Summary
Denne artikel demonstrerer en standardiseret metode til konstruktion af tredimensionelle tumorsfæroider. En strategi for sfærisk observation og billedbaseret dyb læringsanalyse ved hjælp af et automatiseret billeddannelsessystem beskrives også.
Abstract
I de seneste årtier er der ud over monolagsdyrkede celler udviklet tredimensionelle tumorsfæroider som et potentielt kraftfuldt værktøj til evaluering af kræftlægemidler. Imidlertid mangler de konventionelle kulturmetoder evnen til at manipulere tumorsfæroiderne på en homogen måde på det tredimensionelle niveau. For at løse denne begrænsning præsenterer vi i dette papir en bekvem og effektiv metode til konstruktion af gennemsnitlige tumorsfæroider. Derudover beskriver vi en metode til billedbaseret analyse ved hjælp af kunstig intelligens-baseret analysesoftware, der kan scanne hele pladen og få data om tredimensionelle sfæroider. Flere parametre blev undersøgt. Ved at anvende en standardmetode til tumorsfæroidkonstruktion og et billeddannelses- og analysesystem med høj kapacitet kan effektiviteten og nøjagtigheden af lægemiddeltest udført på tredimensionelle sfæroider øges dramatisk.
Introduction
Kræft er en af de sygdomme, som mennesker frygter mest, ikke mindst på grund af den høje dødelighed1. I de senere år er muligheden for behandling af kræft steget, da nye terapier er blevet introduceret 2,3,4,5. Todimensionelle (2D) og tredimensionelle (3D) in vitro-modeller bruges til at studere kræft i laboratorieomgivelser. Imidlertid kan 2D-modeller ikke umiddelbart og nøjagtigt vurdere alle de vigtige parametre, der indikerer antitumorfølsomhed; Derfor repræsenterer de ikke fuldt ud in vivo-interaktioner i lægemiddelterapitest6.
Siden 2020 er det globale tredimensionelle (3D) kulturmarked blevet stærkt boostet. Ifølge en rapport fra NASDAQ OMX vil den globale værdi af markedet for 3D-cellekultur overstige USD 2,7 milliarder ved udgangen af 2025. Sammenlignet med 2D-kulturmetoder udviser 3D-celledyrkning fordelagtige egenskaber, som ikke kun kan optimeres til spredning og differentiering, men også til langsigtet overlevelse 7,8. På denne måde kan in vivo cellulære mikromiljøer simuleres for at opnå mere nøjagtig tumorkarakterisering såvel som metabolisk profilering, således at genomiske og proteinændringer bedre kan forstås. På grund af dette bør 3D-testsystemer nu indgå i almindelige lægemiddeludviklingsoperationer, især dem med fokus på screening og evaluering af nye antitumorlægemidler. Tredimensionelle vækster af udødeliggjorte etablerede cellelinjer eller primære cellekulturer i sfæroidstrukturer besidder in vivo-træk ved tumorer såsom hypoxi og lægemiddelpenetration samt celleinteraktion, respons og resistens og kan betragtes som en streng og repræsentativ model til udførelse af in vitro-lægemiddelscreening 9,10,11.
Disse 3D-kulturmodeller lider dog også af flere problemer, der kan tage lidt tid at løse. Cellesfæroider kan dannes ved hjælp af disse protokoller, men de adskiller sig i visse detaljer, såsom dyrkningstid eller indlejringsgeler12, så disse konstruerede cellesfæroider kan ikke kontrolleres godt under et begrænset størrelsesområde. Størrelsen af sfæroiderne kan påvirke konsistensen af levedygtighedstesten og billeddannelsesanalysen. Vækstmikromiljøerne og vækstfaktorerne varierer også, hvilket kan føre til forskellige morfologier på grund af forskelle i differentieringen mellem celler13. Der er nu et indlysende behov for en standard, enkel og omkostningseffektiv metode til konstruktion af alle typer tumorer med kontrollerede størrelser.
Fra et andet perspektiv, selvom homogene assays og billeddannelsesmetoder med højt indhold er blevet udviklet til evaluering af morfologi, levedygtighed og vækstrate, forbliver screening med høj kapacitet af 3D-modeller en udfordring af forskellige årsager, der er rapporteret i litteraturen, såsom manglen på ensartethed i position, størrelse og morfologi af tumorsfæroider14,15,16.
I protokollen, der præsenteres her, viser vi hvert trin i konstruktionen af 3D-tumorsfæroider og beskriver en metode til sfærisk observation og analyse ved hjælp af et billeddannelsessystem med høj gennemstrømning og højt indhold, der involverer autofokus, autobilleddannelse og analyse blandt andre fordelagtige egenskaber. Vi viser, hvordan denne metode kan producere 3D-tumorsfæroider af ensartet størrelse, der er egnede til billeddannelse med høj kapacitet. Disse sfæroider viser også en høj følsomhed over for kræftlægemiddelbehandling, og morfologiske ændringer i sfæroider kan overvåges ved hjælp af billeddannelse med højt indhold. Sammenfattende demonstrerer vi robustheden af denne metode som et middel til at generere 3D-tumorkonstruktioner til lægemiddelevalueringsformål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Spheroid konstruktion
- Anti-vedhæftningsbehandling af kulturpladen
- Der pipetteres 100 μL antiadhæsionsreagens i hvert hul i en 48-brønds plade med en U-formet brøndbund, og opbevares i 10 min. Efter 10 minutter aspireres belægningsreagenset, og vaskes to gange med steriliseret PBS.
- Kulturpladen anbringes i en inkubator (37 °C i befugtet luft med 5 % CO2) indtil brug.
- Celleforberedelse, indsamling og tælling
- Brug det dyrkningsmedium, der er specifikt for cellerne, til at dyrke cellerne i cellekulturkolber (supplerende tabel 2). For eksempel dyrkes NCI-H23, CT-26-celler i RPMI 1640, og HT-29-celler dyrkes i McCoys 5A-medium. Disse to medier suppleres med henholdsvis 10% varmeinaktiveret FBS og 1% P/S.
- Oprethold alle cellerne under standarddyrkningsbetingelser (37 °C i befugtet luft med 5 % CO2) under spredningen. Her bruges NCI-H23-cellelinjen som et eksempel i de følgende trin.
- Vask celler dyrket i en T25-kolbe to gange med 1x PBS for at fjerne kulturmediet (det er bedre at vælge celler i den logaritmiske fase og passere cellerne ved en sammenløb på 80% -90%).
- De ekspanderede celler behandles med 1 ml 0,25% trypsin/EDTA i 1-2 minutter i en inkubator ved 37 °C, 5% CO2. Bekræft celleformen (normalt cirkulær i dette tilfælde) under mikroskopet, og stop derefter trypsinbehandlingen. For at gøre dette skal du aspirere den brugte trypsin / EDTA-suspension i T25-kolben og vaske cellerne med 4 ml frisk medium.
- Overfør hele suspensionen (5 ml) til et 15 ml rør. Brug 1 ml frisk medium til at vaske de resterende celler ned og tilsæt det til røret. Centrifuger cellerne ved 186,48 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, og der tilsættes 10 ml frisk substrat til cellepellet, efterfulgt af forsigtig pipettering, indtil cellerne er i en homogen suspension.
- Opsug 0,1 ml cellesuspension i et nyt centrifugerør, tilsæt 0,9 ml frisk medium, og pipetter derefter suspensionen godt.
- Der ekstraheres 10 μL af cellesuspensionen til celletælling. Udfør denne proces to eller tre gange og tag en gennemsnitsværdi.
- Suspensionen fortyndes for at opnå en endelig såtæthed på 50.000 celler/ml i overensstemmelse med koncentrationen opnået ved celletællingsprocessen i trin 1.2.7.
- Cellekultur og sfærisk dannelse
- Der tilsættes 200 μL af cellesuspensionen til hvert hul i en U-bundplade med 48 huller.
- Sæt forseglingsfilmen rundt om pladen og centrifuger den ved 119,35 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tag forsigtigt pladen ud af centrifugen og træk beskyttelsesfilmen af. Derefter tilsættes 5-8 ml steriliseret vand i vandkanalen omkring brøndene (for at forhindre fordampning) og inkuberes ved 37 °C i 5 dage. Du må ikke ændre/supplere vand til vandkanalen i perioden.
- Overhold celleaggregeringen i løbet af de følgende 5 dage.
BEMÆRK: Generelt begynder cellerne at klumpe sig sammen som kolonier inden for 5 dage. Imidlertid kan processen med sfærisk konstruktion være hurtigere eller langsommere med forskellige celletyper og celletætheder. På grund af dette skal cellerne observeres hver dag ved hjælp af en af tre mulige metoder. For det første kan cellerne observeres gennem bunden af brøndpladen. Når cellerne endnu ikke har dannet en sfæroide, kan et enkelt lag celler ses i bunden. Når cellerne danner en sfæroide, kan en tæt 3D-konstruktion observeres i bunden af hver brønd. En anden metode indebærer at kontrollere cellerne under et mikroskop. Når cellerne bliver en tumorsfæroid, involverer konstruktionen tre lag (et prolifererende lag, et inaktivt lag og en nekrotisk kerne fra ydersiden til indersiden af sfæroiden), som har en gennemsigtighedsgradient. Endelig kan kulturmediets farve også bruges til observationsformål. Dette kan være nyttigt, når trelagsstrukturen ikke kan ses tydeligt, selv ved hjælp af et digitalt mikroskop. Når mediet bliver fra lilla-rød til gul, kan processen med at indlejre sfæroiderne i gelen begynde. Mediet bør ikke udskiftes i celleaggregeringsperioden.
- Indlejring af gel
BEMÆRK: Gelerne skal opbevares ved en temperatur under -20 °C. Især bør geler placeres langt væk fra køleskabsdøren for at undgå temperatursvingninger. Bemærk, at gelerne er i frossen tilstand på dette stadium af processen.- Tag den frosne gel fra -20 °C køleskabet og læg den på en isboks hele tiden under eksperimentet.
- Overhold cellesfæroiderne under mikroskopet. Før gelindlejringen begynder, skal sfæroidernes status igen kontrolleres med et digitalt mikroskop.
- Fjern forsigtigt 150 μL af mediet. Pladen skal også placeres på isboksen.
- Hver kugleformet i gelen anbringes langsomt ved at tilsætte den flydende gel fra brøndens vægside, mens den forkølede pipettespids flyttes rundt og inde i brønden. Vent i 5 minutter, og hvis gelen ikke spredes jævnt, pipetteres gelen forsigtigt med en 10 μL pipettespids. Hver brønd indeholder en tumorsfæroid, 25 μL 3,5 mg / ml gel og 50 μL komplet dyrkningsmedium. Tilføj også 75 μL medium til kontrollerne.
BEMÆRK: Hver brønd indeholder en sfæroide. - Pladen inkuberes ved 37 °C i 30 minutter, indtil hydrogeleringen er helt afsluttet. Bekræft geleringsstatus under mikroskopet.
- Der lægges 125 μL frisk substrat oven på hver prøve.
- Kultur sfæroiderne i yderligere 7-10 dage. Forbered grupper af sfæroider med fire til seks brønde hver og vælg mindst tre af dem til analyse.
BEMÆRK: Hvis du udfører en lægemiddeltest, skal du forberede to grupper til en prøve. Den ene gruppe bruges til levedygtighedstest, mens den anden bruges til billedoptagelse og analyse.
2. Narkotikabehandling
- Opløs lægemidlet i henhold til producentens anvisninger. Forbered 100x arbejdsløsninger med DMSO. Forbered mindst fem doser af lægemidlet i seriel fortynding. Her bruges lungekræftbehandlingslægemidlet, AMG 510, som eksempel. Sammensætningen fremgår af supplerende tabel 1.
- Brug 0,1% DMSO som en positiv kontrol.
- Der tilsættes 125 μL lægemiddelbehandlet substrat til hvert hul, og pladen anbringes tilbage i inkubatoren (37 °C i befugtet luft med 5 % CO2). På dette stadium indeholder hver brønd en tumorsfæroid, 25 μL 3,5 mg / ml gel og 175 μL af mediet. Kontrollerne indeholder 200 μL af mediet.
3. Sfærisk levedygtighed
- Mål sfæroidlevedygtigheden ved hjælp af et Alamar Blue-analysesæt i henhold til producentens retningslinjer. Levedygtigheden måles ved hjælp af et mikropladefotometer (absorbans ved 570 nm og 600 nm) efter Alamar Blue-behandlingen.
- Mål levedygtigheden på dag 1, dag 4, dag 7 og dag 10 efter indlejring af sfæroiderne i gelen eller som angivet.
BEMÆRK: Når du bruger et Alamar Blue-assay, kræves mindst 16 timers reaktionstid. Tilsæt derfor 20 μL Alamar Blue om eftermiddagen på dag 0, dag 3, dag 6 og dag 9. - Der suges 100 μl supernatantsubstrat fra hvert hul til en ny prøveplade, og der tilsættes 80 μl frisk substrat til hvert hul i dyrkningspladen. Udskift derefter yderligere 100 μL af det lægemiddelbehandlede medium. Sørg for, at der ikke er rester af Alamar Blue i brønden.
BEMÆRK: Medium udskiftning udføres hver gang, levedygtigheden testes, og det lægemiddelbehandlede medium i billeddannelsesanalysegrupperne skal udskiftes samme dag.
4. Sfærisk observation og dyb læringsanalyse gennem billeder i lægemiddeltesten
- Imaging
- Opsug 100 μL af mediet ud før billeddannelse.
- Placer pladen på scenen. Få digitale billeder af sfæroiderne ved hjælp af et automatiseret mikroskop med et 10x mål (2x mål først). Mikroskopet kan fokusere og centralisere disse sfæroider automatisk.
BEMÆRK: Autofokusfunktionen og den anvendte algoritme er tidligere rapporteret af Yazdanfar et al.17. - Vent på den automatiske billeddannelse. Fire billeder erhverves for hver sfæroide. Et integreret billede dannes og behandles med softwaren, der er tilsluttet billedbehandlingssystemet med højt indhold.
- Klik på knappen "Image patch process", og vælg de integrerede billeder i softwaren.
- Vælg "U-NET model", og indtast konverteringsfrekvensen (10x objektive billeder har en konverteringsfrekvens på 3.966). Klik nederst på skærmen nedenfor for at starte billedbehandlingen. Gem derefter diameter-, omkreds- og ruhedsdataene i regnearkssoftware.
- Beregn det overskydende perimeterindeks (EPI). EPI er forholdet mellem den kugleformede omkreds (P 0) og den ækvivalente omkreds (Pe) som beregnet ved ækv. 1. Mål området af sfæroiden ved brændplanet (S) ved hjælp af billede J. Beregn derefter den ækvivalente omkreds af sfæroiden ved hjælp af eq. 2.
EPI = (P o− P e)/Pe (Eq. 1)
(Eq. 2)
BEMÆRK: Den sfæroide omkreds genereres af softwaren med deep learning-algoritmer baseret på den udviklede U-NET-model. - Der tilsættes 100 μL frisk substrat med lægemidlet, og pladen anbringes tilbage i inkubatoren (37 °C i befugtet luft med 5% CO2).
- Sfærisk hæmning
- Beregn tumorvæksthæmningen (TGI) ved hjælp af eq. 3. Det relative sfæroidvolumen (RTV) er terminalvolumenet over det oprindelige volumen (eq. 4). Det sfæroidiske volumen (V) beregnes automatisk af softwaren ved hjælp af eq. 5 i henhold til sfæroiddiameteroutputtet.
TGI = (RTV-kontrol−RTV-behandling)/RTV-kontrol × 100% (Eq. 3)
RTV =V-terminal/Voriginal (ækv. 4)
V = 4/3π(d/2)3 (eq. 5)
BEMÆRK: TGI opnås med henvisning til in vivo væksthæmning, og tumorvægtene erstattes med RTV. RTV-kontrol er kontrolgruppens relative sfæroidvolumen, RTV-behandling er det relative sfæroidvolumen af den lægemiddeltestede gruppe,V-terminal er sfæroidens volumen på den sidste dag,V-original er sfæroidens volumen på den første kulturdag, og d repræsenterer sfæroidediameteren.
- Beregn tumorvæksthæmningen (TGI) ved hjælp af eq. 3. Det relative sfæroidvolumen (RTV) er terminalvolumenet over det oprindelige volumen (eq. 4). Det sfæroidiske volumen (V) beregnes automatisk af softwaren ved hjælp af eq. 5 i henhold til sfæroiddiameteroutputtet.
(Eq. 2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A,B viser den proces, der anvendes til konstruktion af tumorsfæroider i denne undersøgelse. Vi såede først cellerne i en 48-brønds U-bundplade. Dette trin er næsten det samme som det, der anvendes i 2D-cellekultur. Vi opbevarede pladen i en fælles inkubator med vand omkring brøndene, så de aflejrede celler begyndte at danne sfæroider i en selvmonteringsproces. Under normale driftsforhold blev de fleste typer tumorsfæroider fuldstændigt dannet efter 5 dage, når et målrettet medium blev anvendt (supplerende tabel 2). Vi kontrollerede status for sfærisk konstruktion inden for 5 dage med et digitalt mikroskop (figur 1D). Efter at vækstprocessen var afsluttet, blev gel tilsat for at pakke de enkelte sfæroider i hver brønd, hvilket producerede en in vivo-lignende ekstracellulær matrix (ECM) for hver sfæroide. Narkotikatest blev derefter udført. Da vi brugte et billeddannelsessystem med højt indhold med dyb læringsanalysesoftware (figur 1C), kunne vi tydeligt observere individuel sfærisk vækst (figur 1E) og opnå værdier for passende parametre til bestemmelse af egenskaber under lægemiddelbehandling, herunder levedygtighed, diameter og ruhed.
Figur 1: Tumorsfæroiddannelse og automatiseret billeddannelse og analyse . (A) Skematisk, der viser standardtumorsfæroidkulturproceduren med tidslinjen nedenfor. (B) Skematisk over lægemiddelbehandlingstest ved hjælp af tumorsfæroider, der viser forskellige niveauer af invasivitet i 3D-matricer. C) Billede af et algoritmerelateret system baseret på dyb læring til automatiseret billeddannelse og analyse, der viser detaljer som følger: pladeplatform; kondensator med lyskilde; motoriseret x, y trin; motoriseret Z-akse modul; objektivt hjul; filterhjul; CCD; og computer med den udviklede systemsoftware. (D) Dannelsen af NCI-H23 tumorsfæroider fra enkeltlagsceller observeret fra okularet i et mikroskop. Skalabjælken repræsenterer 500 μm. (E) Variation i invasiviteten og størrelsen af NCI-H23-sfæroiderne uden lægemiddelbehandling over 10 dage. Skalabjælkerne repræsenterer 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
I denne undersøgelse brugte vi antitumorlægemidlet AMG510 til at teste dets virkning på behandling af ikke-småcellet lungekræft. Analysesystemet leverede billeddata uden kompleks billedbehandling. Brightfield-billederne i figur 2 viser, at væksten af NCI-H23-sfæroider kan hæmmes af AMG510. Dette blev indikeret af den reducerede størrelse sammen med øget koncentration. I modsætning hertil steg størrelsen i kontrolgruppen i 10 dage. I løbet af denne periode ændrede ruheden af kantsiden, hvilket indikerer invasivitet, også. Sfæroiderne udviste flade kanter på dag 1, men ru kanter på dag 10. Det skal dog bemærkes, at sammenligning af ruhed gennem brightfield-billeder alene er en udfordrende opgave. Det skal også nævnes, at standardmetoden involverer sfæroider af passende gennemsnitlig størrelse. Endelig bemærker vi, at der blev opnået en ren baggrund ved hjælp af denne metode, da få celler klæbede til bunden.
Figur 2: Brightfield-billeder af NCI-H23-cellesfæroider behandlet med forskellige koncentrationer af AMG510, der automatisk optages af et mikroskop med højt indhold. Kolonnerne repræsenterer forskellige dage, og rækkerne repræsenterer forskellige lægemiddelkoncentrationer. Resultaterne omfatter tre sfæroider for hver tilstand. Alle billederne blev automatisk fokuseret på 2x forstørrelse og derefter taget ved 10x forstørrelse af billedbehandlingssystemet med højt indhold ved hjælp af kunstig intelligensbaseret software og en mikroskopassocieret mikromiljøcontroller. Skalabjælkerne repræsenterer 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Cellelevedygtighedsresultaterne, vist i figur 3A, viste reduceret levedygtighed i 10-dages kulturer af lægemiddelbehandlede prøver på alle doseringsniveauer sammenlignet med kontrolgruppen. Prøver med koncentrationer over 0,01 μM udviste et hurtigt fald i tumorcellelevedygtighed, hvilket indikerer AMG510-terapiens følsomhed over for ikke-småcellet lungekræft. På dag 10 udviste disse prøver nogenlunde samme grad af endelig levedygtighed med værdier under 70 %, som vist i figur 3B.
Figur 3: Tumorsfærisk levedygtighed af de AMG510-behandlede prøvegrupper. Narkotika blev tilføjet på dag 1. (A) Tumorsfæroidlevedygtighed blev målt på dag 1, dag 4, dag 7 og dag 10. B) Terminal cellelevedygtighed af prøver med koncentrationsgradienter. Lægemiddelkoncentrationerne, der blev anvendt til behandling af hver tumorsfæroid, blev sat fra 0,001 μM til 5 μM. Alle data præsenteres som middelværdi ± SEM (n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4A viser en lignende tendens med hensyn til analysen af kuglediameteren. Prøver med koncentrationer over 0,01 μM udviste en tydelig reduktion i gennemsnitsdiameteren. Ensartethed i sfærisk størrelse kunne også ses på den første dag af lægemiddelbehandling med værdier på ca. 800 μm. Diameterforholdene mellem disse sfæroider (figur 4B) indikerede sammentrækning under AMG510-samkulturen på en synligt mere indlysende måde end levedygtighedstesten. Derudover beregnede vi spheroid tumorvæksthæmningsværdierne med hensyn til deres diametre, som vist i figur 4C. TGI-værdien er en relativ evalueringsparameter, og værdierne kan indikere nedsat vækst som følge af oprindelige såningsforskelle blandt sfæroiderne; Vi opnåede dog igen det resultat, at koncentrationer over 0,01 μM havde en tydelig effekt på AMG510-behandlingens succes. I en tidligere undersøgelse eksperimenterede vi med IC50-værdien, som er et signifikant indeks for lægemiddeltest; Vi konstaterede imidlertid, at NCI-H23-sfæroider under AMG510-behandling ikke udviste nogen ændringer i denne parameter.
Figur 4: Tumorstørrelse repræsenteret ved sfæroiddiametre i kontrol- og AMG510-behandlede prøvegrupper. (A) Tumorsfæroiddiametre blev målt på dag 1, dag 4, dag 7 og dag 10. (B) Det sfæroide vækstforhold blev defineret som terminalvolumenet i forhold til det oprindelige volumen og beregnet ved hjælp af sfæroiddiametrene. (C) Det sfæroide væksthæmningsforhold blev defineret i forhold til volumenet og beregnet ved hjælp af sfæroiddiametrene. AMG510-koncentrationerne, der blev anvendt til behandling af hver tumorsfæroide, blev sat fra 0,001 μM til 5 μM. Alle data præsenteres som middelværdi ± SEM (n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Vi foretog derefter en yderligere evaluering af sfæroidernes invasivitet med hensyn til de ruhedsværdier, der produceres som output af softwaren (figur 5A) og også det overskydende perimeterindeks baseret på sfæroidgrænserne, produceret på samme måde (figur 5B). Højere ruhed betyder, at flere celler migrerer fra sfæroiden til gelen, hvilket således repræsenterer højere invasivitet. Resultaterne af kontrollerne blev sammenlignet med forskellige stofkoncentrationsniveauer. For NCI-H23, en invasiv cellelinje, steg sfærisk ruhed og EPI-værdier begge med dyrkningstid uden nogen lægemiddelbehandling18, og dette kunne bevises ved brightfield-billederne og diameterforøgelser i kontrolprøverne. Væksten blev dog dæmpet af AMG510-behandlingen, helt proportionalt med variationer i størrelse.
Figur 5: Tumorgrænsegenkendelse i de ubehandlede kontrol- og AMG510-behandlede prøvegrupper. Narkotika blev tilføjet på dag 1. (A) Tumorruhed blev målt af softwaren på dag 1, dag 4, dag 7 og dag 10, hvilket indikerer invasiviteten af tumorsfæroiderne. (B) Den sfæroide omkreds blev lokaliseret og tegnet af softwaren ved hjælp af deep learning-algoritmer. De sfæroidiske områder på brændplanet blev derefter målt med billede J, og et overskydende perimeterindeks blev beregnet ud fra disse data. AMG510-koncentrationerne, der blev anvendt til behandling af hver tumorsfæroide, blev sat fra 0,001 μM til 5 μM. Alle data præsenteres som middelværdi ± SEM (n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel 1: Pladens sammensætning. Anti-lungetumorlægemidlet AMG510 blev anvendt i eksperimentet, og grupper blev indstillet efter lægemiddelgradienter. Der blev anvendt to plader: en til levedygtighedsanalysekittesten og en til billeddannelsesanalysen.
Supplerende tabel 2: Cellelinjer, der er blevet brugt i 3D-tumorkonstruktion og lægemiddeltestning. Klik her for at downloade disse tabeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikromiljøet spiller en vigtig rolle i tumorvækst. Det kan påvirke tilvejebringelsen af ekstracellulære matricer, iltgradienter, ernæring og mekanisk interaktion og dermed påvirke genekspression, signalveje og mange funktioner i tumorceller 19,20,21. I mange tilfælde producerer 2D-celler ikke sådanne virkninger eller producerer endda modsatte virkninger, hvilket påvirker evalueringen af lægemiddelbehandlinger. Fremkomsten af 3D-modeller har imidlertid løst dette problem. For eksempel blev vores evaluering af effekten af AMG510 på et lungekræftbehandlingssystem gennemført ved hjælp af 3D-metoder. Vi konstruerede en 3D-tumor-sfæroide-ECM (TSE) model ved at skabe tumorsfæroider indlejret i en gel for at overvåge AMG510-behandling på en lungerelateret invasiv cellelinje. AMG510 er en ny hæmmer, der er rettet mod G12C-mutant KRAS22, og dens effektivitet blev bekræftet af vores fund af, at den ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), som nogle patienter oplever, reagerer på denne mutant. Fra vores serie af eksperimentelle data og analyser kan nogle meget værdifulde data skelnes. Følsomheden over for AMG510 blev signifikant forbedret under en 3D-sfærisk tilstand sammenlignet med 2D-tilstanden og forbedret yderligere inden for en hypoxi-tilstand.
De modeller, der er konstrueret ved hjælp af den nuværende metode, giver flere fordele. For det første kan den som en 3D-model simulere tumoren og den ekstracellulære matrix godt. Den enkle, men effektive metode til konstruktion af 3D-tumorsfæroider gør det muligt for cellerne at overleve i en 2 ugers periode. Efter de 5 dages sfærisk konstruktion er der en periode på ca. 10 dage til rådighed, hvilket er tilstrækkeligt til at udføre enhver lægemiddeltest. Derudover er metoden til 3D-cellekulturproduktion næsten den samme som 2D-metoden, og dens omkostninger er langt lavere end for 3D-bioprint. Sammenlignet med andre metoder såsom hænge-drop-metoden hjælper metoden beskrevet her med at producere mere ensartede sfæroider, og cellestørrelsen styres fuldt ud af cellernes type og densitet. Endelig har denne model vist sig at være anvendelig på forskellige typer kræftceller, og denne fleksibilitet kan vise sig at være af særlig høj værdi. I fremtiden kan forskere, der beskæftiger sig med dannelsen af tumorsfæroider, ikke kun tilføje fibroblaster og endotelceller til deres tumorcellesuspensioner, men også immunceller som T-celler og NK-celler for at fremme stromalcellemigration og øge de immunterapeutiske virkninger af nye lægemidler23,24.
I de seneste årtier har kun få rapporter fokuseret på at beskrive de teknikker og værktøjer, der i øjeblikket er tilgængelige til at udtrække væsentlige biologiske data fra 3D-modeller25. Disse oplysninger kan betragtes som grundlæggende for lægemiddeltest og terapeutisk opdagelse ved hjælp af 3D-cellekulturmodeller26. Undersøgelsen af Zanoni et al. beskrev ny open source-software, der udfører automatisk billedanalyse af 3D-tumorkolonier. Forfatterne viste, at morfologiparametre påvirkede reaktionen af store sfæroider på lægemiddelbehandling, og at sfærisk størrelse og form begge kunne være kilder til variabilitet27. Men med tumorsfæroider dyrket i 3D-gel, som efterligner ECM'er in vivo, er celleadfærd meget mere kompleks, og invasivitet kan udvises. Mens dataene kun vedrører størrelse og form, vil sådanne begrænsninger forblive. Mange pålidelige og diversificerede parametre kan opnås ved hjælp af et billeddannelsessystem med højt indhold. Sådanne systemer kan ikke kun bestemme cellelevedygtigheden og sfærisk form, men kan også detektere og verificere egenskaberne ved tumorer og hæmningseffekten af lægemidler på tumorer. Invasivitet kan også bestemmes på sådanne måder. For eksempel kan en invasiv tumor have en relativt højere ruhedsværdi, mens en ikke-invasiv tumor kan have en højere EPI-værdi. Ændringer i sådanne værdier kan indikere forskellige lægemiddelvirkninger. I fremtiden håber vi at kombinere disse teknikker med mikrofluidiske chips for at opnå mere bekvemme og effektive strategier.
Den standardiserede metode, der beskrives her, kan opfylde kravene i de fleste lægemiddelscreenings- og evalueringstest. Der er dog stadig nogle problemer, der kan opstå under fremtidige eksperimenter. For eksempel kan celler klæbe til brøndens indre vægge efter centrifugering, eller kulturmediet er muligvis ikke egnet. Derudover kan gelen, der anvendes i protokollen, såvel som den meget anvendte Matrigel, let gelere under den lange proces. Imidlertid kan de fleste af disse problemer løses gennem standard drifts- og optimeringsteknikker. Der er andre mulige begrænsninger i denne metode. På grund af sfæroidstrukturen påvirkes næringsstoffer, ilt og affaldsdiffusion gennem sfæroiden af størrelsen. Levedygtigheden af cellerne i den sfæroide kerne kan blive kompromitteret, når sfæroiddiameteren er over 1.000 μm. Omvendt bliver det svært at observere invasionen, når diameteren er under 400 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer af vores laboratorier for deres kritiske input og forslag. Denne forskning blev støttet af nøgleprojektet fra Jiangsu Commission of Health (K2019030). Konceptualisering blev udført af C.W. og Z.C., metoden blev udført af W.H. og M.L., undersøgelsen blev udført af W.H. og M.L., datakurateringen blev udført af W.H., Z.Z., S.X. og M.L., det oprindelige udkast til forberedelse blev udført af Z.Z., J.Z., S.X., W.H., og X.L., blev gennemgangen og redigeringen udført af Z.C., projektadministrationen blev udført af C.W. og Z.C., og finansieringserhvervelsen blev udført af C.W. Alle forfatterne har læst og accepteret den offentliggjorte version af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Imager and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
References
- Carioli, G., et al. European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer. Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).
- Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer biology and therapy. Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).
- Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy. FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).
- Shokooohi, A., et al. Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world. Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).
- Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 116 (2021).
- Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells. Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).
- Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species. FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F.
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Brüningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. 3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments. Scientific Reports. 10, 1653 (2020).
- Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer. Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
- Carragher, N., et al. Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models. Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).
- Huang, Y., et al. Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).
- Yazdanfar, S., et al. Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy. Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).
- Chen, Z., et al. Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition. Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).
- Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. 3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies. Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).
- Anastasiou, D., et al. Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape. British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).
- Zhou, H., et al. Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis. Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).
- Zhu, G. G., et al. Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance. Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).
- Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy. Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).
- Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
- Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
