Summary
यह लेख त्रि-आयामी ट्यूमर स्फेरॉइड के निर्माण के लिए एक मानकीकृत विधि प्रदर्शित करता है। एक स्वचालित इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके स्फेरॉइड अवलोकन और छवि-आधारित डीप-लर्निंग विश्लेषण के लिए एक रणनीति भी वर्णित है।
Abstract
हाल के दशकों में, मोनोलेयर-सुसंस्कृत कोशिकाओं के अलावा, तीन-आयामी ट्यूमर स्फेरॉइड को एंटीकैंसर दवाओं के मूल्यांकन के लिए एक संभावित शक्तिशाली उपकरण के रूप में विकसित किया गया है। हालांकि, पारंपरिक संस्कृति विधियों में तीन-आयामी स्तर पर एक सजातीय तरीके से ट्यूमर स्फेरॉइड में हेरफेर करने की क्षमता की कमी है। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, इस पेपर में, हम औसत आकार के ट्यूमर स्फेरॉइड के निर्माण का एक सुविधाजनक और प्रभावी तरीका प्रस्तुत करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम कृत्रिम बुद्धि-आधारित विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवि-आधारित विश्लेषण की एक विधि का वर्णन करते हैं जो पूरी प्लेट को स्कैन कर सकता है और त्रि-आयामी स्फेरॉइड पर डेटा प्राप्त कर सकता है। कई मापदंडों का अध्ययन किया गया। ट्यूमर स्फेरॉइड निर्माण की एक मानक विधि और एक उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग और विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके, त्रि-आयामी स्फेरॉइड पर किए गए दवा परीक्षणों की प्रभावशीलता और सटीकता को नाटकीय रूप से बढ़ाया जा सकता है।
Introduction
कैंसर मनुष्यों द्वारा सबसे अधिक भयभीत बीमारियों में से एक है, कम से कम इसकी उच्च मृत्यु दरके कारण नहीं। हाल के वर्षों में, कैंसर के इलाज की संभावना बढ़ गई है क्योंकि नए उपचार 2,3,4,5 पेश किए गए हैं। प्रयोगशाला सेटिंग में कैंसर का अध्ययन करने के लिए दो-आयामी (2 डी) और तीन-आयामी (3 डी) इन विट्रो मॉडल का उपयोग किया जाता है। हालांकि, 2 डी मॉडल तुरंत और सटीक रूप से उन सभी महत्वपूर्ण मापदंडों का आकलन नहीं कर सकते हैं जो एंटीट्यूमर संवेदनशीलता को इंगित करते हैं; इसलिए, वे ड्रग थेरेपी परीक्षण6 में विवो इंटरैक्शन में पूरी तरह से प्रतिनिधित्व करने में विफल रहते हैं।
2020 के बाद से, वैश्विक त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति बाजार को बहुत बढ़ावा दिया गया है। NASDAQ OMX की एक रिपोर्ट के अनुसार, 3D सेल कल्चर बाजार का वैश्विक मूल्य 2025 के अंत तक USD 2.7 बिलियन से अधिक हो जाएगा। 2 डी संस्कृति विधियों की तुलना में, 3 डी सेल संवर्धन लाभप्रद गुणों को प्रदर्शित करता है, जिसे न केवल प्रसार और भेदभाव के लिए बल्किदीर्घकालिक अस्तित्व के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। इस तरह के साधनों से, विवो सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट में अधिक सटीक ट्यूमर लक्षण वर्णन, साथ ही चयापचय प्रोफाइलिंग प्राप्त करने के लिए अनुकरण किया जा सकता है, ताकि जीनोमिक और प्रोटीन परिवर्तनों को बेहतर ढंग से समझा जा सके। इसके कारण, 3 डी परीक्षण प्रणालियों को अब मुख्यधारा के दवा विकास कार्यों में शामिल किया जाना चाहिए, विशेष रूप से उन लोगों के साथ जो नोवेल एंटीट्यूमर दवाओं की स्क्रीनिंग और मूल्यांकन पर ध्यान केंद्रित करते हैं। स्फेरॉइड संरचनाओं में अमर स्थापित सेल लाइनों या प्राथमिक सेल संस्कृतियों के त्रि-आयामी विकास में हाइपोक्सिया और दवा प्रवेश जैसे ट्यूमर की विवो विशेषताएं होती हैं, साथ ही सेल इंटरैक्शन, प्रतिक्रिया और प्रतिरोध, और इन विट्रो ड्रग स्क्रीनिंग 9,10,11 करने के लिए एक कठोर और प्रतिनिधि मॉडल के रूप में माना जा सकता है।
हालांकि, ये 3 डी संस्कृति मॉडल भी कई समस्याओं से पीड़ित हैं जिन्हें हल करने में कुछ समय लग सकता है। इन प्रोटोकॉल का उपयोग करके सेल स्फेरॉइड का गठन किया जा सकता है, लेकिन वे कुछ विवरणों में भिन्न होते हैं, जैसे कि कल्चर टाइम या जैल12 एम्बेड करना, इसलिए इन निर्मित सेल स्फेरॉइड को प्रतिबंधित आकार सीमा के तहत अच्छी तरह से नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। स्फेरॉइड का आकार व्यवहार्यता परीक्षण और इमेजिंग विश्लेषण की स्थिरता को प्रभावित कर सकता है। विकास माइक्रोएन्वायरमेंट और विकास कारक भी भिन्न होते हैं,जिससे कोशिकाओं के बीच भेदभाव में अंतर के कारण विभिन्न आकृति विज्ञान हो सकते हैं। अब नियंत्रित आकार के साथ सभी प्रकार के ट्यूमर के निर्माण के लिए एक मानक, सरल और लागत प्रभावी विधि की स्पष्ट आवश्यकता है।
एक अन्य परिप्रेक्ष्य से, हालांकि आकृति विज्ञान, व्यवहार्यता और विकास दर का मूल्यांकन करने के लिए सजातीय परख और उच्च-सामग्री इमेजिंग दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं, 3 डी मॉडल की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग साहित्य में रिपोर्ट किए गए विभिन्न कारणों के लिए एक चुनौती बनी हुई है, जैसे कि ट्यूमर स्फेरॉइड14,15,16 की स्थिति, आकार और आकृति विज्ञान में एकरूपता की कमी।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हम 3 डी ट्यूमर स्फेरॉइड के निर्माण में प्रत्येक चरण को सूचीबद्ध करते हैं और उच्च-थ्रूपुट, उच्च-सामग्री इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके स्फेरॉइड अवलोकन और विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं जिसमें अन्य लाभप्रद विशेषताओं के बीच ऑटो-फोकस, ऑटो-इमेजिंग और विश्लेषण शामिल है। हम दिखाते हैं कि यह विधि समान आकार के 3 डी ट्यूमर स्फेरॉइड का उत्पादन कैसे कर सकती है जो उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं। ये स्फेरॉइड कैंसर की दवा के उपचार के लिए एक उच्च संवेदनशीलता भी प्रदर्शित करते हैं, और उच्च सामग्री इमेजिंग का उपयोग करके स्फेरॉइड में रूपात्मक परिवर्तनों की निगरानी की जा सकती है। सारांश में, हम दवा मूल्यांकन उद्देश्यों के लिए 3 डी ट्यूमर निर्माण उत्पन्न करने के साधन के रूप में इस पद्धति की मजबूती का प्रदर्शन करते हैं।
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Protocol
1. स्फेरॉइड निर्माण
- संस्कृति प्लेट का विरोधी आसंजन उपचार
- 48-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में एंटी-आसंजन अभिकर्मक के पिपेट 100 μL को यू-आकार के कुएं के साथ रखें, और 10 मिनट के लिए रखें। 10 मिनट के बाद, कोटिंग अभिकर्मक को एस्पिरेट करें, और निष्फल पीबीएस के साथ दो बार धो लें।
- कल्चर प्लेट को एक इनक्यूबेटर (5% सीओ2 के साथ ह्यूमिडिफायर हवा में 37 डिग्री सेल्सियस) में उपयोग होने तक रखें।
- सेल की तैयारी, संग्रह और गिनती।
- सेल-कल्चर फ्लास्क में कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए कोशिकाओं के लिए विशिष्ट संस्कृति माध्यम का उपयोग करें (पूरक तालिका 2)। उदाहरण के लिए, एनसीआई-एच 23, सीटी -26 कोशिकाओं को आरपीएमआई 1640 में सुसंस्कृत किया जाता है, और एचटी -29 कोशिकाओं को मैककॉय के 5 ए माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है। इन दो मीडिया को क्रमशः 10% गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस और 1% पी / एस के साथ पूरक किया जाता है।
- प्रसार के दौरान मानक संस्कृति स्थितियों (5% सीओ2 के साथ ह्यूमिडिफायर हवा में 37 डिग्री सेल्सियस) में सभी कोशिकाओं को बनाए रखें। यहां, एनसीआई-एच 23 सेल लाइन का उपयोग निम्नलिखित चरणों में एक उदाहरण के रूप में किया जाता है।
- संस्कृति माध्यम को हटाने के लिए 1x PBS के साथ दो बार T25 फ्लास्क में संवर्धित कोशिकाओं को धोएं (लघुगणकीय चरण में कोशिकाओं को चुनना और 80% -90% की स्थिरता पर कोशिकाओं को पारित करना बेहतर है)।
- विस्तारित कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेटर में1-2 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन / ईडीटीए के 1 एमएल के साथ इलाज करें। माइक्रोस्कोप के तहत सेल आकार (सामान्य रूप से इस मामले में परिपत्र) की पुष्टि करें, और फिर ट्रिप्सिन उपचार को रोकें। ऐसा करने के लिए, टी 25 फ्लास्क में इस्तेमाल किए गए ट्रिप्सिन / ईडीटीए निलंबन को एस्पिरेट करें, और कोशिकाओं को 4 एमएल ताजा माध्यम से धो लें।
- सभी निलंबन (5 एमएल) को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। अवशिष्ट कोशिकाओं को धोने और इसे ट्यूब में जोड़ने के लिए 1 एमएल ताजा माध्यम का उपयोग करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 186.48 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
- सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और सेल गोली में 10 एमएल ताजा माध्यम जोड़ें, इसके बाद कोमल पाइपिंग करें जब तक कि कोशिकाएं एक समरूप निलंबन में न हों।
- एक नए सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 0.1 एमएल सेल सस्पेंशन को एस्पिरेट करें, 0.9 एमएल ताजा माध्यम जोड़ें, और फिर निलंबन को अच्छी तरह से पिपेट करें।
- सेल गिनती के लिए सेल सस्पेंशन के 10 μL निकालें। इस प्रक्रिया को दो या तीन बार करें और एक औसत मूल्य लें।
- चरण 1.2.7 में सेल गिनती प्रक्रिया से प्राप्त एकाग्रता के अनुसार, 50,000 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम सीडिंग घनत्व तक पहुंचने के लिए निलंबन को पतला करें।
- सेल संस्कृति और स्फेरॉइड गठन।
- 48-वेल यू-बॉटम प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल सस्पेंशन के 200 μL जोड़ें।
- प्लेट के चारों ओर सीलिंग फिल्म लपेटें और इसे कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 119.35 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- प्लेट को सेंट्रीफ्यूज से सावधानी पूर्वक बाहर निकालें और सुरक्षात्मक फिल्म को खींचें। फिर, कुओं के आसपास के पानी के चैनल में 5-8 मिलीलीटर निष्फल पानी जोड़ें (वाष्पीकरण को रोकने के लिए) और 5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इस अवधि के दौरान जल चैनल में किसी भी पानी को न बदलें / पूरक न करें।
- अगले 5 दिनों के दौरान सेल एकत्रीकरण का निरीक्षण करें।
नोट: सामान्य तौर पर, कोशिकाएं 5 दिनों के भीतर कॉलोनियों के रूप में टकराना शुरू कर देती हैं। हालांकि, विभिन्न सेल प्रकारों और सेल घनत्व के साथ स्फेरॉइड निर्माण की प्रक्रिया तेज या धीमी हो सकती है। इसके कारण, कोशिकाओं को तीन संभावित तरीकों में से एक का उपयोग करके हर दिन देखा जाना चाहिए। सबसे पहले, कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्लेट के तल के माध्यम से देखा जा सकता है। जब कोशिकाओं ने अभी तक एक स्फेरॉइड नहीं बनाया है, तो कोशिकाओं की एक परत नीचे देखी जा सकती है। जब कोशिकाएं एक स्फेरॉइड बनाती हैं, तो प्रत्येक कुएं के यू-तल पर एक घना 3 डी निर्माण देखा जा सकता है। एक अन्य विधि में माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करना शामिल है। जब कोशिकाएं एक ट्यूमर स्फेरॉइड बन जाती हैं, तो निर्माण में तीन परतें शामिल होती हैं (एक प्रसार परत, एक निष्क्रिय परत, और एक नेक्रोटिक कोर, बाहर से गोलाकार के अंदर तक), जिसमें एक पारदर्शिता ढाल होती है। अंत में, संस्कृति माध्यम के रंग का उपयोग अवलोकन उद्देश्यों के लिए भी किया जा सकता है। यह सहायक हो सकता है जब तीन-परत संरचना को स्पष्ट रूप से नहीं देखा जा सकता है, यहां तक कि डिजिटल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके भी। जब माध्यम बैंगनी-लाल से पीले रंग में बदल जाता है, तो जेल में स्फेरॉइड एम्बेड करने की प्रक्रिया शुरू हो सकती है। सेल एकत्रीकरण अवधि के दौरान माध्यम को प्रतिस्थापित नहीं किया जाना चाहिए।
- जेल एम्बेडिंग
नोट: जैल को -20 डिग्री सेल्सियस से नीचे के तापमान पर संग्रहीत करने की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, तापमान में उतार-चढ़ाव से बचने के लिए जैल को फ्रिज के दरवाजे से बहुत दूर रखा जाना चाहिए। ध्यान दें कि प्रक्रिया के इस चरण में जैल जमे हुए अवस्था में हैं।- -20 डिग्री सेल्सियस फ्रिज से जमे हुए जेल लें और प्रयोग के दौरान पूरे समय के लिए इसे बर्फ बॉक्स पर रखें।
- माइक्रोस्कोप के तहत सेल स्फेरॉइड का निरीक्षण करें। जेल एम्बेडिंग शुरू होने से पहले, स्फेरॉइड की स्थिति को फिर से डिजिटल माइक्रोस्कोप के साथ जांचना चाहिए।
- माध्यम के 150 μL को ध्यान से निकालें। प्लेट को आइस बॉक्स पर भी रखा जाना चाहिए।
- प्री-कूल्ड पिपेट टिप को कुएं के चारों ओर और अंदर ले जाते हुए कुएं की दीवार की तरफ से धीरे-धीरे तरल जेल जोड़कर जेल में प्रत्येक स्फेरॉइड एम्बेड करें। 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें और यदि जेल समान रूप से नहीं फैलता है, तो धीरे से जेल को 10 μL पिपेट टिप के साथ पिपेट करें। प्रत्येक कुएं में एक ट्यूमर स्फेरॉइड, 3.5 मिलीग्राम / एमएल जेल का 25 μL, और पूर्ण संस्कृति माध्यम का 50 μL होता है। नियंत्रण में 75 μL मध्यम भी जोड़ें।
नोट: प्रत्येक कुएं में एक गोलाकार होता है। - प्लेट को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि हाइड्रोजेलेशन पूरी तरह से पूरा न हो जाए। माइक्रोस्कोप के तहत गेलेशन स्थिति की पुष्टि करें।
- प्रत्येक नमूने पर ताजा माध्यम के 125 μL ओवरले।
- स्फेरॉइड को 7-10 दिनों के लिए कल्चर करें। प्रत्येक चार से छह कुओं के साथ स्फेरॉइड के समूह तैयार करें और विश्लेषण के लिए उनमें से कम से कम तीन चुनें।
नोट: यदि दवा परीक्षण कर रहे हैं, तो एक नमूने के लिए दो समूह तैयार करें। एक समूह का उपयोग व्यवहार्यता परीक्षण के लिए किया जाता है, जबकि दूसरे का उपयोग छवि कैप्चरिंग और विश्लेषण के लिए किया जाता है।
2. दवा उपचार
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार दवा को भंग करें। डीएमएसओ के साथ 100x कार्य समाधान तैयार करें। सीरियल कमजोर पड़ने में दवा की कम से कम पांच खुराक तैयार करें। यहां, फेफड़ों के कैंसर चिकित्सीय दवा, एएमजी 510, एक उदाहरण के रूप में उपयोग किया जाता है। संरचना पूरक तालिका 1 में दिखाया गया है।
- सकारात्मक नियंत्रण के रूप में 0.1% DMSO का उपयोग करें।
- प्रत्येक कुएं में 125 μL दवा-उपचारित माध्यम जोड़ें और प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस रखें (5% सीओ2 के साथ ह्यूमिडिफायर हवा में 37 डिग्री सेल्सियस)। इस स्तर पर, प्रत्येक कुएं में एक ट्यूमर स्फेरॉइड, 3.5 मिलीग्राम / एमएल जेल का 25 μL और माध्यम का 175 μL होता है। नियंत्रण में माध्यम के 200 μL होते हैं।
3. स्फेरॉइड व्यवहार्यता
- निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार अलामार ब्लू परख किट का उपयोग करके स्फेरॉइड व्यवहार्यता को मापें। अलामार ब्लू उपचार किए जाने के बाद माइक्रोप्लेट फोटोमीटर (570 एनएम और 600 एनएम पर अवशोषण) का उपयोग करके व्यवहार्यता को मापें।
- जेल में स्फेरॉइड एम्बेड करने के बाद क्रमशः दिन 1, दिन 4, दिन 7 और दिन 10 पर व्यवहार्यता को मापें, या जैसा कि संकेत दिया गया है।
नोट: अलामार ब्लू परख का उपयोग करते समय, प्रतिक्रिया समय के कम से कम 16 घंटे की आवश्यकता होती है। इसलिए, दिन 0, दिन 3, दिन 6 और दिन 9 की दोपहर में 20 μL Alamar Blue जोड़ें। - प्रत्येक कुएं से एक नई परीक्षण प्लेट में सतह पर तैरनेवाला माध्यम के 100 μL को एस्पिरेट करें और कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में 80 μL ताजा माध्यम जोड़ें। फिर, दवा-उपचारित माध्यम के एक और 100 μL को प्रतिस्थापित करें। सुनिश्चित करें कि कुएं में अलामार ब्लू के कोई अवशेष नहीं हैं।
नोट: मध्यम प्रतिस्थापन प्रत्येक अवसर पर किया जाता है कि व्यवहार्यता का परीक्षण किया जाता है, और इमेजिंग-विश्लेषण समूहों के दवा-उपचारित माध्यम को उसी दिन प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता होती है।
4. दवा परीक्षण में छवियों के माध्यम से स्फेरॉइड अवलोकन और गहन शिक्षण विश्लेषण
- इमेजिंग
- इमेजिंग से पहले माध्यम के 100 μL को एस्पिरेट करें।
- प्लेट को मंच पर रखें। 10x उद्देश्य (2x उद्देश्य पहले) के साथ एक स्वचालित माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्फेरॉइड की डिजिटल छवियां प्राप्त करें। माइक्रोस्कोप स्वचालित रूप से इन स्फेरॉइड पर ध्यान केंद्रित और केंद्रीकृत कर सकता है।
नोट: ऑटोफोकस फ़ंक्शन और उपयोग किए गए एल्गोरिदम को पहले यज़्दानफर एट अल .17 द्वारा रिपोर्ट किया गया है। - स्वचालित इमेजिंग के लिए प्रतीक्षा करें। प्रत्येक स्फेरॉइड के लिए चार चित्र प्राप्त किए जाते हैं। उच्च-सामग्री इमेजिंग सिस्टम से जुड़े सॉफ़्टवेयर के साथ एक एकीकृत छवि बनाई और संसाधित की जाती है।
- "छवि पैच प्रक्रिया" बटन पर क्लिक करें और सॉफ्टवेयर में एकीकृत छवियों का चयन करें।
- "यू-नेट मॉडल" चुनें, और रूपांतरण दर टाइप करें (10x उद्देश्य छवियों में रूपांतरण दर 3.966 है)। छवि प्रसंस्करण शुरू करने के लिए, नीचे दी गई स्क्रीन के नीचे क्लिक करें। फिर, स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में व्यास, परिधि और खुरदरापन डेटा सहेजें।
- अतिरिक्त परिधि सूचकांक (ईपीआई) की गणना करें। ईपीआई गोलाकार परिधि (पी 0) और समकक्ष परिधि (पीई) के बीच का अनुपात है, जैसा कि समीकरण 1 द्वारा गणना की गई है। छवि जे का उपयोग करके फोकल प्लेन (एस) पर स्फेरॉइड के क्षेत्र को मापें। फिर, समीकरण 2 का उपयोग करके स्फेरॉइड के समकक्ष परिधि की गणना करें।
EPI = (P o− P e)/Pe (Eq. 1)
(समीकरण 2)
नोट: विकसित यू-नेट मॉडल के आधार पर डीप-लर्निंग एल्गोरिदम के साथ सॉफ्टवेयर द्वारा गोलाकार परिधि उत्पन्न होती है। - दवा के साथ 100 μL ताजा माध्यम जोड़ें और प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस रखें (5% सीओ2 के साथ ह्यूमिडिफायर हवा में 37 डिग्री सेल्सियस)।
- स्फेरॉइड निषेध।
- Eq. 3 का उपयोग करके ट्यूमर विकास निषेध (TGI) की गणना करें। सापेक्ष स्फेरॉइड वॉल्यूम (RTV) मूल वॉल्यूम (Eq. 4) पर टर्मिनल वॉल्यूम है। स्फेरॉइड वॉल्यूम (वी) की गणना सॉफ्टवेयर द्वारा स्फेरॉइड व्यास आउटपुट के अनुसार ईक्यू 5 का उपयोग करके स्वचालित रूप से की जाती है।
टीजीआई = (आरटीवी नियंत्रण− आरटीवीउपचार)/आरटीवीनियंत्रण × 100% (समीकरण 3)।
RTV = Vटर्मिनल/Vमूल (Eq. 4)
V = 4/3 : (d/2)3 (समीकरण 5)
नोट: टीजीआई को विवो विकास निषेध के संदर्भ में प्राप्त किया जाता है, और ट्यूमर वजन को आरटीवी के साथ बदल दिया जाता है। आरटीवी नियंत्रणनियंत्रण समूह का सापेक्ष स्फेरॉइड वॉल्यूम है, आरटीवीउपचार दवा परीक्षण समूह का सापेक्ष स्फेरॉइड वॉल्यूम है, वीटर्मिनल अंतिम दिन स्फेरॉइड की मात्रा है, वीमूल पहले संस्कृति दिवस पर स्फेरॉइड की मात्रा है, और डी स्फेरॉइड व्यास का प्रतिनिधित्व करता है।
- Eq. 3 का उपयोग करके ट्यूमर विकास निषेध (TGI) की गणना करें। सापेक्ष स्फेरॉइड वॉल्यूम (RTV) मूल वॉल्यूम (Eq. 4) पर टर्मिनल वॉल्यूम है। स्फेरॉइड वॉल्यूम (वी) की गणना सॉफ्टवेयर द्वारा स्फेरॉइड व्यास आउटपुट के अनुसार ईक्यू 5 का उपयोग करके स्वचालित रूप से की जाती है।
(समीकरण 2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
चित्रा 1 ए, बी इस अध्ययन में ट्यूमर स्फेरॉइड के निर्माण के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया को दर्शाता है। हमने पहले कोशिकाओं को 48-वेल यू-बॉटम प्लेट में बीज दिया। यह चरण लगभग वैसा ही है जैसा कि 2 डी सेल संस्कृति में उपयोग किया जाता है। हमने प्लेट को कुओं के आसपास पानी के साथ एक आम इनक्यूबेटर में रखा ताकि जमा कोशिकाओं ने स्व-असेंबली प्रक्रिया में स्फेरॉइड बनाना शुरू कर दिया। सामान्य परिचालन स्थितियों के तहत, अधिकांश प्रकार के ट्यूमर स्फेरॉइड 5 दिनों के बाद पूरी तरह से बन गए थे जब एक लक्षित माध्यम का उपयोग किया गया था (पूरक तालिका 2)। हमने डिजिटल माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 डी) के साथ 5 दिनों के भीतर स्फेरॉइड निर्माण की स्थिति की जांच की। विकास प्रक्रिया पूरी होने के बाद, प्रत्येक कुएं में अलग-अलग स्फेरॉइड को लपेटने के लिए जेल जोड़ा गया, जिससे प्रत्येक स्फेरॉइड के लिए एक विवो जैसी बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) का उत्पादन हुआ। इसके बाद दवा परीक्षण किया गया। जैसा कि हमने डीप-लर्निंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर (चित्रा 1 सी) के साथ एक उच्च-सामग्री इमेजिंग सिस्टम का उपयोग किया है, हम स्पष्ट रूप से व्यक्तिगत स्फेरॉइड विकास (चित्रा 1 ई) का निरीक्षण कर सकते हैं और व्यवहार्यता, व्यास और खुरदरापन सहित दवा चिकित्सा के दौरान विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए उपयुक्त मापदंडों के लिए मान प्राप्त कर सकते हैं।
चित्र 1: ट्यूमर स्फेरॉइड गठन और स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण। (ए) नीचे दी गई समयरेखा के साथ मानक ट्यूमर स्फेरॉइड कल्चर प्रक्रिया दिखाने वाला योजनाबद्ध। (बी) ट्यूमर स्फेरॉइड का उपयोग करके दवा उपचार परीक्षण का योजनाबद्ध 3 डी मैट्रिसेस में आक्रामकता के विभिन्न स्तरों को दर्शाता है। (सी) स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण के लिए एक डीप-लर्निंग-आधारित एल्गोरिथ्म-संबंधित प्रणाली की छवि निम्नानुसार विवरण दिखाती है: प्लेट प्लेटफॉर्म; प्रकाश स्रोत के साथ कंडेनसर; मोटर चालित एक्स, वाई चरण; मोटरचालित जेड-अक्ष मॉड्यूल; उद्देश्य पहिया; फ़िल्टर पहिया; सीसीडी; और विकसित सिस्टम सॉफ्टवेयर के साथ कंप्यूटर। (डी) माइक्रोस्कोप के आईपीस से देखे गए मोनोलेयर कोशिकाओं से एनसीआई-एच 23 ट्यूमर स्फेरॉइड का गठन। स्केल बार 500 μm का प्रतिनिधित्व करता है (E) 10 दिनों में दवा उपचार के बिना NCI-H23 स्फेरॉइड की आक्रामकता और आकार में भिन्नता। स्केल बार 200 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
इस अध्ययन में, हमने गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर के इलाज पर इसके प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एंटीट्यूमर दवा एएमजी 510 का उपयोग किया। विश्लेषण प्रणाली ने जटिल छवि प्रसंस्करण के बिना छवि डेटा प्रदान किया। चित्रा 2 में ब्राइटफील्ड छवियों से पता चलता है कि एनसीआई-एच 23 स्फेरॉइड के विकास को एएमजी 510 द्वारा रोका जा सकता है। यह बढ़ी हुई एकाग्रता के साथ घटे हुए आकार से संकेत दिया गया था। इसके विपरीत, 10 दिनों के लिए नियंत्रण समूह में आकार में वृद्धि हुई। इस अवधि के दौरान, किनारे की तरफ का खुरदरापन, आक्रामकता का संकेत देता है, भी बदल गया। स्फेरॉइड ने पहले दिन सपाट किनारों का प्रदर्शन किया, लेकिन 10 वें दिन खुरदरे किनारों का प्रदर्शन किया। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अकेले ब्राइटफील्ड छवियों के माध्यम से खुरदरापन की तुलना करना एक चुनौतीपूर्ण कार्य है। यह भी उल्लेख किया जाना चाहिए कि मानक विधि में उचित औसत आकार के स्फेरॉइड शामिल हैं। अंत में, हम ध्यान दें कि इस विधि का उपयोग करके एक स्वच्छ पृष्ठभूमि हासिल की गई थी, क्योंकि कुछ कोशिकाओं ने नीचे का पालन किया था।
चित्रा 2: एएमजी 510 की विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किए गए एनसीआई-एच 23 सेल स्फेरॉइड की ब्राइटफील्ड छवियां स्वचालित रूप से एक उच्च-सामग्री माइक्रोस्कोप द्वारा कैप्चर की जाती हैं। कॉलम अलग-अलग दिनों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और पंक्तियां विभिन्न दवा सांद्रता का प्रतिनिधित्व करती हैं। परिणामों में प्रत्येक स्थिति के लिए तीन स्फेरॉइड शामिल हैं। सभी छवियों को स्वचालित रूप से 2x आवर्धन पर केंद्रित किया गया था और फिर कृत्रिम बुद्धिमत्ता-आधारित सॉफ्टवेयर और माइक्रोस्कोप से जुड़े माइक्रोएन्वायरमेंट नियंत्रक का उपयोग करके उच्च-सामग्री इमेजिंग सिस्टम द्वारा 10x आवर्धन पर कैप्चर किया गया था। स्केल बार 200 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3 ए में दिखाए गए सेल व्यवहार्यता परिणामों ने नियंत्रण की तुलना में सभी खुराक स्तरों पर दवा-उपचारित नमूनों की 10 दिवसीय संस्कृतियों में कम व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया। 0.01 μM से अधिक सांद्रता वाले नमूनों ने ट्यूमर सेल व्यवहार्यता में तेजी से कमी का प्रदर्शन किया, जो गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर के लिए AMG510 चिकित्सा की संवेदनशीलता का संकेत देता है। 10 वें दिन, इन नमूनों ने अंतिम व्यवहार्यता के समान स्तर प्रदर्शित किए, 70% से नीचे के मूल्यों के साथ, जैसा कि चित्रा 3 बी में दिखाया गया है।
चित्रा 3: एएमजी 510-उपचारित नमूना समूहों की ट्यूमर स्फेरॉइड व्यवहार्यता। ड्रग्स को पहले दिन जोड़ा गया था। (ए) ट्यूमर स्फेरॉइड व्यवहार्यता को दिन 1, दिन 4, दिन 7 और दिन 10 पर मापा गया था। (बी) सांद्रता ग्रेडिएंट के साथ नमूनों की टर्मिनल सेल व्यवहार्यता। प्रत्येक ट्यूमर स्फेरॉइड के इलाज के लिए उपयोग की जाने वाली दवा सांद्रता 0.001 μM से 5 μM तक सेट की गई थी। सभी डेटा को एसईएम (एन = 3) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4 ए स्फेरॉइड व्यास विश्लेषण के संबंध में एक समान प्रवृत्ति का खुलासा करता है। 0.01 μM से ऊपर सांद्रता वाले नमूने औसत व्यास में एक स्पष्ट कमी का प्रदर्शन करते हैं। स्फेरॉइड आकार में एकरूपता दवा उपचार के पहले दिन भी देखी जा सकती है, जिसमें लगभग 800 μm के मान हैं। इन स्फेरॉइड के व्यास अनुपात (चित्रा 4 बी) ने व्यवहार्यता परीक्षण की तुलना में स्पष्ट रूप से अधिक स्पष्ट तरीके से एएमजी 510 सह-संस्कृति के दौरान संकुचन का संकेत दिया। इसके अलावा, हमने उनके व्यास के संदर्भ में स्फेरॉइड ट्यूमर विकास निषेध मूल्यों की गणना की, जैसा कि चित्रा 4 सी में दिखाया गया है। टीजीआई मान एक सापेक्ष मूल्यांकन पैरामीटर है, और मान स्फेरॉइड के बीच मूल सीडिंग अंतर के परिणामस्वरूप कम वृद्धि का संकेत दे सकते हैं; हालांकि, हमने फिर से परिणाम प्राप्त किया कि 0.01 μM से अधिक सांद्रता का AMG510 उपचार की सफलता पर स्पष्ट प्रभाव पड़ा। पहले के एक अध्ययन में, हमने आईसी 50 मूल्य के साथ प्रयोग किया, जो दवा परीक्षण के लिए एक महत्वपूर्ण सूचकांक है; हालांकि, हमने पाया कि एएमजी 510 उपचार के तहत एनसीआई-एच 23 स्फेरॉइड ने इस पैरामीटर में कोई बदलाव नहीं दिखाया।
चित्रा 4: ट्यूमर का आकार नियंत्रण और एएमजी 510-उपचारित नमूना समूहों में स्फेरॉइड व्यास द्वारा दर्शाया गया है। (ए) ट्यूमर स्फेरॉइड व्यास को दिन 1, दिन 4, दिन 7 और दिन 10 पर मापा गया था। (बी) स्फेरॉइड विकास अनुपात को मूल मात्रा के सापेक्ष टर्मिनल वॉल्यूम के रूप में परिभाषित किया गया था और स्फेरॉइड व्यास का उपयोग करके गणना की गई थी। (सी) स्फेरॉइड विकास निषेध अनुपात को मात्रा के सापेक्ष परिभाषित किया गया था और स्फेरॉइड व्यास का उपयोग करके गणना की गई थी। प्रत्येक ट्यूमर स्फेरॉइड के इलाज के लिए उपयोग की जाने वाली एएमजी 510 सांद्रता 0.001 μM से 5 μM तक सेट की गई थी। सभी डेटा को एसईएम (एन = 3) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
फिर हमने सॉफ्टवेयर (चित्रा 5 ए) द्वारा आउटपुट के रूप में उत्पादित खुरदरापन मूल्यों के संदर्भ में स्फेरॉइड की आक्रामकता का एक और मूल्यांकन किया और उसी माध्यम से उत्पादित स्फेरॉइड सीमाओं के आधार पर अतिरिक्त परिधि सूचकांक भी किया (चित्रा 5 बी)। उच्च खुरदरापन का मतलब है कि अधिक कोशिकाएं स्फेरॉइड से जेल में पलायन कर रही हैं, जो इस प्रकार, उच्च आक्रामकता का प्रतिनिधित्व करती है। नियंत्रण के परिणामों की तुलना विभिन्न दवा एकाग्रता स्तरों के साथ की गई थी। एनसीआई-एच 23 के लिए, एक इनवेसिव सेल लाइन, स्फेरॉइड खुरदरापन और ईपीआई मान दोनों बिना किसी दवा उपचारके संस्कृति समय के साथ बढ़ गए, और यह नियंत्रण नमूनों में उज्ज्वल क्षेत्र छवियों और व्यास में वृद्धि से साबित हो सकता है। हालांकि, एएमजी 510 उपचार द्वारा वृद्धि को क्षीण कर दिया गया था, पूरी तरह से आकार में भिन्नता के अनुपात में।
चित्रा 5: अनुपचारित नियंत्रण और एएमजी 510-उपचारित नमूना समूहों में ट्यूमर सीमा पहचान। ड्रग्स को पहले दिन जोड़ा गया था। (ए) ट्यूमर खुरदरापन को सॉफ्टवेयर द्वारा दिन 1, दिन 4, दिन 7 और दिन 10 पर मापा गया था, जो ट्यूमर स्फेरॉइड की आक्रामकता को दर्शाता है। (बी) स्फेरॉइड परिधि को डीप-लर्निंग एल्गोरिदम का उपयोग करके सॉफ्टवेयर द्वारा स्थित और खींचा गया था। फोकल प्लेन पर स्फेरॉइड क्षेत्रों को तब इमेज जे द्वारा मापा गया था, और इन आंकड़ों के आधार पर एक अतिरिक्त परिधि सूचकांक की गणना की गई थी। प्रत्येक ट्यूमर स्फेरॉइड के इलाज के लिए उपयोग की जाने वाली एएमजी 510 सांद्रता 0.001 μM से 5 μM तक सेट की गई थी। सभी डेटा को एसईएम (एन = 3) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक तालिका 1: प्लेट की संरचना। प्रयोग में एंटी-लंग-ट्यूमर दवा एएमजी 510 का उपयोग किया गया था, और समूह दवा ग्रेडिएंट के अनुसार निर्धारित किए गए थे। दो प्लेटों का उपयोग किया गया था: एक व्यवहार्यता परख किट परीक्षण के लिए और एक इमेजिंग विश्लेषण के लिए।
पूरक तालिका 2: सेल लाइनें जिनका उपयोग 3 डी ट्यूमर निर्माण और दवा परीक्षण में किया गया है। कृपया इन तालिकाओं को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
माइक्रोएन्वायरमेंट ट्यूमर के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह बाह्य मैट्रिक्स, ऑक्सीजन ग्रेडिएंट्स, पोषण और यांत्रिक बातचीत के प्रावधान को प्रभावित कर सकता है और इस प्रकार, जीन अभिव्यक्ति, सिग्नल मार्ग औरट्यूमर कोशिकाओं के कई कार्यों को प्रभावित कर सकता है। कई मामलों में, 2 डी कोशिकाएं ऐसे प्रभाव पैदा नहीं करती हैं या यहां तक कि विपरीत प्रभाव भी पैदा करती हैं, इस प्रकार दवा उपचार के मूल्यांकन को प्रभावित करती हैं। हालांकि, 3 डी मॉडल के उद्भव ने इस समस्या को संबोधित किया है। उदाहरण के लिए, फेफड़ों के कैंसर के उपचार प्रणाली पर एएमजी 510 के प्रभाव का हमारा मूल्यांकन 3 डी विधियों का उपयोग करके पूरा किया गया था। हमने फेफड़ों से संबंधित इनवेसिव सेल लाइन पर एएमजी 510 उपचार की निगरानी के लिए जेल के भीतर एम्बेडेड ट्यूमर स्फेरॉइड बनाकर एक 3 डी ट्यूमर-स्फेरॉइड-ईसीएम (टीएसई) मॉडल का निर्माण किया। एएमजी 510 एक नया अवरोधक है जो जी 12 सी-उत्परिवर्ती केआरएएस22 को लक्षित करता है, और इसकी प्रभावशीलता की पुष्टि हमारी खोज से हुई थी कि इस उत्परिवर्ती का जवाब देने वाले कुछ रोगियों द्वारा अनुभव किए गए गैर-छोटे-सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी) का अनुभव किया गया था। प्रयोगात्मक डेटा और विश्लेषण की हमारी श्रृंखला से, कुछ बहुत मूल्यवान डेटा को समझा जा सकता है। एएमजी 510 के प्रति संवेदनशीलता 2 डी स्थिति की तुलना में 3 डी स्फेरॉइड स्थिति के तहत काफी बढ़ गई थी, और हाइपोक्सिया स्थिति के भीतर अभी भी सुधार हुआ था।
वर्तमान विधि के माध्यम से निर्मित मॉडल कई फायदे प्रदान करते हैं। सबसे पहले, एक 3 डी मॉडल के रूप में, यह ट्यूमर और बाह्य मैट्रिक्स को अच्छी तरह से अनुकरण कर सकता है। 3 डी ट्यूमर स्फेरॉइड के निर्माण की सरल लेकिन प्रभावी विधि कोशिकाओं को 2 सप्ताह की अवधि के लिए जीवित रहने की अनुमति देती है। स्फेरॉइड निर्माण के 5 दिनों के बाद, लगभग 10 दिनों की अवधि उपलब्ध है, जो किसी भी दवा परीक्षण को पूरा करने के लिए पर्याप्त है। इसके अलावा, 3 डी सेल कल्चर उत्पादन की विधि लगभग 2 डी विधि के समान है, और इसकी लागत 3 डी बायोप्रिंटिंग की तुलना में बहुत कम है। हैंगिंग-ड्रॉप विधि जैसे अन्य तरीकों की तुलना में, यहां वर्णित विधि अधिक समान स्फेरॉइड का उत्पादन करने में मदद करती है, और सेल का आकार कोशिकाओं के प्रकार और घनत्व से पूरी तरह से नियंत्रित होता है। अंत में, इस मॉडल को विभिन्न प्रकार के कैंसर कोशिकाओं पर लागू दिखाया गया है, और यह लचीलापन विशेष रूप से उच्च मूल्य का साबित हो सकता है। भविष्य में, ट्यूमर स्फेरॉइड के निर्माण में लगे शोधकर्ता न केवल अपने ट्यूमर सेल निलंबन में फाइब्रोब्लास्ट और एंडोथेलियल कोशिकाओं को जोड़ सकते हैं, बल्कि स्ट्रोमल सेल माइग्रेशन को बढ़ावा देने औरनई दवाओं के इम्यूनोथेराप्यूटिक प्रभावों को बढ़ावा देने के लिए टी कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भी जोड़ सकते हैं।
हाल के दशकों में, कुछ रिपोर्टों ने 3 डी मॉडल25 से महत्वपूर्ण जैविक डेटा निकालने के लिए वर्तमान में उपलब्ध तकनीकों और उपकरणों का वर्णन करने पर ध्यान केंद्रित किया है। इस जानकारी को 3 डी सेल कल्चर मॉडल26 का उपयोग करके दवा परीक्षण और चिकित्सीय खोज के लिए मौलिक माना जा सकता है। ज़ानोनी एट अल के अध्ययन ने उपन्यास ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर का वर्णन किया जो 3 डी ट्यूमर कॉलोनियों के स्वचालित छवि विश्लेषण करता है। लेखकों ने दिखाया कि आकृति विज्ञान मापदंडों ने दवा उपचार के लिए बड़े स्फेरॉइड की प्रतिक्रिया को प्रभावित किया और यह कि स्फेरॉइड आकार और आकारदोनों परिवर्तनशीलता के स्रोत हो सकते हैं। हालांकि, 3 डी जेल में सुसंस्कृत ट्यूमर स्फेरॉइड के साथ, जो विवो में ईसीएम की नकल करते हैं, सेल व्यवहार बहुत अधिक जटिल है, और आक्रामकता का प्रदर्शन किया जा सकता है। जबकि डेटा केवल आकार और आकार से संबंधित हैं, ऐसी सीमाएं बनी रहेंगी। कई विश्वसनीय और विविध पैरामीटर एक उच्च सामग्री इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करके प्राप्त किए जा सकते हैं। इस तरह की प्रणालियां न केवल सेल व्यवहार्यता और स्फेरॉइड आकार निर्धारित कर सकती हैं, बल्कि ट्यूमर की विशेषताओं और ट्यूमर पर दवाओं के निषेध प्रभाव का पता लगा सकती हैं और सत्यापित कर सकती हैं। आक्रामकता को ऐसे साधनों से भी निर्धारित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक आक्रामक ट्यूमर में अपेक्षाकृत अधिक खुरदरापन मूल्य हो सकता है, जबकि एक गैर-आक्रामक ट्यूमर में उच्च ईपीआई मूल्य हो सकता है। ऐसे मूल्यों में परिवर्तन विभिन्न दवा प्रभावों का संकेत दे सकते हैं। भविष्य में, हम अधिक सुविधाजनक और प्रभावी रणनीतियों को प्राप्त करने के लिए इन तकनीकों को माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के साथ संयोजित करने की उम्मीद करते हैं।
यहां वर्णित मानकीकृत विधि अधिकांश दवा स्क्रीनिंग और मूल्यांकन परीक्षणों की आवश्यकताओं को पूरा कर सकती है। हालांकि, अभी भी कुछ समस्याएं हैं जो भविष्य के प्रयोगों के दौरान हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, कोशिकाएं सेंट्रीफ्यूजिंग के बाद कुओं की आंतरिक दीवारों का पालन कर सकती हैं, या संस्कृति माध्यम उपयुक्त नहीं हो सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला जेल, साथ ही व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला मैट्रीगेल, लंबी प्रक्रिया के दौरान आसानी से गेलेट कर सकता है। हालांकि, इनमें से अधिकांश समस्याओं को मानक संचालन और अनुकूलन तकनीकों के माध्यम से हल किया जा सकता है। इस विधि में अन्य संभावित सीमाएं हैं। स्फेरॉइड संरचना के कारण, स्फेरॉइड के माध्यम से पोषक तत्व, ऑक्सीजन और अपशिष्ट प्रसार आकार से प्रभावित होते हैं। स्फेरॉइड कोर में कोशिकाओं की व्यवहार्यता से समझौता किया जा सकता है जब स्फेरॉइड व्यास 1,000 μm से अधिक होता है। इसके विपरीत, जब व्यास 400 μm से नीचे होता है तो आक्रमण का निरीक्षण करना कठिन हो जाता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम अपनी प्रयोगशालाओं के सभी सदस्यों को उनके महत्वपूर्ण इनपुट और सुझावों के लिए धन्यवाद देते हैं। इस शोध को जियांग्सू कमीशन ऑफ हेल्थ (K2019030) की प्रमुख परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था। अवधारणा सीडब्ल्यू और जेडसी द्वारा आयोजित की गई थी, कार्यप्रणाली डब्ल्यूएच और एमएल द्वारा की गई थी, जांच डब्ल्यूएच और एमएल द्वारा की गई थी, डेटा क्यूरेशन डब्ल्यूएच, जेडजेड, एसएक्स और एमएल द्वारा किया गया था, मूल मसौदा तैयारी जेडजेड, जेजेड, एसएक्स, डब्ल्यूएच द्वारा की गई थी। और एक्स.एल., समीक्षा और संपादन जेडसी द्वारा किया गया था, परियोजना प्रशासन सीडब्ल्यू और जेडसी द्वारा किया गया था, और फंडिंग अधिग्रहण सीडब्ल्यू द्वारा आयोजित किया गया था। सभी लेखकों ने पांडुलिपि के प्रकाशित संस्करण को पढ़ा और सहमति व्यक्त की है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Imager and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
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