 감소하고 수축이 손상될 수 있으므로 측정에서 제외해야 합니다. 빨간색 화살표: 과수축된 FDB 근육 섬유의 예. 과도한 과수축은 분쇄가 너무 격렬하게 수행되거나 콜라게나제 과소화 또는 비평형 배양 배지의 사용으로 인해 발생할 수 있습니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: FDB = flexor digitorum brevis. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 광학 기반의 고처리량 수축 시스템을 사용하여 측정된 섬유 수축 과도 현상의 예. (A) 정상 수축 과도 현상의 예. 이 과도 현상은 아래쪽 도구 모음에 표시된 보라색 사각형으로 둘러싸인 sarcomeres에서 가져옵니다. 과도 현상은 기준선에서의 육종 길이(녹색), 수축 기간(파란색), 최대 수축 시의 육종 길이(보라색) 및 이완 기간(빨간색)의 구성 요소로 구성됩니다. 속도 및 수축률과 같은 매개변수는 이러한 값에서 계산됩니다. (B) 부적절한 수축 과도의 예. 이러한 측정은 노이즈로 인해 sarcomere 신호가 포착되지 않을 때 발생합니다(빨간색 화살표 참조). (C) 움직임 아티팩트가 있는 수축 과도 현상의 예(녹색 화살표 참조). 움직임 아티팩트는 수축 중에 근육 섬유가 초점 밖으로 이동할 때 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 2D와 3D 조건 및 다양한 하이드로겔을 비교할 때 광학 기반 고처리량 수축 시스템을 사용하여 얻은 대표적인 데이터입니다 . (A) 30개의 측정을 기반으로 2D 배양 및 3D 배양에서 데이터 분석 프로그램에 의해 발견된 허용 및 거부된 수축 측정의 백분율. (B) 배양 24시간 후 3마리의 마우스에서 분리된 2D 배양 및 3D 배양 근육 섬유의 최대 수축 속도 비교. (C) 배양 24시간 후 3마리의 마우스에서 분리된 2D 배양 및 3D 배양 근육 섬유의 육종 단축 비교. (D) 배양 24시간 후 3마리의 마우스에서 분리된 순수 기저막 매트릭스(Matrigel) 포매 및 피브린 하이드로겔 포매 근육 섬유의 최대 수축 속도 비교. (E) 배양 24시간 후 3마리의 마우스에서 분리된 순수 기저막 기질(Matrigel) 포매 및 피브린 하이드로겔 포매 근육 섬유의 육종 단축 비교. 데이터는 스튜던트 t-검정을 사용하여 분석되었으며 평균 ± SD로 표시됩니다. 각 데이터 포인트는 하나의 근섬유입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 근육을 해부하는 데 사용되는 해부 배지, 분리된 근육 섬유를 배양하는 데 사용되는 피브린 배양 배지 및 분리된 근육을 효소적으로 소화하는 데 사용되는 근육 소화 배지의 조성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 하이드로겔을 캐스팅하는 데 사용되는 세포 혼합물과 하이드로겔을 캐스팅하는 데 사용되는 매트릭스 혼합물의 조성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에서는 3D 배양 형식으로 FDB 근섬유의 효소 분리 및 배양을 수행한 후 광학 기반 수축 측정 시스템을 사용하여 수축 측정을 수행하는 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 1) 단일 근육에서 많은 온전한 근육 섬유를 간단하고 시기 적절하게 분리하는 것을 포함하여 여러 가지 장점이 있습니다. 2) 조정가능한 하이드로겔 매트릭스에 근섬유를 포매하는 단계; 3) 광학 기반 시스템을 사용한 고처리량 수축성 측정의 성능; 4) 개입 후 동일한 근육 섬유를 반복적으로 측정하는 능력. 단일 살아있는 근육 섬유의 분리는 수축 기능을 유지하는 성숙한 근육 세포를 제공합니다. 마우스 FDB에서 얻은 근섬유는 상대적으로 작기 때문에 분리 중에 쉽게 조작할 수 있고 직선 모양을 유지하여 다운스트림 수축 측정이 가능합니다. 이 시스템은 주로 심근 세포 수축을 연구하기 위해 개발되었지만, 골격근 섬유는 쉽게 구별 할 수있는 육근 패턴을 가진 동일한 수축 기계를 포함하므로이 시스템을 사용하여 측정 할 수도 있습니다29. 단일 세포 수축 측정과 생체 외 근육 섬유 배양의 결합은 전기적 활성화에 대한 반응으로 성숙한 근육 섬유 건강 및 기능을 평가하는 강력한 도구입니다.
해리된 근육 섬유 사용의 한계는 섬유에 가해지는 외력(즉, 수동적 스트레치)이 부족하여 생체 내에서 발견되는 것보다 휴식 근관 길이가 더 짧다는 것입니다. 2.4-2.5 μm의 육종 길이는 최적의 힘 생산을 보장하지만, 휴식 근관 길이는 크게 다를 수 있습니다33. FDB의 생체 내 휴식 육종 길이는 아직 설명되지 않았지만, 우리 자신의 미공개 데이터는 평균 길이가 2.2μm임을 시사합니다. 현재 결과는 배양 24시간 후 로드되지 않은 FDB 섬유에서 ~1.95μm의 평균 휴지기 육종 길이를 보여줍니다(그림 3). 이 낮은 휴식 sarcomere 길이는 더 낮은 힘 생산을 초래하지만, ~ 1.95 μm의 길이는 여전히 최대 힘34의 >90 %를 생성해야합니다. 따라서 이러한 육종 길이는 서로 다른 유전 모델 간의 또는 약물 치료 후 섬유 기능의 차이를 결정하기에 충분해야 합니다. 또한, 하이드로겔에 섬유를 매립하면 자유 부동 2D 배양 섬유에 비해 접착력에 대한 많은 추가 지점을 제공하여 시간이 지남에 따라 추가 육종 단축을 제한할 수 있습니다.
이 근섬유 분리 프로토콜의 한 가지 장점은 장신근(EDL)과 같은 다른 근육과 비교할 때 상대적으로 작은 근섬유로 구성된 쉽게 해부되는 속근근을 사용한다는 것입니다. 크기가 작을수록 근육 분리가 분쇄 기반 분리에 더 적합하므로 근육 섬유에 피펫 또는 엉킴으로 인한 손상 가능성이 줄어듭니다. FDB 근육의 세포외 기질은 콜라겐 분해 효소로 쉽게 분해 될 수 있으므로 단기간에 수백 개의 근육 섬유를 분리 할 수 있습니다. 그러나 과소화는 근육 섬유에 손상을 줄 수 있습니다. 근육 섬유의 과소화는 근육을 분쇄할 때 근육이 거의 즉시 떨어져 나갈 때 또는 세포 파종 절차 중에 세포 부피의 많은 부분이 과수축될 때 인식할 수 있습니다. 근육의 과소화를 방지하려면 각 콜라게나제 배치에 대해 소화 시간을 최적화해야 합니다. 이를 테스트하기 위해 두 개의 FDB 근육을 병행하여 소화해야 하며 그 사이에 5분의 시차를 두고 소화해야 합니다. 생존 가능한 근육 섬유의 수율이 가장 높은 소화 시간을 선택해야합니다. 그런 다음 이 최적화를 두 번째로 수행해야 하며, 다시 분해 시간에 5분의 분리를 수행해야 합니다. 가장 높은 생존 가능한 근육 섬유를 생성하는 소화 시간은 현재 콜라게나제 배치에 대한 최적의 소화 시간으로 사용되어야 합니다. 콜라게나제의 배치 간 변동성을 제한하는 또 다른 방법은 원액의 밀리리터당 활성 단위를 직접 계산한 다음 후속 콜라게나제 배치를 동일한 양으로 재구성하는 것입니다. 마지막으로, 소화 시간은 예를 들어 증가된 세포외 기질 침착을 나타내는 노화되거나 병든 동물을 연구하는 경우 다양한 마우스 균주에 걸쳐 최적화되어야 할 수 있습니다35,36.
생존 가능한 분리된 근섬유를 피펫팅할 수 있는 가능성은 다양한 배양 조건에서 FDB 근섬유를 배양할 수 있는 가능성을 열어줍니다. 이러한 옵션 중 하나는 천연 조직 배양 환경을 모방하기 위해 하이드로겔에서 이러한 섬유를 배양하는 것입니다. 이 임베딩 프로토콜은 수축 측정 중에 섬유가 제자리에 유지되도록 보장하고 겔이 굳기 전에 섬유가 플레이트 바닥에 가라앉을 수 있도록 최적화되었습니다. 그러나 이 프로토콜은 트롬빈과 피브리노겐 스톡의 차이를 수용하기 위해 조정해야 할 수도 있습니다. 트롬빈 활성이 너무 높으면 젤이 조기에 굳어지고 섬유가 현미경의 초점면 외부의 더 높은 위치에 부유 상태를 유지할 수 있습니다. 이 경우 트롬빈:피브리노겐 비율을 조정해야 합니다. 이것은 점점 더 낮은 트롬빈 농도로 섬유를 도금하고 중합에 걸리는 시간을 기록하여 테스트할 수 있습니다. 일반적으로 이 작업은 30분보다 빠르지 않아야 합니다. 그러나, 너무 낮은 트롬빈 농도를 갖는 것은 또한 중합 과정을 손상시킬 수 있다. 섬유가 올바른 초점면에 있는지 확인하는 또 다른 방법은 먼저 2D 프로토콜을 사용하여 시드한 다음 배양 플레이트에 부착된 후 섬유 위에 하이드로겔 층을 추가하는 것입니다. 그러나 섬유에서 매체를 제거하면 건조에 민감하기 때문에 과수축을 유발할 수 있음을 알아야 합니다. 하이드로겔이 배양 접시에 완전히 부착되는지 여부도 불분명하며 더 쉽게 느슨해질 수 있습니다. 따라서 이 매립 절차는 섬유를 생존 가능하게 유지하고 수축 측정을 위해 제자리에 유지하는 데 바람직합니다.
이 프로토콜의 사용은 생체 외에서 성숙한 근육 섬유의 수축 역학을 연구할 수 있게 하며 건강한 마우스와 근육 질환에 대한 유전적 돌연변이를 가진 마우스 모두에 적용할 수 있습니다. 마찬가지로, 배양 조건이나 화합물 첨가가 근육 섬유 기능에 어떤 영향을 미치는지 테스트할 수 있습니다. 광학 기반 시스템을 사용하여 얻은 수축성 데이터는 살아있는 단일 근육 섬유의 수축 능력을 나타내며 이 능력의 변화는 섬유 건강과 상관관계가 있을 수 있습니다. 그러나 이러한 데이터만으로는 이러한 변화가 근육 수축의 액틴-미오신 교차 가교 또는 칼슘 방출 단계에서 발생하는지 여부를 결정하기에 충분하지 않습니다. 이 프로토콜에서 칼슘 신호 전달을 측정하는 방법을 설명하지는 않지만, 이 설정은 수축하는 근육 세포에서 Fura 기반 칼슘 과도 현상을 측정할 수도 있습니다29. 이 시스템의 단점은 FDB 근육이 속근 IIa형/IIx형 근섬유만을 함유하고 있고, 이 크기의 저속 경련 I형 섬유를 함유하는 근육은 아직 설명되지 않았다는 것이다 37. 이것은 이 방법을 사용하여 섬유 유형별 기능을 연구하는 능력을 제거합니다. 여기서 제안하는 프로토콜은 섬유 유형 차이를 연구하기 위해 EDL 또는 가자미근과 같은 다른 근육에 잠재적으로 적용될 수 있습니다. 크기가 더 크기 때문에 이 프로토콜은 이러한 근육에 대해 추가로 최적화되어야 합니다. 더 긴 섬유는 중력 침강 단계에서 엉키는 경향이 있으며 피펫팅으로 조작하면 파열되어 수율이 낮아집니다. 따라서 피펫팅과 호환되지 않기 때문에 더 긴 섬유는 겔 임베딩 기술과도 호환성이 떨어집니다. 이러한 섬유의 측정은 여전히 2D 배양 형식으로 수행할 수 있지만 섬유는 크기 때문에 수축 중에 더 많이 움직일 수 있으므로 신호 대 잡음비에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 시스템의 또 다른 한계는 다른 온전한 근섬유 제제(28)를 사용하여 얻을 수 있는 힘 측정과 같은 수축성 측정과 함께 힘 측정을 수행할 수 없다는 것이다. 그러나 이러한 제한은 근섬유에 의해 생성되는 힘을 추정함으로써 우회할 수 있습니다. 근섬유의 발생력은 수축 및 이완 상태 동안의 근섬유 형태와 매트릭스의 영률(Young's modulus)이 알려져 있는 경우 추정할 수 있다25. 그럼에도 불구하고 이 광학 기반 시스템은 근육 수축 기능을 연구하기 위한 사용하기 쉬운 고처리량 접근 방식을 제공하고 유전적 근육 질환 및 치료 개입을 연구하기 위한 다양한 새로운 가능성을 열어줍니다.
Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 이 프로토콜을 개발하는 데 도움을 준 기술 전문 지식을 제공한 Sylvia Bogaards, Sanna Luijcx, Valentijn Jansen, Michiel Helmes 및 Emmy Manders에게 감사를 표합니다. 이 연구는 근이영양증 협회 (T.J.K에 MDA603238 개발 상), 네덜란드 심혈관 연합 (TJK에 재능 보조금) 및 국립 보건 및 의료 연구위원회 (NHMRC, 호주; 친교 APP1121651 M.Y).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aprotinin, from Bovine Lung | Thermo Scientific | AAJ63039MC | 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Collagenase type 2 | Worthington | 77336 | 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma Aldrich | 50-176-5054 | 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413201 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Gibco MEM High glucose + pyruvate | Thermo Fisher | 11095080 | |
| Horse serum | Thermo Fisher | H1270 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Serum Replacement 2 (50x) | Sigma Aldrich | S9388 | |
| Thrombin, Bovine Plasma | Thermo Scientific | AAJ63383EXP | 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Tranexamic Acid | Thermo Scientific | AC228042500 | 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Equipment | |||
| 24-well electrical stimulator | IonOptix | N/a | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| MultiCell Cytocypher | IonOptix | N/a | |
| MyoCam-S3 | IonOptix | N/a | |
| MyoPacer | IonOptix | N/a | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent | Dow corning | N/a | |
| Vannas Spring Scissor - 25 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Software | |||
| CytoSolver | IonOptix | N/a | |
| IonWizard | IonOptix | N/a |
References
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