Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

एक परिपक्व प्रतिरक्षा फेनोटाइप के साथ मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल सेल जैसी कोशिकाओं के लिए मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का भेदभाव

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65134
Automatic Translation
1, 2, 3
1Graduate School of Medicine, Yamaguchi University, 2Theodor Kocher Institute, University of Bern, 3Department of Neurotherapeutics, Yamaguchi University of Medicine

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल, विस्तारित एंडोथेलियल सेल कल्चर विधि (ईईसीएम) का वर्णन करते हैं, जो प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल सेल (बीएमईसी) जैसी कोशिकाओं में भेदभाव करने की अनुमति देता है। ये कोशिकाएं एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु अभिव्यक्ति दिखाती हैं और इस प्रकार एक मानव रक्त-मस्तिष्क बाधा मॉडल हैं जो विट्रो में प्रतिरक्षा कोशिका इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैं।

Abstract

रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) शिथिलता केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को प्रभावित करने वाले कई न्यूरोडीजेनेरेटिव और न्यूरोइन्फ्लेमेटरी रोगों की एक पैथोलॉजिकल पहचान है। रोग से संबंधित बीबीबी नमूनों तक सीमित पहुंच के कारण, यह अभी भी अच्छी तरह से समझा नहीं गया है कि बीबीबी खराबी रोग के विकास के लिए प्रेरक है या बल्कि न्यूरोइन्फ्लेमेटरी या न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रक्रिया का परिणाम है। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) इसलिए स्वस्थ दाताओं और रोगियों से इन विट्रो बीबीबी मॉडल स्थापित करने का एक नया अवसर प्रदान करते हैं, और इस प्रकार व्यक्तिगत रोगियों से रोग-विशिष्ट बीबीबी विशेषताओं का अध्ययन करते हैं। एचआईपीएससी से मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल सेल (बीएमईसी) जैसी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए कई भेदभाव प्रोटोकॉल स्थापित किए गए हैं। संबंधित बीएमईसी-भेदभाव प्रोटोकॉल के सही विकल्प के लिए विशिष्ट शोध प्रश्न पर विचार करना अनिवार्य है। यहां, हम विस्तारित एंडोथेलियल सेल कल्चर विधि (ईईसीएम) का वर्णन करते हैं, जिसे एक परिपक्व प्रतिरक्षा फेनोटाइप के साथ बीएमईसी जैसी कोशिकाओं में एचआईपीएससी को अलग करने के लिए अनुकूलित किया गया है, जिससे प्रतिरक्षा सेल-बीबीबी इंटरैक्शन के अध्ययन की अनुमति मिलती है। इस प्रोटोकॉल में, HIPSC को पहले WNT / β-कैटेनिन सिग्नलिंग को सक्रिय करके एंडोथेलियल पूर्वज कोशिकाओं (EPCs) में विभेदित किया जाता है। परिणामी संस्कृति, जिसमें चिकनी मांसपेशियों जैसी कोशिकाएं (एसएमएलसी) होती हैं, फिर एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) की शुद्धता बढ़ाने और बीबीबी-विशिष्ट गुणों को प्रेरित करने के लिए क्रमिक रूप से पारित की जाती है। इन एसएमएलसी या एसएमएलसी से वातानुकूलित माध्यम के साथ ईईसीएम-बीएमईसी की सह-संस्कृति ईसी आसंजन अणुओं की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, संवैधानिक और साइटोकिन-विनियमित अभिव्यक्ति की अनुमति देती है। महत्वपूर्ण रूप से, ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाएं प्राथमिक मानव बीएमईसी की तुलना में बाधा गुण स्थापित करती हैं, और सभी ईसी आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति के कारण, ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाएं अन्य एचआईपीएससी-व्युत्पन्न इन विट्रो बीबीबी मॉडल से अलग होती हैं। ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाएं इस प्रकार बीबीबी के स्तर पर रोग प्रक्रियाओं के संभावित प्रभाव की जांच के लिए पसंद का मॉडल हैं, जिसमें व्यक्तिगत फैशन में प्रतिरक्षा कोशिका बातचीत पर प्रभाव पड़ता है।

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका प्रणाली (सीएनएस) में न्यूरोवास्कुलर यूनिट (एनवीयू) में अत्यधिक विशिष्ट माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी), एंडोथेलियल तहखाने झिल्ली में एम्बेडेड पेरिसाइट्स के साथ-साथ पैरेन्काइमल तहखाने की झिल्ली और एस्ट्रोसाइट एंड-फीट1 शामिल हैं। एनवीयू के भीतर, मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं (बीएमईसी) प्रमुख घटक हैं जो रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) बनाते हैं। बीएमईसी जटिल और निरंतर तंग जंक्शन बनाते हैं और परिधीय अंगों में माइक्रोवस्कुलर ईसी की तुलना में बेहद कम पिनोसाइटोटिक गतिविधि होती है, जो बीबीबी को सीएनएस में पानी में घुलनशील अणुओं के मुक्त पैरासेलुलर प्रसार को रोकने की अनुमति देती है। बीएमईसी द्वारा विशिष्ट प्रवाह ट्रांसपोर्टरों और एफ्लक्स पंपों की अभिव्यक्ति सीएनएस2 से क्रमशः पोषक तत्वों और हानिकारक अणुओं के उत्थान और निर्यात को सुनिश्चित करती है। इसके अलावा, बीबीबी सीएनएस3 में प्रतिरक्षा कोशिका तस्करी के लिए महत्वपूर्ण एंडोथेलियल आसंजन अणुओं के निम्न स्तर को व्यक्त करके सीएनएस में प्रतिरक्षा कोशिका प्रवेश को सख्ती से नियंत्रित करता है। शारीरिक परिस्थितियों में, बीएमईसी की सतह पर आसंजन अणुओं के अभिव्यक्ति स्तर, जैसे कि अंतरकोशिकीय आसंजन अणु -1 (आईसीएएम -1) और संवहनी कोशिका आसंजन अणु -1 (वीसीएएम -1), कम हैं, लेकिन ये स्तर कुछन्यूरोलॉजिकल विकारों में बढ़ जाते हैं। बीबीबी के रूपात्मक और कार्यात्मक टूटने की सूचना कई न्यूरोलॉजिकल बीमारियों में दी जाती है, जैसे कि स्ट्रोक4, मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस)5, और कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग 6,7,8। शारीरिक और रोग दोनों स्थितियों के तहत बीएमईसी की सेलुलर और आणविक विशेषताओं की विस्तृत जांच बीबीबी को लक्षित करने वाली नवीन चिकित्सीय रणनीतियों की पहचान करने का एक दृष्टिकोण है।

कुछ समय पहले तक, बीबीबी का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक या अमर मानव और कृंतक बीएमईसी का उपयोग किया जाता था। हालांकि, बीबीबी के पशु मॉडल के आधार पर निष्कर्ष मानव बीबीबी पर आसानी से लागू होते हैं या नहीं, यह स्पष्ट नहीं है, क्योंकि आसंजन अणुओं और विलेय वाहक प्रोटीन सहित कई महत्वपूर्ण अणुओं की अभिव्यक्ति मनुष्यों और कृन्तकोंके बीच भिन्न होती है। यद्यपि मानव BMEC लाइनें जैसे HCMEC / D3 आसंजन अणुओं के उचित स्तर को व्यक्त करतीहैं11, इन अमर BMECs में आम तौर पर जटिल तंग जंक्शन और मजबूतबाधा गुण नहीं होते हैं। प्राथमिक मानव बीएमईसी बाधा कार्यों13 का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं, लेकिन वे सभी शोधकर्ताओं के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं हैं। इसके अलावा, रोगियों से प्राथमिक बीएमईसी प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है क्योंकि उन्हें मस्तिष्क बायोप्सी या सर्जरी के माध्यम से एकत्र किया जाना चाहिए जो केवल विशिष्ट नैदानिक स्थितियों के तहत किया जाता है।

स्टेम सेल प्रौद्योगिकी में हालिया प्रगति ने मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) जैसे स्टेम सेल स्रोतों से उत्पन्न विभिन्न मानव सेल प्रकारों के भेदभाव की अनुमति दी है। एचआईपीएस-व्युत्पन्न मॉडल हमें रोगी-व्युत्पन्न नमूनों का उपयोग करके पैथोफिजियोलॉजिकल मॉडल स्थापित करने की अनुमति देते हैं। कई एचआईपीएससी-व्युत्पन्न सेल प्रकारों को ऑटोलॉगस सह-संस्कृतियों या ऑर्गेनोइड्स को स्थापित करने के लिए जोड़ा जा सकता है जो शारीरिक स्थितियों की बेहतर नकल करते हैं। कई व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल14,15,16,17,18,19 का उपयोग एचआईपीएस-व्युत्पन्न बीएमईसी जैसी कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जा सकता है, जिनमें बीबीबी-विशिष्ट ट्रांसपोर्टरों और एफ्लक्स पंपों की अभिव्यक्ति के साथ मजबूत प्रसार बाधा गुण होते हैं, और छोटे अणुओं के पैरासेलुलर प्रसार, आणविक परिवहन तंत्रऔर मस्तिष्क को दवा वितरण का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं।. हालांकि, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली एचआईपीएस-व्युत्पन्न बीएमईसी जैसी कोशिकाओं में वीसीएएम -1, सेलेक्टिन और आईसीएएम -2 सहित प्रमुख एंडोथेलियल आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति की कमी होती है, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं और बीबीबी22 के बीच बातचीत की मध्यस्थता के लिए जिम्मेदार हैं। इसके अलावा, पिछले एचआईपीएस-व्युत्पन्न बीएमईसी को ट्रांसक्रिप्शनल स्तर23 पर मिश्रित एंडोथेलियल और उपकला विशेषताओं को प्रदर्शित करने की सूचना दी गई है। इसलिए, हमने विस्तारित एंडोथेलियल सेल कल्चर विधि (ईईसीएम) विकसित की, एक नया प्रोटोकॉल जो बीएमईसी जैसी कोशिकाओं में एचआईपीएससी के भेदभाव की अनुमति देता है जो आकृति विज्ञान, बाधा विशेषताओं और एंडोथेलियल आसंजन अणु अभिव्यक्ति के संबंध में प्राथमिक मानव बीएमईसी से मिलते जुलते हैं। यह प्रोटोकॉल एक परिपक्व प्रतिरक्षा फेनोटाइप प्रदर्शित करने वाली बीएमईसी जैसी कोशिकाओं के लिए एचआईपीएससी को अलग करने के लिए विस्तृत पद्धति प्रक्रियाओं का वर्णन करता है।

Protocol

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल का अवलोकन। पांडुलिपि एचआईपीएससी को ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं में अलग करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है। सही योजनाएं प्रत्येक चरण में सेल आबादी को दर्शाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

HIPSC लाइन, HPS1006, MEXT / AMED, जापान के राष्ट्रीय जैव-संसाधन परियोजना के माध्यम से RIKEN BRC द्वारा प्रदान की गई थी।

1. एंडोथेलियल पूर्वज कोशिकाओं (ईपीसी) में एचआईपीएस भेदभाव का प्रेरण।

  1. बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) -लेपित प्लेटें और अभिकर्मक
    1. 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 2.5 मिलीग्राम मैट्रिक्स जेल को एलिकोट करके बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 12-वेल प्लेटें तैयार करें। 30 मिलीलीटर ठंडा डलबेकको के संशोधित ईगल के मध्यम / पोषक तत्व मिश्रण एफ -12 (डीएमईएम / एफ 12), जिसे रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) में रखा गया है, ट्यूब में। जेल पिघलने तक पाइपिंग करके धीरे से मिलाएं और फिर 12-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 500 μL घोल जोड़ें। प्लेट को कम से कम 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में रखें।
      नोट: तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जेल तापमान के प्रति संवेदनशील है और इसे एलिकोटिंग और प्लेट कोटिंग के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार संभाला जाना चाहिए। बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन की एकाग्रता बैचों के बीच भिन्न हो सकती है। सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, लॉट नंबर का उपयोग करके विशिष्ट बैच के लिए गुणवत्ता प्रमाण पत्र पत्रक पर सटीक एकाग्रता को संदर्भित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, यदि सटीक एकाग्रता 10.0 मिलीग्राम / एमएल है, तो कुल 2.5 मिलीग्राम के लिए 250 μL जेल का उपयोग करें।
    2. बाँझ पानी में रॉक अवरोधक को 10 एमएम की एकाग्रता तक घोलकर रो-काइनेज (रॉक) अवरोधक स्टॉक समाधान तैयार करें (तालिका 1)। स्टॉक समाधान को 100-200 μL वॉल्यूम में एलिकोट करें और फ्रीज-पिघलाव चक्र से बचने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. 50 मिलीलीटर बाँझ पानी में 5 ग्राम एल-एस्कॉर्बिक एसिड को घोलकर एल-एस्कॉर्बिक एसिड का 100 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक घोल बनाएं और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (तालिका 1)। एलएसआर माध्यम 24 बनाने के लिए उन्नत डीएमईएम / एफ 12 के 500 एमएल में6.25 एमएल ग्लूटामाइन और 305 μL एल-एस्कॉर्बिक एसिड स्टॉक समाधान जोड़ें (तालिका 1)। 2 सप्ताह तक 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. चिर99021 को 10 एमएम की अंतिम सांद्रता तक अपरिवर्तित डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में घोलकर सीएचआईआर 99021 समाधान तैयार करें (तालिका 1)। फ्रीज-पिघलाव चक्र ों से बचने के लिए घोल को 100-200 μL वॉल्यूम में एलिकोट करें और 1 वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान के कामकाजी एलिकोट स्टोर करें।
    5. डीएमईएम/एफ12-10 माध्यम तैयार करें, जिसमें 450 एमएल डीएमईएम/एफ12 में 50 मिलीलीटर हीट-इनएक्टिवेटेड भ्रूण गोजातीय सीरम जोड़ा जाए। माध्यम को 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने तक स्टोर करें (तालिका 1)।
    6. डलबेकको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 467 एमएल में 7.5% बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के 33.3 मिलीलीटर को जोड़कर फ्लो बफर -1 तैयार करें (तालिका 1)। 6 महीने तक 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. एकल उच्च रक्तचाप वाले उच्च रक्तचाप और ईपीसी विभेदन के लिए विस्तार (दिन-3 से दिन-1)
    1. भेदभाव शुरू करें जब 6-वेल प्लेट में एचआईपीएससी कालोनियां कोई सहज भेदभाव नहीं दिखाती हैं और पासिंग के लिए उपयुक्त घनत्व होता है, आमतौर पर लगभग 80% कंफ्लुएंसी (2.5-3.5 x 106 कोशिकाएं)। माइक्रोस्कोप के तहत सहज रूप से विभेदित कोशिकाओं की सावधानीपूर्वक निगरानी करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि गैर-विभेदित कोशिकाओं को खत्म करने के लिए कई मार्गों की आवश्यकता है या नहीं। सेल कल्चर माध्यम और बाह्य मैट्रिक्स के बारे में जानकारी के लिए चरण 1.4.15 के नीचे दिए गए नोट को देखें।
    2. माध्यम को एस्पिरेट करें और कुओं में 1 मिलीलीटर पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-7 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। दो या तीन बार कुओं की सतहों पर धीरे-धीरे पृथक्करण अभिकर्मक समाधान को पाइप करके कोशिकाओं को अलग और एकवचन करें।
    3. अलग की गई कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 4 एमएल एचआईपीएस रखरखाव माध्यम होता है और कोशिकाओं को अच्छी तरह से निलंबित कर दिया जाता है। सेल गिनती के लिए 10 μL एलिकोट आरक्षित करें।
    4. 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 200 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजिंग करके कोशिकाओं को गोली दें। कोशिकाओं की गणना करें और एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 12-वेल प्लेट (चरण 1.1.1) में एचआईपीएससी (75-400 x 103 प्रति कुएं) के उचित घनत्व को प्राप्त करने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें।
    5. कुओं से कोटिंग समाधान को एस्पिरेट करें और प्रत्येक कुएं में 10 μM ROCK अवरोधक युक्त 1 मिलीलीटर HIPSC माध्यम जोड़ें (1: 1,000 कमजोर पड़ना)। सेंट्रीफ्यूजिंग के बाद, सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और गोली को 1 एमएल एचआईपीएस माध्यम में अलग करें।
    6. चरण 1.2.4 में निर्धारित HIPSC की आवश्यक मात्रा को 12-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में जोड़ें। दो से चार 12-वेल प्लेटें एक एचपीएससी क्लोन को अलग करने के लिए पर्याप्त हो सकती हैं। सीडिंग कोशिकाओं के लिए आवश्यक प्लेटों की संख्या निर्धारित करने के लिए चरण 1.2.4 देखें।
    7. प्लेट को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में रखें। प्लेट को धीरे-धीरे आगे और पीछे खिसकाकर और फिर इनक्यूबेटर में बगल से बगल में स्लाइड करके कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करें।
    8. अगले दिन (यानी, दिन -2), माध्यम को 2 एमएल एचआईपीएस रखरखाव माध्यम के साथ एक्सचेंज करें जिसमें रॉक अवरोधक की कमी है। अगले दिन (दिन -1) में, 2 एमएल ताजा एचपीएससी रखरखाव माध्यम के साथ माध्यम का आदान-प्रदान करें।
  3. ग्लाइकोजन सिंथेज़ काइनेज 3 (जीएसके -3) अवरोधक सीएचआईआर 99021 (दिन 0 से दिन 5) के साथ ईपीसी का प्रेरण।
    1. दिन 0 पर, प्रत्येक कुएं में HIPSC रखरखाव माध्यम को 2 मिलीलीटर LASR माध्यम से प्रतिस्थापित करें जिसमें 8 μM CHIR99021 होता है।
    2. पहले दिन, मध्यम को एस्पिरेट करें और 8 μM CHIR99021 युक्त ताजा LASR माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. दिन 2, 3, और 4 पर, माध्यम को 2 एमएल ताजा एलएसआर माध्यम के साथ प्रतिस्थापित करें जिसमें सीएचआईआर 99021 की कमी है।
  4. सीडी 31 को शुद्ध करने के लिए चुंबकीय सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस)+ ईपीसी (दिन 5)
    1. 5 वें दिन, माध्यम को एस्पिरेट करें और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 6-8 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने से पहले, प्रत्येक कुएं में 1 मिलीलीटर पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें।
    2. कोशिकाओं को एक माइक्रोपिपेट के साथ अलग और एकवचन करें और निलंबन को 50 एमएल ट्यूब में फ़िल्टर करने के लिए 40 μm सेल छन्नी से गुजरें जिसमें DMEM / F12-10 माध्यम के 10 मिलीलीटर शामिल हैं। दो से अधिक 12-वेल प्लेटों से एकत्र किए गए सेल निलंबन को कम से कम दो 50 एमएल ट्यूबों में फ़िल्टर करें।
    3. डीएमईएम / एफ 12-10 माध्यम (50 एमएल तक) जोड़कर पाचन प्रतिक्रिया को रोकें। पिपेट अच्छी तरह से और कोशिकाओं की गिनती के लिए 10 μL आरक्षित करें। 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 200 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजिंग करके कोशिकाओं को गोली दें।
    4. सतह पर तैरनेवाला को हटाने के बाद, डीएमईएम / एफ 12-10 माध्यम के 10 एमएल जोड़ें और सेल निलंबन को ताजा 15 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 200 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजिंग करके कोशिकाओं को गोली दें।
    5. सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और 1.0 x 107 कोशिकाओं प्रति 100 μL बफर के घनत्व पर प्रवाह बफर -1 में पुन: निलंबित करें।
    6. 1:100 के अनुपात में एफसीआर ब्लॉकिंग अभिकर्मक जोड़ें और फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) लेबल वाले सीडी 31 एंटीबॉडी को 1: 200 से जोड़ने से पहले 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 20-25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए निलंबन को इनक्यूबेट करें।
    7. 10 एमएल फ्लो बफर -1 जोड़ें, सीडी 31+ कोशिकाओं के अंश को निर्धारित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए निलंबन के 10 μL को आरक्षित करें (चित्रा 2)।
    8. 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके कोशिकाओं को गोली दें। फिर, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और प्रवाह बफर -1 समाधान के प्रति 100 μL प्रति 1.0 x 107 कोशिकाओं के घनत्व पर पुन: निलंबित करें। एफआईटीसी चयन कॉकटेल जोड़ें (5 μL प्रति 100 μL सेल सस्पेंशन)। पाइपटिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं और 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
    9. सेल सस्पेंशन के प्रति 100 μL में चुंबकीय नैनोकणों के 5 μL जोड़ें, अच्छी तरह से पिपेट करें, और 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
    10. सेल निलंबन को 5 एमएल फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब में स्थानांतरित करें और 2.5 एमएल की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए फ्लो बफर -1 जोड़ें। फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब को चुंबक में 5 मिनट के लिए रखें।
    11. एक निरंतर गति में, चुंबक को उल्टा करें और सेल निलंबन युक्त कोशिकाओं को हटा दें जिन्हें एफआईटीसी-सीडी 31 एंटीबॉडी के साथ लेबल नहीं किया गया था। चुंबक और ट्यूब को 2-3 सेकंड के लिए उल्टे स्थिति में बनाए रखें और फिर शेष तरल को हटा दें। ट्यूब को सीधी स्थिति में वापस करने से पहले ट्यूब के किनारे पर किसी भी बूंद को एस्पिरेट करें।
    12. चुंबक से फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब उठाएं और शेष सीडी 31+ कोशिकाओं को धोने के लिए 2.5 एमएल फ्लो बफर -1 जोड़ें। कोशिकाओं को धीरे-धीरे दो या तीन बार ऊपर और नीचे करके कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। प्रवाह ट्यूब को चुंबक में 5 मिनट के लिए रखें।
    13. चरण 1.4.11-1.4.12 को तीन बार दोहराएं और फिर चरण 1.4.11 को कुल चार वॉश के लिए एक बार और दोहराएं।
    14. चुंबक से प्रवाह ट्यूब को हटा दें और शुद्ध सीडी 31+ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए ट्यूब में एक उपयुक्त माध्यम (जैसे, विस्तारित ईसी संस्कृति के लिए मानव एंडोथेलियल सीरम-मुक्त माध्यम [एचईसीएसआर] या ठंड के लिए ठंड माध्यम) की इंगित मात्रा जोड़ें। निलंबन के दो 10 μL एलिकोट आरक्षित करें, एक सेल गिनती के लिए और दूसरा पोस्ट-एमएसीएस नमूनों में सीडी 31+ कोशिकाओं की शुद्धता का आकलन करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण करने के लिए (चित्रा 2)। यदि एक प्रवाह साइटोमीटर तुरंत उपलब्ध नहीं है, तो विश्लेषण तक एलिकोट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    15. यदि अगले चरण (चरण 2 के माध्यम से) तुरंत नहीं किए जा सकते हैं, तो इस बिंदु पर सीडी 31 + ईपीसी को फ्रीज करें। ईपीसी के विस्तार और चयनात्मक पासिंग के लिए, चरण 2 पर आगे बढ़ें।
      नोट: विट्रोनेक्टिन25-लेपित 12-वेल प्लेटों और अधिक स्थिर एचआईपीएससी रखरखाव माध्यम (एमटीईएसआर प्लस) का उपयोग तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों और एचआईपीएससी रखरखाव माध्यम (एमटीईएसआर 1) के स्थान पर किया जा सकता है। विट्रोनेक्टिन-लेपित 12-वेल प्लेटों को तैयार करने के लिए, 10 μg / mL की अंतिम सांद्रता के लिए कमजोर बफर के साथ विट्रोनेक्टिन को पतला करें और फिर 12-वेल प्लेटों के प्रत्येक कुएं में 500 μL पतला घोल स्थानांतरित करें। प्लेटों को कम से कम 1 घंटे के लिए 20-25 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें। एकल हाइपीएससी का सीडिंग घनत्व तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों के लिए उपयोग किए जाने वाले घनत्व के बराबर है। संस्कृति माध्यम या मैट्रिक्स संरचना को बदलने से HIPSC के प्रसार और सहज भेदभाव पर प्रभाव पड़ सकता है, जिसे आमतौर पर नई संस्कृति स्थितियों के अनुकूल होने के लिए 1-2 सप्ताह की आवश्यकता होती है। यदि अधिक स्थिर HIPSC रखरखाव माध्यम का उपयोग HIPSC रखरखाव के लिए किया जाता है, तो इस माध्यम का उपयोग HIPSC रखरखाव माध्यम के बजाय EPC भेदभाव के लिए किया जा सकता है। इस मामले में, रॉक अवरोधक को हटाने के लिए दिन -2 में अधिक स्थिर एचआईपीएस रखरखाव माध्यम को बदला जाना चाहिए, और दिन -1 पर विनिमय को छोड़ा जा सकता है।

2. मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल सेल जैसी कोशिकाओं (बीएमईसी जैसी कोशिकाओं) और चिकनी मांसपेशियों जैसी कोशिकाओं (एसएमएलसी) को अलग करने के लिए विस्तारित एंडोथेलियल सेल कल्चर विधि (ईईसीएम)

  1. कोलेजन-लेपित प्लेटों और अभिकर्मकों की तैयारी
    1. 5 मिलीलीटर बाँझ पानी में 5 मिलीग्राम क्रिस्टलीकृत कोलेजन टाइप IV को घोलकर कोलेजन-लेपित 6-वेल प्लेटें तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोटिंग और भंडारण से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। 10 μg /mL समाधान का उत्पादन करने के लिए बाँझ पानी में कोलेजन IV एलिकोट 1: 100 पतला करें और 6-वेल प्लेटों के प्रत्येक कुएं में 10 μg / mL कोलेजन IV समाधान जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें। प्लेटों को 1 सप्ताह तक 37 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. डलबेकको के पीबीएस के 5 एमएल में एफजीएफ के 500 μg को घोलकर मानव फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 2 (FGF2) का स्टॉक समाधान तैयार करें, 0.1% की अंतिम एकाग्रता में 7.5% बीएसए जोड़ें, और स्टॉक समाधान को 20-200 μL वॉल्यूम में एलिकोट करें। इन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर 3 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है (तालिका 1)। स्टॉक समाधान 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है; फ्रीज-पिघलने चक्र से बचें। एचईसीएसआर माध्यम के 98 एमएल में बी -27 पूरक के 2 एमएल और एफजीएफ 2 के 20 μL को जोड़कर एचईसीएसआर माध्यम तैयार करें (तालिका 1)। एचईसीएसआर माध्यम को 2 सप्ताह तक 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. ईपीसी, ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं और एसएमएलसी के लिए 15 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम, 5 एमएल डीएमएसओ और 25 μL रॉक अवरोधक समाधान को 30 मिलीलीटर एचईसीएसआर माध्यम में जोड़कर ठंड माध्यम तैयार करें (तालिका 1)। ठंड माध्यम को 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. विस्तारित एंडोथेलियल सेल कल्चर के लिए ईपीसी सीडिंग
    1. 6-वेल प्लेटों से कोलेजन समाधान निकालें। फिर, 1.0-2.0 x 10 5 शुद्ध सीडी 31 + ईपीसी को एचईसीएसआर माध्यम के 2 एमएल में स्थानांतरित करें जिसमें5 μM रॉक अवरोधक (1: 2,000 कमजोर पड़ना) शामिल हैं। प्लेट को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में रखें। समान रूप से प्लेटों को आगे और पीछे, फिर बगल से साइड में स्लाइड करके कोशिकाओं को वितरित करें।
    2. अगले दिन, रॉक अवरोधक युक्त एचईसीएसआर माध्यम को हटा दें और रॉक अवरोधक के बिना 2 एमएल ताजा एचईसीएसआर माध्यम जोड़ें। 100% संगम तक पहुंचने तक हर दूसरे दिन एचईसीएसआर माध्यम का आदान-प्रदान करें।
      नोट: यदि सप्ताहांत में एक नियमित भोजन कार्यक्रम बनाए नहीं रखा जा सकता है, तो माध्यम को सप्ताह के अंतिम कार्य दिवस की शाम को और फिर सप्ताहांत के बाद सुबह जल्दी बदला जा सकता है।
  3. ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं और एसएमएलसी को शुद्ध करने के लिए चयनात्मक मार्ग
    1. ईसी और गैर-ईसी आबादी के मिश्रण वाले 6-वेल प्लेटों से एचईसीएसआर माध्यम को हटा दें। प्रत्येक कुएं में 1 एमएल पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें।
    2. माइक्रोस्कोप के तहत सेल आकृति विज्ञान की सावधानीपूर्वक निगरानी करें। जब ईसी (लेकिन गैर-ईसी नहीं) उज्ज्वल और गोल दिखाई देते हैं (आमतौर पर 2-5 मिनट के भीतर), प्लेट के किनारे पर टैप करके उन्हें अलग करें। अधिकांश गैर-ईसी प्लेट से जुड़े रहते हैं।
    3. माइक्रोपिपेट का उपयोग करके अलग किए गए ईसी एकत्र करें, गैर-ईसी को फिर से निलंबित करने से बचने के लिए ध्यान रखें। ईसी को 15 एमएल या 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें डीएमईएम / एफ 12-10 प्रति 1 एमएल पृथक्करण अभिकर्मक का 4 एमएल होता है।
    4. SMLCs स्थापित करने के लिए शेष संलग्न गैर-ECs वाले कुओं में 2 मिलीलीटर hECSR माध्यम जोड़ें। प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें।
    5. सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ईसी निलंबन को अच्छी तरह से मिलाने के लिए पिपेट करें और सेल गिनती के लिए निलंबन के 10 μL आरक्षित करें। शेष कोशिकाओं को 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 200 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। गोली से सतह पर तैरनेवाला को निकालें और प्रति 1.0-2.0 x 105 ईसी में 2 मिलीलीटर एचईसीएसआर माध्यम जोड़ें।
    6. एक नई 6-वेल प्लेट से कोलेजन IV समाधान को हटाने पर, प्रत्येक कुएं में 2 एमएल ईसी निलंबन जोड़ें, इसके बाद 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन। प्लेट में कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए, धीरे से इसे इनक्यूबेटर शेल्फ पर आगे और पीछे और साइड टू साइड गति में ले जाएं।
    7. हर दूसरे दिन एचईसीएसआर माध्यम को बदलें जब तक कि ईसी 100% कंफ्लुएंसी तक न पहुंच जाएं।
    8. चरण 2.3.1-2.3.7 को तब तक दोहराएं जब तक कि एक शुद्ध ईसी मोनोलेयर प्राप्त न हो जाए। यदि निम्न चरणों को पूरा नहीं किया जा सकता है, तो CD31+ ECs को फ्रीज करें (चरण 2.4.2 देखें)। ईसी कार्यों का विश्लेषण करने के लिए, चरण 3 पर आगे बढ़ें।
      नोट: सामान्य तौर पर, ईसी की लगभग शुद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए दो या तीन चयनात्मक मार्ग की आवश्यकता होती है जो कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं, और हम इन कोशिकाओं को ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं के रूप में मानते हैं। पांच या छह से अधिक मार्ग के बाद, सेल प्रसार आमतौर पर धीमा हो जाता है, हालांकि यह चर एचआईपीएस लाइन पर निर्भर करता है।
    9. एसएमएलसी को कल्चर करने के लिए, हर दूसरे दिन एचईसीएसआर माध्यम को बदलें। एसएमएलसी-वातानुकूलित माध्यम (सीएम) एकत्र करने के लिए, एकत्र किए गए माध्यम को प्रत्येक माध्यम परिवर्तन पर 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से पारित करें। सीएम का उपयोग ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं की वीसीएएम -1 अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए किया जा सकता है। एसएमएलसी-सीएम को तब तक पूल करें जब तक कि एसएमएलसी 100% कंफ्लुएंसी तक नहीं पहुंच जाते।
  4. ईपीसी, ईईसीएम-बीएमईसी जैसी सेल, और एसएमएलसी क्रायोप्रिजर्वेशन और पिघलना।
    1. ईपीसी को फ्रीज करने के लिए, अंतिम एमएसीएस वॉश (चरण 1.4.13) के बाद, ईपीसी को 1.0-2.0 x 106 सेल / एमएल के घनत्व पर एचईसीएसआर माध्यम के बजाय फ्रीजिंग माध्यम में फिर से निलंबित करें। सेल निलंबन के 1 एमएल को क्रायोट्यूब में वितरित करें। क्रायोट्यूब को एक नियंत्रित दर फ्रीजिंग डिवाइस में रखें और जल्दी से उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें। लंबे समय तक भंडारण के लिए, ट्यूबों को ठंड के 24 से 48 घंटे बाद तरल नाइट्रोजन टैंक में ले जाएं।
    2. ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं और एसएमएलसी को फ्रीज करने के लिए, कुओं से माध्यम को हटाने के बाद, पृथक्करण अभिकर्मक (1 एमएल / वेल) जोड़ें और प्लेट को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं अलग न हो जाएं (क्रमशः ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं और एसएमएलसी के लिए 5-7 मिनट और 20-30 मिनट)। कोशिकाओं को 15 एमएल या 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें जिसमें डीएमईएम / एफ 12-10 प्रति 1 एमएल पृथक्करण अभिकर्मक होता है।
    3. सेल गिनती के लिए सेल सस्पेंशन के 10 μL को अच्छी तरह से मिश्रण और आरक्षित करने के लिए पिपेट। 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके कोशिकाओं को गोली दें। सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 1.0-2.0 x 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व के लिए ठंड माध्यम में कोशिकाओं को अच्छी तरह से पुन: निलंबित करें। सेल निलंबन के 1 एमएल को ताजा क्रायोट्यूब में वितरित करें।
    4. क्रायोट्यूब को एक नियंत्रित दर फ्रीजिंग डिवाइस में रखें और तुरंत उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें। लंबे समय तक भंडारण के लिए, ट्यूबों को ठंड के 24 से 48 घंटे बाद तरल नाइट्रोजन टैंक में स्थानांतरित किया जा सकता है।
    5. ईपीसी, ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं और एसएमएलसी को पिघलाने के लिए, हाथों के बीच क्रायोट्यूब की शीशियों को रोल करें या 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं लगभग पूरी तरह से पिघल न जाएं। डीएमईएम / एफ 12-10 के 500 μL जोड़ें और धीरे से सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें डीएमईएम / एफ 12-10 माध्यम के 4 एमएल हैं। 1 एमएल डीएमईएम / एफ 12-10 जोड़कर क्रायोट्यूब को एक बार धो लें और फिर 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और 5 μM ROCK अवरोधक (1:2,000 कमजोर पड़ने) वाले hECSR माध्यम के 2 मिलीलीटर में गोली को ईपीसी के लिए 1.0-2.0 x 10 5 कोशिकाओं प्रति 2 मिलीलीटर के घनत्व तक और ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं और SMLCs के लिए 2.0-3.0 x 105 कोशिकाओं प्रति 2 मिलीलीटर के घनत्व तक पुन: निलंबित करें।
    7. कुओं में कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए प्लेटों को धीरे-धीरे आगे और पीछे, फिर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेटर के शेल्फ पर एक तरफ ले जाएं।
    8. अगले दिन, माध्यम को ताजा एचईसीएसआर माध्यम के साथ एक्सचेंज करें जिसमें रॉक अवरोधक की कमी है। एचईसीएसआर माध्यम को हर दूसरे दिन तब तक एक्सचेंज करें जब तक कि 100% कंफ्लुएंसी प्राप्त न हो जाए। फिर, ईपीसी के लिए चयनात्मक पासिंग (चरण 2.3 देखें) और ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं के लिए कार्यात्मक विश्लेषण (चरण 3 देखें) के लिए आगे बढ़ें। आणविक लक्षण वर्णन और कार्यात्मक परख करने से पहले, ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं को 100% कंफ्लुएंट होना चाहिए, जो आमतौर पर पिघलने के 2-3 दिन बाद प्राप्त किया जाता है।

3. ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं और एसएमएलसी का सत्यापन

  1. छोटे अणु ट्रेसर के लिए पारगम्यता परख
    1. सोडियम फ्लोरेसिन पारगम्यता को मापकर ईईसीएम-बीएमईसी जैसी सेल बाधा अखंडता का आकलन करें, जैसा कि निशिहारा एट अल .26 द्वारा वर्णित है। पूर्ण मोनोलेयर विकसित करने और सोडियम फ्लोरेसिन की पारगम्यता को मापने के लिए फिल्टर इंसर्ट पर ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं को बीज दें।
  2. प्रमुख अणुओं का आकलन करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला।
    1. मोनोलेयर या एसएमएलसी में ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं के जंक्शनल अणुओं, आसंजन अणुओं या साइटोस्केलेटल प्रोटीन की अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के लिए, चैंबर स्लाइड, 96-वेल प्लेटों या सम्मिलित फिल्टर के साथ झिल्ली का उपयोग करें। भड़काऊ साइटोकिन उत्तेजना के साथ या बिना सेल सतह आसंजन अणुओं की ईईसीएम-बीएमईसी जैसी सेल अभिव्यक्ति का आकलन करें, जैसा कि निशिहारा एट अल .26 द्वारा वर्णित है।
  3. ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं पर सेल सतह आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री
    1. सीएनएस में प्रतिरक्षा कोशिका प्रवास में शामिल सेल सतह आसंजन अणुओं की अर्ध-मात्रात्मक अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करें, जिसमें आईसीएएम -1, आईसीएएम -2, वीसीएएम -1, पी-सेलेक्टिन, ई-सेलेक्टिन, सीडी 9 9 और प्लेटलेट एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु -1 (पीईसीएएम -1) शामिल हैं, जैसा कि निशिहारा एट अल .26 द्वारा वर्णित है। 16-18 घंटे के लिए भड़काऊ साइटोकिन्स की उपस्थिति और अनुपस्थिति में एसएमएलसी-वातानुकूलित माध्यम के साथ ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं को कल्चर करें।
  4. कार्यात्मक आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए स्थैतिक परिस्थितियों में प्रतिरक्षा कोशिका आसंजन परख
    1. यह निर्धारित करने के लिए निशिहारा एट अल .26 द्वारा वर्णित विधि का उपयोग करें कि ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं के सेल सतह आसंजन अणु कार्यात्मक हैं या नहीं।
    2. संक्षेप में, ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं को 5.5 x 104/सेमी2 पर एक कक्ष स्लाइड पर बीज दें और संगम तक बढ़ें। लगभग 24 घंटे बाद, प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स की उपस्थिति या अनुपस्थिति में संस्कृति माध्यम को एसएमएलसी-वातानुकूलित माध्यम में बदलें, और अतिरिक्त 16 घंटे के लिए ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    3. प्रयोग के दिन, टी-सेल वॉश बफर (तालिका 1) के साथ क्रायोसंरक्षित प्रतिरक्षा कोशिकाओं (जैसे, टी कोशिकाओं या परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं [पीबीसी]) को पिघलाएं और टी-सेल माध्यम में फ्लोरोसेंट रंजक (जैसे, सेल ट्रैकर रंजक) के साथ लेबल करें (तालिका 1)। प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए संस्कृति माध्यम का अनुकूलन अध्ययन किए जा रहे विशिष्ट प्रकार की प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अनुरूप होना चाहिए।
    4. 16-वेल चैंबर स्लाइड में, ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं में 2 x 104 टीएच 1 कोशिकाओं को जोड़ें। विशेष रूप से, टीएच 1 कोशिकाओं जैसे प्रभावक टी कोशिकाओं के साथ काम करते समय, यह देखा गया है कि वे पीबीएमसी की तुलना में ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं के प्रति अधिक लगाव प्रदर्शित करते हैं (निशिहारा। नतीजतन, शुद्ध प्रभावक टी कोशिकाओं की तुलना में ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं में जोड़े जाने वाले पीबीएमसी की संख्या अधिक होनी चाहिए।
    5. माइग्रेशन परख माध्यम में 30 मिनट के लिए ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं के मोनोलेयर के साथ प्रतिरक्षा कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें (तालिका 1)। 30 मिनट के बाद, स्लाइड को धीरे से धो लें, दो बार डलबेकको के पीबीएस युक्त जार में डुबोकर और बाद में 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड समाधान के साथ ठीक करें।
    6. निर्धारण के बाद, डलबेकको के पीबीएस युक्त जार में डुबोकर स्लाइड को दो बार धोएं और कवरस्लिप के साथ माउंट करें। इसके बाद ईईसीएम-बीएमईसी जैसे सेल मोनोलेयर से जुड़ी प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गिनती के लिए स्लाइड पर मोनोलेयर के केंद्र की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियां प्राप्त करें।

Representative Results

पारगम्यता परख
सोडियम फ्लोरेसिन की पारगम्यता की गणना 15, 30, 45 और 60 मिनट पर निचले कक्ष से एकत्र किए गए माध्यम की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापकर की गई थी। प्रत्येक समय बिंदु पर माध्यम के कुल 150 μL का नमूना लिया जाता है और 150 μL की लापता मात्रा को hECSR माध्यम से बदल दिया जाता है। प्रतिदीप्ति तीव्रता को फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर (485 एनएम उत्तेजना / 530 एनएम उत्सर्जन) का उपयोग करके पढ़ा जाता है और सही संकेतों, निकासी मात्रा और पारगम्यता की गणना पहले वर्णित सूत्र18 (तालिका 2) का उपयोग करके की जाती है। यह पुष्टि करने की सिफारिश की जाती है कि सोडियम फ्लोरेसिन की प्रतिदीप्ति तीव्रता समय के साथ बढ़ती है या नहीं। प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए एक परख के लिए कई फिल्टर-कम से कम तीन प्रतियों का उपयोग किया जाना चाहिए। स्वस्थ नियंत्रण-व्युत्पन्न ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं के लिए, सोडियम फ्लोरेसिन (376 डीए) पारगम्यता 0.3 x 10-3 सेमी / मिनट से नीचे होनी चाहिए। एक कंफ्लुएंट ईईसीएम-बीएमईसी जैसे सेल मोनोलेयर के गठन की पुष्टि करने के लिए, पारगम्यता परख में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक फिल्टर के ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं के जंक्शनल प्रोटीन के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग इस परख के बाद किया जाना चाहिए।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना।
ईईसीएम-बीएमईसी जैसे सेल जंक्शनल अणुओं के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन, जिसमें क्लॉडिन -5, ऑक्लुडिन और वीई-कैडरिन1 शामिल हैं, का उपयोग सेल आकृति विज्ञान और निरंतर और परिपक्व जंक्शनों की उपस्थिति का आकलन करने के लिए किया गया था (चित्रा 4)। फिल्टर इंसर्ट की झिल्लियों पर ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं के मोनोलेयर को 20 सेकंड के लिए ठंडे मेथनॉल (-20 डिग्री सेल्सियस) के साथ तय किया गया था, ब्लॉकिंग बफर (तालिका 1) के साथ अवरुद्ध किया गया था, और फिर प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था। ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं ने स्पिंडल जैसे आकार और ज़िगज़ैग आकार के जंक्शनों का प्रदर्शन किया, जिनमें से दोनों बीएमईसी27 की विशिष्ट रूपात्मक विशेषताएं हैं। ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं की उत्तेजना प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स के साथ चैंबर स्लाइड पर बीजित होती है, जैसे कि ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α (टीएनएफ-α) और इंटरफेरॉन-γ (आईएनएफ-γ) (0.1 एनजी/एमएल टीएनएफ-α + 2 आईयू/एमएल आईएफएन-γ) एसएमएलसी-व्युत्पन्न वातानुकूलित माध्यम में पतला, आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति को विनियमित करता है, जैसे कि आईसीएएम -1 और वीसीएएम -128 (चित्रा 5)। चिकनी मांसपेशी कोशिका मार्करों की प्रतिनिधि छवियां, जिनमें α-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए), कैलपोनिन और चिकनी मांसपेशी प्रोटीन 22-अल्फा (एसएम 22 ए) 29 शामिल हैं, चित्र 6 में दिखाए गए हैं। चैंबर स्लाइड पर बीज वाले एसएमएलसी को 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया था, ब्लॉकिंग बफर के साथ अवरुद्ध किया गया था, और फिर प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था।

"ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं द्वारा सेल सतह आसंजन अणु अभिव्यक्ति का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण"।
ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं पर एंडोथेलियल आसंजन अणुओं की कोशिका सतह अभिव्यक्ति के लिए प्रतिनिधि परिणाम चित्र 7 में प्रदर्शित किए गए हैं। टीएनएफ -α और आईएनएफ -γ जैसे प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स के साथ उत्तेजना ने आईसीएएम -1, वीसीएएम -1 और पी-सेलेक्टिन सहित कई आसंजन अणुओं की कोशिका सतह अभिव्यक्ति को विनियमित किया। एसएमएलसी-वातानुकूलित माध्यम के साथ ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं की खेती ने एंडोथेलियल वीसीएएम -1 सेल सतह अभिव्यक्ति को बढ़ाया। वीसीएएम -1 सेल सतह अभिव्यक्ति के प्रेरण का प्रभाव एसएमएलसी-वातानुकूलित माध्यम के बैचों के बीच भिन्न हो सकता है। यह अनुशंसा की जाती है कि एक ही एचआईपीएस स्रोत से प्राप्त एसएमएलसी से प्राप्त वातानुकूलित माध्यम के कई बैचों को एसएमएलसी को अलग करते समय संग्रहीत किया जाए, ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि कौन सा बैच वीसीएएम -1 की उपयुक्त अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है।

स्थैतिक परिस्थितियों में प्रतिरक्षा कोशिका आसंजन परख।
संलग्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं की सतह पर कार्यात्मक आसंजन अणुओं के अभिव्यक्ति स्तर से संबंधित है। भड़काऊ साइटोकिन्स के साथ उत्तेजना ने एंडोथेलियल आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति को विनियमित किया और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बढ़ती संख्या को बढ़ावा दिया जो ईईसीएम-बीएमईसी जैसे सेल मोनोलेयर का पालन करते थे (चित्रा 8)। वर्तमान प्रयोग ने ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं पर आसंजन अणुओं की कार्यक्षमता का प्रदर्शन किया, जिससे यह मॉडल प्रतिरक्षा सेल-ईसी इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हो गया।

Figure 2
चित्र 2: सीडी 31 + ईसी का शुद्धिकरण। ईसीएस के स्कैटर गेटिंग और एफआईटीसी-लेबल सीडी 31 से पहले (चरण 1.4.7) और बाद में (चरण 1.4.14) एमएसीएस के बाद सेल आबादी के धुंधला होने से प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री डेटा के डॉट प्लॉट। एमएसीएस आबादी में सीडी 31 + ईपीसी की शुद्धता में सुधार करता है। संक्षेप: एसएससी = साइड स्कैटर; एफएससी = फॉरवर्ड स्कैटर; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; एमएसीएस = चुंबकीय सक्रिय सेल सॉर्टिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: ईईसीएम-बीएमईसी-मोनोलेयर पारगम्यता (10-3 सेमी / मिनट) सोडियम फ्लोरेसिन की कच्ची प्रतिदीप्ति तीव्रता से गणना की जाती है। निकासी मात्रा के रैखिक ढलान की गणना प्रत्येक फिल्टर (चित्रा 3 ए) के लिए रैखिक प्रतिगमन का उपयोग करके की जाती है। सोडियम फ्लोरेसिन की पारगम्यता की गणना दो सूत्रों (चित्रा 3 बी) का उपयोग करके की जाती है। (ए) निकासी मात्रा बनाम समय के रैखिक ढलान की गणना फ़िल्टर 1 (एमसी 1) और रिक्त फिल्टर (एमएफ) के लिए रैखिक प्रतिगमन का उपयोग करके की गई थी। mc1 और mf क्रमशः Xc1 और Xf के गुणांक हैं। (बी) एमसी और एमएफ (फॉर्मूला 1) का उपयोग करके फ्लोरेसिन पारगम्यता (पीई) की गणना के लिए सूत्र। पीई इकाइयों को एक फिल्टर (फॉर्मूला 2) के सतह क्षेत्र का उपयोग करके परिवर्तित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाएं परिपक्व सेलुलर जंक्शनप्रदर्शित करती हैं। सम्मिलित फिल्टर की झिल्लियों पर उगाए गए ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं में क्लॉडिन -5, ऑक्लुडिन, या वीई-कैडरिन (लाल) के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन। नाभिक को 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (DAPI) (नीला) का उपयोग करके दाग दिया गया था। पारगम्यता परख के लिए उपयोग किए जाने वाले ठीक उसी फिल्टर इंसर्ट पर धुंधलापन किया गया था। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं द्वारा एंडोथेलियल आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति। एसएमएलसी-व्युत्पन्न सीएम की उपस्थिति में फिल्टर इंसर्ट की झिल्लियों पर विकसित ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग का प्रदर्शन किया गया था। आईसीएएम -1 या वीसीएएम -1 (लाल) के लिए इम्यूनोस्टेनिंग गैर-उत्तेजित और 1 एनजी / एमएल टीएनएफ -α + 20 आईयू / एमएल आईएफएन- γ उत्तेजित ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं के लिए दिखाया गया है। नाभिक DAPI (नीले) से सना हुआ था। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: एसएमएलसी का लक्षण वर्णन। चैंबर स्लाइड पर उगाए गए एसएमएलसी के लिए α-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए), कैलपोनिन या चिकनी मांसपेशी प्रोटीन 22-अल्फा (एसएम 22 ए) (लाल) के इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री को दिखाया गया है। नाभिक DAPI (नीले) से सना हुआ था। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं पर आसंजन अणुओं की एंडोथेलियल सेल सतह अभिव्यक्ति। ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं पर ईसी सतह आसंजन अणु अभिव्यक्ति के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के परिणाम दिखाए गए हैं। ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं को एसएमएलसी-व्युत्पन्न वातानुकूलित माध्यम का उपयोग करके सुसंस्कृत किया गया था। हिस्टोग्राम ओवरले की नीली, लाल और ग्रे रेखाएं क्रमशः गैर-उत्तेजित (एनएस) स्थिति, 1 एनजी / एमएल टीएनएफ -α + 20 आईयू / एमएल आईएफएन -γ-उत्तेजित स्थिति और आइसोटाइप नियंत्रण दिखाती हैं। एंडोथेलियल आसंजन अणुओं की कोशिका सतह अभिव्यक्ति, जिसमें अंतरकोशिकीय आसंजन अणु 1 (आईसीएएम -1), आईसीएएम -2, संवहनी कोशिका आसंजन अणु 1 (वीसीएएम -1), पी-सेलेक्टिन, ई-सेलेक्टिन, सीडी 9 9 और प्लेटलेट एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु -1 (पीईसीएएम -1) शामिल हैं, का मूल्यांकन किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं का आसंजन । (ए) गैर-उत्तेजित (एनएस) और 0.1 एनजी / एमएल टीएनएफ -α + 2 आईयू / एमएल आईएफएन -γ-उत्तेजित (टीएनएफ -α + आईएफएन -γ) ईईसीएम-बीएमईसी जैसे सेल मोनोलेयर पर फ्लोरोसेंटली लेबल वाले अनुयायी प्रतिरक्षा कोशिकाओं की छवियां। चित्र कुओं के केंद्रों के अनुरूप हैं। स्केल बार = 50 μm. (B) एनएस और TNF-α + IFN-γ-उत्तेजित EECM-BMEC जैसी कोशिकाओं के मोनोलेयर पर फ्लोरोसेंटली लेबल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या। फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके अनुगामी प्रतिरक्षा कोशिकाओं / दृश्य क्षेत्रों (एफओवी) को स्वचालित रूप से गिना गया था। डॉट्स संलग्न टी कोशिकाओं की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं। पट्टियाँ माध्य मान दिखाती हैं, और त्रुटि पट्टियाँ आठ परीक्षणों के मानक विचलन (SD) दिखाती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: परख के लिए विशिष्ट अभिकर्मकों का विवरण। प्रत्येक विशिष्ट अभिकर्मक के लिए सामग्री का नाम और सटीक मात्रा का वर्णन किया गया है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: पीई गणना के लिए प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर के कच्चे डेटा का उदाहरण। बोल्डफेस प्रकार में संख्याएं एक प्लेट रीडर द्वारा मापा सोडियम फ्लोरेसिन की कच्ची प्रतिदीप्ति तीव्रता हैं। डेटा का सटीक विश्लेषण करने के लिए, कच्चे मूल्यों से पृष्ठभूमि संकेत को हटाना और निचले कक्ष के नमूने के परिणामस्वरूप किसी भी सिग्नल हानि के लिए जिम्मेदार होना आवश्यक है, और बाद में सिग्नल को सही करना आवश्यक है। उदाहरण के लिए, पृष्ठभूमि को घटाने के बाद, 15 मिनट का नमूना 100 सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों (आरएफयू) का संकेत प्रदर्शित करता है, और 30 मिनट का नमूना 150 आरएफयू का संकेत प्रदर्शित करता है। 30 मिनट पर सही किया गया संकेत (150 RFU + 15 मिनट [100 RFU x 150 μL/1,500 μL]) पर अनुपलब्ध मान है, जो 150 RFU + 10 RFU = 160 RFU है। निकासी आयतन = (1,500 x [S B,t])/(S T,60 मिनट), जहाँ 1,500 नीचे के कक्ष का आयतन है (1,500 μL), S B, t समय t पर सही संकेत है, और S T,60 मिनट 60 मिनट पर शीर्ष कक्ष का संकेत है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

महत्वपूर्ण बिंदु और समस्या निवारण
ईपीसी भेदभाव शुरू करने से पहले, शोधकर्ताओं को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि एचआईपीएस संस्कृतियों में कोई सहज सेल भेदभाव की घटनाएं नहीं हुई हैं। अनायास विभेदित कोशिकाओं की अनुपस्थिति और शुद्ध एचआईपीएस कालोनियों का उपयोग प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। एमएसीएस के बाद सीडी 31+ ईपीसी की उच्च शुद्धता प्राप्त करने के लिए दिन -3 पर एचआईपीएससी सीडिंग घनत्व महत्वपूर्ण है। प्रत्येक HIPSC लाइन और प्रत्येक मार्ग के लिए सीडिंग घनत्व को अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। HIPSC लाइन और पैसेज नंबर के आधार पर, सीडिंग घनत्व 75 x 10 3से 400 x 10 3 HIPSC प्रति 12-वेल प्लेट (20-100 x 103/सेमी 2) के बीच हो सकताहै। HIPSC का न्यूनतम घनत्व चेकपॉइंट दिन 2 पर सेल घनत्व है। HIPSC को नवीनतम दिन 2 तक 100% स्थिरता तक पहुंचना चाहिए। यदि HIPSC दिन 2 तक संगत नहीं होते हैं, तो MACS के बाद CD31+ EPC की शुद्धता आमतौर पर काफी कम होगी। इस मामले में, HIPSC सीडिंग घनत्व बढ़ाया जा सकता है। यदि बड़ी संख्या में विभेदक कोशिकाएं दिन 3 से दिन 5 के आसपास प्लेट से अलग हो जाती हैं, तो प्रारंभिक एचपीएससी सीडिंग घनत्व कम हो सकता है। हमारे अनुभव में 7-8 μM CHIR99021 यहां उपयोग की जाने वाली HIPSC लाइनों के लिए इष्टतम एकाग्रता है, लेकिन एकाग्रता को अन्य HIPSC लाइनों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है जो अवरोधक उपचार के लिए अलग-अलग प्रतिक्रिया दे सकते हैं। सीडी 31 + ईपीसी की शुद्धता एमएसीएस से पहले और बाद में पुष्टि की जानी चाहिए। एमएसीएस जारी रखने से पहले, पूर्व-क्रमबद्ध सेल मिश्रण >10% सीडी 31+ सेल होना चाहिए। <6% के सीडी 31+ सेल प्रतिशत आमतौर पर एमएसीएस के बाद <80% ईपीसी का परिणाम होते हैं। इस स्थिति में प्रारंभिक सीडिंग घनत्व और/या CHIR99021 सांद्रता के अनुकूलन की आवश्यकता है।

सफल चयनात्मक पासिंग और शुद्ध ईसी मोनोलेयर के उत्पादन के लिए, सीडी 31+ ईपीसी की पोस्ट-एमएसीएस शुद्धता महत्वपूर्ण है। यदि एमएसीएस के बाद शुद्धता <90% है, तो एक या दो अतिरिक्त धोने की सिफारिश की जाती है (चरण 1.4.11-1.4.12)। आदर्श रूप से, पोस्ट-एमएसीएस शुद्धता >95% होनी चाहिए। कोलेजन-लेपित प्लेटों पर ईपीसी सीडिंग घनत्व को 3-7 दिनों के भीतर 100% कंफ्लुएंसी प्राप्त करने के लिए एचआईपीएससी लाइन के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए। जब तक ईसी 100% संगत नहीं होते हैं, तब तक प्रतीक्षा करना आमतौर पर सफल चयनात्मक मार्ग की ओर ले जाएगा। हालांकि, 100% कॉन्फ्लुएंट ईसी के लिए भी, कुछ हाईपीएससी लाइनों के एसएमएलसी भी जल्दी अलग हो जाते हैं। इस मामले में, कम प्रवाह (जैसे, ≤80%) पर चयनात्मक पासिंग प्रभावी हो सकती है। यदि कुछ एसएमएलसी ईसी से पहले अलग हो जाते हैं, तो ईसीएस को अक्सर मिश्रित ईसी-एसएमएलसी आबादी से बचाया नहीं जा सकता है। इस मामले में, पासिंग ईसी और दोहराए जाने वाले चयनात्मक पासिंग में पृथक्करण अभिकर्मक के लिए सक्रियण समय को छोटा करना सहायक हो सकता है। एक पृथक्करण अभिकर्मक के रूप में ट्रिप्सिन के बजाय एक वाणिज्यिक पृथक्करण अभिकर्मक का उपयोग चयनात्मक पासिंग के लिए फायदेमंद है, क्योंकि ट्रिप्सिन ईसी और एसएमएलसी की अलग-अलग टुकड़ी की अनुमति नहीं देता है। छोटे अणु ट्रेसर का उपयोग करके हमारी पारगम्यता परख और तंग जंक्शन और आसंजन अणु अभिव्यक्ति स्तरों के परीक्षण से संकेत मिलता है कि ईपीसी, ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं और एसएमएलसी को कम से कम 2 साल तक तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया जा सकता है।

विधि का महत्व और सीमाएं
यह विधि डब्ल्यूएनटी/β-कैटेनिन सिग्नलिंग को सक्रिय करने के लिए रासायनिक जीएसके-3 इनहिबिटर के उपयोग के माध्यम से सीडी 31+ ईपीसी को एचआईपीएससी से अलग करती है। एमएसीएस द्वारा सीडी 31 + ईपीसी के सकारात्मक चयन के बाद, ईपीसी को एक परिभाषित एंडोथेलियल माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है जो मिश्रित एंडोथेलियल और एसएमएलसी आबादी में भेदभाव को बढ़ावा देता है। विभिन्न चिपकने वाले गुणों के साथ इन मिश्रित आबादी की चयनात्मक पासिंग एसएमएलसी से ईसी को अलग करने की अनुमति देती है। एक या दो मार्ग के बाद, ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाएं बाधा गुणों और एंडोथेलियल आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करती हैं जो प्राथमिक मानव बीएमईसी के उन लोगों को पुन: उत्पन्न करती हैं। एसएमएलसी या उनके सुपरनैटेंट के साथ सह-संस्कृति वीसीएएम -1 की साइटोकिन-प्रेरित अभिव्यक्ति को प्रेरित करती है।

विवो में, बीबीबी विशिष्ट ट्रांसपोर्टरों के माध्यम से पोषक तत्वों के परिवहन और सीएनएस में प्रतिरक्षा कोशिका तस्करी के नियंत्रण के माध्यम से अणुओं की कम पैरासेलुलर और ट्रांससेलुलर पारगम्यता स्थापित करके सीएनएस होमियोस्टैसिस को बनाए रखता है। बीबीबी के अध्ययन के लिए, एक उपयुक्त मॉडल जो संबंधित अणुओं और रुचि के कार्यों को प्रदर्शित करता है, आवश्यक है। परिभाषित अभिकर्मकों और रोगियों या स्वस्थ विषयों के नमूनों का उपयोग करके ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं का उत्पादन एक स्केलेबल मानव बीबीबी मॉडल प्रदान करता है। अन्य बीबीबी मॉडल पर ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं का उपयोग करने वाले मॉडल के फायदे हैं: 1) एक आकृति विज्ञान और एंडोथेलियल ट्रांसक्रिपटम प्रोफाइल30 जो प्राथमिक मानव बीएमईसी जैसा दिखता है; 2) परिपक्व तंग जंक्शनों की उपस्थिति; 3) वांछनीय बाधा गुण; और 4) एंडोथेलियल आसंजन अणुओं की मजबूत अभिव्यक्ति, जिसमें आईसीएएम -1, आईसीएएम -2, वीसीएएम -1, ई- और पी-सेलेक्टिन, सीडी 9 9, मेलेनोमा सेल आसंजन अणु (एमसीएएम), और सक्रिय ल्यूकोसाइट सेल आसंजन अणु (एएलसीएएम) 22 शामिल हैं। इस प्रकार, यह मॉडल प्रतिरक्षा कोशिकाओं और बीएमईसी के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। यद्यपि छोटे अणु ट्रेसर की पारगम्यता ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं के लिए पहले आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी जैसी कोशिकाओं14,15 की तुलना में अधिक है, बाधा गुण प्राथमिक मानव बीएमईसी के लिए वर्णित लोगों की तुलना में काफी अच्छी तरह से तुलना करते हैं। यह समानता इंगित करती है कि ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाएं बीबीबी का एक अच्छा इन विट्रो मॉडल होने की संभावना है। शारीरिक परिस्थितियों में ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं पर ई-सेलेक्टिन अभिव्यक्ति को गैर-सूजन बीबीबी का अध्ययन करने के लिए इस मॉडल का उपयोग करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए, जिसमें विवो31 में संवैधानिक ई-सेलेक्टिन अभिव्यक्ति की कमी है। हमारे पिछले अध्ययन में, हमने दिखाया कि ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाएं बीबीबी को फेनोकॉपी कर सकती हैं, जैसा कि बाधित तंग जंक्शनों के संबंध में एमएस रोगियों के दिमाग में देखा गया है। इसके परिणामस्वरूप छोटे अणुओं की उच्च पारगम्यता और कार्यात्मक आसंजन अणु की अभिव्यक्ति में वृद्धि होती है, जो बीएमईसी जैसी कोशिकाओं मेंप्रतिरक्षा कोशिकाओं के बढ़ते आसंजन और स्थानांतरण की मध्यस्थता करती है। इसके अलावा, हमने दिखाया कि डब्ल्यूएनटी / β-कैटेनिन सिग्नलिंग की सक्रियता तंग जंक्शनों के विघटन को कम कर सकती है और एमएस-व्युत्पन्न ईईसीएम-बीएमईसीजैसी कोशिकाओं में वीसीएएम -1 अभिव्यक्ति में वृद्धि कर सकती है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि मॉडल वास्तव में एमएस जैसे न्यूरोइम्यूनोलॉजिकल रोगों में बीबीबी की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है।

एक साथ लिया गया, ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाएं बीबीबी के स्तर पर पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र की गहन समझ के लिए और बीबीबी स्थिरीकरण के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों को विकसित करने के लिए एक उपकरण के रूप में एक आशाजनक उपकरण हैं। भविष्य में, मॉडल को बीमारियों के व्यापक स्पेक्ट्रम में बीबीबी डिसफंक्शन का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है और नए चिकित्सीय दृष्टिकोण के लिए रास्ते खोल सकता है।

Disclosures

बीई को रक्त-मस्तिष्क बाधा में टी-सेल माइग्रेशन पर नतालिज़ुमाब की विस्तारित खुराक का अध्ययन करने के लिए बायोजेन से अनुदान मिला और न्यूरोलॉजिकल विकारों में रक्त-मस्तिष्क बाधा शिथिलता के आणविक आधार की जांच करने के लिए सीएसएल बेहरिंग से अनुदान मिला। एचएन और बीई ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं (63/084980 और 63/185815) से संबंधित अनंतिम अमेरिकी पेटेंट अनुप्रयोगों के आविष्कारक हैं।

Acknowledgments

एचएन को यूएनएसएफ (जेआरपी) अनुदान संख्या जेपीजेएसजेआरपी 20221507 और केकेएनएचआई अनुदान संख्या 22के15711, जेएसटी वन कार्यक्रम (अनुदान संख्या जेपीएमजेएफआर 2269, जापान), योकोयामा फाउंडेशन फॉर क्लिनिकल फार्माकोलॉजी ग्रांट नंबर वाईआरवाई -2217, आईसीएचआरआई -2217 के सहयोग से लागू संयुक्त अनुसंधान कार्यक्रम के तहत यूहारा मेमोरियल फाउंडेशन, एक ईसीटीआरआईएमएस पोस्टडॉक्टोरल रिसर्च एक्सचेंज फैलोशिप, जेएसपीएस द्वारा समर्थित किया गया था। विज्ञान को बढ़ावा देने के लिए नोवार्टिस फाउंडेशन (जापान), और यामागुची विश्वविद्यालय फंड। बीई को स्विस एमएस सोसाइटी और स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (अनुदान 310030_189080 और ZLJZ3_214086) और रणनीतिक जापानी-स्विस विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (एसजेएसएसटीपी) अनुदान IZLJZ3_214086 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 mm Syringe filter TPP 99722
15 mL Centrifuge tube Falcon 352196
40 μm Falcon cell strainer Falcon 352340
5 mL Round-bottom tube SPL 40005
50 mL Centrifuge tube Falcon 352070
96-Well plate, round bottom SPL 34096
Accutase Sigma-Aldrich A6964-500ml
Acetic acid Sigma-Aldrich 695092
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634
All-in-One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X810
B-27 Supplement (503), serum free Thermo Fischer Scientific 17504044
Bovine serum albumin (BSA), 7.5% in dPBS Sigma-Aldrich A8412
CellAdhere Dilution Buffer STEMCELL Technologies ST-07183
CellTracker Green CMFDA Dye Invitrogen C7025
Chamber slides Thermo Fischer Scientific 178599
CHIR99021 Selleck Chemicals S1263
Collagen IV from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Corning tissue culture plates (12-well) Corning 3512
Corning tissue culture plates (6-well) Corning 3506
Cryo tube innercap 2.0 mL Watson 1396-201S
Dimethylsulfoxide (DMSO), sterile Sigma-Aldrich D2650
DMEM (13), [+] 4.5 g/L D-glucose, [-] L-glutamine, [-] pyruvate Thermo Fischer Scientific 31053-028
Dulbecco’s (d) PBS (without calcium, magnesium) Thermo Fisher 14190250
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/nutrient mixture F-12 (DMEM-F12) Thermo Fischer Scientific 11320074
EasySepFITC Positive Selection Kit II STEMCELL Technologies 18558
EasySepMagnet Stemcell Technologies 18000
Ethylenediaminetetraacetic Acid Solution0.02% in DPBS Sigma E8008-100ML
Fetal Bovine Serum, qualified Thermo Fischer Scientific 10270106
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141
Ficoll-Paque PLUS Sigma-Aldrich GE17144002
FIJI software (Version 2.0.0) Image J, USA
FlowJo version10 BD
Fluorescein sodium salt Sigma-Aldrich F6377
GlutaMAX Supplement Thermo Fischer Scientific 35050-061
Glutaraldehyde solution Sigma-Aldrich G6257
HCL Sigma-Aldrich H1758
HEPES buffer solution Thermo Fischer Scientific 15630-056
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) Thermo Fischer Scientific 11111-044
Human fibroblast growth factor 2 (FGF2) Tocris 233-FB-500
iPS human induced pluripotent stem cells Riken RBC HPS1006
Kanamycin Sulfate (100x) Thermo Fischer Scientific 15160-047
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960-5G
L-Glutamine 200 mM (1003) Thermo Fischer Scientific 25030-024
Matrigel, growth factor reduced Corning 354230
MEM NEAA (1003) Thermo Fischer Scientific 11140-035
Methanol Sigma-Aldrich 32213
Mowiol Sigma-Aldrich 81381
mTeSR Plus-cGMP STEMCELL Technologies ST-100-0276
mTeSR1 complete kit (basal medium plus 53 supplement) STEMCELL Technologies 85850
NaCl Sigma-Aldrich 71376
Paraformaldehyde Millipore 104005
Pen Strep Thermo Fischer Scientific 15140-122
Recombinant Human IFN-gamma Protein R&D Systems 285-IF-100
Recombinant Human IL-2 BD Biosciences 554603
Recombinant Human TNF-alpha Protein R&D Systems 210-TA-020
ROCK inhibitor Y-27632 Tocris 1254
RPMI medium 1640 Thermo Fischer Scientific 21875-034
Scalpel FEATHER 2975-11
Skim milk BD Biosciences 232100
Sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich 71290
Sodium pyruvate Thermo Fischer Scientific 11360-039
Transwells, PC Membrane, 0.4 mm, 12 mm, TC-Treated Corning 3401
Tris base Sigma-Aldrich 93362
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Vitronectin XF STEMCELL Technologies 078180
Water, sterile, cell culture Sigma-Aldrich W3500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Castro Dias, M., Mapunda, J. A., Vladymyrov, M., Engelhardt, B. Structure and junctional complexes of endothelial, epithelial and glial brain barriers. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5372 (2019).
  2. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).
  3. Marchetti, L., Engelhardt, B. Immune cell trafficking across the blood-brain barrier in the absence and presence of neuroinflammation. Vascular Biology. 2 (1), H1-H18 (2020).
  4. Yang, C., Hawkins, K. E., Dore, S., Candelario-Jalil, E. Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 316 (2), C135-C153 (2019).
  5. Nishihara, H., Engelhardt, B. Brain barriers and multiple sclerosis: novel treatment approaches from a brain barriers perspective. Handbook of Experimental Pharmacology. 273, 295-329 (2020).
  6. Pan, Y., Nicolazzo, J. A. Altered blood-brain barrier and blood-spinal cord barrier dynamics in amyotrophic lateral sclerosis: Impact on medication efficacy and safety. British Journal of Pharmacology. 179 (11), 2577-2588 (2022).
  7. Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer disease and other neurodegenerative disorders. Nature Reviews Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).
  8. Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell Transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
  9. Song, H. W., et al. Transcriptomic comparison of human and mouse brain microvessels. Scientific Reports. 10 (1), 12358 (2020).
  10. Lecuyer, M. A., et al. Dual role of ALCAM in neuroinflammation and blood-brain barrier homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (4), E524-E533 (2017).
  11. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  12. DeStefano, J. G., Jamieson, J. J., Linville, R. M., Searson, P. C. Benchmarking in vitro tissue-engineered blood-brain barrier models. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 32 (2018).
  13. Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
  14. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  15. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
  16. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
  17. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 9 (2017).
  18. Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  19. Praca, C., et al. Derivation of brain capillary-like endothelial cells from human pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells. Stem Cell Reports. 13 (4), 599-611 (2019).
  20. Al-Ahmad, A. J. Comparative study of expression and activity of glucose transporters between stem cell-derived brain microvascular endothelial cells and hCMEC/D3 cells. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 313 (4), C421-C429 (2017).
  21. Canfield, S. G., et al. An isogenic neurovascular unit model comprised of human induced pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells, pericytes, astrocytes, and neurons. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 25 (2019).
  22. Nishihara, H., et al. Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions. The FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).
  23. Lu, T. M., et al. Pluripotent stem cell-derived epithelium misidentified as brain microvascular endothelium requires ETS factors to acquire vascular fate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (8), e2016950118 (2021).
  24. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
  25. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
  26. Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. STAR Protocols. 2 (2), 100563 (2021).
  27. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
  28. Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends in Immunology. 33 (12), 579-589 (2012).
  29. Duband, J. L., Gimona, M., Scatena, M., Sartore, S., Small, J. V. Calponin and SM 22 as differentiation markers of smooth muscle: spatiotemporal distribution during avian embryonic development. Differentiation. 55 (1), 1-11 (1993).
  30. Gastfriend, B. D., et al. Wnt signaling mediates acquisition of blood-brain barrier properties in naïve endothelium derived from human pluripotent stem cells. eLife. 10, e70992 (2021).
  31. Eppihimer, M. J., Wolitzky, B., Anderson, D. C., Labow, M. A., Granger, D. N. Heterogeneity of expression of E- and P-selectins in vivo. Circulation Research. 79 (3), 560-569 (1996).
  32. Nishihara, H., et al. Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).

Tags

इस महीने JoVE में अंक 195
एक परिपक्व प्रतिरक्षा फेनोटाइप के साथ मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल सेल जैसी कोशिकाओं के लिए मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का भेदभाव
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matsuo, K., Engelhardt, B.,… More

Matsuo, K., Engelhardt, B., Nishihara, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Brain Microvascular Endothelial Cell-Like Cells with a Mature Immune Phenotype. J. Vis. Exp. (195), e65134, doi:10.3791/65134 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter