Summary
Her beskriver vi en protokol, den udvidede endotelcellekulturmetode (EECM), der tillader differentiering af pluripotente stamceller til hjernens mikrovaskulære endotelcelle (BMEC) -lignende celler. Disse celler viser endotelcelleadhæsionsmolekyleekspression og er således en human blod-hjerne-barrieremodel, der er egnet til at studere immuncelleinteraktioner in vitro.
Abstract
Blod-hjerne barriere (BBB) dysfunktion er et patologisk kendetegn ved mange neurodegenerative og neuroinflammatoriske sygdomme, der påvirker centralnervesystemet (CNS). På grund af den begrænsede adgang til sygdomsrelaterede BBB-prøver er det stadig ikke godt forstået, om BBB-funktionsfejl er årsagssammenhæng for sygdomsudvikling eller snarere en konsekvens af den neuroinflammatoriske eller neurodegenerative proces. Human inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) giver derfor en ny mulighed for at etablere in vitro BBB-modeller fra raske donorer og patienter og dermed studere sygdomsspecifikke BBB-karakteristika fra individuelle patienter. Flere differentieringsprotokoller er blevet etableret til udledning af hjernemikrovaskulære endotelceller (BMEC) -lignende celler fra hiPSC'er. Overvejelse af det specifikke forskningsspørgsmål er obligatorisk for det korrekte valg af den respektive BMEC-differentieringsprotokol. Her beskriver vi den udvidede endotelcellekulturmetode (EECM), som er optimeret til at differentiere hiPSC'er til BMEC-lignende celler med en moden immunfænotype, hvilket muliggør undersøgelse af immuncelle-BBB-interaktioner. I denne protokol differentieres hiPSC'er først til endotelstamceller (EPC'er) ved at aktivere Wnt / β-catenin-signalering. Den resulterende kultur, som indeholder glatte muskellignende celler (SMLC'er), passeres derefter sekventielt for at øge renheden af endotelceller (EC'er) og for at inducere BBB-specifikke egenskaber. Co-kultur af EECM-BMEC'er med disse SMLC'er eller konditioneret medium fra SMLC'er muliggør reproducerbar, konstitutiv og cytokinreguleret ekspression af EC-adhæsionsmolekyler. Det er vigtigt, at EECM-BMEC-lignende celler etablerer barriereegenskaber, der kan sammenlignes med primære humane BMEC'er, og på grund af deres ekspression af alle EC-adhæsionsmolekyler er EECM-BMEC-lignende celler forskellige fra andre hiPSC-afledte in vitro BBB-modeller. EECM-BMEC-lignende celler er således den valgte model til undersøgelse af den potentielle indvirkning af sygdomsprocesser på BBB-niveau med indflydelse på immuncelleinteraktion på en personlig måde.
Introduction
Den neurovaskulære enhed (NVU) i det centrale nervesystem (CNS) består af de højt specialiserede mikrovaskulære endotelceller (EC'er), pericytter indlejret i endotelkældermembranen samt parenkymal kældermembran og astrocytendefødder1. Inden for NVU er hjernens mikrovaskulære endotelceller (BMEC'er) nøglekomponenterne, der danner blod-hjerne-barrieren (BBB). BMEC'er danner komplekse og kontinuerlige tætte kryds og har ekstremt lav pinocytotisk aktivitet sammenlignet med mikrovaskulære EC'er i perifere organer, hvilket gør det muligt for BBB at hæmme den frie paracellulære diffusion af vandopløselige molekyler i CNS. BMEC'ernes ekspression af specifikke tilstrømningstransportører og effluxpumper sikrer optagelse og eksport af henholdsvis næringsstoffer og skadelige molekyler fra CNS2. Derudover kontrollerer BBB strengt immuncelleindgangen til CNS ved at udtrykke lave niveauer af endoteladhæsionsmolekyler, der er afgørende for immuncellehandel i CNS3. Under fysiologiske forhold er ekspressionsniveauerne af adhæsionsmolekyler på overfladen af BMEC'er, såsom intercellulært adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1) og vaskulært celleadhæsionsmolekyle-1 (VCAM-1), lave, men disse niveauer stiger i nogle neurologiske lidelser2. Morfologisk og funktionel nedbrydning af BBB rapporteres i mange neurologiske sygdomme, såsom slagtilfælde4, multipel sklerose (MS)5 og flere neurodegenerative sygdomme 6,7,8. Detaljeret undersøgelse af BMECs cellulære og molekylære egenskaber under både fysiologiske og patologiske tilstande er en tilgang til at identificere nye terapeutiske strategier, der er målrettet BBB.
Indtil for nylig blev primære eller udødeliggjorte menneskelige og gnaver-BMEC'er brugt til at studere BBB. Det er imidlertid uklart, om konklusioner baseret på dyremodeller af BBB er let anvendelige på den humane BBB, da ekspressionen af flere vigtige molekyler, herunder vedhæftningsmolekyler og opløste bærerproteiner, adskiller sig mellem mennesker og gnavere 9,10. Selvom humane BMEC-linjer som hCMEC / D3 udtrykker passende niveauer af vedhæftningsmolekyler11, har disse udødeliggjorte BMEC'er generelt ikke komplekse tætte kryds og robuste barriereegenskaber12. Primære humane BMEC'er er nyttige til at studere barrierefunktioner13, men de er ikke let tilgængelige for alle forskere. Desuden kan primære BMEC'er fra patienter være vanskelige at opnå, da de skal indsamles gennem en hjernebiopsi eller operation, der kun udføres under specifikke kliniske forhold.
Nylige fremskridt inden for stamcelleteknologi har gjort det muligt at differentiere forskellige humane celletyper, der stammer fra stamcellekilder som humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er). De hiPSC-afledte modeller giver os mulighed for at etablere patofysiologiske modeller ved hjælp af patientafledte prøver. Flere hiPSC-afledte celletyper kan kombineres for at etablere autologe cokulturer eller organoider, der bedre efterligner fysiologiske tilstande. Flere almindeligt anvendte protokoller 14,15,16,17,18,19 kan bruges til at differentiere hiPSC-afledte BMEC-lignende celler, der har robuste diffusionsbarriereegenskaber med ekspression af BBB-specifikke transportører og effluxpumper og er nyttige til at studere den paracellulære diffusion af små molekyler, molekylære transportmekanismer og lægemiddelafgivelse til hjernen 20,21. Tidligere undersøgelser har imidlertid vist, at almindeligt anvendte hiPSC-afledte BMEC-lignende celler mangler ekspression af vigtige endoteladhæsionsmolekyler, herunder VCAM-1, selektiner og ICAM-2, som er ansvarlige for formidling af interaktioner mellem immunceller og BBB22. Desuden er tidligere hiPSC-afledte BMEC'er rapporteret at udvise blandede endotel- og epitelegenskaber på transkriptionsniveau23. Derfor udviklede vi den udvidede endotelcellekulturmetode (EECM), en ny protokol, der tillader differentiering af hiPSC'er i BMEC-lignende celler, der ligner primære humane BMEC'er med hensyn til morfologi, barriereegenskaber og endoteladhæsionsmolekyleekspression. Denne protokol beskriver de detaljerede metodologiske procedurer til differentiering af hiPSC'er til BMEC-lignende celler, der viser en moden immunfænotype.
Protocol
Figur 1: Oversigt over protokollen. Manuskriptet præsenterer en trin-for-trin protokol til differentiering af hiPSC'er i EECM-BMEC-lignende celler. De rigtige ordninger skildrer cellepopulationerne på hvert trin. Klik her for at se en større version af denne figur.
HiPSC-linjen, HPS1006, blev leveret af RIKEN BRC gennem National Bio-Resource Project fra MEXT/AMED, Japan.
1. Induktion af hiPSC-differentiering i endotelstamceller (EPC'er)
- Plader og reagenser belagt med ekstracellulær matrix (ECM)
- Forbered kældermembranmatrixbelagte plader med 12 brønde ved at aliquotere 2,5 mg matrixgel i 50 ml centrifugerør til opbevaring ved -20 °C i op til 6 måneder. Tilsæt 30 ml kold Dulbeccos modificerede Eagle's medium/næringsstofblanding F-12 (DMEM/F12), som har været opbevaret i køleskab (4 °C), i røret. Bland forsigtigt ved pipettering, indtil gelen er optøet, og tilsæt derefter 500 μL af opløsningen til hvert hul i pladen med 12 huller. Pladen anbringes i en inkubator (37 °C, 5% CO2) i mindst 1 time.
BEMÆRK: Kældermembranmatrixgelen er temperaturfølsom og skal håndteres i henhold til producentens anvisninger for aliquoting og pladebelægning. Koncentrationen af ekstracellulære matrixproteiner kan variere mellem batcher. For at sikre nøjagtighed anføres den nøjagtige koncentration på kvalitetscertifikatarket for det specifikke parti ved hjælp af partinummeret. For eksempel, hvis den nøjagtige koncentration er 10,0 mg / ml, skal du bruge 250 μL gel til i alt 2,5 mg. - Stamopløsning af rhokinase (ROCK) fremstilles ved at opløse ROCK-hæmmeren i sterilt vand til en koncentration på 10 mM (tabel 1). Stamopløsningen afsaltes i volumener på 100-200 μL og opbevares ved -20 °C for at undgå fryse-optøningscyklusser.
- Der fremstilles en 100 mg/ml stamopløsning af L-ascorbinsyre ved opløsning af 5 g L-ascorbinsyre i 50 ml sterilt vand og opbevares ved -20 °C (tabel 1). Der tilsættes 6,25 ml glutamin og 305 μL L-ascorbinsyrestamopløsning i 500 ml avanceret DMEM/F12 til et LaSR-medium24 (tabel 1). Opbevares ved 2-8 °C i op til 2 uger.
- CHIR99021-opløsningen fremstilles ved at opløse CHIR99021 i ufortyndet dimethylsulfoxid (DMSO) til en slutkoncentration på 10 mM (tabel 1). Opløsningen omsættes i volumener på 100-200 μL for at undgå fryse-optøningscyklusser og opbevares ved -20 °C i op til 1 år. Arbejdsdelprøver af stamopløsningen opbevares ved 4 °C i op til 1 måned.
- Forbered DMEM / F12-10 medium ved at tilføje 50 ml varmeinaktiveret føtalt bovin serum til 450 ml DMEM / F12. Opbevar mediet ved 2-8 °C i op til 1 måned (tabel 1).
- Forbered flowbuffer-1 ved at tilsætte 33,3 ml 7,5% bovint serumalbumin (BSA) til 467 ml Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (PBS) (tabel 1). Opbevares ved 2-8 °C i op til 6 måneder.
- Forbered kældermembranmatrixbelagte plader med 12 brønde ved at aliquotere 2,5 mg matrixgel i 50 ml centrifugerør til opbevaring ved -20 °C i op til 6 måneder. Tilsæt 30 ml kold Dulbeccos modificerede Eagle's medium/næringsstofblanding F-12 (DMEM/F12), som har været opbevaret i køleskab (4 °C), i røret. Bland forsigtigt ved pipettering, indtil gelen er optøet, og tilsæt derefter 500 μL af opløsningen til hvert hul i pladen med 12 huller. Pladen anbringes i en inkubator (37 °C, 5% CO2) i mindst 1 time.
- Seedning af singulariserede hiPSC'er og udvidelse til EPC-differentiering (dag -3 til dag -1)
- Begynd differentiering, når hiPSC-kolonierne i en 6-brønds plade ikke viser nogen spontan differentiering og har den passende tæthed til passage, typisk omkring 80% sammenløb (2,5-3,5 x 106 celler). Overvåg omhyggeligt spontant differentierede celler under mikroskopet for at sikre, om der kræves flere passager for at eliminere ikke-differentierede celler. Se bemærkningen nedenfor trin 1.4.15 for oplysninger om cellekulturmedium og ekstracellulær matrix.
- Substratet suges til og tilsættes 1 ml dissociationsreagens til hullerne og inkuberes i 5-7 minutter ved 37 °C. Dissocier og singulariser cellerne ved at pipettere dissociationsreagensopløsningen forsigtigt over hullernes overflader to eller tre gange.
- De løsrevne celler overføres til et 15 ml rør indeholdende 4 ml hiPSC-vedligeholdelsesmedium, og cellerne resuspenderes grundigt. Reserver en 10 μL alikvote til celletælling.
- Pillecellerne centrifugeres i 5 minutter ved 200 x g ved 20-25 °C. Cellerne tælles, og det krævede volumen beregnes for at opnå en passende tæthed af hiPSC'er (75-400 x 103 pr. hul) i en kældermembranmatrixbelagt 12-brøndsplade (trin 1.1.1).
- Opsug overfladebehandlingsopløsningen fra hullerne, og tilsæt 1 ml hiPSC-medium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer i hvert hul (1:1.000 fortynding). Efter centrifugering aspireres supernatanten, og pelletsen dissocieres i 1 ml hiPSC-medium.
- Det krævede volumen hiPSC, bestemt i trin 1.2.4, tilsættes til hvert hul på 12-brøndspladen. To til fire plader med 12 brønde kan være tilstrækkelige til at differentiere en hiPSC-klon. Se trin 1.2.4 for at bestemme antallet af plader, der kræves til såning af celler.
- Pladen anbringes i en inkubator (37 °C, 5% CO2). Fordel cellerne jævnt ved forsigtigt at glide pladen frem og tilbage og derefter side til side i inkubatoren.
- Den følgende dag (dvs. dag -2) udskiftes mediet med 2 ml hiPSC-vedligeholdelsesmedium, der mangler ROCK-hæmmer. Den næste dag (dag -1) udskiftes mediet med 2 ml frisk hiPSC-vedligeholdelsesmedium.
- Induktion af EPC'er med glykogensyntase kinase 3 (GSK-3) hæmmeren CHIR99021 (dag 0 til dag 5)
- På dag 0 udskiftes hiPSC-vedligeholdelsesmediet i hvert hul med 2 ml LaSR-substrat indeholdende 8 μM CHIR99021.
- På dag 1 aspireres mediet, og der tilsættes 2 ml frisk LaSR-substrat indeholdende 8 μM CHIR99021.
- På dag 2, 3 og 4 udskiftes mediet med 2 ml frisk LaSR-medium, der mangler CHIR99021.
- Magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) til rensning af CD31+ EPC'er (dag 5)
- På dag 5 aspireres mediet og tilsættes derefter 1 ml dissociationsreagens til hvert hul, før det inkuberes i 6-8 minutter ved 37 °C.
- Dissocier og singulariser cellerne med en mikropipette og passér gennem en 40 μm cellesil for at filtrere suspensionen i et 50 ml rør indeholdende 10 ml DMEM / F12-10 medium. Cellesuspensionen opsamlet fra mere end to plader med 12 huller filtreres i mindst to 50 ml rør.
- Stop fordøjelsesreaktionen ved at tilsætte DMEM/F12-10 medium (op til 50 ml). Pipetten pipetteres grundigt, og reserver 10 μL til tælling af celler. Pillecellerne centrifugeres i 5 minutter ved 200 x g ved 20-25 °C.
- Efter fjernelse af supernatanten tilsættes 10 ml DMEM/F12-10-substrat, og cellesuspensionen overføres til friske 15 ml reagensglas. Pillecellerne centrifugeres i 5 minutter ved 200 x g ved 20-25 °C.
- Supernatanten suges til syn, og resuspenderes til flowbuffer-1 med en densitet på 1,0 x 107 celler pr. 100 μl buffer.
- Der tilsættes FcR-blokerende reagens i forholdet 1:100 og inkuberes i 5 minutter, før der tilsættes det fluoresceinisothiocyanat (FITC)-mærkede CD31-antistof fortyndet 1:200. Inkuber suspensionen i 30 minutter i mørke ved 20-25 °C.
- Der tilsættes 10 ml flowbuffer-1, idet 10 μL af suspensionen reserveres til flowcytometrianalyse for at bestemme fraktionen af CD31+ celler (figur 2).
- Pillecellerne centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 20-25 °C. Derefter fjernes supernatanten, og opslæmningen resuspenderes til en massefylde på 1,0 x 107 celler pr. 100 μl flowbuffer-1-opløsning. Tilsæt FITC-udvælgelsescocktailen (5 μL pr. 100 μL cellesuspension). Bland grundigt ved pipettering og inkuber i mørke i 15 minutter ved 20-25 °C.
- Der tilsættes 5 μL magnetiske nanopartikler pr. 100 μL cellesuspension, pipetteopbevares og inkuberes i mørke i 10 minutter ved 20-25 °C.
- Overfør cellesuspensionen til et 5 ml flowcytometrirør, og tilsæt flowbuffer-1 for at opnå et samlet volumen på 2,5 ml. Placer flowcytometrirøret i magneten i 5 min.
- I en kontinuerlig bevægelse inverteres magneten og dekanteres cellesuspensionen indeholdende celler, der ikke var mærket med FITC-CD31-antistoffet. Hold magneten og røret i omvendt position i 2-3 s, og fjern derefter den resterende væske. Opsug eventuelle dråber på rørkanten, før du sætter røret tilbage i lodret position.
- Tag flowcytometrirøret op fra magneten, og tilsæt 2,5 ml flowbuffer-1 for at vaske de resterende CD31+ celler. Resuspender cellerne ved forsigtigt at pipettere cellerne op og ned to eller tre gange. Placer flowrøret i magneten i 5 min.
- Gentag trin 1.4.11-1.4.12 tre gange og derefter trin 1.4.11 endnu en gang for i alt fire vaske.
- Fjern strømningsrøret fra magneten, og tilsæt den angivne mængde af et passende medium (f.eks. humant endotelserumfrit medium [hECSR] til udvidet EC-kultur eller frysemedium til frysning) til røret for at resuspendere de rensede CD31+ -celler. Der reserveres to 10 μL alikvoter af suspensionen, en til celletælling og den anden til at udføre flowcytometrianalyse for at vurdere renheden af CD31+ celler i post-MACS-prøver (figur 2). Hvis et flowcytometer ikke umiddelbart er tilgængeligt, opbevares prøven ved 4 °C indtil analysen.
- Hvis de næste trin (gennem trin 2) ikke kan udføres med det samme, skal du fryse CD31+ EPC'erne på dette tidspunkt. For udvidelse og selektiv overførsel af EPC'er skal du fortsætte til trin 2.
BEMÆRK: Vitronectin25-belagte 12-brøndsplader og det mere stabile hiPSC-vedligeholdelsesmedium (mTeSR plus) kan bruges i stedet for kældermembranmatrixbelagte plader og hiPSC-vedligeholdelsesmedium (mTeSR1). For at fremstille vitronectinbelagte plader med 12 huller fortyndes vitronectin med fortyndingsbuffer til en slutkoncentration på 10 μg/ml og overføres derefter 500 μL af den fortyndede opløsning til hvert hul i pladerne med 12 huller. Pladerne efterlades ved 20-25 °C i mindst 1 time. Såtætheden af singulariserede hiPSC'er er sammenlignelig med den, der anvendes til kældermembranmatrixbelagte plader. Ændring af dyrkningsmediet eller matrixsammensætningen kan påvirke spredning og spontan differentiering af hiPSC'er, som typisk kræver 1-2 uger at tilpasse sig nye dyrkningsforhold. Hvis det mere stabile hiPSC-vedligeholdelsesmedium anvendes til hiPSC-vedligeholdelse, kan dette medium bruges til EPC-differentiering i stedet for hiPSC-vedligeholdelsesmediet. I dette tilfælde skal det mere stabile hiPSC-vedligeholdelsesmedium ændres på dag -2 for at fjerne ROCK-hæmmer, og udskiftningen på dag -1 kan springes over.
2. Udvidet endotelcellekulturmetode (EECM) til differentiering af hjernemikrovaskulære endotelcellelignende celler (BMEC-lignende celler) og glatte muskellignende celler (SMLC'er)
- Fremstilling af kollagenbelagte plader og reagenser
- Forbered kollagenbelagte 6-brøndsplader ved at opløse 5 mg krystalliseret kollagen type IV i 5 ml sterilt vand. Der inkuberes natten over ved 4 °C, før der foretages aliquotering og opbevares ved -20 °C. Kollagen IV alikvoter fortyndes 1:100 i sterilt vand for at producere 10 μg/ml opløsninger, og der tilsættes 1 ml 10 μg/ml kollagen IV-opløsninger til hvert hul i pladerne med 6 huller. Pladerne inkuberes i mindst 30 minutter ved 37 °C. Pladerne kan opbevares ved 37 °C i op til 1 uge.
- Der fremstilles en stamopløsning af human fibroblastvækstfaktor 2 (FGF2) ved at opløse 500 μg FGF i 5 ml Dulbeccos PBS, der tilsættes 7,5 % BSA til en slutkoncentration på 0,1 %, og stamopløsningen omdannes til volumener på 20-200 μL. Disse kan opbevares ved -20 °C i op til 3 måneder (tabel 1). Stamopløsninger kan opbevares ved 4 °C i op til 1 måned; Undgå fryse-optøningscyklusser. Forbered hECSR-substrat ved at tilsætte 2 ml B-27-supplement og 20 μL FGF2 i 98 ml hECSR-medium (tabel 1). HECSR-substratet kan opbevares ved 2-8 °C i op til 2 uger.
- Forbered frysemedium til EPC'erne, EECM-BMEC-lignende celler og SMLC'er ved at tilsætte 15 ml føtalt bovint serum, 5 ml DMSO og 25 μL ROCK-hæmmeropløsning til 30 ml hECSR-medium (tabel 1). Frysemediet kan opbevares ved 2-8 °C i op til 2 uger.
- Såning af EPC'er til udvidet endotelcellekultur
- Fjern kollagenopløsningen fra pladerne med 6 brønde. Derefter overføres 1,0-2,0 x 10 5 oprensede CD31+ EPC'er i 2 ml hECSR-medium indeholdende5 μM ROCK-hæmmer (1:2.000 fortynding). Pladen anbringes i en inkubator (37 °C, 5% CO2). Fordel cellerne jævnt ved forsigtigt at glide pladerne frem og tilbage og derefter fra side til side.
- Den næste dag fjernes hECSR-mediet indeholdende ROCK-hæmmer, og der tilsættes 2 ml frisk hECSR-medium uden ROCK-hæmmer. Udskift hECSR-mediet hver anden dag, indtil 100% sammenløb er nået.
BEMÆRK: Hvis en regelmæssig fodringsplan ikke kan opretholdes over en weekend, kan mediet udskiftes om aftenen den sidste arbejdsdag i ugen og igen tidligt om morgenen efter weekenden.
- Selektiv passage til rensning af EECM-BMEC-lignende celler og SMLC'er
- HECSR-substratet fjernes fra pladerne med 6 huller, der indeholder en blanding af EC'er og ikke-EF-populationer. Der tilsættes 1 ml dissociationsreagens til hvert hul.
- Overvåg cellemorfologien omhyggeligt under et mikroskop. Når EC'erne (men ikke ikke-EC'erne) ser lyse og runde ud (typisk inden for 2-5 min), skal du fjerne dem ved at banke på kanten af pladen. De fleste ikke-EC'er forbliver fastgjort til pladen.
- De løsrevne EC'er indsamles ved hjælp af en mikropipette, idet det sikres, at ikke-EC'erne ikke suspenderes igen. EC'erne overføres til et 15 ml eller 50 ml centrifugeglas indeholdende 4 ml DMEM/F12-10 pr. 1 ml dissociationsreagens.
- Der tilsættes 2 ml hECSR-substrat til hullerne indeholdende de resterende fastgjorte ikke-EC'er for at etablere SMLC'er. Pladen anbringes i inkubatoren.
- EF-suspensionen pipetteres i centrifugeglasset for at blande grundigt, og der reserveres 10 μL af suspensionen til celletælling. De resterende celler centrifugeres i 5 minutter ved 200 x g ved 20-25 °C. Supernatanten fjernes fra pelleten, og der tilsættes 2 ml hECSR-substrat pr. 1,0-2,0 x 105 EC.
- Efter fjernelse af kollagen IV-opløsningen fra en ny 6-brønds plade tilsættes 2 ml EC-suspension til hvert hul efterfulgt af inkubation ved 37 °C med 5% CO2. For jævnt at fordele cellerne i pladen skal du forsigtigt flytte den frem og tilbage og side til side bevægelse på inkubatorhylden.
- Udskift hECSR-mediet hver anden dag, indtil EC'erne når 100% sammenløb.
- Trin 2.3.1-2.3.7 gentages, indtil der opnås et rent EF-monolag. Hvis følgende trin ikke kan udføres, skal du fryse CD31+ EC'erne (se trin 2.4.2). For at analysere EC-funktioner skal du fortsætte til trin 3.
BEMÆRK: Generelt er to eller tre selektive passager nødvendige for at opnå næsten rene kulturer af EC'er, der er egnede til funktionelle analyser, og vi betragter disse celler som EECM-BMEC-lignende celler. Efter mere end fem eller seks passager sænkes celleproliferation typisk, selvom denne variabel afhænger af hiPSC-linjen. - For at dyrke SMLC'er skal du udskifte hECSR-mediet hver anden dag. For at opsamle SMLC-konditioneret medium (CM) skal det opsamlede medium ledes gennem et 0,22 μm filter ved hver medieændring. CM kan bruges til at opregulere VCAM-1-ekspressionen af EECM-BMEC-lignende celler. Saml SMLC-CM, indtil SMLC'erne når 100% sammenløb.
- EPC, EECM-BMEC-lignende celle og SMLC-kryopræservering og optøning
- For at fryse EPC'er efter den endelige MACS-vask (trin 1.4.13) skal EPC'erne resuspenderes i frysemedium i stedet for hECSR-medium ved en densitet på 1,0-2,0 x 106 celler/ml. 1 ml af cellesuspensionen fordeles i kryotuber. Kryorørene anbringes i en fryseanordning med kontrolleret hastighed, og de overføres hurtigt til -80 °C. Ved langtidsopbevaring flyttes rørene til en flydende nitrogentank 24 til 48 timer efter frysning.
- For at fryse EECM-BMEC-lignende celler og SMLC'er tilsættes dissociationsreagens (1 ml / hul) efter fjernelse af mediet fra hullerne og inkuberes pladen ved 37 ° C med 5% CO2 , indtil cellerne løsner sig (henholdsvis 5-7 min og 20-30 min for EECM-BMEC-lignende celler og SMLC'er). Cellerne opsamles i et 15 ml eller 50 ml centrifugeglas indeholdende 4 ml DMEM/F12-10 pr. 1 ml dissociationsreagens.
- Pipetten pipetteres grundigt for at blande og reservere 10 μL af cellesuspensionen til celletælling. Pillecellerne centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 20-25 °C. Supernatanten fjernes og resuspenderes grundigt i frysemedium til en massefylde på 1,0-2,0 x 106 celler/ml. 1 ml af cellesuspensionen fordeles i friske kryorør.
- Kryorørene anbringes i en fryseanordning med kontrolleret hastighed, og de overføres straks til -80 °C. Til langtidsopbevaring kan rørene overføres til en flydende nitrogentank 24 til 48 timer efter frysning.
- Til optøning af EPC'er, EECM-BMEC-lignende celler og SMLC'er rulles hætteglas med kryorør mellem hænderne eller inkuberes i et 37 °C vandbad, indtil cellerne er næsten helt optøet. Der tilsættes 500 μL DMEM/F12-10, og cellesuspensionen overføres forsigtigt til et 15 ml glas indeholdende 4 ml DMEM/F12-10 medium. Kryorøret vaskes én gang ved tilsætning af 1 ml DMEM/F12-10, og cellerne centrifugeres derefter ved 200 x g i 5 minutter ved 20-25 °C.
- Supernatanten suges op, og pellet resuspenderes i 2 ml hECSR-medium indeholdende 5 μM ROCK-hæmmer (1:2.000 fortynding) til en densitet på 1,0-2,0 x 10 5 celler pr. 2 ml for EPC'er og 2,0-3,0 x 105 celler pr. 2 ml for EECM-BMEC-lignende celler og SMLC'er. Cellesuspensionen fordeles mellem hullerne i de kollagenbelagte 6-brøndsplader efter opsugning af kollagenopløsningen.
- Pladerne bevæges forsigtigt frem og tilbage og derefter fra side til side på hylden i en inkubator ved 37 °C, 5 % CO2 for at fordele cellerne jævnt i hullerne.
- Næste dag skal du udskifte mediet med frisk hECSR-medium, der mangler ROCK-hæmmer. Udskift hECSR-mediet hver anden dag, indtil der opnås 100% sammenløb. Fortsæt derefter til selektiv passaging for EPC'er (se trin 2.3) og funktionelle analyser for EECM-BMEC-lignende celler (se trin 3). Før der udføres molekylær karakterisering og funktionelle assays, skal EECM-BMEC-lignende celler være 100% sammenflydende, hvilket typisk opnås 2-3 dage efter optøning.
3. Validering af EECM-BMEC-lignende celler og SMLC'er
- Permeabilitetsanalyse for sporstoffer med små molekyler
- Vurder den EECM-BMEC-lignende cellebarriereintegritet ved at måle natriumfluoresceinpermeabilitet, som beskrevet af Nishihara et al.26. Frø de EECM-BMEC-lignende celler på filterindsatser for at udvikle komplette monolag og måle permeabiliteten af natriumfluorescein.
- Immunofluorescensfarvning for at vurdere nøglemolekyler.
- Til immunofluorescensfarvning til overvågning af ekspressionen af forbindelsesmolekyler, adhæsionsmolekyler eller cytoskeletale proteiner fra EECM-BMEC-lignende celler i monolag eller SMLC'er skal du bruge kammerglas, 96-brøndplader eller membraner med indsatsfiltre. Vurder den EECM-BMEC-lignende celleekspression af celleoverfladeadhæsionsmolekyler med eller uden inflammatorisk cytokinstimulering, som beskrevet af Nishihara et al.26.
- Flowcytometri til analyse af ekspressionen af celleoverfladeadhæsionsmolekyler på EECM-BMEC-lignende celler
- Brug flowcytometri til at vurdere den semikvantitative ekspression af celleoverfladeadhæsionsmolekyler involveret i immuncellemigration til CNS, herunder ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, P-selectin, E-selectin, CD99 og blodpladeendotelcelleadhæsionsmolekyle-1 (PECAM-1), som beskrevet af Nishihara et al.26. Dyrk de EECM-BMEC-lignende celler med SMLC-konditioneret medium i nærvær og fravær af inflammatoriske cytokiner i 16-18 timer.
- Immunocelleadhæsionsassay under statiske betingelser for at vurdere ekspressionen af funktionelle adhæsionsmolekyler
- Brug metoden beskrevet af Nishihara et al.26 til at bestemme, om celleoverfladeadhæsionsmolekylerne i EECM-BMEC-lignende celler er funktionelle.
- Kort sagt, frø de EECM-BMEC-lignende celler på et kammerglas ved 5,5 x 104 / cm2 og vokse til sammenløb. Ca. 24 timer senere ændres dyrkningsmediet til SMLC-konditioneret medium i nærvær eller fravær af proinflammatoriske cytokiner, og de EECM-BMEC-lignende celler inkuberes i yderligere 16 timer.
- På forsøgsdagen optø kryopræserverede immunceller (f.eks. T-celler eller mononukleære celler i perifert blod [PBMC'er]) med T-cellevaskebuffer (tabel 1) og mærke med fluorescerende farvestoffer (f.eks. cellesporingsfarvestoffer) i T-cellemedium (tabel 1). Optimering af dyrkningsmediet til immuncellerne bør skræddersys til den specifikke type immunceller, der undersøges.
- I et kammerglas med 16 brønde tilsættes 2 x 104 Th1-celler til de EECM-BMEC-lignende celler. Specifikt, når man arbejder med effektor T-celler såsom Th1-celler, er det blevet observeret, at de udviser større binding til EECM-BMEC-lignende celler sammenlignet med PBMC'er (Nishihara. et al. [2022]). Derfor skal antallet af PBMC'er, der skal føjes til de EECM-BMEC-lignende celler, være højere sammenlignet med rene effektor T-celler.
- Immuncellerne inkuberes med monolaget af EECM-BMEC-lignende celler i 30 minutter i migrationsassaymedium (tabel 1). Efter 30 minutter vaskes objektglasset forsigtigt to gange ved nedsænkning i en krukke indeholdende Dulbeccos PBS og fastgøres derefter med 2,5% glutaraldehydopløsning ved 4 °C i 2 timer.
- Efter fiksering vaskes diaset to gange ved at nedsænke i en krukke indeholdende Dulbeccos PBS og monteres med en dæksel. Derefter erhverves fluorescensmikroskopibilleder af midten af monolaget på diasene til tælling af immunceller fastgjort til EECM-BMEC-lignende cellemonolag.
Representative Results
Permeabilitetsanalyse
Permeabiliteten af natriumfluorescein blev beregnet ved at måle fluorescensintensiteten af mediet opsamlet fra det nedre kammer ved 15, 30, 45 og 60 min. Der udtages prøver af i alt 150 μL substrat på hvert tidspunkt, og det manglende volumen på 150 μL erstattes med hECSR-medium. fluorescensintensiteten aflæses ved hjælp af en fluorescerende pladelæser (485 nm excitation/530 nm emission), og de korrekte signaler, frigangsvolumener og permeabiliteter beregnes ved hjælp af en tidligere beskrevet formel18 (tabel 2). Det anbefales at bekræfte, om fluorescensintensiteten af natriumfluorescein stiger over tid. Der bør anvendes flere filtre - mindst tre eksemplarer - til et assay for at sikre reproducerbarhed. For sunde kontrolafledte EECM-BMEC-lignende celler bør natriumfluorescein (376 Da) permeabiliteten være under 0,3 x 10-3 cm / min. For at bekræfte dannelsen af et sammenflydende EECM-BMEC-lignende cellemonolag skal immunofluorescensfarvning for forbindelsesproteiner i de EECM-BMEC-lignende celler i hvert filter, der anvendes i permeabilitetsassaysne, udføres efter dette assay.
Immunofluorescens farvning
Immunofluorescensfarvning af EECM-BMEC-lignende celleforbindelsesmolekyler, herunder claudin-5, occludin og VE-cadherin1, blev anvendt til at vurdere cellemorfologi og tilstedeværelsen af kontinuerlige og modne kryds (figur 4). Monolagene af EECM-BMEC-lignende celler på membranerne i filterindsatserne blev fikseret med kold methanol (-20 °C) i 20 s, blokeret med blokerende buffer (tabel 1) og derefter inkuberet med primære og sekundære antistoffer. De EECM-BMEC-lignende celler udviste spindellignende former og zigzagformede kryds, som begge er karakteristiske morfologiske træk ved BMEC'er27. Stimulering af de EECM-BMEC-lignende celler podet på kammerglas med proinflammatoriske cytokiner, såsom tumornekrosefaktor-α (TNF-α) og interferon-γ (INF-γ) (0,1 ng / ml TNF-α + 2 IE / ml IFN- γ) fortyndet i SMLC-afledt konditioneret medium, opregulerede ekspressionen af adhæsionsmolekyler, såsom ICAM-1 og VCAM-128 (figur 5). Repræsentative billeder af glatte muskelcellemarkører, herunder α-glat muskelaktin (SMA), calponin og glat muskelprotein 22-alfa (SM22a)29, er vist i figur 6. SMLC'er podet på kammerobjektglasset blev fikseret med 4% paraformaldehyd i 10 minutter, blokeret med blokerende buffer og derefter inkuberet med primære og sekundære antistoffer.
Flowcytometrianalyse af celleoverfladeadhæsionsmolekyleekspression af EECM-BMEC-lignende celler
Figur 7 viser repræsentative resultater for celleoverfladeekspression af endoteladhæsionsmolekyler på EECM-BMEC-lignende celler. Stimulering med proinflammatoriske cytokiner, som TNF-α og INF-γ, opregulerede celleoverfladeekspressionen af flere adhæsionsmolekyler, herunder ICAM-1, VCAM-1 og P-selectin. Dyrkning af EECM-BMEC-lignende celler med SMLC-konditioneret mediumforbedret endotel-VCAM-1-celleoverfladeekspression. Effekten af induktionen af VCAM-1-celleoverfladeekspression kan variere mellem batcher af SMLC-konditioneret medium. Det anbefales, at flere batcher konditioneret substrat høstet fra SMLC'er, afledt af samme hiPSC-kilde, opbevares ved differentiering af SMLC'er for at kontrollere, hvilken batch der inducerer den korrekte ekspression af VCAM-1.
Immunocelleadhæsionsanalyse under statiske forhold
Antallet af bundne immunceller korrelerede med ekspressionsniveauet af funktionelle adhæsionsmolekyler på overfladen af EECM-BMEC-lignende celler. Stimulering med inflammatoriske cytokiner opregulerede ekspressionen af endoteladhæsionsmolekyler og fremmede det øgede antal immunceller, der klæbede til EECM-BMEC-lignende cellemonolag (figur 8). Det nuværende eksperiment demonstrerede funktionaliteten af adhæsionsmolekyler på EECM-BMEC-lignende celler, hvilket gør denne model velegnet til at studere immuncelle-EF-interaktioner.
Figur 2: Oprensning af CD31+ EC'er. Prikplotter af repræsentative flowcytometridata fra spredning af EC'er og FITC-mærket CD31-farvning af cellepopulationer før (trin 1.4.7) og efter (trin 1.4.14) MACS. MACS forbedrer renheden af CD31+ EPC'er i befolkningen. Forkortelser: SSC = side scatter; FSC = fremadrettet spredning; FITC = fluoresceinisothiocyanat; MACS = magnetisk aktiveret cellesortering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: EECM-BMEC-monolags permeabilitet (10-3 cm/min) beregnet ud fra natriumfluoresceins intensitet af rå fluorescens. Den lineære hældning af frirumsvolumen beregnes ved hjælp af lineær regression for hvert filter (figur 3A). Permeabiliteten af natriumfluorescein beregnes ved hjælp af to formler (figur 3B). (A) Den lineære hældning af frirumsvolumen versus tid blev beregnet ved hjælp af lineær regression for filter 1 (mc1) og blindfilteret (mf). M c1 og m f er koefficienter på henholdsvis Xc1 og Xf. (B) Formel til beregning af fluoresceinpermeabilitet (Pe) ved anvendelse af mc og mf (formel 1). Pe-enheder blev konverteret ved hjælp af overfladearealet af et filter (formel 2). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: EECM-BMEC-lignende celler viser modne cellulære kryds. Immunofluorescensfarvning for claudin-5, occludin eller VE-cadherin (rød) i EECM-BMEC-lignende celler dyrket på membraner i indsatsfiltre. Kerner blev farvet under anvendelse af 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (blå). Farvning blev udført på nøjagtig de samme filterindsatser, der blev brugt til permeabilitetsanalyserne. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Ekspression af endoteladhæsionsmolekyler af EECM-BMEC-lignende celler. Immunofluorescensfarvning blev udført på EECM-BMEC-lignende celler dyrket på membraner af filterindsatser i nærværelse af SMLC-afledt CM. Immunfarvning for ICAM-1 eller VCAM-1 (rød) er vist for ikke-stimulerede og 1 ng/ml TNF-α + 20 IE/ml IFN- γ stimulerede EECM-BMEC-lignende celler. Kerner blev farvet med DAPI (blå). Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Karakterisering af SMLC'er. Immunocytokemi af α-glat muskelactin (SMA), calponin eller glat muskelprotein 22-alfa (SM22a) (rød) for SMLC'er dyrket på kammerglas er vist. Kerner blev farvet med DAPI (blå). Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Endotelcelleoverfladeekspression af adhæsionsmolekyler på EECM-BMEC-lignende celler. Resultater af flowcytometrianalyse af EC-overfladeadhæsionsmolekyleekspression på EECM-BMEC-lignende celler vises. EECM-BMEC-lignende celler blev dyrket ved hjælp af SMLC-afledt konditioneret medium. Blå, røde og grå linjer i histogramoverlejringerne viser henholdsvis den ikke-stimulerede (NS) tilstand, 1 ng/ml TNF-α + 20 IE/ml IFN-γ-stimuleret tilstand og isotypekontrol. Celleoverfladeekspressionen af endoteladhæsionsmolekyler, herunder intercellulært adhæsionsmolekyle 1 (ICAM-1), ICAM-2, vaskulær celleadhæsionsmolekyle 1 (VCAM-1), P-selectin, E-selectin, CD99 og trombocytendotelcelleadhæsionsmolekyle-1 (PECAM-1) blev vurderet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Adhæsion af immunceller på EECM-BMEC-lignende celler. (A) Billeder af fluorescerende mærkede vedhængende immunceller på ikke-stimulerede (NS) og 0,1 ng/ml TNF-α + 2 IE/ml IFN-γ-stimulerede (TNF-α + IFN-γ) EECM-BMEC-lignende cellemonolag. Billederne svarer til brøndenes centre. Skalabjælke = 50 μm. (B) Antallet af fluorescerende mærkede immunceller på monolag af NS og TNF-α + IFN-γ-stimulerede EECM-BMEC-lignende celler. Klæbende immunceller / synsfelter (FOV'er) blev automatisk talt ved hjælp af FIJI-software. Prikker repræsenterer antallet af vedhæftede T-celler. Søjler viser middelværdien, og fejlbjælker viser standardafvigelsen (SD) for otte forsøg. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Nærmere oplysninger om specifikke reagenser til analyserne. Navnet og den nøjagtige mængde ingredienser for hvert specifikt reagens er beskrevet. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Eksempel på rådata for fluorescenspladelæseren til Pe-beregning. Tal med fed skrift er den rå fluorescensintensitet af natriumfluorescein målt af en pladelæser. For nøjagtigt at analysere dataene er det nødvendigt at fjerne baggrundssignalet fra de rå værdier og tage højde for ethvert signaltab som følge af prøveudtagning af bundkammeret og derefter korrigere signalet. For eksempel, efter at have trukket baggrunden, udviser 15 min-prøven et signal på 100 relative fluorescensenheder (RFU), og 30 min-prøven udviser et signal på 150 RFU. Det korrigerede signal efter 30 min er (150 RFU + de manglende værdier ved 15 min [100 RFU x 150 μL/1.500 μL]), hvilket er 150 RFU + 10 RFU = 160 RFU. Frirumsvolumen = (1.500 x [S B,t])/(S T,60 min), hvor 1.500 er volumenet af det nederste kammer (1.500 μL), S B,t er det korrigerede signal på tidspunktet t, og ST,60 min er signalet fra det øverste kammer på 60 min. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Kritiske punkter og fejlfinding
Før EPC-differentiering påbegyndes, bør forskerne sikre, at der ikke er sket spontane celledifferentieringshændelser i hiPSC-kulturerne. Fraværet af spontant differentierede celler og brugen af rene hiPSC-kolonier er afgørende for at opnå reproducerbare resultater. HiPSC-såtætheden på dag -3 er vigtig for at opnå en høj renhed af CD31+ EPC'er efter MACS. Såtætheden for hver hiPSC-linje og hver passage kan kræve optimering. Afhængigt af hiPSC-linjen og passagenummeret kan såtætheden variere mellem 75 x 10 3 til 400 x 10 3 hiPSC'er pr. hul på en 12-brøndplade (20-100 x 103/cm2). Minimumstæthedskontrolpunktet for hiPSC'er er celletætheden på dag 2. HiPSC'erne skal nå 100% sammenløb senest på dag 2. Hvis hiPSC'erne ikke flyder sammen på dag 2, vil renheden af CD31+ EPC'er efter MACS normalt være ret lav. I dette tilfælde kan hiPSC-såtætheden øges. Hvis et stort antal differentierende celler løsner sig fra pladen omkring dag 3 til dag 5, kan den indledende hiPSC-såtæthed reduceres. 7-8 μM CHIR99021 er efter vores erfaring den optimale koncentration for de hiPSC-linjer, der anvendes her, men koncentrationen skal muligvis optimeres til andre hiPSC-linjer, der kan reagere anderledes på inhibitorbehandlingen. Renheden af CD31+ EPC'er bør bekræftes før og efter MACS. Før du fortsætter MACS, skal den forsorterede celleblanding være >10% CD31+ celler. CD31+ celleprocenter på <6% resulterer typisk i <80% EPC'er efter MACS. Optimering af den indledende såtæthed og/eller CHIR99021-koncentrationen er nødvendig i denne situation.
For vellykket selektiv passaging og generering af rene EC-monolag er renheden efter MACS af CD31+ EPC'er kritisk. Hvis renheden efter MACS er <90%, anbefales en eller to yderligere vaske (trin 1.4.11-1.4.12). Ideelt set bør renheden efter MACS være >95%. EPC-såtætheden på kollagenbelagte plader skal optimeres i henhold til hiPSC-linjen for at opnå 100% sammenløb inden for 3-7 dage. At vente, indtil EC'erne er 100% sammenflydende, vil normalt føre til vellykket selektiv passage. Men selv for 100% sammenflydende EC'er løsner nogle hiPSC-linjers SMLC'er også tidligt. I dette tilfælde kan selektiv passaging ved lavere sammenløb (f.eks. ≤80%) være effektiv. Hvis nogle SMLC'er løsner sig tidligere end EC'er, kan EC'erne ofte ikke reddes fra den blandede EC-SMLC-befolkning. I dette tilfælde kan det være nyttigt at forkorte aktiveringstiden for dissociationsreagenset ved passage af EC'er og gentagen selektiv passaging. Anvendelsen af et kommercielt dissociationsreagens snarere end trypsin som dissociationsreagens er gavnligt for selektiv passaging, da trypsin ikke tillader separat løsrivelse af EC'er og SMLC'er. Vores permeabilitetsanalyser ved hjælp af små molekylesporstoffer og test af tætte forbindelses- og vedhæftningsmolekyleekspressionsniveauer indikerer, at EPC'er, EECM-BMEC-lignende celler og SMLC'er kan opbevares i flydende nitrogen i mindst 2 år.
Metodens betydning og begrænsninger
Metoden adskiller CD31+ EPC'er fra hiPSC'er ved brug af kemiske GSK-3-hæmmere til at aktivere Wnt/β-catenin-signalering. Efter positiv udvælgelse af CD31+ EPC'er af MACS dyrkes EPC'er i et defineret endotelmedium, der fremmer differentiering i blandede endotel- og SMLC-populationer. Selektiv overførsel af disse blandede populationer med forskellige klæbeegenskaber muliggør adskillelse af EC'er fra SMLC'er. Efter en eller to passager udviser EECM-BMEC-lignende celler barriereegenskaber og ekspression af endoteladhæsionsmolekyler, der rekapitulerer dem fra primære humane BMEC'er. Co-kultur med SMLC'er eller deres supernatanter inducerer den cytokininducerede ekspression af VCAM-1.
In vivo opretholder BBB CNS-homeostase ved at etablere lav paracellulær og transcellulær permeabilitet af molekyler gennem transport af næringsstoffer via specifikke transportører og kontrol af immuncellehandel ind i CNS. For undersøgelser af BBB er en passende model, der viser de respektive molekyler og funktioner af interesse, afgørende. Produktion af EECM-BMEC-lignende celler ved hjælp af definerede reagenser og prøver fra patienter eller raske forsøgspersoner giver en skalerbar human BBB-model. Fordelene ved en model, der bruger EECM-BMEC-lignende celler i forhold til andre BBB-modeller, er: 1) en morfologi og endoteltranskriptomprofil30, der ligner den for primære humane BMEC'er; 2) tilstedeværelsen af modne tætte kryds; 3) ønskelige barriereegenskaber og 4) den robuste ekspression af endoteladhæsionsmolekyler, herunder ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, E- og P-selectin, CD99, melanomcelleadhæsionsmolekyle (MCAM) og aktiveret leukocytcelleadhæsionsmolekyle (ALCAM)22. Således er denne model særlig nyttig til at studere interaktioner mellem immunceller og BMEC'er. Selvom permeabiliteten af små molekylesporstoffer er højere for EECM-BMEC-lignende celler end den, der tidligere er rapporteret for iPSC-afledte BMEC-lignende celler14,15, sammenligner barriereegenskaberne ganske godt med dem, der er beskrevet for primære humane BMEC'er. Denne lighed indikerer, at EECM-BMEC-lignende celler sandsynligvis er en god in vitro-model af BBB. E-selectinekspression på EECM-BMEC-lignende celler under fysiologiske forhold skal tages i betragtning, når denne model anvendes til at studere ikke-betændte BBB'er, der mangler konstitutiv E-selectinekspression in vivo31. I vores tidligere undersøgelse viste vi, at EECM-BMEC-lignende celler kunne fænokopiere BBB, som observeret i hjernen hos MS-patienter med hensyn til forstyrrede tætte kryds. Dette resulterer i en højere permeabilitet af små molekyler og øget ekspression af funktionelt adhæsionsmolekyle, hvilket medierer den øgede vedhæftning og transmigration af immunceller på tværs af de BMEC-lignende celler32. Desuden viste vi, at aktivering af Wnt/β-catenin-signalering kan forbedre forstyrrelsen af snævre kryds og øget VCAM-1-ekspression i MS-afledte EECM-BMEC-lignende celler32. Disse resultater indikerer, at modellen faktisk er nyttig til at studere BBB's rolle i neuroimmunologiske sygdomme, såsom MS.
Samlet set er EECM-BMEC-lignende celler et lovende værktøj til dybdegående forståelse af patofysiologiske mekanismer på BBB-niveau og som et værktøj til at udvikle nye terapeutiske mål for BBB-stabilisering. I fremtiden kan modellen anvendes til at studere BBB-dysfunktion i et bredere spektrum af sygdomme og kan åbne muligheder for nye terapeutiske tilgange.
Disclosures
BE modtog en bevilling fra Biogen til at studere udvidet dosering af Natalizumab på T-cellemigration over blod-hjerne-barrieren og en bevilling fra CSL Behring til at undersøge det molekylære grundlag for blod-hjerne-barrieredysfunktion ved neurologiske lidelser. HN og BE er opfindere af de foreløbige amerikanske patentansøgninger vedrørende de EECM-BMEC-lignende celler (63/084980 og 63/185815).
Acknowledgments
HN blev støttet af Uehara Memorial Foundation, et ECTRIMS Postdoctoral Research Exchange Fellowship, JSPS under Joint Research Program implementeret i samarbejde med SNSF (JRPs) Grant No. JPJSJRP20221507 og KAKENHI Grant No. 22K15711, JST FOREST Program (Grant Number JPMJFR2269, Japan), YOKOYAMA Foundation for Clinical Pharmacology Grant No. YRY-2217, ICHIRO KANEHARA FOUNDATION, Narishige Neuroscience Research Foundation, NOVARTIS Foundation (Japan) til fremme af videnskab og YAMAGUCHI UNIVERSITY FUND. BE blev støttet af Swiss MS Society og Swiss National Science Foundation (tilskud 310030_189080 og ZLJZ3_214086) og Strategic Japanese-Swiss Science and Technology Programme (SJSSTP) tilskud IZLJZ3_214086.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 mm Syringe filter | TPP | 99722 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Falcon | 352196 | |
| 40 μm Falcon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round-bottom tube | SPL | 40005 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
| 96-Well plate, round bottom | SPL | 34096 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-500ml | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| B-27 Supplement (503), serum free | Thermo Fischer Scientific | 17504044 | |
| Bovine serum albumin (BSA), 7.5% in dPBS | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | STEMCELL Technologies | ST-07183 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Chamber slides | Thermo Fischer Scientific | 178599 | |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | |
| Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| Corning tissue culture plates (12-well) | Corning | 3512 | |
| Corning tissue culture plates (6-well) | Corning | 3506 | |
| Cryo tube innercap 2.0 mL | Watson | 1396-201S | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), sterile | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM (13), [+] 4.5 g/L D-glucose, [-] L-glutamine, [-] pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 31053-028 | |
| Dulbecco’s (d) PBS (without calcium, magnesium) | Thermo Fisher | 14190250 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/nutrient mixture F-12 (DMEM-F12) | Thermo Fischer Scientific | 11320074 | |
| EasySepFITC Positive Selection Kit II | STEMCELL Technologies | 18558 | |
| EasySepMagnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Solution0.02% in DPBS | Sigma | E8008-100ML | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Thermo Fischer Scientific | 10270106 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Ficoll-Paque PLUS | Sigma-Aldrich | GE17144002 | |
| FIJI software (Version 2.0.0) | Image J, USA | ||
| FlowJo version10 | BD | ||
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fischer Scientific | 35050-061 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| HCL | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| HEPES buffer solution | Thermo Fischer Scientific | 15630-056 | |
| Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) | Thermo Fischer Scientific | 11111-044 | |
| Human fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Tocris | 233-FB-500 | |
| iPS human induced pluripotent stem cells | Riken RBC | HPS1006 | |
| Kanamycin Sulfate (100x) | Thermo Fischer Scientific | 15160-047 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-Glutamine 200 mM (1003) | Thermo Fischer Scientific | 25030-024 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| MEM NEAA (1003) | Thermo Fischer Scientific | 11140-035 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| mTeSR Plus-cGMP | STEMCELL Technologies | ST-100-0276 | |
| mTeSR1 complete kit (basal medium plus 53 supplement) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 104005 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | |
| Recombinant Human IFN-gamma Protein | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-2 | BD Biosciences | 554603 | |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| RPMI medium 1640 | Thermo Fischer Scientific | 21875-034 | |
| Scalpel | FEATHER | 2975-11 | |
| Skim milk | BD Biosciences | 232100 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | 71290 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 11360-039 | |
| Transwells, PC Membrane, 0.4 mm, 12 mm, TC-Treated | Corning | 3401 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 93362 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vitronectin XF | STEMCELL Technologies | 078180 | |
| Water, sterile, cell culture | Sigma-Aldrich | W3500 |
References
- Castro Dias, M., Mapunda, J. A., Vladymyrov, M., Engelhardt, B. Structure and junctional complexes of endothelial, epithelial and glial brain barriers. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5372 (2019).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).
- Marchetti, L., Engelhardt, B. Immune cell trafficking across the blood-brain barrier in the absence and presence of neuroinflammation. Vascular Biology. 2 (1), H1-H18 (2020).
- Yang, C., Hawkins, K. E., Dore, S., Candelario-Jalil, E. Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 316 (2), C135-C153 (2019).
- Nishihara, H., Engelhardt, B. Brain barriers and multiple sclerosis: novel treatment approaches from a brain barriers perspective. Handbook of Experimental Pharmacology. 273, 295-329 (2020).
- Pan, Y., Nicolazzo, J. A. Altered blood-brain barrier and blood-spinal cord barrier dynamics in amyotrophic lateral sclerosis: Impact on medication efficacy and safety. British Journal of Pharmacology. 179 (11), 2577-2588 (2022).
- Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer disease and other neurodegenerative disorders. Nature Reviews Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).
- Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell Transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
- Song, H. W., et al. Transcriptomic comparison of human and mouse brain microvessels. Scientific Reports. 10 (1), 12358 (2020).
- Lecuyer, M. A., et al. Dual role of ALCAM in neuroinflammation and blood-brain barrier homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (4), E524-E533 (2017).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- DeStefano, J. G., Jamieson, J. J., Linville, R. M., Searson, P. C. Benchmarking in vitro tissue-engineered blood-brain barrier models. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 32 (2018).
- Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
- Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
- Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
- Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 9 (2017).
- Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
- Praca, C., et al. Derivation of brain capillary-like endothelial cells from human pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells. Stem Cell Reports. 13 (4), 599-611 (2019).
- Al-Ahmad, A. J. Comparative study of expression and activity of glucose transporters between stem cell-derived brain microvascular endothelial cells and hCMEC/D3 cells. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 313 (4), C421-C429 (2017).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic neurovascular unit model comprised of human induced pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells, pericytes, astrocytes, and neurons. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 25 (2019).
- Nishihara, H., et al. Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions. The FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).
- Lu, T. M., et al. Pluripotent stem cell-derived epithelium misidentified as brain microvascular endothelium requires ETS factors to acquire vascular fate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (8), e2016950118 (2021).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L.
- Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. STAR Protocols. 2 (2), 100563 (2021).
- Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
- Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends in Immunology. 33 (12), 579-589 (2012).
- Duband, J. L., Gimona, M., Scatena, M., Sartore, S., Small, J. V. Calponin and SM 22 as differentiation markers of smooth muscle: spatiotemporal distribution during avian embryonic development. Differentiation. 55 (1), 1-11 (1993).
- Gastfriend, B. D., et al. Wnt signaling mediates acquisition of blood-brain barrier properties in naïve endothelium derived from human pluripotent stem cells. eLife. 10, e70992 (2021).
- Eppihimer, M. J., Wolitzky, B., Anderson, D. C., Labow, M. A., Granger, D. N. Heterogeneity of expression of E- and P-selectins in vivo. Circulation Research. 79 (3), 560-569 (1996).
- Nishihara, H., et al. Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).
