Summary
本协议描述了如何在人体中进行 64CuPET / CT和PET / MRI成像，以研究铜相关疾病，例如威尔逊病，以及对铜代谢的治疗效果。
Abstract
铜是一种必需的微量元素，在生物系统中起到催化和信号传导的作用。几十年来，放射性标记的铜一直被用于研究基本的人类和动物铜代谢和铜相关疾病，如威尔逊病（WD）和门克氏病。该工具包的最新成员是 64 铜 （64Cu） 正电子发射断层扫描 （PET），它将现代计算机断层扫描 （CT） 或磁共振成像 （MRI） 扫描仪的精确解剖成像与 64Cu PET 示踪信号的生物分布相结合。这允许 体内跟踪铜 通量和动力学，从而直接可视化人类和动物铜器官的交通和代谢。因此， 64Cu PET非常适合评估临床和临床前治疗效果，并且已经证明了准确诊断WD的能力。此外， 64项Cu PET / CT研究已被证明在癌症和中风研究等其他科学领域具有价值。本文展示了如何在人体中进行 64Cu PET/CT 或 PET/MR。此处演示了 64Cu 处理、患者准备和扫描仪设置的程序。
Introduction
铜是一种重要的催化辅助因子，驱动生命所必需的多种重要生化过程，而铜稳态缺陷是人类疾病的直接原因。编码铜转运ATP酶的ATP7A或ATP7B基因突变分别导致Menke和Wilson病。门克氏病 （ATP7A） 是一种罕见的肠道铜过度积累致死性疾病，伴有外周组织严重铜缺乏和铜依赖性酶缺陷1。威尔逊病（WD）（ATP7B）是一种罕见的疾病，其特征是无法将多余的铜排泄到胆汁中，导致铜过载和随后的器官损伤，最严重的是影响肝脏和大脑2。
几十年来，对铜代谢的研究一直使用放射性标记的铜（通常是64-铜[64 Cu]或67-铜），这些研究已被证明对于我们了解哺乳动物铜代谢（包括吸收部位和排泄途径）非常宝贵3，4，5，6。以前，伽马计数器用于以有限的解剖分辨率检测放射性信号，但最近，64Cu正电子发射断层扫描 （PET） 结合计算机断层扫描 （CT） 或磁共振成像 （MRI） 已被引入人类和动物研究。如今，PET扫描仪具有如此高的灵敏度，可以在注射后长达70小时跟踪64Cu。64Cu的半衰期为12.7小时，可以长期评估铜助焊剂。这种分辨率的提高最近才进入铜研究领域，关于正常和病理性铜代谢的研究，以及评估特定治疗影响的研究，开始出现。此外，具有扩展视野的全身PET扫描仪的引入将进一步提高这些检查的灵敏度。
该方法论文旨在使临床医生和科学家能够在现有的工具库中添加64Cu PET CT / MRI，作为一种强大且易于使用的方法，以核医学部门之间可比的方式评估铜代谢。64铜的生产可以使用不同的方法进行，通常在特殊设施中进行。在核反应中，广泛使用64 Ni（p，n）64 Cu方法，因为在该路线7，8中，低能质子可以获得64Cu的高产率。 生产方法的详细说明超出了本工作的范围，可用性将因国家和地区而异。
在本文中，我们首先描述必要的放射化学和示踪剂的制备。然后，演示了制备PET / CT或PET / MRI扫描仪的原理。
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Protocol
丹麦中部地区伦理委员会已批准一些使用该 64Cu PET/CT 或 PET/MRI 方案的临床试验 [1-10-72-196-16 （EudraCT 2016-001975-59）、1-10-72-41-19 （EudraCT 2019-000905-57）、1-10-72-343-20 （EudraCT 2020-005832-31）、1-10-72-25-21 （EudraCT 2021-000102-25） 和 1-10-72-15-22 （EudraCT 2021-005464-21）]。在入组时获得参与者的书面知情同意。所有受试者的纳入标准均为>18岁，女性为使用安全避孕措施。威尔逊病患者的排除标准是失代偿性肝硬化、终末期肝病模型（MELD）评分>11或改良的Nazer评分>6。所有受试者的排除标准是已知对示踪剂配方中的 64铜或其他成分过敏，怀孕，母乳喂养或在试验结束前怀孕的愿望。
1. 64CuCl2的制备
- 将固体64CuCl2溶解在盐酸（0.1M）中，并加入乙酸钠缓冲液（0.5M）以将pH值提高至~5。用盐水配制并过滤，通过0.22μm过滤器对溶液进行灭菌（见材料表）。
注意：醋酸钠缓冲液（0.5 M）由醋酸钠三水合物和无菌水制成，通过0.22μm灭菌过滤器。 - 为了对产生的 64CuCl2 溶液进行质量控制，请进行 pH 测量、细菌内毒素测试、放射化学纯度测定和放射性核素鉴定7，8。
- 将产品储存在室温下的铅容器中，并保持检疫，直到满足所有质量控制规范。
注意：对于本研究，生产了 64CuCl2 ，放射性核素纯度≥99%，放射化学纯度≥95%。用作起始材料的固体 64CuCl2是从商业来源获得的（见 材料表）。
2. PET扫描仪的制备
- 按照制造商的协议对扫描仪进行质量检查（QC）9 （参见 材料表）。
注意：QC必须在每天早上患者扫描前进行。
3.静脉注射（IV）注射和每次口服（PO）给药的示踪剂图纸
- 戴上塑料手套，从铅容器上取下盖子。
- 使用长镊子用消毒棉签对铅容器内含有示踪剂的玻璃瓶的橡胶膜进行消毒。
- 使用镊子将短插管（~0.5 mm x 16 mm）插入膜中，以避免瓶内真空溢出。
- 使用镊子插入更长的套管以抽取。这个套管应该足够长，以到达瓶子的底部（通常为50毫米）。
- 确保剂量校准器（见 材料表）校准为 64Cu。 计算第一次抽取的近似体积。
注意：从化学质量控制报告中，将提供液体的活性量和体积，从而可以计算要绘制的近似体积。 - 戴上塑料手套，将适当大小的塑料注射器插入长套管中，并绘制计算出的体积。该体积将取决于产品中64Cu的浓度以及为方案确定的64Cu量（参见代表性结果下的剂量计算）。
- 使用镊子握住套管，同时将注射器移动到剂量校准器以测量放射性。
- 继续绘制，直到达到适当的放射性量。注射后，大约5%的示踪剂将保留在注射器和套管中。
注意： 64Cu 不应在盐水中稀释，因为示踪剂可能会沉淀。因此，注射后不能用盐水冲洗注射器（这与PO给药无关）。 - 用镊子，使用带盖的套管（~16毫米套管）关闭注射器并将其储存在铅容器中直至应用。
4. 示踪剂的应用
- 静脉注射
- 插入静脉插管（~22 G，25 mm），最好在肘静脉中，并用盐水冲洗以确保正确放置。
注意：应提供一份工作表，其中包含参与者的姓名，用于示踪剂质量控制发布的印章或签名，以及用于绘图，注射和剩余示踪剂的时间点和放射性。 - 使用可用的剂量校准器测量注射器中的放射性，并在工作表上记下时间和活性。
- 将铅容器中的注射器运送到参与者的床边。
- 如果注射发生任何溢出，请将餐巾纸放在参与者的肘部下方，以便测量溢出的放射性。
- 用镊子从注射器上取下盖子/套管，并戴上塑料手套，将注射器连接到IV通路。记下工作表上的时间，然后以一个稳定的运动注入。
注意：如前所述，注射器不应用盐水冲洗，因为示踪剂可能会沉淀。 - 从IV通路中取出注射器，戴上盖子/套管，如有必要，将其与餐巾纸一起放入铅容器中。
- 用盐水冲洗静脉通路。
- 注意工作表上注射器中的时间和剩余放射性。
注意：注射活性计算为注射前后注射器活性之间的差异，但使用PET扫描协议来校正衰减。因此，当扫描参与者时，所有三个时间点（抽吸、注射和剩余测量）以及抽吸和剩余测量处测量的放射性都输入到 PET 扫描协议中（参见步骤 5）。 - 根据机构安全规定适当处理剩余材料。
- 移除静脉输液通道。如果出现任何过敏反应，请将静脉通路留置30分钟。
- 插入静脉插管（~22 G，25 mm），最好在肘静脉中，并用盐水冲洗以确保正确放置。
- 口服
注意：应提供一份工作表，其中包含参与者的姓名，用于示踪剂质量控制发布的印章或签名，以及用于绘图，管理和剩余示踪剂的时间点和放射性。- 在一次性柔软的塑料杯中，倒入约 100 毫升的水或甜水; 64Cu是无味的。应提供一次性塑料吸管和小型一次性塑料袋。
- 使用可用的剂量校准器测量注射器中的放射性，并在工作表上记下时间和活性。
- 将铅容器中的注射器运送到参与者的床边。参与者应坐在床或椅子上。
- 用镊子从注射器中取出盖子/套管，戴上塑料手套，将示踪剂注入杯中，小心不要溢出任何。取一点水/亲切，然后再次注入杯中。
- 在杯子里放一根塑料吸管（这是为了尽量减少参与者喝水时溢出的风险）。
- 记下工作表上的时间，让参与者喝酒。杯子应该尽可能空。
- 将空杯子和吸管放入带有空注射器的一次性塑料袋中，并将它们放入铅容器中。
- 注意时间并测量注射器中剩余的放射性。在工作表中注明。
注意：注射活性计算为注射前后注射器活性之间的差异，但使用PET扫描协议来校正衰减。
因此，当扫描参与者时，所有三个时间点（抽吸、注射和剩余测量）以及抽吸和剩余测量处测量的放射性都输入到 PET 扫描协议中（参见扫描）。
- 根据机构安全规定适当处理剩余材料。
注意：摄入后观察参与者的急性过敏反应30分钟可能是合适的。
5. PET扫描
- 将参与者置于扫描仪的仰卧位置。
- 执行概述 CT 或 MR 扫描以计划在 PET 扫描期间要检查的特定区域。
- 注意抽吸，注射和剩余测量的时间，以及PET方案中抽吸和剩余测量时的放射性。
- 按照以下步骤执行 PET 扫描。
注意：PET扫描协议必须针对同一研究的所有参与者的扫描持续时间和图像重建参数进行标准化;应遵循已发布的报告 10，11，12。- 执行静态PET扫描，示踪剂给药后扫描时间为4.5分钟/床位置长达24小时，示踪剂给药后扫描时间为10分钟/床位置长达68小时（有关进一步详细说明，请参阅代表性结果下的扫描）。
注意：在动态PET扫描期间，衰减被连续记录，随后分割成框架结构。这允许从短时间间隔中选择帧以强调 64Cu 分布的动态，并从较长的时间间隔中选择帧以优先考虑灵敏度。通常，在注射后立即选择较短的间隔，此后逐渐增加10。
- 执行静态PET扫描，示踪剂给药后扫描时间为4.5分钟/床位置长达24小时，示踪剂给药后扫描时间为10分钟/床位置长达68小时（有关进一步详细说明，请参阅代表性结果下的扫描）。
6. 图像重建
- 使用衰减、散射、飞行时间和点扩散函数的最佳可用校正重建图像。
注意：必须仔细选择图像重建参数以优化图像属性，例如信号恢复和信噪比。对于多中心研究，标准化中心之间的图像质量至关重要。
7. 数据分析
注意：本研究描述了一种量化肝脏中 64Cu含量的简单方法。PET信号以标准摄取值（SUV）测量，根据参与者体重注射活性和/或每毫升组织千贝克勒尔（kBq）调整的组织放射性浓度。
- 将数据下载到合适的程序，例如Dicom文件，到PMOD。
注意：可能有许多不同的程序可以分析PET图像，例如Hermes或PMOD（参见 材料表）。 - 调整 CT/MR 扫描音调以区分解剖结构。
- 确保解剖扫描和PET扫描重叠。
- 在水平面上用最好的MRI或CT扫描工作，定位肝脏和大结构。
- 在肝脏中放置适当体积的兴趣（VOI）或多个VOI。
注意：VOI是测量SUV的特定组织区域。VOI由多个感兴趣区域（ROI）组成，这些区域是一个平面中的组织区域。许多程序将球形VOI作为预设，这意味着不必绘制多个ROI（每个平面一个）即可构成VOI。右肝叶往往更均匀，因此是放置 VOI 的好位置。 - 将多个 VOI 放置在不同水平面的右肝叶中以实现最精确的活动测量，因为 SUV 在右肝叶中可能会有所不同 （~5%）。计算这些 VOI 的平均 SUV。
- 例如，为了量化整个肝脏中的SUV，请在每个平面上绘制涵盖整个肝脏体积的ROI以进行剂量学研究。
注意：使用此方法时，避免使用动脉和静脉等大型结构。
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Representative Results
剂量计算
根据剂量学计算，IV给药的有效放射性剂量为62±5μSv / MBq示踪剂10。因此，根据时间范围，建议使用 50 MBq 剂量。高达 75-80 MBq 适用于较长时间的检查，并提供高质量的图像，而不会超过道德认可的剂量。口服给药的有效剂量为113±1μSv / MBq示踪剂，这是由于示踪剂的肠道蓄积。因此，需要考虑较低的剂量，并且在注射后长达24小时，30 MBq足以产生高质量的图像。在施用示踪剂之前，应始终要求有生育能力的女性参与者进行阴性妊娠试验。
扫描
对于长时间的检查，按照 64Cu生物分布和动力学数小时或数天进行，PET检查作为多个单独的静态PET扫描进行。这允许患者在PET检查之间休息。调整每次PET检查的持续时间以获得最佳图像质量（即，随着注入的示踪剂衰减，扫描时间延长）。提供高质量图像的扫描时间的一个例子是示踪剂给药后4.5分钟/床位置长达20小时，示踪剂给药后10分钟/床位置长达68小时。较长的扫描时间可能会提供更好的图像质量，但过长的扫描对患者来说是不可行的和不舒服的。因此，扫描的长度受到实用性的限制。
数据分析
SUV是比较个体（由于体重调整）和比较干预前后相同个体的绝佳措施。VOI中SUV的标准偏差可从数据分析程序（例如PMOD）获得。该标准差在注射后随时间增加而增加，因为噪声增加。
图1显示了在健康受试者和WD10受试者中IV注射~70 MBq示踪剂后6小时和20小时体内的64Cu。这些图像在定性上很容易解释，因为64Cu在胆囊（图中很难看到），小肠和后来的结肠中迅速可见，同时它在患者的肝脏中积聚。肠道在患者的扫描中也可见，但这不是来自肠腔中的64Cu，而是来自肠道血管。肠道的64 Cu在整个肠道段上分布更均匀，而在健康受试者中，64Cu在信号较高的部分可见。通过将五个直径为10 mm的球形VOI放置在右肝叶的不同平面上，进一步量化肝脏中的64Cu含量，为每个参与者在器官中产生一个平均SUV，然后计算该组的平均SUV以进行比较组间。
图 1：PET 扫描显示静脉给药后健康和 WD 受试者的 64Cu 分布。 该图显示了IV注射~70 MBq示踪剂后6小时和20小时体内 的64Cu。 请点击此处查看此图的大图。
图2显示了使用口服示踪剂在两个个体中进行64次Cu扫描的结果。两者都是WD患者，但底部个体正在接受锌治疗，这表明锌治疗减少了肠道中的铜摄取，从而减少了肝脏的铜摄取;这是锌处理13的众所周知的效果。虽然口服示踪剂是摄取铜的生理方式，但可能难以用于诊断，因为64铜中只有50%从肠道吸收到体循环（大部分示踪剂进入肝脏）。然而，为了证明药物对铜摄取的影响，这可能是WD非常感兴趣的，该方法已被证明是有价值的11。这可以在图3中看到，其中同一个人在用锌11治疗4周之前和之后使用口服64Cu进行扫描。该研究假设是通过估计肝脏中的铜含量来量化锌对阻断肠道铜摄取的影响。该研究使用不同的锌盐和剂量方案进行，并证明了该方法在测试治疗效果方面的质量。该方法量化动物和人类其他治疗效果的能力正在测试中。
图 2：PET 扫描显示每次口服给药后两名 WD 患者中的 64Cu 分布。 上图患者未接受锌治疗，下图患者接受锌治疗。注意肝脏中的信号差异。描绘肝脏SUV的图表。 请点击此处查看此图的大图。
图3：药物对铜摄取的影响。PET / CT扫描在（A）和（B）锌治疗4周之前和之后口服64Cu。参与者是一个健康的人（注意胆囊中的64Cu，这在WD患者中是看不到的）。锌治疗将肝脏中的64铜含量降低到治疗前含量的50%左右（10名受试者）。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该方法与任何其他PET方法类似，但12.7小时的长半衰期提供了研究长期铜通量的机会（我们在IV示踪剂注射后长达68小时获得了良好的结果）。协议中的所有步骤都必须由熟悉PET的人员处理，尽管它们并不比任何其他PET检查更关键。
故障 排除
因为我们经常使用 64Cu进行长期研究，所以PET信号会比平时更嘈杂。在量化PET信号时，特别是在胆囊等较小的器官中，记住这一点很重要。胆囊中的信号很难与肝脏和结肠的溢出区分开来。在这种情况下，器官中央较小的VOI是最可靠的。
根据我们的经验，尽管静脉注射，肝脏中 64Cu的量在个体之间往往会有所不同（口服示踪剂必须预期肠道中示踪剂摄取的相当大的差异）。这限制了个人之间的比较，并要求使用比率而不是确定的数字。如果首选每次口服示踪剂给药，建议在摄入示踪剂之前将试验对象保持标准化饮食至少 24 小时，以限制个体内差异，因为不同的食物可能会干扰铜，从而干扰 64Cu 摄取11。
局限性
当使用64 Cu PET方法时，假设“热”铜（64Cu）的作用类似于体内的“冷”铜。然而，这并不确定，因此我们无法确定“热”铜在体内是否受到不同的对待。然而，从目前的结果来看，我们认为“热”铜的作用类似于“冷”铜。在健康个体中观察到20小时后血液放射性的增加，表明64Cu内置于铜蓝蛋白中。这种增加在WD患者中没有看到，由于他们的疾病，他们无法将铜构建到携带铜的蛋白质中。这一点以及患者缺乏示踪剂排泄指向64Cu充当“冷”铜。
尽管68小时对于放射性示踪剂来说是很长的时间，但它仍然应该被认为是体内铜发生情况的临时图像。一个例子是，即使在WD基因杂合子的个体中可以看到 停滞的64 Cu排泄，因此在20小时后肝脏中有更多的 64Cu，但他们没有肝脏疾病，因为从长远来看，他们不会积累铜。
到目前为止，尚不清楚短期铜积累（长达68小时）与肝脏和其他器官中的长期铜积累之间是否存在相关性。因此，该方法不能用于确定疾病的严重程度或药理学试剂的长期影响。然而，该方法在确定治疗的短期效果方面非常有用。它可用于测试治疗是否在铜摄入后 68 小时内增加胆道或尿排泄，或者治疗是否减少肠道铜摄取。
意义
在WD中使用 64Cu进行实验并不是一项新技术。事实上，示踪剂的静脉给药和放射性的血液测量可以追溯到 1950 年代14。如今，高分辨率PET扫描仪与CT或MR的组合为研究全身 64Cu的分布提供了独特的机会。使用动态PET，可以进一步阐明示踪剂的动力学特性。到目前为止，由于PET扫描仪的视野有限，对铜在全身的生物分布进行动力学分析是不可行的。目前，动态摄取仅限于肝脏和上腹部，但全身扫描仪的出现将使同时研究更大的区域成为可能。这将有助于检查在多个器官中注射 64Cu后的初始阶段，但鉴于注射后的晚期时间点与铜相关疾病更相关，全身扫描仪由于其更高的灵敏度，预计会更加重要。即使在低放射性水平下也能实现高质量成像，超越当前扫描仪的能力。
未来应用
在人类中，该技术已显示出诊断WD10 和量化不同治疗对铜摄取的影响的潜力11。在动物中，该方法已被证明能够通过量化 64Cu的肝潴留以及粪便排泄和血液动力学的变化来显示WD基因治疗的效果15。未来，预计 64Cu PET/CT 或 PET/MR 将在临床环境中用于 WD 的诊断和治疗评估。该方法也极有可能成为涉及WD新疗法的许多临床试验的一部分，特别是基因疗法，其中IV注射示踪剂的粪便排泄可能是效果的替代标志物15。目前没有关于大脑 64Cu摄取的良好数据，但这与WD的临床研究高度相关。
该技术尚未在Menke病中探索，但可能显示从肠道吸收铜和铜摄取到大脑作为治疗效果。该技术也可能在阿尔茨海默病等神经退行性疾病中具有潜力，其中铜代谢可能会改变16。
值得注意的是，随着64Cu-Dotatate在神经内分泌肿瘤（NET）诊断中的使用越来越多，64Cu在美国变得越来越广泛。此外，67Cu在癌症治疗诊断学中显示出潜力;因此，这种示踪剂也可能变得更加可用。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
由制造商Vilhelm Pedersen&Wife纪念基金会资助。该基金会在研究的规划或任何其他阶段都没有发挥任何作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 micrometer sterilizing filter | Merck Life Science | ||
| Cannula 21 G 50 mm | BD Microlance | 301155 | |
| Cannula 25 G 16 mm | BD Microlance | 300600 | |
| Dose calibrator | Capintec CRC-PC calibrator | ||
| PET/CT scanner | Siemens: Biograph | ||
| PET/MR scanner | GE Signa | ||
| PMOD version 4.0 | PMOD Technologies LLC | ||
| Saline solution 0.9% NaCl | Fresenius Kabi | ||
| Sodium acetate trihydrate BioUltra | Sigma Aldrich | 71188 | |
| Solid 64CuCl2 | Danish Technical University Risø | ||
| Sterile water | Fresenius Kabi | ||
| Venflon 22 G 25 mm | BD Venflon Pro Safety | 393280 |
References
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