Summary
이 글에서는 3차원 종양 스페로이드를 구성하기 위한 표준화된 방법을 보여줍니다. 자동화된 이미징 시스템을 사용한 스페로이드 관찰 및 이미지 기반 딥러닝 분석을 위한 전략도 설명합니다.
Abstract
최근 수십 년 동안 단층 배양 세포 외에도 3차원 종양 스페로이드가 항암제 평가를 위한 잠재적으로 강력한 도구로 개발되었습니다. 그러나 종래의 배양 방법은 3차원 수준에서 균질한 방식으로 종양 스페로이드를 조작하는 능력이 부족합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 본 논문에서는 평균 크기의 종양 스페로이드를 구성하는 편리하고 효과적인 방법을 제시합니다. 또한 전체 플레이트를 스캔하고 3차원 스페로이드에 대한 데이터를 얻을 수 있는 인공 지능 기반 분석 소프트웨어를 사용한 이미지 기반 분석 방법에 대해 설명합니다. 몇 가지 매개 변수가 연구되었습니다. 표준 종양 스페로이드 구성 방법과 고처리량 이미징 및 분석 시스템을 사용하면 3차원 스페로이드에서 수행되는 약물 테스트의 효과와 정확성을 크게 높일 수 있습니다.
Introduction
암은 인간이 가장 두려워하는 질병 중 하나이며, 특히 높은 사망률때문에 1. 최근 몇 년 동안 새로운 치료법이 도입됨에 따라 암 치료 가능성이 높아졌습니다 2,3,4,5. 2차원(2D) 및 3차원(3D) 체외 모델은 실험실 환경에서 암을 연구하는 데 사용됩니다. 그러나 2D 모델은 항종양 민감도를 나타내는 모든 중요한 매개변수를 즉각적이고 정확하게 평가할 수 없습니다. 따라서 약물 치료 테스트에서 생체 내 상호작용을 완전히 나타내지 못한다6.
2020년부터 글로벌 3차원(3D) 문화 시장이 크게 성장했습니다. NASDAQ OMX의 한 보고서에 따르면 3D 세포 배양 시장의 글로벌 가치는 2025년 말까지 27억 달러를 초과할 것입니다. 2D 배양 방법과 비교하여 3D 세포 배양은 증식 및 분화뿐만 아니라 장기 생존을 위해 최적화할 수 있는 유리한 특성을 나타냅니다 7,8. 이러한 수단을 통해 생체 내 세포 미세 환경을 시뮬레이션하여 보다 정확한 종양 특성화와 대사 프로파일링을 얻을 수 있으므로 게놈 및 단백질 변화를 더 잘 이해할 수 있습니다. 이로 인해 3D 테스트 시스템은 이제 주류 약물 개발 작업, 특히 새로운 항암제 스크리닝 및 평가에 중점을 둔 작업에 포함되어야 합니다. 스페로이드 구조에서 불멸화된 확립된 세포주 또는 일차 세포 배양의 3차원 성장은 저산소증 및 약물 침투와 같은 종양의 생체 내 특징뿐만 아니라 세포 상호작용, 반응 및 내성을 가지며, 시험관 내 약물 스크리닝을 수행하기 위한 엄격하고 대표적인 모델로 간주될 수 있습니다 9,10,11.
그러나 이러한 3D 배양 모델에는 해결하는 데 시간이 걸릴 수 있는 몇 가지 문제가 있습니다. 세포 스페로이드는 이러한 프로토콜을 사용하여 형성될 수 있지만, 배양 시간 또는 매립 겔(12)과 같은 특정 세부사항에서 상이하므로, 이러한 구성된 세포 스페로이드는 제한된 크기 범위 하에서 잘 제어될 수 없다. 스페로이드의 크기는 생존력 테스트 및 이미징 분석의 일관성에 영향을 미칠 수 있습니다. 성장 미세 환경과 성장 인자 또한 다양하며, 이는 세포 간의 분화의 차이로 인해 다른 형태를 초래할 수 있다13. 이제 제어된 크기로 모든 유형의 종양을 구성하기 위한 표준적이고 간단하며 비용 효율적인 방법이 분명히 필요합니다.
또 다른 관점에서, 형태, 생존력 및 성장률을 평가하기 위해 균질한 분석 및 고함량 이미징 접근법이 개발되었지만, 종양 스페로이드의 위치, 크기 및 형태의 균일성 부족과 같은 문헌에 보고된 다양한 이유로 3D 모델의 고처리량 스크리닝은 여전히 도전 과제로 남아 있습니다14,15,16.
여기에 제시된 프로토콜에서는 3D 종양 스페로이드 구성의 각 단계를 나열하고 다른 유리한 특성 중에서 자동 초점, 자동 이미징 및 분석을 포함하는 고처리량, 고함량 이미징 시스템을 사용하여 스페로이드 관찰 및 분석 방법을 설명합니다. 우리는 이 방법이 어떻게 고처리량 이미징에 적합한 균일한 크기의 3D 종양 스페로이드를 생성할 수 있는지 보여줍니다. 이러한 스페로이드는 또한 암 약물 치료에 대한 높은 민감도를 나타내며 고함량 이미징을 사용하여 스페로이드의 형태학적 변화를 모니터링할 수 있습니다. 요약하면, 우리는 약물 평가 목적을 위한 3D 종양 구조를 생성하는 수단으로서 이 방법론의 견고성을 입증합니다.
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Protocol
1. 스페로이드 구조
- 배양 접시의 유착 방지 처리
- 유착방지제 시약 100 μL를 U자형 웰 바닥이 있는 48웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고, 10분 동안 유지한다. 10분 후, 코팅 시약을 흡인하고, 멸균된 PBS로 2회 세척한다.
- 배양 접시를 사용할 때까지 인큐베이터(37°C, 5%CO2로 가습된 공기)에 넣는다.
- 세포 준비, 수집 및 계수
- 세포에 특이적인 배양 배지를 사용하여 세포 배양 플라스크에서 세포를 배양한다(보충표 2). 예를 들어, NCI-H23, CT-26 세포는 RPMI 1640에서 배양되고, HT-29 세포는 McCoy's 5A 배지에서 배양된다. 이 두 매체에는 각각 10% 열 비활성화 FBS 및 1% P/S가 보충됩니다.
- 증식 동안 모든 세포를 표준 배양 조건(5%CO2로 가습된 공기 중에서 37°C)으로 유지한다. 여기서, NCI-H23 세포주는 다음 단계의 예로서 사용된다.
- T25 플라스크에서 배양된 세포를 1x PBS로 두 번 세척하여 배양 배지를 제거합니다(대수 단계에서 세포를 선택하고 80%-90%의 밀도로 세포를 계대하는 것이 좋습니다).
- 확장된 세포를 1mL의 0.25% 트립신/EDTA로 37°C, 5%CO2의 인큐베이터에서 1-2분 동안 처리합니다. 현미경으로 세포 모양(이 경우 일반적으로 원형)을 확인한 다음 트립신 처리를 중지합니다. 이를 위해 T25 플라스크에서 사용된 트립신/EDTA 현탁액을 흡인하고 4mL의 신선한 배지로 세포를 세척합니다.
- 모든 현탁액(5mL)을 15mL 튜브로 옮깁니다. 1mL의 신선한 배지를 사용하여 잔류 세포를 씻어내고 튜브에 추가합니다. 세포를 실온에서 5분 동안 186.48 x g 로 원심분리합니다.
- 상층액을 제거하고 세포 펠릿에 10mL의 신선한 배지를 첨가한 다음 세포가 균질한 현탁액이 될 때까지 부드럽게 피펫팅합니다.
- 0.1mL의 세포 현탁액을 새 원심분리기 튜브에 흡인하고 0.9mL의 새로운 배지를 추가한 다음 현탁액을 잘 피펫팅합니다.
- 세포 계수를 위해 세포 현탁액 10 μL를 추출한다. 이 과정을 두세 번 수행하고 평균값을 취하십시오.
- 50,000 단계의 세포 계수 프로세스에서 얻은 농도에 따라 1.2.7 cells/mL의 최종 파종 밀도에 도달하도록 현탁액을 희석합니다.
- 세포 배양 및 스페로이드 형성
- 200μL의 세포 현탁액을 48웰 U자형 바닥 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
- 플레이트 주위에 밀봉 필름을 감싸고 실온에서 5분 동안 119.35 x g 로 원심분리합니다.
- 원심분리기에서 플레이트를 조심스럽게 꺼내고 보호 필름을 당겨 빼냅니다. 그런 다음 5-8mL의 멸균수를 우물을 둘러싼 수로에 넣고(증발을 방지하기 위해) 37°C에서 5일 동안 배양합니다. 해당 기간 동안 수로에 물을 변경/보충하지 마십시오.
- 다음 5일 동안 세포 응집을 관찰합니다.
참고: 일반적으로 세포는 5일 이내에 집락으로 뭉치기 시작합니다. 그러나 스페로이드 구성 과정은 세포 유형과 세포 밀도가 다르면 더 빠르거나 느릴 수 있습니다. 이 때문에 가능한 세 가지 방법 중 하나를 사용하여 매일 세포를 관찰해야합니다. 먼저, 웰 플레이트의 바닥을 통해 세포를 관찰할 수 있다. 세포가 아직 스페로이드를 형성하지 않은 경우 바닥에 단일 세포 층을 볼 수 있습니다. 세포가 스페로이드를 형성하면 각 웰의 U-바닥에서 조밀한 3D 구조를 관찰할 수 있습니다. 또 다른 방법은 현미경으로 세포를 확인하는 것입니다. 세포가 종양 스페로이드가 되면 구조는 투명도 구배를 갖는 3개의 층(증식층, 비활성층, 괴사 코어, 스페로이드의 외부에서 내부까지)을 포함합니다. 마지막으로, 배양 배지의 색상은 관찰 목적으로도 사용될 수 있습니다. 이는 디지털 현미경을 사용해도 3층 구조를 명확하게 볼 수 없을 때 유용할 수 있습니다. 배지가 보라색-빨간색에서 노란색으로 바뀌면 젤에 스페로이드를 매립하는 과정이 시작될 수 있습니다. 세포 응집 기간 동안 배지를 교체해서는 안 됩니다.
- 젤 임베딩
참고: 젤은 -20°C 이하의 온도에서 보관해야 합니다. 특히 젤은 온도 변화를 피하기 위해 냉장고 문에서 멀리 떨어진 곳에 두어야 합니다. 젤은 공정의 이 단계에서 동결된 상태에 있습니다.- -20 °C 냉장고에서 냉동 젤을 꺼내 실험 기간 동안 전체 시간 동안 아이스 박스에 놓습니다.
- 현미경으로 세포 스페로이드를 관찰합니다. 젤 임베딩이 시작되기 전에 디지털 현미경으로 스페로이드의 상태를 다시 확인해야 합니다.
- 배지 150μL를 조심스럽게 제거합니다. 접시는 또한 아이스 박스 위에 놓아야합니다.
- 미리 냉각된 피펫 팁을 웰 주변과 내부로 이동하면서 웰의 벽 쪽에서 액체 젤을 천천히 추가하여 각 스페로이드를 젤에 삽입합니다. 5분 동안 기다렸다가 젤이 고르게 퍼지지 않으면 10μL 피펫 팁으로 젤을 부드럽게 피펫팅합니다. 각 웰에는 종양 스페로이드, 3.5mg/mL 겔 25μL 및 완전 배양 배지 50μL가 들어 있습니다. 대조군에도 75μL의 배지를 추가합니다.
참고: 각 웰에는 하나의 스페로이드가 포함되어 있습니다. - 플레이트를 37°C에서 30분 동안 하이드로겔화가 완전히 완료될 때까지 인큐베이션한다. 현미경으로 겔화 상태를 확인합니다.
- 각 샘플에 125 μL의 신선한 배지를 오버레이합니다.
- 스페로이드를 7-10일 더 배양합니다. 각각 4-6개의 웰이 있는 스페로이드 그룹을 준비하고 분석을 위해 그 중 최소 3개를 선택합니다.
참고: 약물 검사를 수행하는 경우 하나의 샘플에 대해 두 그룹을 준비합니다. 한 그룹은 생존성 테스트에 사용되고 다른 그룹은 이미지 캡처 및 분석에 사용됩니다.
2. 약물 치료
- 제조업체의 지침에 따라 약물을 용해하십시오. DMSO로 100x 작업 솔루션을 준비합니다. 연속 희석으로 최소 5 회 복용하십시오. 여기서, 폐암 치료제인 AMG 510을 예로 들 수 있다. 조성은 보충표 1에 제시되어 있다.
- 양성 대조군으로 0.1% DMSO를 사용하십시오.
- 125 μL의 약물 처리 배지를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 다시 인큐베이터(5%CO2로 가습된 공기 중에서 37°C)에 넣는다. 이 단계에서 각 웰에는 종양 스페로이드, 3.5mg/mL 겔 25μL 및 배지 175μL가 포함되어 있습니다. 대조군에는 200 μL의 배지가 포함되어 있습니다.
3. 스페로이드 생존력
- 제조업체의 지침에 따라 Alamar Blue 분석 키트를 사용하여 스페로이드 생존력을 측정합니다. Alamar Blue 처리가 수행된 후 마이크로플레이트 광도계(570 nm 및 600 nm에서의 흡광도)를 이용하여 생존율을 측정한다.
- 스페로이드를 겔에 각각 포매한 후 1일, 4일, 7일째 및 10일째에 또는 지시된 대로 생존율을 측정합니다.
참고: Alamar Blue 분석을 사용할 때 최소 16시간의 반응 시간이 필요합니다. 따라서 0일, 3일, 6일 및 9일 오후에 20μL의 Alamar Blue를 추가합니다. - 각 웰의 상청액 배지 100μL를 새 테스트 플레이트로 흡인하고 80μL의 신선한 배지를 배양 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 약물 처리 배지 100μL를 추가로 교체합니다. 우물에 알라마르 블루의 잔해가 없는지 확인하십시오.
참고: 배지 교체는 생존력이 테스트될 때마다 수행되며, 이미징 분석 그룹의 약물 처리 배지는 같은 날 교체해야 합니다.
4. 약물 검사에서 이미지를 통한 스페로이드 관찰 및 딥러닝 분석
- 이미징
- 이미징 전에 배지 100μL를 흡인합니다.
- 접시를 무대에 놓습니다. 10x 대물렌즈(2x 대물렌즈 우선)의 자동 현미경을 사용하여 스페로이드의 디지털 이미지를 얻을 수 있습니다. 현미경은 이러한 스페로이드에 자동으로 초점을 맞추고 중앙 집중화할 수 있습니다.
참고: 자동 초점 기능과 사용된 알고리즘은 이전에 Yazdanfar et al.17에 의해 보고되었습니다. - 자동 이미징을 기다립니다. 각 스페로이드에 대해 4개의 이미지가 획득됩니다. 통합 이미지는 high-content imaging system에 연결된 소프트웨어로 형성되고 처리됩니다.
- "이미지 패치 프로세스" 버튼을 클릭하고 소프트웨어에서 통합된 이미지를 선택합니다.
- "U-NET 모델"을 선택하고 전환율을 입력합니다(10x 대물 이미지의 전환율은 3.966). 아래 화면 하단의 을 클릭하여 이미지 처리를 시작합니다. 그런 다음 지름, 둘레 및 거칠기 데이터를 스프레드시트 소프트웨어에 저장합니다.
- 초과 경계 지수(EPI)를 계산합니다. EPI는 식 1에 의해 계산된 바와 같이 스페로이드 둘레(P0)와 등가 둘레(Pe) 사이의 비율이다. Image J를 사용하여 초점면(S)에서 스페로이드의 면적을 측정합니다. 그런 다음 식 2를 사용하여 스페로이드의 등가 둘레를 계산합니다.
EPI = (P o− P e)/Pe (식 1)
(식 2)
참고: 스페로이드 둘레는 개발된 U-NET 모델을 기반으로 하는 딥 러닝 알고리즘을 사용하여 소프트웨어에 의해 생성됩니다. - 약물과 함께 100 μL의 신선한 배지를 첨가하고 플레이트를 다시 인큐베이터(5%CO2로 가습된 공기에서 37°C)에 넣습니다.
- 스페로이드 억제
- 식 3을 사용하여 종양 성장 억제(TGI)를 계산합니다. 상대 스페로이드 부피(RTV)는 원래 부피에 대한 말단 부피입니다(식 4). 스페로이드 부피(V)는 스페로이드 직경 출력에 따라 식 5를 사용하여 소프트웨어에 의해 자동으로 계산됩니다.
TGI = (RTV 대조군− RTV처리)/RTV대조군 × 100% (식 3)
RTV = V단자/V오리지널 (수식 4)
V = 4/3π(d/2)3 (식 5)
참고: TGI는 생체 내 성장 억제를 참조하여 얻어지며 종양 무게는 RTV로 대체됩니다. RTV 대조군은대조군 의 상대적 스페로이드 부피, RTV처리 는 약물 시험군의 상대적 스페로이드 부피, V말단 은 마지막 날의 스페로이드 부피, V원 은 배양 1일의 스페로이드 부피, d 는 스페로이드 직경을 나타냅니다.
- 식 3을 사용하여 종양 성장 억제(TGI)를 계산합니다. 상대 스페로이드 부피(RTV)는 원래 부피에 대한 말단 부피입니다(식 4). 스페로이드 부피(V)는 스페로이드 직경 출력에 따라 식 5를 사용하여 소프트웨어에 의해 자동으로 계산됩니다.
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Representative Results
그림 1A,B는 이 연구에서 종양 스페로이드를 구성하는 데 사용된 프로세스를 보여줍니다. 우리는 먼저 48웰 U자형 바닥 플레이트에 세포를 시드했습니다. 이 단계는 2D 세포 배양에 사용되는 단계와 거의 동일합니다. 우리는 우물을 둘러싸고 있는 물이 있는 공통 인큐베이터에 플레이트를 보관하여 증착된 세포가 자가 조립 과정에서 스페로이드를 형성하기 시작하도록 했습니다. 정상적인 작동 조건에서 대부분의 유형의 종양 스페로이드는 표적 배지를 사용한 후 5일 후에 완전히 형성되었습니다(보충 표 2). 디지털 현미경으로 5일 이내에 스페로이드 구성 상태를 확인했습니다(그림 1D). 성장 과정이 완료된 후, 겔을 첨가하여 각 웰에서 개별 스페로이드를 감싸고, 각 스페로이드에 대해 생체 내 유사 세포외 기질(ECM)을 생성했습니다. 그런 다음 약물 검사가 수행되었습니다. 딥러닝 분석 소프트웨어(그림 1C)와 함께 High-Content Imaging 시스템을 사용했기 때문에 개별 스페로이드 성장(그림 1E)을 명확하게 관찰하고 생존력, 직경 및 거칠기를 포함한 약물 치료 중 특성을 결정하는 데 적합한 매개변수에 대한 값을 얻을 수 있었습니다.
그림 1: 종양 스페로이드 형성과 자동 이미징 및 분석. (A) 아래 타임라인과 함께 표준 종양 스페로이드 배양 절차를 보여주는 개략도. (B) 3D 매트릭스에서 다양한 수준의 침습성을 보여주는 종양 스페로이드를 사용한 약물 치료 테스트 개략도. (c) 다음과 같은 세부 사항을 보여주는 자동 이미징 및 분석을 위한 딥러닝 기반 알고리즘 관련 시스템의 이미지: 플레이트 플랫폼; 광원이 있는 콘덴서; 전동 X, Y 스테이지; 전동 Z축 모듈; 목표 휠; 필터 휠; 증권 시세 표시기; 그리고 개발된 시스템 소프트웨어가 있는 컴퓨터. (D) 현미경의 접안렌즈에서 관찰한 단층 세포로부터 NCI-H23 종양 스페로이드의 형성. 눈금 막대는 500μm를 나타냅니다. (E) 10일 동안 약물 치료를 하지 않은 NCI-H23 스페로이드의 침습성 및 크기 변화. 눈금 막대는 200μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
본 연구에서는 항암제 AMG510을 사용하여 비소세포폐암 치료에 미치는 효과를 시험하였다. 분석 시스템은 복잡한 이미지 처리 없이 이미지 데이터를 제공했습니다. 그림 2 의 명시야 이미지는 NCI-H23 스페로이드의 성장이 AMG510에 의해 억제될 수 있음을 보여줍니다. 이것은 농도 증가와 함께 감소 된 크기로 나타났다. 대조적으로, 크기는 대조군에서 10일 동안 증가하였다. 이 기간 동안 침습성을 나타내는 가장자리 측면의 거칠기도 변경되었습니다. 스페로이드는 1일차에 평평한 모서리를 나타냈지만 10일차에는 거친 모서리를 보였습니다. 그러나 명시야 이미지만으로 거칠기를 비교하는 것은 어려운 작업이라는 점에 유의해야 합니다. 또한 표준 방법에는 적절한 평균 크기의 스페로이드가 포함된다는 점도 언급해야 합니다. 마지막으로, 우리는 바닥에 붙어있는 세포가 거의 없기 때문에이 방법을 사용하여 깨끗한 배경을 얻었다는 것을 알 수 있습니다.
그림 2: 다양한 농도의 AMG510으로 처리된 NCI-H23 세포 스페로이드의 명시야 이미지를 고함량 현미경으로 자동 캡처했습니다. 열은 서로 다른 요일을 나타내고 행은 서로 다른 약물 농도를 나타냅니다. 결과에는 각 조건에 대한 3개의 스페로이드가 포함됩니다. 모든 이미지는 자동으로 2배 배율로 초점을 맞춘 다음 인공 지능 기반 소프트웨어와 현미경 관련 미세 환경 컨트롤러를 사용하여 고함량 이미징 시스템에 의해 10배 배율로 캡처되었습니다. 눈금 막대는 200μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3A에 제시된 세포 생존율 결과는, 대조군과 비교하였을 때 모든 투여량 수준에서 약물-처리된 샘플의 10일 배양에서 감소된 생존율을 입증하였다. 0.01μM 이상의 농도를 가진 샘플은 종양 세포 생존율의 급격한 감소를 나타내었으며, 이는 비소세포폐암에 대한 AMG510 요법의 민감성을 나타냅니다. 10일째에, 이들 샘플들은 도 3B에 나타낸 바와 같이, 70% 미만의 값으로 유사한 수준의 최종 생존율을 나타내었다.
그림 3: AMG510 처리된 샘플 그룹의 종양 스페로이드 생존율. 약물은 1일째에 추가되었습니다. (A) 종양 스페로이드 생존율은 1일, 4일, 7일 및 10일에 측정되었습니다. (B) 농도 구배를 갖는 샘플의 말단 세포 생존율. 각 종양 스페로이드를 치료하기 위해 사용된 약물 농도는 0.001 μM 내지 5 μM로 설정하였다. 모든 데이터는 평균 ± SEM(n=3)으로 제시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4A는 스페로이드 직경 분석과 관련하여 유사한 경향을 나타낸다. 농도가 0.01 μM 이상인 샘플은 평균 직경의 명백한 감소를 나타냈다. 스페로이드 크기의 균일성은 약물 치료 첫날에도 약 800μm의 값으로 볼 수 있었습니다. 이러한 스페로이드의 직경 비율(그림 4B)은 AMG510 동시 배양 동안 생존력 테스트보다 눈에 띄게 더 분명한 방식으로 수축을 나타냅니다. 또한, 본 발명자들은 도 4C에 도시된 바와 같이, 그들의 직경에 따라 스페로이드 종양 성장 억제 값을 계산하였다. TGI 값은 상대적인 평가 매개변수이며, 이 값은 스페로이드 간의 원래 파종 차이로 인한 성장 감소를 나타낼 수 있습니다. 그러나 0.01μM 이상의 농도가 AMG510 치료의 성공에 명백한 영향을 미친다는 결과를 다시 얻었습니다. 이전 연구에서 우리는 약물 테스트의 중요한 지표인 IC50 값을 실험했습니다. 그러나 AMG510 처리 하의 NCI-H23 스페로이드는 이 매개변수에 변화가 없음을 발견했습니다.
그림 4: 대조군 및 AMG510 처리 샘플 그룹에서 스페로이드 직경으로 표시되는 종양 크기. (A) 종양 스페로이드 직경은 1일, 4일, 7일 및 10일에 측정되었습니다. (B) 스페로이드 성장 비율은 원래 부피에 대한 말단 부피로 정의되고 스페로이드 직경을 사용하여 계산되었습니다. (C) 스페로이드 성장 억제 비율은 부피를 기준으로 정의하고 스페로이드 직경을 사용하여 계산했습니다. 각 종양 스페로이드를 치료하기 위해 사용된 AMG510 농도는 0.001 μM 내지 5 μM로 설정하였다. 모든 데이터는 평균 ± SEM(n=3)으로 제시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그런 다음 소프트웨어에 의해 출력된 거칠기 값(그림 5A)과 동일한 방법으로 생성된 스페로이드 경계를 기반으로 한 초과 주변 지수(그림 5B) 측면에서 스페로이드의 침습성에 대한 추가 평가를 수행했습니다. 거칠기가 높다는 것은 더 많은 세포가 스페로이드에서 겔로 이동한다는 것을 의미하며, 이는 더 높은 침습성을 나타냅니다. 대조군의 결과는 상이한 약물 농도 수준과 비교되었다. 침습성 세포주인 NCI-H23의 경우, 스페로이드 거칠기 및 EPI 값은 약물 처리 없이 배양 시간에 따라 모두 증가했으며(18), 이는 대조군 샘플의 명시야 이미지와 직경 증가로 입증될 수 있습니다. 그러나 AMG510 처리에 의해 성장이 약화되었으며, 이는 전적으로 크기 변화에 비례합니다.
그림 5: 처리되지 않은 대조군 및 AMG510 처리된 샘플 그룹의 종양 경계 인식. 약물은 1일째에 추가되었습니다. (A) 종양 거칠기는 1일, 4일, 7일 및 10일에 소프트웨어에 의해 측정되었으며, 이는 종양 스페로이드의 침습성을 나타냅니다. (B) 스페로이드 둘레는 딥 러닝 알고리즘을 사용하여 소프트웨어에 의해 위치되고 그려졌습니다. 그런 다음 초점면의 스페로이드 영역을 이미지 J로 측정하고 이러한 데이터를 기반으로 초과 주변 지수를 계산했습니다. 각 종양 스페로이드를 치료하기 위해 사용된 AMG510 농도는 0.001 μM 내지 5 μM로 설정하였다. 모든 데이터는 평균 ± SEM(n=3)으로 제시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충표 1: 플레이트의 조성. 실험에는 항폐종양제인 AMG510을 사용하였으며, 약물 구배에 따라 군을 설정하였다. 두 개의 플레이트가 사용되었는데, 하나는 생존도 분석 키트 테스트용이고 다른 하나는 이미징 분석용입니다.
보충 표 2: 3D 종양 구성 및 약물 테스트에 사용된 세포주. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
미세 환경은 종양 성장에 중요한 역할을 합니다. 그것은 세포 외 기질, 산소 구배, 영양 및 기계적 상호 작용의 제공에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 유전자 발현, 신호 경로 및 종양 세포의 많은 기능에 영향을 미칠 수 있습니다 19,20,21. 많은 경우에, 2D 세포는 그러한 효과를 내지 못하거나 심지어 반대 효과를 생성하여, 약물 치료의 평가에 영향을 미친다. 그러나 3D 모델의 출현으로 이 문제가 해결되었습니다. 예를 들어, 폐암 치료 시스템에 대한 AMG510의 효과에 대한 평가는 3D 방법을 사용하여 완료되었습니다. 폐 관련 침습성 세포주에서 AMG510 치료를 모니터링하기 위해 겔 내에 내장된 종양 스페로이드를 생성하여 3D 종양-스페로이드-ECM(TSE) 모델을 구축했습니다. AMG510은 G12C 돌연변이 KRAS22를 표적으로 하는 새로운 억제제이며, 이 돌연변이에 반응하는 일부 환자들이 경험한 비소세포폐암(NSCLC)이라는 발견으로 그 효과가 확인되었습니다. 일련의 실험 데이터 및 분석을 통해 매우 귀중한 데이터를 식별 할 수 있습니다. AMG510에 대한 민감도는 2D 조건에 비해 3D 스페로이드 조건에서 크게 향상되었으며 저산소증 조건 내에서 훨씬 더 향상되었습니다.
본 방법을 통해 구축된 모델들은 몇 가지 장점을 제공한다. 첫째, 3D 모델로서 종양과 세포외 기질을 잘 시뮬레이션할 수 있습니다. 3D 종양 스페로이드를 구성하는 간단하지만 효과적인 방법을 통해 세포가 2주 동안 생존할 수 있습니다. 5일간의 스페로이드 제작 후 약 10일의 기간을 사용할 수 있으며 이는 모든 약물 검사를 수행하기에 충분합니다. 또한 3D 세포 배양 생산 방법은 2D 방법과 거의 동일하며 비용은 3D 바이오 프린팅보다 훨씬 저렴합니다. 행잉 드롭 방법과 같은 다른 방법과 비교할 때 여기에 설명된 방법은 보다 균일한 스페로이드를 생성하는 데 도움이 되며 셀 크기는 셀의 유형과 밀도에 의해 완전히 제어됩니다. 마지막으로, 이 모델은 다양한 유형의 암세포에 적용할 수 있는 것으로 나타났으며 이러한 유연성은 특히 높은 가치가 있는 것으로 판명될 수 있습니다. 앞으로 종양 스페로이드 형성에 종사하는 연구자들은 종양 세포 현탁액에 섬유아세포와 내피 세포뿐만 아니라 T 세포 및 NK 세포와 같은 면역 세포를 추가하여 기질 세포 이동을 촉진하고 신약의 면역 치료 효과를 높일 수 있습니다23,24.
최근 수십 년 동안, 3D 모델로부터 중요한 생물학적 데이터를 추출하기 위해 현재 이용 가능한 기술 및 도구를 설명하는 데 초점을 맞춘 보고서는 거의 없었다25. 이 정보는 3D 세포 배양 모델26을 사용한 약물 테스트 및 치료 발견의 기본으로 간주될 수 있습니다. Zanoni et al.의 연구는 3D 종양 콜로니의 자동 이미지 분석을 수행하는 새로운 오픈 소스 소프트웨어를 설명했습니다. 저자들은 형태 매개변수가 약물 치료에 대한 대형 스페로이드의 반응에 영향을 미치고 스페로이드 크기와 모양이 모두 가변성의 원인이 될 수 있음을 보여주었습니다27. 그러나 생체 내에서 ECM을 모방한 3D 겔에서 배양된 종양 스페로이드를 사용하면 세포 행동이 훨씬 더 복잡해지고 침습성이 나타날 수 있습니다. 데이터는 크기와 모양에만 관련되지만 이러한 제한은 그대로 유지됩니다. 많은 신뢰할 수 있고 다양한 파라미터는 high-content 이미징 시스템을 사용하여 얻을 수 있습니다. 이러한 시스템은 세포 생존율과 스페로이드 모양을 결정할 수 있을 뿐만 아니라 종양의 특성과 종양에 대한 약물의 억제 효과를 감지하고 확인할 수 있습니다. 침습성은 또한 그러한 수단에 의해 결정될 수있다. 예를 들어, 침윤성 종양은 상대적으로 더 높은 거칠기 값을 가질 수 있는 반면, 비침습성 종양은 더 높은 EPI 값을 가질 수 있습니다. 이러한 값의 변화는 다른 약물 효과를 나타낼 수 있습니다. 앞으로 우리는 이러한 기술을 미세 유체 칩과 결합하여 보다 편리하고 효과적인 전략을 얻을 수 있기를 희망합니다.
여기에 설명된 표준화된 방법은 대부분의 약물 스크리닝 및 평가 테스트의 요구 사항을 충족할 수 있습니다. 그러나 향후 실험 중에 발생할 수 있는 몇 가지 문제가 여전히 있습니다. 예를 들어, 세포는 원심분리 후 웰의 내벽에 부착될 수 있거나, 또는 배양 배지가 적합하지 않을 수 있다. 또한, 프로토콜에 사용되는 겔과 널리 사용되는 Matrigel은 긴 과정에서 쉽게 겔화 될 수 있습니다. 그러나 이러한 문제의 대부분은 표준 운영 및 최적화 기술을 통해 해결할 수 있습니다. 이 방법에는 다른 가능한 제한 사항이 있습니다. 스페로이드 구조로 인해 스페로이드를 통한 영양분, 산소 및 폐기물 확산은 크기에 영향을 받습니다. 스페로이드 코어에 있는 세포의 생존력은 스페로이드 직경이 1,000μm를 초과할 때 손상될 수 있습니다. 반대로, 직경이 400 μm 이하인 경우 침입을 관찰하기가 어려워집니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
중요한 의견과 제안을 해주신 모든 실험실 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 Jiangsu Commission of Health (K2019030)의 핵심 프로젝트에 의해 지원되었습니다. 개념화는 C.W.와 Z.C.에 의해, 방법론은 W.H.와 M.L.에 의해 수행되었고, 조사는 W.H.와 M.L.에 의해 수행되었고, 데이터 큐레이션은 W.H., Z.Z., S.X., M.L.에 의해 수행되었고, 원래 초안 준비는 Z.Z., J.Z., S.X., W.H., 및 X.L., 검토 및 편집은 Z.C.에서, 프로젝트 관리는 C.W.와 Z.C.에서, 자금 조달은 C.W.에서 수행했습니다. 모든 저자는 출판된 버전의 원고를 읽고 동의했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Imager and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
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