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Biology

माइकोहेटरोट्रॉफ़िक पौधों में एंडोफाइटिक कवक की पहचान करने के लिए अलगाव, लक्षण वर्णन और कुल डीएनए निष्कर्षण

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/65135
Automatic Translation
1, 1, 1
1LabPlaM - Mycoheterotrophic Plants Research Lab, Department of Plant Biology, State University of Campinas (UNICAMP)

Summary

वर्तमान लेख का उद्देश्य पौधे से जुड़े एंडोफाइटिक कवक के अलगाव के लिए विस्तृत और पर्याप्त प्रोटोकॉल प्रदान करना है, आइसोलेट्स का दीर्घकालिक संरक्षण, रूपात्मक लक्षण वर्णन, और बाद में आणविक पहचान और मेटागेनोमिक विश्लेषण के लिए कुल डीएनए निष्कर्षण।

Abstract

माइकोहेटरोट्रॉफ़िक पौधे माइकोरिज़ल निर्भरता के सबसे चरम रूपों में से एक प्रस्तुत करते हैं, जो पूरी तरह से अपनी ऑटोट्रॉफ़िक क्षमता खो चुके हैं। किसी भी अन्य महत्वपूर्ण संसाधन के रूप में आवश्यक, कवक जिसके साथ ये पौधे घनिष्ठ रूप से जुड़ते हैं, उनके लिए आवश्यक हैं। इसलिए, मायकोहेटरोट्रॉफ़िक प्रजातियों का अध्ययन करने में कुछ सबसे प्रासंगिक तकनीकें हैं जो संबंधित कवक की जांच को सक्षम करती हैं, विशेष रूप से जड़ों और भूमिगत अंगों में रहने वाले। इस संदर्भ में, संस्कृति-निर्भर और संस्कृति-स्वतंत्र एंडोफाइटिक कवक की पहचान करने की तकनीक आमतौर पर लागू की जाती है। फंगल एंडोफाइट्स को अलग करना उन्हें रूपात्मक रूप से पहचानने, उनकी विविधता का विश्लेषण करने और आर्किड बीजों के सहजीवी अंकुरण में अनुप्रयोगों के लिए इनोकुला बनाए रखने का एक साधन प्रदान करता है। हालांकि, यह ज्ञात है कि पौधों के ऊतकों में रहने वाले गैर-खेती योग्य कवक की एक विशाल विविधता है। इस प्रकार, संस्कृति-स्वतंत्र आणविक पहचान तकनीक प्रजातियों की विविधता और बहुतायत का एक व्यापक आवरण प्रदान करती है। इस लेख का उद्देश्य दो जांच प्रक्रियाओं को शुरू करने के लिए आवश्यक पद्धतिगत समर्थन प्रदान करना है: एक संस्कृति-निर्भर और एक स्वतंत्र। संस्कृति-निर्भर प्रोटोकॉल के बारे में, संग्रह स्थलों से प्रयोगशाला सुविधाओं तक पौधों के नमूनों को इकट्ठा करने और बनाए रखने की प्रक्रियाएं विस्तृत हैं, साथ ही माइकोहेटरोट्रॉफ़िक पौधों के भूमिगत और हवाई अंगों से फिलामेंटस कवक को अलग करने के साथ-साथ, आइसोलेट्स का संग्रह रखते हुए, स्लाइड कल्चर पद्धति द्वारा रूपात्मक रूप से हाइपहे की विशेषता रखते हुए, और कुल डीएनए निष्कर्षण द्वारा कवक की आणविक पहचान। संस्कृति-स्वतंत्र पद्धतियों को शामिल करते हुए, विस्तृत प्रक्रियाओं में एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके मेटागेनोमिक विश्लेषण और एक्लोरोफिलस पौधों के अंगों से कुल डीएनए निष्कर्षण के लिए पौधों के नमूने एकत्र करना शामिल है। अंत में, निरंतरता प्रोटोकॉल (जैसे, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन [पीसीआर], अनुक्रमण) भी विश्लेषण के लिए सुझाव दिए जाते हैं, और तकनीक यहां प्रस्तुत की जाती हैं।

Introduction

एंडोफाइटिक कवक, परिभाषा के अनुसार, वे हैं जो अगोचर संक्रमणों में पौधे के अंगों और ऊतकों के आंतरिक भाग में रहते हैं (यानी, उनके मेजबान को नुकसान पहुंचाए बिना)1,2. ये कवक तटस्थ या लाभकारी मेजबान पौधों के साथ बातचीत कर सकते हैं, रोगजनकों और प्रतिकूल पर्यावरणीय परिस्थितियों के प्रतिरोध प्रदान कर सकते हैं, और पौधे के लिए लाभकारी यौगिकों के संश्लेषण में योगदान कर सकते हैं (जैसे, विकास कारक और अन्य फाइटोहोर्मोन)1,3. माइकोरिज़ल एंडोफाइट्स कवक हैं जो पौधे के साथ माइकोरिज़ल संघों को स्थापित करते हैं, पोषक तत्व हस्तांतरण में भाग लेते हैं4. ऑर्किडेसी में, माइकोरिज़ल एंडोफाइट्स के साथ बातचीत प्रजातियों के विशाल बहुमत में बीज अंकुरण के लिए मौलिक है, और परिवार में सभी पौधों में अंकुर स्थापना5. ऐसे संदर्भों में, मायकोहेटेरोट्रॉफ़िक ऑर्किड अपने माइकोरिज़ल भागीदारों के बारे में कुल निर्भरता के मामले का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्योंकि वे अपने पूरे जीवन चक्र के दौरान इन कवक द्वारा खनिज पोषक तत्वों और कार्बन यौगिकोंके हस्तांतरण पर निर्भर करते हैं। इसलिए, माइकोहेटरोट्रॉफ़िक जीवन रणनीतियों की जांच करते समय कवक को जोड़ने का अलगाव और पहचान एक मौलिक आधार है। इसके अलावा, बहुत कम mycoheterotrophic पौधों या यहां तक कि इन कवक 7,8 की वास्तविक विविधता में कवक endophytes की भूमिकाओं के बारे में जाना जाता है.

एंडोफाइटिक कवक की जांच विभिन्न तकनीकों के माध्यम से आयोजित की जा सकती है, जिसे पारंपरिक रूप से संस्कृति-स्वतंत्र या निर्भर के रूप में वर्णित किया गया है, उदाहरण के लिए: (ए) प्रत्यक्ष अवलोकन, (बी) फंगल अलगाव और रूपात्मक और / या आणविक पहचान, और (सी) पौधे के ऊतकों और आणविक पहचान9 का कुल डीएनए निष्कर्षण। प्रत्यक्ष अवलोकन (ए) में, एंडोफाइटिक कवक की जांच की जा सकती है, जबकि अभी भी प्रकाश या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी9 द्वारा पौधों की कोशिकाओं और ऊतकों के इंटीरियर में है, क्योंकि विभिन्न माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल पेना-पासोस एट अल.10द्वारा विस्तृत हैं। अलगाव विधियों (बी) द्वारा, फंगल एंडोफाइट्स को उनकी कॉलोनियों, हाइपहे और प्रजनन या प्रतिरोध संरचना आकृति विज्ञान के अनुसार चित्रित किया जा सकता है। इसके अलावा, अलगाव तकनीकों के माध्यम से, डीएनए निष्कर्षण, आणविक पहचान अनुक्रमों (बारकोड या उंगलियों के निशान), औरअनुक्रमण 11 के प्रवर्धन के माध्यम से आइसोलेट्स की आणविक पहचान का संचालन करना संभव है। उत्तरार्द्ध तकनीक (सी) डीएनए निष्कर्षण प्रति एंडोफाइटिक कवक की आणविक पहचान को सक्षम बनाता है, जबकि पौधे के ऊतकों (मेटाबारकोडिंग) के इंटीरियर में, पुस्तकालय की तैयारी औरअनुक्रमण 12 के बाद।

इसके अलावा, फंगल आइसोलेट्स को सहजीवी अंकुरण परीक्षणों में लागू किया जा सकता है, ऑटोट्रॉफिक या मायकोहेटेरोट्रॉफ़िक ऑर्किड से बीज का उपयोग करके। इस तरह के एक आवेदन का एक उदाहरण सिस्टी एट अल.13 द्वारा की गई जांच है, जो पोगोनियोप्सिस शेंकी, एक मायकोहेटेरोट्रॉफ़िक ऑर्किड में प्रोटोकॉर्म विकास के अंकुरण और प्रारंभिक चरणों का वर्णन करता है, इसके कुछ आइसोलेट्स के सहयोग से, जिसमें गैर-माइकोरिज़ल एंडोफाइटिक कवक शामिल हैं। लागू सहजीवी अंकुरण प्रोटोकॉल विस्तृत है और पेना-पासोस एट अल.10 द्वारा एक वीडियो में प्रस्तुत किया गया है। विभिन्न पौधों के अंगों के साथ मिलकर कवक को अलग करने से पौधे-कवक इंटरैक्शन की प्रकृति के बारे में विविध जांच केंद्रित होती है (उदाहरण के लिए, एसोसिएशन के पारिस्थितिक या शारीरिक पहलुओं को समझने के लिए, साथ ही कवक से पौधे तक पोषक तत्व हस्तांतरण में पूछताछ)9।

धारा 1 में प्रस्तुत पद्धतियां भूमिगत अंग के नमूनों के संग्रह पर आधारित हैं, क्योंकि ये अंग संग्रह में सबसे अधिक कठिनाइयां पेश करते हैं, और वे प्रमुख रुचि के हैं क्योंकि माइकोरिज़ल एंडोफाइट्स उन्हें उपनिवेश बनाते हैं। हालांकि, दोनों शामिल प्रोटोकॉल (चरण 1.1 और 1.2) अन्य मायकोहेट्रोट्रॉफ़िक पौधों के अंगों (जैसे, प्रकंद, पुष्प उपजी और फल) पर लागू किए जा सकते हैं। चरण 1.1 में वर्णित संग्रह पद्धति को रूपात्मक लक्षण वर्णन (धारा 4 और 5) और/या अलग पहचान (धारा 6) के लिए कुल डीएनए निष्कर्षण के लिए एंडोफाइटिक कवक (धारा 2) को अलग करने के लिए नामित किया गया है। दूसरी ओर, चरण 1.2 में वर्णित संग्रह पद्धति विशेष रूप से मेटाबारकोडिंग तकनीकों (धारा 7) के लिए पौधे के ऊतकों के कुल डीएनए निष्कर्षण को सौंपी गई है। धारा 3 में, फिलामेंटस कवक भंडारण और संरक्षण के लिए चार तरीके प्रस्तुत किए गए हैं, दो अल्पकालिक भंडारण (3-6 महीने) के लिए और अन्य दो दीर्घकालिक भंडारण (>1 वर्ष) के लिए पर्याप्त हैं। रूपात्मक लक्षण वर्णन (खंड 4 और 5) इसे सुदृढ़ करने और फंगल मैक्रो- और माइक्रोमोर्फोलॉजी पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने के लिए आणविक पहचान से जुड़ा हो सकता है। चित्रा 1 इसके बाद वर्णित सामूहिक पद्धतियों को सारांशित करता है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रस्तुत विधियों का योजनाबद्ध सारांश। "संस्कृति-निर्भर और -स्वतंत्र पद्धतियों द्वारा पौधे का संग्रह और फंगल अलगाव, संरक्षण और आणविक पहचान"। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Protocol

1. पौधे का नमूना संग्रह

  1. संस्कृति-निर्भर तरीकों के लिए नमूना संग्रह
    1. भूमिगत अंगों को सावधानीपूर्वक खोदें; ये एकत्र किए जाने वाले पौधे की जड़ें, तने, प्रकंद या भंडारण अंग हो सकते हैं। अत्यधिक कॉम्पैक्ट मिट्टी के अलावा, इन नमूनों को हाथ से एकत्र करें।
      नोट: इस चरण में ट्रॉवेल या स्कूप जैसे उपकरणों का उपयोग बीमार सलाह दी जाती है, क्योंकि यह माइकोहेटरोट्रॉफ़िक पौधों की नाजुक संरचनाओं को नुकसान पहुंचा सकता है और गैर-एंडोफाइटिक कवक द्वारा ऊतक संदूषण का कारण बन सकता है।
    2. जितना संभव हो उतने भूमिगत अंगों को इकट्ठा करें। एक ठंडा कंटेनर (जैसे, polystyrene फोम बॉक्स या बर्फ के साथ थर्मल बैग) के अंदर पेपर बैग में नमूने बनाए रखें. यदि हवाई अंगों को भी एकत्र किया जाता है, तो उन्हें भूमिगत लोगों से अलग से परिवहन करें।
  2. संस्कृति-स्वतंत्र तरीकों के लिए नमूना संग्रह
    1. चरण 1.1.1 से नोट में बताई गई सिफारिशों के तहत एकत्र किए जाने वाले पौधे की जड़ों को सावधानीपूर्वक खोदें।
    2. जितना संभव हो उतने भूमिगत अंगों को इकट्ठा करें। तरल नाइट्रोजन (वांछनीय विकल्प) के अंदर क्रायोट्यूब में एकत्रित नमूनों को बनाए रखें या सूखी बर्फ (वैकल्पिक विकल्प) से घिरे अपकेंद्रित्र ट्यूबों का उपयोग करें। एकत्र होने पर हवाई अंगों को अलग से बनाए रखें।

2. पौधों के अंगों से जुड़े एंडोफाइटिक कवक का अलगाव14

नोट: इस खंड में उपयोग की जाने वाली प्रत्येक सामग्री, समाधान और अभिकर्मक बाँझ होना चाहिए। जिन्हें पहले से निष्फल नहीं खरीदा जा सकता है, उन्हें 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव किया जाना चाहिए।

  1. पौधों के अंगों का सतही विघटन
    1. बहते पानी में एकत्रित नमूने (चरण 1.1.2) धो लें और जितना संभव हो उतना सब्सट्रेट और अन्य मलबे को हटा दें।
    2. एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर, 1 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में जलमग्न धुले नमूने बनाए रखें (एक बीकर या एक ग्लास जार इस्तेमाल किया जा सकता है).
    3. 3 मिनट के लिए 2% सक्रिय क्लोरीन के साथ सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ दूसरे कंटेनर में नमूने स्थानांतरित करें।
    4. 70% इथेनॉल के साथ एक कंटेनर के लिए नमूने बदलें और 1 मिनट के लिए जलमग्न बनाए रखें. बाद में, आसुत जल के साथ दो कंटेनरों में क्रमिक रूप से नमूने धो लें.
  2. संस्कृति माध्यम में पौधे के टुकड़ों की स्थापना
    नोट: चरण 2.2 में विस्तृत हर कदम एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर आयोजित किया जाना चाहिए.
    1. स्थापना से पहले, 19.5 ग्राम / एल आलू डेक्सट्रोज अगर कल्चर मीडियम (पीडीए) + 7 ग्राम / एल बैक्टीरियोलॉजिकल अगर + 3 एमएल / एल एंटीबायोटिक्स (जैसे, स्ट्रेप्टोमाइसिन, पेनिसिलिन, टेट्रासाइक्लिन, एम्पीसिलीन) के साथ पेट्री डिश (व्यास में 8-10 सेमी) तैयार करें।
    2. कोई संदूषण है सुनिश्चित करने के लिए उन्हें सुनिश्चित करने के लिए 24 घंटे के लिए 36 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति माध्यम के साथ पेट्री व्यंजन बनाए रखें. बैक्टीरिया या कवक कालोनियों से दूषित व्यंजनों को त्यागें।
      नोट: इस चरण में माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा आवश्यक है, क्योंकि अंग बैक्टीरिया से अत्यधिक संक्रमित होते हैं जो फंगल विकास को रोक सकते हैं। सत्यापित करें कि क्या ऑटोक्लेविंग के दौरान एंटीबायोटिक्स को गर्म किया जा सकता है; कुछ एंटीबायोटिक दवाओं को मध्यम को लगभग 36 डिग्री सेल्सियस (व्यंजन में रखने से पहले) ठंडा करने के बाद जोड़ा जाना चाहिए।
    3. इसके तुरंत बाद नमूनों के सतही disinfestation के बाद और अभी भी एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर, पीडीए में, अंतिम कंटेनर नमूने धोने के लिए इस्तेमाल किया से आसुत जल की कुछ बूंदों टीका लगाना. नमूनों के सतही विघटन की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है।
    4. एक खाली autoclaved पकवान में, नमूने जगह और चारों ओर 0.2 सेमी की मोटाई के लिए नमूने अनुभाग के लिए एक flamed स्केलपेल और संदंश का उपयोग करें.
    5. खंड बेलनाकार नमूने अनुदैर्ध्य रूप से दो हिस्सों में यदि माध्यम के संपर्क में सतह को बढ़ाना चाहते हैं। फलों और अन्य अधिक गोलाकार अंगों को बेहतर ढंग से उजागर करने के लिए, संरचनाओं को अच्छी तरह से काट लें या काट लें। बीज महत्वपूर्ण कवक स्रोत भी हो सकते हैं, इसलिए सुनिश्चित करें कि खंडित फल उन्हें माध्यम में उजागर करता है।
      नोट: केवल स्वस्थ अंगों, ऊतक क्षति या संभावित बीमारियों या रोगजनक संक्रमण के संकेतों के बिना, फंगल एंडोफाइट अलगाव में इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
    6. पीडीए + एंटीबायोटिक के साथ पेट्री व्यंजन में भूमिगत अंगों के पांच टुकड़े वितरित करें। सुनिश्चित करें कि टुकड़े यथासंभव एक दूसरे से दूर हैं, और डिश किनारों को भी नहीं छू रहे हैं। माध्यम पर किसी भी टुकड़े को सरणी न करें। संदूषण के मामले में एहतियात के तौर पर स्थापित प्रत्येक अंग की प्रतिकृति तैयार करें।
    7. क्लिंग फिल्म के साथ पेट्री व्यंजन सील और उन्हें 5 दिनों के लिए 25-27 डिग्री सेल्सियस (अधिमानतः एक इनक्यूबेटर में) पर अंधेरे में स्टोर करें।
  3. अलगाव आवृत्ति (IF) पथरी11
    1. अंग के टुकड़े के 5 दिनों के इनक्यूबेशन के बाद, आईएफ की गणना करें, इनक्यूबेटेड टुकड़ों की संख्या के अनुसार जो फंगल कॉलोनियों को इनक्यूबेटेड टुकड़ों के कुल से विभाजित करते हैं, जैसा कि निम्नलिखित समीकरण में दर्शाया गया है:
      Equation 1
  4. धारीदार और उपसंस्कृति द्वारा फंगल आइसोलेट्स की शुद्धि
    नोट: चरण 2.4 में विस्तृत हर कदम एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर आयोजित किया जाना चाहिए.
    1. पेट्री व्यंजन (व्यास में 5 सेमी) 5-7 ग्राम / एल अगर (एए; बैक्टीरियोलॉजिकल अगर केवल) के साथ तैयार करें। संभवतः दूषित लोगों को खत्म करने के लिए 36 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए व्यंजन बनाए रखें।
    2. एक कोड के साथ प्रत्येक उगाए गए कवक कॉलोनी की पहचान करें और डिश के नीचे की तरफ इसके मार्जिन का परिसीमन करें (एक स्थायी मार्कर के साथ किया जा सकता है)। रंग, विकास पैटर्न, बनावट और मार्जिन प्रारूप द्वारा कालोनियों को अलग करें।
    3. एक ऑटोक्लेव्ड लकड़ी के टूथपिक के साथ, ठीक टिप का उपयोग करके, एक कवक कॉलोनी से मायसेलियम की एक छोटी मात्रा को पुनः प्राप्त करें। कॉलोनी मार्जिन पर अधिमानतः ध्यान केंद्रित करें और एक अन्य कॉलोनी से जहां तक संभव हो एक क्षेत्र का चयन करें, एक बार में एक से अधिक प्रकार की कॉलोनी को स्वस्थ करने से बचें।
    4. टिप पर मायसेलियम के साथ एक ही टूथपिक का उपयोग करके, एए को तीन स्ट्राइ (खांचे) का उत्पादन करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक स्ट्रिया दूसरे और डिश किनारों से 1 सेमी की दूरी पर है। उपयुक्त कोड लिखें (स्टिकर पेपर और पेंसिल का उपयोग करके), व्यंजन सील करें, और उन्हें 3 दिनों के लिए 25-27 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में ऊष्मायन करें।
    5. 39 ग्राम / एल पीडीए के साथ पेट्री व्यंजन (व्यास में 8 सेमी) तैयार करें। इस स्तर पर एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़ना आवश्यक नहीं है।
    6. एए व्यंजनों को इनक्यूबेट करने के बाद, सावधानीपूर्वक उन्हें प्रकाश (दीपक या खिड़की से) के खिलाफ निरीक्षण करें, जिसका उद्देश्य अलग-अलग कॉलोनियों को बनाने वाले ठीक हाइपहे की पहचान करना है। पेट्री डिश के नीचे की तरफ एक स्थायी मार्कर का उपयोग करके, प्रति डिश एक व्यक्तिगत कॉलोनी के क्षेत्र का परिसीमन करें।
    7. एक लामिना का प्रवाह हुड में, कॉलोनी युक्त माध्यम के एक हिस्से को काटने के लिए एक autoclaved टूथपिक का उपयोग करें और एक नए पीडीए पकवान के केंद्र में कटौती मात्रा हस्तांतरण.
    8. आइसोलेट्स के कोड के साथ पेट्री डिश को पहचानें, क्लिंग फिल्म के साथ व्यंजन सील करें, और उन्हें 7-14 दिनों के लिए 25-27 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में बनाए रखें।

3. शुद्ध कवक आइसोलेट्स का संरक्षण

नोट: इस खंड में उपयोग की जाने वाली प्रत्येक सामग्री, समाधान और अभिकर्मक बाँझ होना चाहिए। जिन्हें पहले से निष्फल नहीं खरीदा जा सकता है, उन्हें 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव किया जाना चाहिए।

  1. कैस्टेलानी की विधि के साथ या खनिज तेल में संरक्षण (3-6 महीने)11,15
    1. आसुत जल के 0.5 एमएल या खनिज तेल के 0.5 एमएल युक्त (चुने हुए विधि के आधार पर) के साथ 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें। सुनिश्चित करें कि ट्यूबों को खाली कर दिया गया है, और आटोक्लेव पानी और तेल को लामिना का प्रवाह हुड के अंदर ट्यूबों में जोड़ा जाता है।
    2. एक लामिना का प्रवाह हुड में, 7-14 दिनों के लिए पीडीए (39 ग्राम / एल) में पहले से ही उगाए गए शुद्ध आइसोलेट्स के साथ पेट्री व्यंजन रखें। एक autoclaved टूथपिक का प्रयोग, mycelium मार्जिन युक्त माध्यम के छोटे cuboids (0.5 सेमी x 0.5 सेमी ऊपरी क्षेत्र में 0.5 सेमी) कटौती.
    3. आसुत जल (Castellani की विधि) या खनिज तेल के साथ microcentrifuge ट्यूबों में चार से छह cuboids रखें. अंधेरे में ट्यूबों की दुकान, 25 डिग्री सेल्सियस पर के रूप में लंबे समय के रूप में जरूरत के रूप में, विधि की समय सीमाओं का अवलोकन.
      नोट: ट्यूबों में बहुत सारे क्यूबोइड जोड़ने और उन्हें पूरा करने से बचें, जिससे संदूषण की संभावना बढ़ सकती है। ट्यूबों को प्रशीतित बनाए रखना संभव है, जो लंबे समय तक कुछ आइसोलेट्स के संरक्षण का पक्ष ले सकता है। Currah et al.16 उष्णकटिबंधीय ऑर्किड से माइकोरिज़ल कवक आइसोलेट्स की प्रतिकृतियों को प्रशीतित और 25 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने की सलाह देते हैं, क्योंकि कोल्ड स्टोरेज में होने पर वे खो सकते हैं।
    4. एक घनाभ स्वस्थ हो जाओ और एक संग्रहीत अलग विकसित करने के लिए एक नए पीडीए पकवान के केंद्र में जगह है.
  2. बिना छिलके वाले चावल के दानों में क्रायोप्रिजर्वेशन (>1 वर्ष)17
    1. बिना छिलके वाले चावल के दानों को बहते पानी में धोएं और उन्हें तब तक पकाएं जब तक कि चावल का छिलका न खुलने लगे। एक पेंच टोपी के साथ ग्लास टेस्ट ट्यूब में पका हुआ अनाज वितरित करें और बीच में 24 घंटे के अंतराल के साथ दो बार आटोक्लेव करें।
    2. एक लामिना का प्रवाह हुड में, 7-14 दिनों के लिए पीडीए (39 ग्राम / एल) में पहले से ही उगाए गए शुद्ध आइसोलेट्स के साथ पेट्री व्यंजन रखें। एक ऑटोक्लेव्ड टूथपिक का उपयोग करके, मायसेलियम मार्जिन से पांच छोटे हाइपहे टुकड़ों को पुनः प्राप्त करें और उन्हें ऑटोक्लेव्ड चावल के दानों वाली ट्यूब में टीका लगाएं।
      नोट: ट्यूब के विभिन्न बिंदुओं और गहराई पर हाइपहे को टीका लगाना गारंटी देता है कि आइसोलेट कम समय में बिना छिलके वाले चावल के दानों को उपनिवेशित करता है।
    3. 14 दिनों के लिए 25-27 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। अनाज को अलग-अलग रखने के लिए हर 3 दिनों में भंवर करके ट्यूबों को हिलाएं।
    4. चावल के दानों में फंगल वृद्धि को देखने के बाद, कागज पर नमी को अवशोषित करने के लिए फिल्टर पेपर के साथ पंक्तिबद्ध एक ऑटोक्लेव्ड पेट्री डिश में अनाज वितरित करें ताकि अनाज सूख सकें। 2-3 दिनों के लिए 25-27 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें।
    5. नीचे 1/3 सिलिका जेल और सिलिका के ऊपर 1/3 ग्लास ऊन के साथ क्रायोट्यूब तैयार करें। अंत में, चावल के दानों में से 1/3 को उगाए गए कवक मायसेलियम के साथ वितरित करें। 24 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. 24 घंटे के बाद, विधि की समय सीमाओं को देखते हुए, जब तक आवश्यक हो, तब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोट्यूब स्टोर करें।
  3. क्रायोप्रोटेक्टेंट का उपयोग करके वर्मीक्यूलाइट में क्रायोप्रिजर्वेशन (>1 वर्ष)18
    1. आसुत जल में 0.2% खमीर निकालने और 2% ग्लूकोज से बना एक तरल संस्कृति माध्यम तैयार करें। पीएच को 5 पर समायोजित करें और इसे आटोक्लेव करें।
    2. एक स्क्रू कैप के साथ क्रायोट्यूब में 0.2 ग्राम वर्मीक्यूलाइट (ठीक ग्रैनुलोमेट्री का उपयोग करें) वितरित करें और उन्हें आटोक्लेव करें। वर्मीक्यूलाइट युक्त क्रायोट्यूब में 0.8 एमएल ऑटोक्लेव्ड तरल माध्यम जोड़ें।
    3. एक लामिना का प्रवाह हुड में, 7-14 दिनों के लिए पीडीए (39 ग्राम / एल) में पहले से ही उगाए गए शुद्ध आइसोलेट्स के साथ पेट्री व्यंजन रखें। एक ऑटोक्लेव्ड टूथपिक का उपयोग करके, मायसेलियम मार्जिन से तीन से पांच हाइपहे टुकड़ों को पुनः प्राप्त करें और वर्मीक्यूलाइट + तरल संस्कृति माध्यम युक्त ट्यूब के साथ टीका लगाएं। संबंधित आइसोलेट कोड के साथ क्रायोट्यूब की पहचान करना याद रखें।
      नोट: क्रायोट्यूब के विभिन्न बिंदुओं और गहराई में हाइपहे को टीका लगाना गारंटी देता है कि आइसोलेट कम समय में वर्मीक्यूलाइट का उपनिवेश करता है।
    4. क्रायोट्यूब को अंधेरे में 25-27 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि अधिकांश वर्मीक्यूलाइट अनाज का उपनिवेशण नहीं देखा जा सकता है, जिसमें आमतौर पर लगभग 14 दिन लगते हैं।
    5. आसुत जल में 5% ग्लिसरॉल और 5% ट्रेहलोस से बना क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान तैयार करें और इसे आटोक्लेव करें। उपयोग करने से पहले घोल को ठंडा होने दें।
    6. क्रायोट्यूब में वर्मीक्यूलाइट को संबंधित फंगल आइसोलेट द्वारा उपनिवेशित करने के बाद, प्रत्येक ट्यूब में क्रायोप्रोटेक्टेंट के 0.4 एमएल वितरित करें और क्रायोट्यूब को 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रशीतित रखें। बाद में, विधि की समय सीमाओं को देखते हुए, जब तक आवश्यक हो तब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोट्यूब बनाए रखें।

4. फिलामेंटस कवक (कॉलोनी आकृति विज्ञान) के मैक्रोमोर्फोलॉजिकल लक्षण वर्णन

  1. 7-14 दिनों के लिए 39 ग्राम / एल पीडीए के साथ प्रत्येक पेट्री डिश में उगाए गए मायसेलियम का एक फोटोग्राफिक रजिस्टर बनाए रखें। कॉलोनी के दोनों किनारों को पंजीकृत करना याद रखें, ऊपरी और नीचे (रिवर्स)। यदि व्यंजन धारा 6 में आसानी से उपयोग किए जा रहे हैं या बनाए नहीं रखा जा रहा है, तो बेहतर फ़ोटो प्राप्त करने के लिए उनकी तस्वीर खींचते समय व्यंजन खोलें।
  2. यदि कॉलोनी आकृति विज्ञान पर मात्रात्मक डेटा में रुचि रखते हैं, तो उपसंस्कृति आइसोलेट्स की प्रतिकृति बनाती है और उन्हें एक ही बढ़ती परिस्थितियों में बनाए रखती है और कॉलोनी व्यास को पंजीकृत करने और विकास दर (आमतौर पर मिमी /
    नोट: अधिक परिष्कृत मात्रात्मक परिणाम19 की तुलना के लिए संस्कृति मीडिया के विभिन्न प्रकार का उपयोग करके और डेटा का इलाज करने के लिए सांख्यिकी उपकरण पर विचार करके प्राप्त किया जा सकता है.
  3. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत कालोनियों का निरीक्षण करें और साथ ही आवर्धन में रूपात्मक विशेषताओं और फोटोग्राफ की पहचान करें। उनके मैक्रोमोर्फोलॉजिकल विशेषताओं के अनुसार कालोनियों का मूल्यांकन करें, जैसा कि परिणाम अनुभाग में विस्तृत है। मैक्रोमोर्फोलॉजी को आणविक और/या रूपात्मक पहचान से वर्गीकृत करने और संबंधित करने में मदद करने के लिए विविध ग्रंथ सूची स्रोतों से परामर्श करें।

5. फिलामेंटस कवक (हाइफल आकृति विज्ञान) के माइक्रोमोर्फोलॉजिकल लक्षण वर्णन

नोट: माइक्रोमोर्फोलॉजिकल तकनीकों की तुलना चर्चा अनुभाग में की जाती है, उनके संभावित उपयोगों और नुकसान पर विचार करते हुए।

  1. 7-14 दिनों के लिए 39 ग्राम / एल पीडीए के साथ पेट्री डिश पर आइसोलेट्स बढ़ाएं। ख्यात आर्किड mycorrhizal कवक का मूल्यांकन करने के लिए, 3-7 दिनों19 के लिए 17 ग्राम / एल मकई भोजन अगर (सीएमए; या एक और पोषक तत्व सीमित माध्यम) पर अलग बढ़ने.
  2. टीज़ माउंट
    1. एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर काम. एक साफ कांच स्लाइड पर एक चुना दाग (5.5 कदम) की एक बूंद रखें.
    2. एक आटोक्लेव टूथपिक या किसी अन्य बाँझ सामग्री का उपयोग करके, ध्यान से उगाए गए आइसोलेट से कुछ हाइप को हटा दें और उन्हें दाग की बूंद में रखें। एक coverslip प्लेस (अधिमानतः 45 डिग्री के एक प्रारंभिक कोण पर हवा बुलबुले से बचने के लिए) और एक प्रकाश खुर्दबीन के तहत विश्लेषण.
  3. चिपकने वाला टेप माउंट
    नोट: इस तकनीक को आमतौर पर फंगल संस्कृतियों में लागू किया जाता है ताकि आसानी से धारा 6 में उपयोग किया जा सके या बनाए नहीं रखा जा सके, क्योंकि चिपकने वाला टेप आटोक्लेव नहीं किया जा सकता है, और विधि को निष्पादित करने के बाद संदूषण हो सकता है।
    1. एक साफ कांच स्लाइड पर एक चुना दाग (5.5 कदम) की एक बूंद रखें. पारदर्शी चिपकने वाली टेप की एक पट्टी को एक आकार में काटें जो ग्लास स्लाइड और केंद्रीय दाग ड्रॉप को अच्छी तरह से फिट करता है।
    2. पट्टी की चिपचिपी सतह को मायसेलियम सतह पर निर्देशित करें। दबाएं नहीं, और उनमें से बहुत से चिपके बिना कुछ हाइप इकट्ठा करने का प्रयास करें।
    3. टेप को ग्लास स्लाइड पर चिपका दें, यह सुनिश्चित करें कि दाग एकत्रित हाइपहे के संपर्क में है। टेप के ऊपर पानी की एक बूंद प्लेस और एक coverslip जगह. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड का विश्लेषण करें।
  4. फिलामेंटस कवक की स्लाइड संस्कृति20
    1. एक बड़े पेट्री डिश (>9 सेमी व्यास, अधिमानतः) के अंदर, जगह: निचले हिस्से में फिल्टर पेपर, एक यू-आकार का ग्लास रॉड या एक अनुकूलन (उद्देश्य ग्लास स्लाइड के लिए ऊंचाई प्रदान करना है), एक ग्लास स्लाइड, और दो कवरस्लिप। उच्च पेट्री व्यंजन हेरफेर की सुविधा प्रदान करते हैं। पेट्री डिश के इन किटों को ऑटोक्लेव करें, प्रत्येक अलग के लिए एक।
    2. 39 ग्राम / एल पीडीए या 17 ग्राम / एल सीएमए की एक छोटी मात्रा तैयार करें, 10 ग्राम / एल बैक्टीरियोलॉजिकल अगर जोड़ें, और आटोक्लेव (एक पेट्री डिश के लिए मात्रा 30 से अधिक आइसोलेट्स के लिए पर्याप्त है)। स्लाइड संस्कृति में उपयोग की जाने वाली संस्कृति मीडिया सामान्य मीडिया की तुलना में कठिन होनी चाहिए। आटोक्लेव आसुत जल के 100 एमएल।
    3. एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर काम. पेट्री डिश में तरल माध्यम रखें, लगभग 0.5 सेमी ऊंची परत का उत्पादन करें। माध्यम को जमने दें। एक बार ठोस, आयाम में 1 सेमी x 1 सेमी हैं कि माध्यम के वर्गों में कटौती करने के लिए एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करें.
    4. एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर पेट्री डिश किट खोलें और पकवान के अंदर autoclaved सामग्री को व्यवस्थित करने के लिए flamed संदंश का उपयोग करें. सामग्री को क्रमांकित क्रम में व्यवस्थित करें, जैसा कि चित्र 2A में देखा गया है, कांच की स्लाइड पर संस्कृति माध्यम का एक वर्ग रखकर। माध्यम पर coverslip रखने से पहले, 5.4.5 कदम के लिए आगे बढ़ने.
    5. एक अलग से कुछ हाइपहे को पुनः प्राप्त करने के लिए एक ऑटोक्लेव्ड टूथपिक का उपयोग करें और ग्लास स्लाइड पर रखे माध्यम के चार पार्श्व चेहरों को ध्यान से रगड़ें। लौ संदंश का उपयोग मध्यम वर्ग पर एक autoclaved coverslip रखें.
    6. एक नम कक्ष बनाने के लिए, फिल्टर पेपर में autoclaved पानी जगह के लिए एक बाँझ विंदुक टिप का प्रयोग करें. अधिक मात्रा में पानी रखे बिना कागज को संतृप्त करने के लिए एक मात्रा का उपयोग करें। क्लिंग फिल्म के साथ पेट्री डिश सील और संबंधित अलग कोड के साथ यह पहचान. 3-7 दिनों के लिए 25-27 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में व्यंजन बनाए रखें।
    7. ग्लास स्लाइड और कवरस्लिप में हाइपहे वृद्धि का मूल्यांकन करें। प्रत्येक स्लाइड कल्चर किट से दो स्लाइड का उत्पादन किया जाता है, एक हाइपहे के साथ ग्लास स्लाइड और ऑटोक्लेव्ड कवरस्लिप का उपयोग करके, दूसरा हाइपहे और दूसरे ग्लास स्लाइड के साथ कवरस्लिप का उपयोग करके।
    8. हाइफल विकास मनाया जाता है के बाद, ध्यान से कांच स्लाइड (चित्रा 2 बी) से माध्यम के वर्ग को अलग करें, एक चुने हुए दाग (चरण 5.5) का उपयोग करके दो स्लाइड्स माउंट करें, और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत विश्लेषण करें। स्लाइड पर अलग कोड की पहचान करना याद रखें। अर्ध-स्थायी स्लाइड का उत्पादन करने के लिए, स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप को सील करें।
    9. स्थायी स्लाइड का उत्पादन करने के लिए, धुंधला होने के बाद पालन किए गए हाइपहे से डाई को सावधानीपूर्वक धो लें और स्लाइड को सूखने दें। तेजी से बढ़ते माध्यम के साथ माउंट करें (विवरण के लिए, पेना-पासोस एट अल.10 पढ़ें)।
      नोट: इस तकनीक के साथ एक स्थायी स्लाइड बनाने का दोष यह है कि कांच का पालन नहीं करने वाले बीजाणुओं और संरचनाओं को धोया जा सकता है।
  5. धुंधला हो जाना तरीके और हाइपहे अवलोकन
    1. लैक्टोफेनॉल कॉटन ब्लू (एलपीसीबी)21: लैक्टिक एसिड के 20 एमएल, ग्लिसरॉल के 40 एमएल और आसुत जल के 20 एमएल जोड़ें। इस घोल में 20 ग्राम फिनोल क्रिस्टल को धीरे से गर्म करके घोलें। 0.05 ग्राम मिथाइल ब्लू (कपास नीला, या 1% जलीय घोल का 2 एमएल) भंग करें। LPCB को पहले से तैयार करके भी आसानी से खरीदा जा सकता है।
      चेतावनी: फिनोल अत्यधिक विषाक्त और अस्थिर है; इसे विशेष रूप से एक धूआं हुड के अंदर हेरफेर करें और दस्ताने पहनें।
    2. टोलुइडीन ब्लू ओ10 (टीबीओ): 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीएच 6.8) में 0.05% टीबीओ तैयार करें।
    3. कांगो लाल22,23,24: आसुत जल में 1% कांगो लाल का घोल तैयार करें और इसे छान लें। 5-10 मिनट के लिए सेते हैं. इस डाई भी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी25 के लिए लागू किया जा सकता है.
    4. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत फंगल हाइपहे का अवलोकन और फोटोग्राफ करते समय, संरचनाओं की पहचान करने में मदद करने के लिए विभिन्न ग्रंथ सूची स्रोतों से परामर्श करें (चर्चा की जांच करें)।

Figure 2
चित्रा 2: फिलामेंटस कवक की स्लाइड संस्कृति के लिए प्रक्रियाएं । (ए) स्लाइड कल्चर किट का योजनाबद्ध विन्यास, जहां संख्याएं तत्वों की व्यवस्था के क्रम को इंगित करती हैं। (बी) हाइफल विकास के बाद संस्कृति माध्यम के वर्ग को अलग करना ग्लास स्लाइड और कवरस्लिप में मनाया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

6. फंगल आइसोलेट्स से कुल डीएनए निष्कर्षण (संशोधनों के साथ घर का प्रोटोकॉल26 27)

नोट: इस खंड में उपयोग की जाने वाली प्रत्येक सामग्री, समाधान और अभिकर्मक बाँझ होना चाहिए। जिन्हें पहले से निष्फल नहीं खरीदा जा सकता है, उन्हें 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव किया जाना चाहिए। पूरे प्रोटोकॉल के दौरान दस्ताने पहनें और एक धूआं हुड के अंदर कुछ चरणों का प्रदर्शन.

  1. निष्कर्षण बफर तैयार करें: 1% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस), 250 मिमी एनएसीएल, 200 मिमी ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0), और 25 मिमी एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए)। शुद्ध आइसोलेट्स को 39-7 दिनों के लिए 14 ग्राम/एल पीडीए में उगाएं।
  2. ध्यान से एक स्पैटुला या एक चम्मच का उपयोग करके एक अलग से माइसेलियम को परिमार्जन करें और टुकड़ों को एक ऑटोक्लेव्ड मोर्टार में स्थानांतरित करें, संस्कृति माध्यम को हाइपहे कुल के साथ स्थानांतरित करने से बचें। एक चीनी मिट्टी के बरतन मूसल का उपयोग करके, माइसेलियम को तरल नाइट्रोजन के साथ एक महीन पाउडर में पीस लें। मायसेलियम को जमीन पर पिघलने न दें, इससे बचने के लिए नाइट्रोजन मिलाएं।
  3. 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में निष्कर्षण बफर के 1 एमएल जोड़ें और 1.5 एमएल निशान तक जमीन का नमूना रखें। धीरे homogenize करने के लिए ट्यूबों की सामग्री आंदोलन.
  4. 5 एस के लिए एक भंवर में ट्यूबों को उत्तेजित करें और उन्हें 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोब्लॉक में रखें। ध्यान से हर 7-10 मिनट उलटा द्वारा सामग्री homogenize.
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें। बेहतर चरण से 800 माइक्रोन को एक नई 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, ट्यूबों में फिनोल के 800 माइक्रोन जोड़ें, और उलटा द्वारा सामग्री को मिलाएं।
    चेतावनी: फिनोल एक अत्यधिक विषाक्त और अस्थिर अभिकर्मक है; यह एरिथेमा, गैंग्रीन और ऊतक परिगलन का कारण बन सकता है। जब साँस ली जाती है, तो यह डिस्पेनिया और खांसी का कारण बन सकता है। प्रणालीगत अवशोषण यकृत, गुर्दे और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को नुकसान पहुंचा सकता है। एक धूआं हुड के अंदर विशेष रूप से फिनोल में हेरफेर करें और दस्ताने पहनें।
    नोट: अगले चरण से, दस्ताने का उपयोग करें और एक धूआं हुड के अंदर प्रोटोकॉल का संचालन करें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें और बेहतर चरण से 800 माइक्रोन को एक नई 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, ध्यान से अवर चरण सामग्री के हस्तांतरण से बचें।
  7. ट्यूबों में फिनोल के 400 माइक्रोन और क्लोरोफॉर्म के 400 माइक्रोन जोड़ें और उलटा द्वारा सामग्री को मिलाएं। उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र.
    चेतावनी: क्लोरोफॉर्म एक अत्यधिक विषाक्त और अस्थिर अभिकर्मक है; यह त्वचा के संपर्क में आने पर जलन और चोट का कारण बन सकता है, और यदि साँस ली जाती है, तो केंद्रीय तंत्रिका और कार्डियोरेस्पिरेटरी सिस्टम, यकृत और गुर्दे को प्रभावित करता है। एक धूआं हुड के अंदर विशेष रूप से क्लोरोफॉर्म में हेरफेर करें और दस्ताने पहनें।
  8. बेहतर चरण से 800 माइक्रोन या उससे कम को एक नई 2 एमएल ट्यूब में पुन: प्राप्त करें। क्लोरोफॉर्म के 800 माइक्रोन जोड़ें, उलटा द्वारा सामग्री मिलाएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
    नोट: इस चरण में, अवर चरण से कोई अवशेष नई ट्यूबों में स्थानांतरित नहीं किया जाना चाहिए। इस प्रकार, बेहतर चरण को स्वस्थ करते समय अतिरिक्त सावधानी बरतें।
  9. बेहतर चरण से 600-800 माइक्रोन को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और आइसोप्रोपेनॉल के 450 माइक्रोन जोड़ें। उलटा द्वारा सामग्री मिलाएं और 5 मिन के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें और माइक्रोपिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें। ट्यूब के तल पर जमा गोली को त्यागने के लिए नहीं सावधान रहें.
  11. 5 मिन के लिए 80% इथेनॉल और अपकेंद्रित्र के 500 माइक्रोन जोड़ें। गोली स्पष्ट नहीं होने की स्थिति में दो बार दोहराएं।
  12. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके इथेनॉल निकालें और 30-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गोली को सूखें। विआयनीकृत पानी के 30-50 माइक्रोन जोड़ें, एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके गोली को हटा दें।
  13. पूर्ण डीएनए क्षालन के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को बनाए रखें और -20 डिग्री सेल्सियस पर सामग्री को फ्रीज करें।

7. मेटाबारकोडिंग पद्धति (वाणिज्यिक किट) के लिए पौधे के अंगों से कुल डीएनए निष्कर्षण

नोट: निम्नलिखित पद्धति के लिए, मिट्टी डीएनए निष्कर्षण किट के रूप में सामग्री की तालिका में इंगित वाणिज्यिक किट खरीदना आवश्यक है। इस खंड में उपयोग की जाने वाली प्रत्येक सामग्री, समाधान और अभिकर्मक बाँझ होना चाहिए। जिन्हें पहले से निष्फल नहीं खरीदा जा सकता है, उन्हें 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव किया जाना चाहिए। यह अत्यधिक पूरे प्रोटोकॉल के दौरान दस्ताने पहनने के लिए सिफारिश की है, और कदम एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर आयोजित किया जा सकता है. वर्णित प्रोटोकॉल निर्माता द्वारा विस्तृत प्रोटोकॉल से डी सूजा एट अल 12 से संशोधित किया गया है।

  1. चीनी मिट्टी के बरतन मूसल और मोर्टार का उपयोग करके, तरल नाइट्रोजन में चरण 1.2 के बाद एकत्र जड़ों को पीसें, नमूनों को एक महीन पाउडर में कम करें। जमीन के नमूनों से पावरबीड ट्यूबों में 0.3 ग्राम जोड़ें और धीरे से समरूप बनाने के लिए आंदोलन करें।
  2. PowerBead ट्यूबों के लिए समाधान C1 (किट में शामिल) के 60 माइक्रोन जोड़ें और उलटा द्वारा सामग्री मिश्रण. एक ऊतक homogenizer और सेल lyser (सामग्री की तालिका) का प्रयोग, एक पर्याप्त समर्थन करने के लिए मजबूती से ट्यूबों टाई, भंवर के लिए समर्थन जोड़ी, और 10-20 मिनट के लिए अधिकतम गति पर उपकरण शुरू.
    नोट: यदि C1 समाधान अवक्षेपित है, तो इसे पूर्ण विघटन तक 60 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
  3. 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 10,000 x ग्राम पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला के 500 माइक्रोन को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। हस्तांतरित सामग्री कण हो सकती है।
  4. ट्यूबों में समाधान सी 2 के 250 माइक्रोन जोड़ें और 5 एस के लिए एक भंवर में आंदोलन करें। 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और फिर 25 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करते हैं।
  5. गोली से बचने के लिए, नए 2 एमएल ट्यूबों के लिए सतह पर तैरनेवाला के 600 माइक्रोन से अधिक स्थानांतरण। समाधान C3 के 200 माइक्रोन जोड़ें और 5 s के लिए एक भंवर पर आंदोलन करें।
  6. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और फिर 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करते हैं। इस चरण में, सुनिश्चित करें कि सतह पर तैरनेवाला कण नहीं है।
  7. गोली से बचने के लिए, नए 2 एमएल ट्यूबों के लिए सतह पर तैरनेवाला के 750 माइक्रोन से अधिक स्थानांतरण. समाधान C4 को अच्छी तरह से समरूप करें, सतह पर तैरनेवाला में समाधान C4 के 1,100 μL जोड़ें, और 5 s के लिए एक भंवर में आंदोलन करें।
  8. एमबी स्पिन कॉलम में ट्यूबों की सामग्री से 675 माइक्रोन लोड करें, फिल्टर पर, और 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। तरल सामग्री को त्यागें।
  9. पिछले चरण को दो बार दोहराएं जब तक कि प्रत्येक ट्यूब की सभी सामग्री संसाधित न हो जाए। फिर, ट्यूब के बेहतर स्तंभ पर मौजूद फिल्टर के केंद्र में समाधान सी 5 के 500 माइक्रोन जोड़ें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
  10. पिछले चरण के समान परिस्थितियों में तरल सामग्री और अपकेंद्रित्र को फिर से त्यागें। ध्यान से नए 2 एमएल microcentrifuge ट्यूबों के लिए एमबी स्पिन कॉलम के बेहतर स्तंभ हस्तांतरण, स्तंभ में किसी भी तरल सामग्री टपकने से बचने.
  11. फिल्टर के केंद्र में समाधान सी 6 के 85-100 माइक्रोन जोड़ें और 1 मिनट प्रतीक्षा करें। 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और एमबी स्पिन कॉलम त्यागें। ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

8. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में डीएनए मात्रा का ठहराव (सामग्री की तालिका की जांच करें)

  1. संकेतित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके, सॉफ़्टवेयर खोलें। विकल्प न्यूक्लिक एसिड का चयन करें, विकल्प डीएनए चुनें, और एकाग्रता को ng/μL पर सेट करें।
  2. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर डिटेक्टर में विआयनीकृत पानी का 1 माइक्रोन जोड़ें और विकल्प का चयन करके कैलिब्रेट करें खाली. पढ़ने के बाद, नरम टिशू पेपर के साथ डिटेक्टर को धीरे से पोंछ लें।
  3. पढ़ने के लिए नमूने के अलग कोड के साथ फ़ील्ड नमूने का नाम दें और उपकरण डिटेक्टर में इसका 1 माइक्रोन रखें। विकल्प का चयन करें माप; परिणामों के साथ एक ग्राफ और एक तालिका उत्पन्न होती है।
  4. चरण 8.3 को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी नमूने पढ़ न लिए जाएं। रिकॉर्ड और विश्लेषण के लिए उत्पन्न परिणामों के साथ तालिका को सहेजने की अनुशंसा की जाती है: विकल्प का चयन करें रिपोर्ट और वह स्थान जहां .xml फ़ाइल सहेजी जाएगी।
  5. डिटेक्टर में विआयनीकृत पानी के 5 माइक्रोन जोड़ें, कई मिनट प्रतीक्षा करें, और धीरे से इसे नरम टिशू पेपर से पोंछ लें।

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Representative Results

अलगाव प्रोटोकॉल में, विचार पिछले धोने पर इस्तेमाल पानी से संदूषण है और संदूषण भी टीका टुकड़े के साथ पेट्री व्यंजन में पाया जाता है, विभिन्न कार्रवाई की जा सकती है, दूषित पदार्थ के प्रकार (तालिका 1) के आधार पर. इस प्रक्रिया को अत्यधिक स्पोरुलेटिंग फंगल दूषित पदार्थों के मामले में शुरुआत से दोहराया जाना चाहिए, जो त्वरित विकास और तीव्र-गुणा बैक्टीरिया भी पेश करते हैं, जो चुने हुए एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोधी हैं। इसके बजाय, यदि कवक संदूषक धीमी गति से विकास प्रस्तुत करता है या स्पोरुलेट नहीं करता है, तो प्रोटोकॉल के बाद के चरणों में इसे अलग करने से बचना संभव है। अंत में, बैक्टीरिया के उपभेदों के साथ संदूषण जो धीरे-धीरे गुणा करते हैं, उन्हें पीछे के चरणों में भी आसानी से बचा जा सकता है, विशेष रूप से शुद्धिकरण में, जब हाइपहे को पुन: प्राप्त किया जाता है।

पहले प्रस्तुत किए गए सभी मामलों में, आदर्श परिदृश्य अन्य नमूनों का उपयोग करके कीटाणुशोधन प्रक्रिया को फिर से कर रहा है और पौधे के टुकड़ों को एक संस्कृति माध्यम में स्थापित कर रहा है जो अन्य एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़ती है, कार्रवाई के व्यापक स्पेक्ट्रम के साथ, प्रतिरोधी बैक्टीरिया के मामलों में पहले व्यंजन दूषित करते हैं। हालांकि, नए नमूने एकत्र करने और माइकोहेटरोट्रॉफ़िक पौधों से अंग प्राप्त करने में शामिल कठिनाइयों को देखते हुए, कुछ मामलों को प्रोटोकॉल के पीछे के चरणों में सफलतापूर्वक हल किया जा सकता है, जैसा कि तालिका 1में प्रस्तुत किया गया है।

प्रदूषक संदूषक विशेषता संदूषण का संभावित परिणाम आवश्यक कार्रवाई
जीवाणु तीव्र गुणन ब्याज के एंडोफाइट्स के विकास का कुल या आंशिक निषेध शुरुआत से अलगाव को फिर से शुरू करें
धीमा गुणन ब्याज के एंडोफाइट के साथ बैक्टीरिया का अलगाव शुद्धिकरण के दौरान बैक्टीरिया कॉलोनियों से बचें
कवक जोरदार वृद्धि और/या अत्यधिक स्पोरुलेटिंग ब्याज के एंडोफाइट्स को अलग करना और/या शुद्ध करना असंभव बनाता है शुरुआत से अलगाव को फिर से शुरू करें
धीमी वृद्धि और/या गैर-स्पोरुलेटिंग गलती से दूषित पदार्थ का अलगाव दूषित पदार्थ के अलगाव से बचें

तालिका 1: एंडोफाइटिक कवक अलगाव, संदूषण के परिणाम और शमन प्रक्रियाओं की प्रक्रिया में संभावित दूषित पदार्थों का विवरण।

पीडीए माध्यम में अंग के टुकड़ों की स्थापना से 5 दिनों के बाद, टुकड़ों के इंटीरियर (चित्रा 3) से निकलने वाले फिलामेंटस कवक मायसेलिया के छोटे समूहों के विकास की कल्पना करना संभव है। प्रत्येक mycelial morphotype अलगाव प्रोटोकॉल के अंत तक एक कवक अलग में परिणाम चाहिए, विचार है कि उनमें से प्रत्येक शुद्धि के लिए एए माध्यम के साथ एक नए पेट्री डिश में धारीदार होना चाहिए. यह सलाह दी जाती है कि पूरे अलगाव प्रोटोकॉल को पूरा करने से पहले टुकड़ा स्थापना से मूल व्यंजन को त्याग नहीं दिया जाता है। वे 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रशीतित रखा जा सकता है जब तक शुद्ध कालोनियों प्राप्त कर रहे हैं. इसके अलावा, प्रोटोकॉल के इस हिस्से के बारे में, अगर विश्लेषण ऊतक के नमूनों के प्रतिशत का मूल्यांकन करने में बहुत मददगार हो सकता है जिसके परिणामस्वरूप कुल स्थापित नमूनों के बीच पृथक कवक होता है।

Figure 3
चित्रा 3: आलू डेक्सट्रोज अगर में फंगल अलगाव के लिए रूट टुकड़े। "एक माइकोहेटरोट्रॉफ़िक आर्किड के जड़ के टुकड़ों से बढ़ने वाली संस्कृति योग्य एंडोफाइटिक कवक, सीए के बाद 5 दिनों का इनक्यूबेशन"। प्रत्येक पेट्री डिश (ए, बी, और सी) में पांच रूट टुकड़े होते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पृथक शुद्धि के लिए एए व्यंजनों के इनक्यूबेशन के बाद 3 दिनों के बाद, मिनट हाइफल कॉलोनियों, लगभग अगोचर, एए माध्यम में स्ट्राई से उगाया जाना चाहिए था। इस स्तर पर, यदि अलगाव व्यंजनों में धीमी गति से बढ़ने वाले बैक्टीरिया से कोई संदूषण था, तो संभव है कि इन जीवाणुओं को चयनित फंगल एंडोफाइट हाइप के साथ एए व्यंजनों में भी स्थानांतरित किया गया था। यदि ऐसा है, तो बैक्टीरिया को स्ट्रिया क्षेत्रों तक सीमित कर दिया जाएगा, कवक की तुलना में थोड़ी वृद्धि के साथ, नए पीडीए व्यंजनों के लिए पूरी तरह से ब्याज के कवक की पुनरावृत्ति की अनुमति देता है।

पीडीए व्यंजनों में शुद्ध कवक आइसोलेट्स के टीकाकरण के 7-14 दिनों के दौरान, शुद्ध कॉलोनी को सेंट्रीफ्यूजली (डिश के केंद्र से इसकी परिधि तक) विकसित करना चाहिए, जिससे एकमात्र गोलाकार मायसेलियम (चित्र 4)का निर्माण होता है। इस चरण में संभावित संदूषण आसानी से पहचाने जाते हैं, क्योंकि वे इसके विकास, रूप, पहलू, रंग, माध्यम में वर्णक उत्पादन आदि से संबंधित कॉलोनी एकरूपता से काफी समझौता करते हैं। मान लें कि प्राप्त अंतिम कालोनियों शुद्ध नहीं हैं, शुरू में अंग के टुकड़ों से उगाए गए कवक को फिर से शुद्धि प्रक्रियाओं के लिए प्रस्तुत किया जाना चाहिए, पट्टी और उपसंस्कृति (चरण 2.4) द्वारा। शुरू में स्थापित अंगों या विषम संस्कृतियों वाले अंतिम अलगाव व्यंजनों से आइसोलेट्स को पुनः प्राप्त करना संभव है।

Figure 4
चित्रा 4: शुद्ध कवक आइसोलेट्स का प्रतिनिधित्व, पीडीए संस्कृति माध्यम में 7-14 दिनों के लिए उगाया जाता है। पहले और तीसरे कॉलम (ए, सी, ई, जी, आई और के) में, पंजीकृत कॉलोनियों को ऊपरी तरफ से देखा जाता है; दूसरे और चौथे कॉलम (बी, डी, एफ, एच, जे, और एल) क्रमशः एक ही कॉलोनियों को प्रस्तुत करते हैं, जो क्रमशः नीचे से देखे जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: पीडीए संस्कृति माध्यम में 7-14 दिनों के लिए उगाए गए अशुद्ध कवक आइसोलेट्स का प्रतिनिधित्व। पहले कॉलम (ए, डी, और जी) में, ऊपरी तरफ से उपनिवेशों का एक सामान्य दृश्य देखा जाता है; दूसरा कॉलम (बी, ई, और एफ) कॉलोनियों को विस्तार से दिखाता है; तीसरा कॉलम (सी, एफ, और आई) नीचे से कॉलोनियों को दिखाता है। संख्याएं प्रत्येक डिश में मौजूद विभिन्न फंगल मॉर्फोटाइप का प्रतिनिधित्व करती हैं, और लाइनें विभिन्न फंगल आइसोलेट्स के बीच एक सूक्ष्म परिसीमन का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

आइसोलेट्स का संरक्षण एक एकमात्र भंडारण विधि का उपयोग करके नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि प्रत्येक कवक वर्णित प्रत्येक विधि के लिए कम या ज्यादा संवेदनशीलता पेश कर सकता है। प्रत्येक फंगल आइसोलेट के लिए कम से कम दो प्रकार के स्टोरेज का चयन करना अत्यधिक उचित है, जिससे इसे संरक्षित करने में सफलता की अधिक संभावना की गारंटी मिलती है। हम इस बात पर प्रकाश डालते हैं कि कैस्टेलानी या खनिज तेल में संरक्षित कवक की अव्यवहार्यता 6 महीने या उससे कम समय के बाद होने की उम्मीद है। शोधकर्ताओं को विचार करना चाहिए कि क्या ये एकमात्र संरक्षण विधियां हैं, जिन्हें चुना गया है, ताकि आइसोलेट्स के संभावित अप्रत्याशित नुकसान से बचा जा सके। इस सीमित अवधि का विस्तार करने के लिए, फंगल आइसोलेट्स को पीडीए माध्यम (39 ग्राम / एल) में 2-3 सप्ताह के लिए उगाकर और फिर उन्हें फिर से संग्रहीत करके पुनः सक्रिय करना संभव है। भंडारण की अवधि के बाद, यह उम्मीद की जाती है कि आइसोलेट्स इसके संरक्षण से पहले देखी गई वृद्धि दर की तुलना में धीमी वृद्धि पेश करते हैं, और कम जोरदार पहलुओं (यानी, कम घने, रंग में भिन्न) के साथ उपनिवेश होते हैं। पोषक तत्वों से भरपूर संस्कृति माध्यम में कुछ बार उपसंस्कृति करना ऐसी विशेषताओं को फिर से स्थापित करने के लिए पर्याप्त है।

अलगाव प्रक्रिया में प्राप्त उपनिवेशों के मैक्रोमोर्फोलॉजी का मूल्यांकन करते समय, गुणात्मक डेटा एकत्र किया जाना चाहिए, जितना संभव हो उतनी विशेषताओं पर विचार करना: (ए) कॉलोनी का रंग (ऊपर और नीचे), जिसका विश्लेषण मुद्रित रंग गाइड (जैसे, रेनर28, कोर्नरअप और वांशर29, रिडवे30) का उपयोग करके किया जा सकता है; (बी) कॉलोनी अस्पष्टता: पारदर्शी, अपारदर्शी, पारदर्शी; (ग) माध्यम31 में विसारक वर्णक (उपस्थिति/अनुपस्थिति और रंग); (डी)एक्सयूडेट्स 31 (उपस्थिति/अनुपस्थिति, रंग, सामान्य उपस्थिति); (ई) मैक्रोस्कोपिक संरचनाएं31 (उपस्थिति / अनुपस्थिति, प्रकार, और उपस्थिति; जैसे, स्क्लेरोटिया, पाइकनिडिया); (च) हवाई और जलमग्न मायसेलिया 19,32,21 (उपस्थिति/अनुपस्थिति, उपस्थिति-कम या प्रचुर मात्रा में); (छ) मार्जिन उपस्थिति19 (रंग, रूप, एकरूपता - जलमग्न या हवाई); और (ज) कॉलोनी स्थलाकृति (ढेर, झुर्रीदार, crateriform, फ्लैट, आदि), सामान्य उपस्थिति और बनावट - कपास, मखमली, ख़स्ता, ऊनी, वसामय (मोमी), चमकदार, चॉकलेट, घिनौना, चमड़े काँटेदार, आदि19,21.

Figure 6
चित्रा 6: मैक्रो- और मायकोहेटेरोट्रॉफ़िक ऑर्किड वुलस्क्लेगेलिया एफिला से अलग एक अज्ञात कवक की माइक्रोमोर्फोलॉजी। (ए) कॉलोनी के ऊपरी और (बी) निचले पहलुओं, (सी) हवाई हाइपहे का प्रवर्धित दृश्य (जैसा कि एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप में देखा गया है)। हाइपहे (डी) की माइक्रोमोर्फोलॉजी, बिना दाग के और (ई) एलपीसीबी और (एफ) टीबीओ के साथ दागदार। संक्षिप्ताक्षर: c = conidiophore, p = phialide, s = सेप्टम। स्केल बार: ए, बी = 2 सेमी; सी = 2 मिमी; डीएफ = 20 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 6 में, वर्णित पद्धति को लागू करते हुए, माइकोहेटेरोट्रॉफ़िक ऑर्किड Wullschlaegelia aphylla की फ्यूसीफॉर्म जड़ों से अलग एक कॉलोनी दिखाई गई है। कॉलोनी ऊपरी तरफ सफेद से भूरे रंग की होती है (चित्र 6A) और निचले चेहरे पर भूरी होती है (चित्र 6B)। यह अपारदर्शी है, जिसमें न तो माध्यम में विसारक वर्णक हैं और न ही बाहर निकलते हैं। मायसेलिया हवाई और प्रचुर मात्रा में हैं, मार्जिन अनियमित और हवाई हैं, और कॉलोनी में एक मखमली बनावट और एक झुर्रीदार स्थलाकृति (चित्रा 6 ए) है। मैक्रोस्कोपिक संरचनाएं अनुपस्थित हैं।

स्लाइड संस्कृति विधि पारंपरिक और लाभप्रद है, और हालांकि समय लेने वाली, स्थायी स्लाइड है कि बाद में जांच की जा सकती है का उत्पादन करने के लिए लागू किया जा सकता है. यहां प्रस्तुत विभिन्न रंगों का उपयोग महत्वपूर्ण संरचनाओं को विकसित करने के लिए किया जा सकता है, और उन्हें सबसे पर्याप्त इनक्यूबेशन समय निर्धारित करने के लिए नमूनों में परीक्षण की आवश्यकता होती है। कांगो लाल और टीबीओ सामान्य उद्देश्य के दाग हैं। कांगो लाल कुछ नाजुक संरचनाओं को प्रदर्शित करने के लिए पर्याप्त है (आगे पढ़ने: मैलोच22)। टीबीओ सेल सामग्री को फंगल सेल की दीवार (चित्रा 6 एफ) की तुलना में अधिक तीव्रता से दाग देता है। हालांकि पौधे संरचनाओं के लिए एक सामान्य डाई होने और फंगल माइक्रोस्कोपी में इतना आम नहीं है, टीबीओ में एक महत्वपूर्ण मेटाक्रोमैटिक संपत्ति33 है, जो अन्य अनुप्रयोगों का पक्ष लेती है, जैसे कि पौधे के ऊतकों में फंगल विश्लेषण10. एलपीसीबी फंगल विश्लेषण में एक विशाल रूप से लागू डाई है, हालांकि फिनोल के कारण सावधानी बरतने की मांग है। कपास नीला (पर्यायवाची: मिथाइल ब्लू) दाग है, लैक्टिक एसिड एक समाशोधन एजेंट है, और फिनोल एक हत्या एजेंट21 है। एलपीसीबी में चिटिन और एविंस बीजाणु दीवारों और अलंकरणों के लिए एक आत्मीयता है23,24. फंगल सेप्टा न तो एलपीसीबी (चित्रा 6ई) और न ही टीबीओ(चित्रा 6एफ)द्वारा दाग दिया जाता है, जिससे ऐसी संरचनाओं की पहचान की सुविधा मिलती है। दाग का आवेदन उन संरचनाओं को विकसित करने के लिए फायदेमंद है जो आसानी से नहीं देखे जाते हैं जब हाइपहे दाग नहीं होते हैं (चित्र 6डी)।

कवक और जड़ के नमूनों से डीएनए निष्कर्षण के लिए, तरल नाइट्रोजन में जमीन के नमूने की मात्रा निष्कर्षण बफर में जोड़ा जाना चाहिए, प्रोटोकॉल में संकेतित राशि से अधिक नहीं, सम्मान किया जाना चाहिए. हमें इस बात पर प्रकाश डालना चाहिए कि बड़ी मात्रा में संसाधित नमूना केवल बड़ी कमियों के बिना डीएनए की उच्च सांद्रता के प्रभाव का प्रतिनिधित्व नहीं करता है, क्योंकि यह अंतिम डीएनए गुणवत्ता से काफी समझौता कर सकता है। यह डीएनए शुद्धि के निम्नलिखित चरणों को संतृप्त करते समय होता है। इसके अलावा, डीएनए के साथ अंतिम समाधान में मौजूद पौधों या कवक (जैसे, पिगमेंट, सेकेंडरी मेटाबोलाइट्स) द्वारा उत्पादित ख्यात यौगिकों को केंद्रित करना, डीएनए की गुणवत्ता को कम करने और/या पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) को रोकने के लिए कार्य कर सकता है। एक और मुद्दा जो डीएनए की गुणवत्ता को काफी कम कर सकता है, वह फंगल मायसेलियम के साथ पूरी तरह से संस्कृति माध्यम को स्क्रैप कर रहा है और इसे पीस रहा है, जिसे दृढ़ता से बचा जाना चाहिए। निष्कर्षण प्रक्रिया (जैसे, फिनोल, एथिल अल्कोहल, एसडीएस) और अन्य पदार्थों (जैसे, फंगल पिगमेंट) से कुछ अभिकर्मक पीसीआर के साथ हस्तक्षेप करने वाले अवरोधक हो सकते हैं।

डीएनए सफाई चरणों में, फिनोल और क्लोरोफॉर्म का उपयोग करते समय, सतह पर तैरनेवाला को हमेशा कम अशुद्धियों के साथ चरण का प्रतिनिधित्व करना चाहिए, आमतौर पर सबसे स्पष्ट चरण को समझना चाहिए। इस तरह के एक चरण के दौरान, अवर चरण recorperated नहीं किया जाना चाहिए जब सतह पर तैरनेवाला है कि नई ट्यूबों को स्थानांतरित किया जाएगा. प्रोटोकॉल के अंत तक, गोली (डीएनए द्वारा गठित) सफेद रंग के लिए एक translucid (अत्यधिक वांछनीय) पेश करना चाहिए. सुखाने के चरण में, थर्मोब्लॉक में डीएनए को सुखाने के साथ आगे बढ़ना इथेनॉल को पूरी तरह से वाष्पित करने के लिए मौलिक है। 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के बाद, गोली को ट्यूबों में जोड़े गए जलीय घोल में पूरी तरह से एल्यूट किया जाना चाहिए, उसके बाद दिखाई नहीं दे रहा है। यदि क्षालन पूरा नहीं हुआ है, और डीएनए एकाग्रता आदर्श एकाग्रता के नीचे है, तो इसकी गुणवत्ता में महत्वपूर्ण नुकसान के बिना, समाधान को 12 घंटे अधिक के लिए प्रशीतित रखना संभव है।

सॉफ्टवेयर में डीएनए विश्लेषण एक तालिका उत्पन्न करता है, जैसा कि तालिका 2 में दर्शाया गया है, जहां डीएनए मात्रा और गुणवत्ता से संबंधित डेटा इंगित किया गया है। डीएनए की मात्रा का ठहराव एक नमूने के प्रति माइक्रोलीटर नैनोग्राम में न्यूक्लिक एसिड की एकाग्रता द्वारा दिया जाता है। पृथक कवक की आणविक पहचान को ध्यान में रखते हुए, डीएनए नमूनों में एकाग्रता में लगभग 200 एनजी / न्यूक्लिक एसिड की उच्च सांद्रता वाले नमूनों के मामलों में, नमूने से एक विभाज्य को पतला किया जाना चाहिए, पहले उल्लेख किए गए मूल्य के लिए एकाग्रता का अनुमान लगाया जाना चाहिए। अत्यधिक उच्च सांद्रता वाले नमूने, जैसे कि तालिका 2 में नमूने 1 और 2, समाधान में दूषित पदार्थों के कारण गलत पहचान का सुझाव दे सकते हैं। इस बीच, कम न्यूक्लिक एसिड सांद्रता वाले नमूने, जैसे कि संख्या 7 (तालिका 2), अभी भी पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रतिक्रियाओं में नमूना की अधिक मात्रा को लागू करने के लिए महत्वपूर्ण है। गुणवत्ता मापदंडों के संबंध में, यह संतोषजनक है कि भागफल 260/280 और 260/230 1.8 और 2.2 के बीच हैं, जैसा कि नमूने 3, 5 और 8 (तालिका 2) में दर्शाया गया है। नमूने है कि इस तरह के मूल्यों (बहुत नीचे या ऊपर किया जा रहा है) प्रस्तुत नए डीएनए निष्कर्षण के लिए प्रस्तुत किया जाना चाहिए, के रूप में तालिका 2 से नमूने 9 और 10 में संकेत दिया है. डीएनए की पर्याप्त मात्रा वाले नमूनों के मामलों में और न्यूनतम रूप से आदर्श गुणवत्ता सीमा से अधिक है, जैसा कि संख्या 4 और 6 (तालिका 2) में 260/280 और 260/230 मूल्यों द्वारा सुझाया गया है, कमजोर करना पीसीआर के लिए न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता को पर्याप्त बनाने के लिए सबसे फायदेमंद प्रक्रिया है और निष्कर्षण प्रक्रिया से अवशिष्ट अभिकर्मकों जैसे संभव अवरोधकों को पतला करना, नमूनों में।

नमूना न्यूक्लिक एसिड Conc. इकाई ए260 ए280 260/280 260/230 नमूना प्रकार
1 14491.7 एनजी/μL 289.833 141.175 2.05 1.8 डीएनए
2 13359.3 एनजी/μL 267.187 124.607 2.14 2.15 डीएनए
3 1137.6 एनजी/μL 22.751 10.574 2.15 2.13 डीएनए
4 1472.6 एनजी/μL 29.452 13.287 2.22 2.16 डीएनए
5 3464.8 एनजी/μL 69.295 33.329 2.08 1.88 डीएनए
6 1884.2 एनजी/μL 37.684 17.912 2.1 1.78 डीएनए
7 187.6 एनजी/μL 3.751 1.834 2.05 2.06 डीएनए
8 1580.3 एनजी/μL 31.607 15.281 2.07 1.98 डीएनए
9 923.3 एनजी/μL 18.466 9.196 2.01 1.37 डीएनए
10 2414.4 एनजी/μL 48.287 21.008 2.3 3.45 डीएनए

तालिका 2: एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में विश्लेषण किए गए फंगल डीएनए नमूनों से सॉफ्टवेयर में उत्पन्न परिणाम।

पृथक एंडोफाइटिक कवक से डीएनए नमूनों से अलग, मेटाबारकोडिंग विश्लेषण के लिए नमूनों में डीएनए एकाग्रता को उच्च गुणवत्ता और आणविक भार के साथ निकाले गए डीएनए अणुओं की भारी मात्रा में पेश करना चाहिए। नमूनों का मूल्यांकन अगारोज जेल में वैद्युतकणसंचलन द्वारा किया जाना चाहिए, अधिकतम अखंडता प्राप्त करना, जेल में बहुत कम या कोई धब्बा नहीं।

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Discussion

पौधों के नमूनों की सतही विघटन प्रस्तुत प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। अंतिम धोने से बूंदों के साथ पीडीए व्यंजनों में कोई संदूषण अत्यधिक वांछनीय नहीं है। बैक्टीरिया अक्सर अलगाव व्यंजनों में दूषित पदार्थों के रूप में मनाया जाता है, आमतौर पर हवाई स्पोरुलेटिंग कवक से अधिक, एंडोफाइटिक बैक्टीरिया को पौधे के ऊतकों 3,11 के भीतर भी आम मानते हैं। इस प्रकार, अंग के टुकड़े स्थापित करते समय संस्कृति माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा आवश्यक है। विभिन्न एंटीबायोटिक प्रकारों के संयोजन पर बेहतर परिणाम प्राप्त होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कार्रवाई का एक व्यापक स्पेक्ट्रम होता है। एक अन्य महत्वपूर्ण विचार कवक को अलग करने में आंतरिक पूर्वाग्रह है, क्योंकि पीडीए और एए का उपयोग अनिवार्य रूप से कुछ प्रजातियों का चयन करेगा और दूसरों को अपमानित करेगा। अन्य संस्कृति मीडिया के संयोजन पूर्वाग्रह को कम करसकते हैं, हालांकि इस तरह की सीमाओं को खत्म नहीं 9.

आम तौर पर, पेट्री डिश में बढ़ने के दौरान बीजाणुओं का उत्पादन करने वाले कवक संरक्षण प्रोटोकॉल में उच्च जीवित रहने की दर पेश करते हैं, या तो कम तापमान में या नहीं, और गैर-स्पोरुलेटिंग आइसोलेट्स कैस्टेलानी या खनिज तेल संरक्षण34,35,36 को सहन नहीं कर सकते हैं, इसलिए ऐसे मामलों में क्रायोप्रेज़र्वेशन विधि महत्वपूर्ण हो सकती है। इसके अतिरिक्त, कुछ आइसोलेट्स ठंड के प्रति संवेदनशील हो सकते हैं, और क्रायोप्रोटेक्टेंट्स के अलावा संरक्षण में सहायता करता है, जैसा कि वर्मीक्यूलाइट18 का उपयोग करके प्रस्तुत विधि में है। कॉलोनी और हाइफ़ल विशेषताएँ आइसोलेट्स को समान लक्षणों के साथ समूहित करने के लिए उपयोगी हो सकती हैं, जिससे सहजीवी अंकुरण उपचार में उपयोग के लिए चयन की सुविधा मिलती है (जैसा कि पेना-पासोस एट अल.10 द्वारा विस्तृत है)। ये विशेषताएं लागू होने वाले संरक्षण विधियों को चुनने में भी योगदान करती हैं, विशेष रूप से स्पोरुलेशन या इसकी अनुपस्थिति पर विचार करते हुए।

रूपात्मक रूप से आइसोलेट्स की विशेषता भी विशेष साहित्य में उपलब्ध रूपात्मक विवरणों में सुधार और पूरक है, खासकर जब आणविक लक्षण वर्णन से जुड़ा हो। कई आइसोलेट्स के साथ एक चुनौती होने के बावजूद, रूपात्मक रूप से कवक की विशेषता समय लेने वाली है और प्रकाशित आंकड़ों पर निर्भर करती है। यहां तक कि अगर केवल आणविक लक्षण वर्णन आयोजित करने की योजना बनाई है, तो भविष्य की पहचान प्रक्रियाओं में योगदान करने के लिए कॉलोनी उपस्थिति (मैक्रोमोर्फोलॉजी) के एक फोटोग्राफिक रजिस्टर को बनाए रखने और जब भी संभव हो इसे प्रकाशित करने की सलाह दी जाती है। उन व्यंजनों की तस्वीरें बनाए रखना जहां टुकड़े स्थापित किए गए हैं, अंतिम प्राप्त आइसोलेट्स और स्थापना व्यंजनों में बढ़ते हुए देखे गए मॉर्फोटाइप के बीच तुलना की अनुमति देने के लिए भी महत्वपूर्ण है। ऐसे मामले में, तुलना की गई कवक को उसी प्रकार के माध्यम में सुसंस्कृत किया जाना चाहिए। अतिरिक्त तरीके Currah एट अल.16 में आम आर्किड माइकोरिज़ल कवक का मूल्यांकन करने के लिए पाए जाते हैं, जैसे कि टैनिक एसिड माध्यम (टीएएम) पर संस्कृति एपुलोरिज़ा (टेलीमोर्फ: तुलस्नेला) और सेरेटोरिज़ा (टेलीमोर्फ: सेराटोबेसिडियम) पीढ़ी को अलग करने के लिए, और राइजोक्टोनिया कॉम्प्लेक्स से कवक के लक्षण वर्णन के लिए मोनिलोइड कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए सीएमए पर संस्कृति।

एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत फंगल हाइपहे का निरीक्षण करने के लिए विस्तृत तरीकों को ध्यान में रखते हुए, टीज़ माउंट और चिपकने वाला टेप माउंट स्लाइड संस्कृति की तुलना में तेज़ है, हालांकि बीजाणुओं का विश्लेषण करने और शाखा कोणों को मापने के लिए टीज़ माउंट विधि पर्याप्त नहीं है। चिपकने वाला टेप माउंट माइसेलियम संगठन को टीज़ माउंट तकनीक से बेहतर संरक्षित करता है, हालांकि चिपकने वाला टेप का उपयोग शाखा कोणों (लेखकों के अवलोकन) को मापने के लिए स्लाइड संस्कृति के रूप में विश्वसनीय नहीं है। स्लाइड संस्कृति, समय लेने वाली होने के बावजूद, अर्ध-स्थायी और स्थायी स्लाइड बनाने के लिए सबसे पर्याप्त तकनीक है। साहित्य को ध्यान में रखते हुए मैक्रो- और माइक्रोमोर्फोलॉजी का विश्लेषण किया जाता है। वेबस्टर और वेबर32 सूचना और अतिरिक्त संदर्भों का एक व्यापक सामान्य स्रोत है। Currah et al.16 और Zettler और Corey37 आर्किड माइकोरिज़ल कवक पर उपयोगी जानकारी प्रदान करते हैं। हालांकि चिकित्सा महत्व के कवक का वर्णन करते हुए, वाल्श एट अल 21 और मैकगिनिस31 फिलामेंटस कवक कालोनियों की सामान्य विशेषताओं, दृश्य / वर्णनात्मक जानकारी और फंगल माइक्रोमोर्फोलॉजी के लिए अतिरिक्त संदर्भों पर भी सहायक हैं।

यू एट अल 38 के अनुसार, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में डीएनए परिमाणीकरण विश्लेषण मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण के अनुरूप होने के कारण महान सटीकता और सटीकता प्रस्तुत करता है। एक महत्वपूर्ण अवलोकन यह है कि कुछ आइसोलेट्स बाद के आणविक पहचान चरणों के लिए पर्याप्त रूप से शुद्ध डीएनए नमूने प्रदान नहीं कर सकते हैं, क्योंकि माइकोहेटेरोट्रॉफ़्स के फंगल एंडोफाइट्स बेहद विविध हैं, विशेष रूप से उष्णकटिबंधीय पौधों39 से जुड़े हैं, जैसा कि उत्पादित मेटाबोलाइट्स हैं। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर विश्लेषण का उपयोग ऐसे मामलों और विभिन्न प्रोटोकॉल, या नमूनों के डीएनए शुद्धिकरण के लिए लागू वाणिज्यिक किट का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। आइसोलेट्स की आणविक पहचान में सुझाए गए बाद के चरण आंतरिक लिखित स्पेसर (आईटीएस) क्षेत्र और अनुक्रमण का प्रवर्धन हैं। आईटीएस क्षेत्र एक राइबोसोमल आरएनए स्पेसर डीएनए है जो बड़े पैमाने पर विशेष साहित्य में नियोजित है और औपचारिक रूप से फंगल पहचान 9,40 के लिए मुख्य बारकोड के रूप में स्वीकार किया जाता है। इसे पीसीआर द्वारा प्राइमर ITS1 और ITS441 के साथ प्रवर्धित किया जा सकता है, फिर सेंगर प्लेटफॉर्म42 में अनुक्रमित किया जा सकता है।

मेटाबारकोडिंग विश्लेषण, पर्यावरण और पौधों के नमूनों में सूक्ष्मजीवों की समृद्धि, बहुतायत, और वर्गीकरण संरचना की जांच की अनुमति देने के अलावा, इन सूक्ष्मजीवों12के बीच सकारात्मक या नकारात्मक बातचीत के परिणाम प्रदान कर सकते हैं. DNeasy PowerSoil मानक प्रोटोकॉल में जोड़े गए तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके मैक्रेशन चरण का उद्देश्य पौधे के ऊतकों के संबंध में जितना संभव हो उतने कवक कोशिकाओं को तोड़ना है, जिससे मैकरेटेड ऊतक11 में कवक समुदाय का बेहतर नमूना लिया जा सके। आणविक पहचान में फंगल अनुक्रमों (बारकोड) के लिए प्राइमर विकल्पों को पौधे डीएनए के साथ हस्तक्षेप पर विचार करना चाहिए। हम प्राइमरों के उपयोग की सलाह देते हैं जो कवक 18S जीन के परिवर्तनशील क्षेत्रों को बढ़ाते हैं, उदाहरण के लिए, ITS1-5,8S-ITS243। डीएनए नमूने प्राप्त करने के बाद, बाद के चरण मेटागेनोमिक पुस्तकालयों को तैयार कर रहे हैं, जो चुने हुए अनुक्रमण मंच, पुस्तकालयों के पीछे अनुक्रमण पर निर्भर करते हैं, और जैव सूचना उपकरणों का उपयोग करके प्राप्त डेटा का विश्लेषण करते हैं। हम प्लेटफॉर्म इलुमिना MiSeq का उपयोग करने की सलाह देते हैं, जो उच्च आउटपुट के साथ एक कम खर्चीले विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है, जो कम समय अवधि250 में 11,44 बीपी अनुक्रम उत्पन्न करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है और हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम FAPESP (2015/26479-6) और CNPq (447453/2014-9) से फंडिंग का धन्यवाद करते हैं। JLSM उत्पादकता अनुदान के लिए CNPq को धन्यवाद देता है (303664/2020-7)। MPP धन्यवाद Capes (मास्टर डिग्री छात्रवृत्ति, प्रक्रिया 88887.600591/2021-00) और CNPq।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive tape (from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses)
Ampicillin Sigma-Aldrich A5354 (for installation of plant fragments; other antibiotics may be used - check step 2.2.1)
Autoclave (from any company, for materials sterilization in many steps)
Bacteriological agar Sigma-Aldrich A1296 (for many steps)
C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions Qiagen 12888-50 (purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Centrifuge   Merck/Eppendorf 5810 G (for total DNA extraction from fungal isolates)
Centrifuge tubes Merck CLS430828 (for samples collection)
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Congo red Supelco 75768 (for hyphae staining)
Cryotubes Merck BR114831 (for many steps)
Ethanol Supelco 100983 It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich 3609 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Filter paper Merck WHA10010155 (for many steps)
Glass test tubes Merck CLS7082516 (for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glass wool Supelco 20411 (for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite)
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB)
Isopropanol Sigma-Aldrich 563935 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Lactic acid Sigma-Aldrich 252476 (for preparing LPCB - hyphae staining)
Lactophenol blue solution (LPCB) Sigma-Aldrich 61335 (for hyphae staining)
Laminar flow hood (class I, from any company, for many steps)
Light microscope (from any company, for hyphae observation)
MB Spin Columns Qiagen 12888-50 (purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Methyl blue (cotton blue) Sigma-Aldrich M5528 (for preparing LPCB - hyphae staining)
Microcentrifuge tube (1.5 mL) Merck HS4323 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Microcentrifuge tube (2 mL) Merck BR780546 (for many steps)
Mineral oil (for preservation of fungal isolates)
Paper bags Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection)
Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm) Merck/Pyrex SLW1480/10D (autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones)
Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm) Merck/Aldrich Z740618 (for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm) Merck/Brand BR455732 (for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Phenol Sigma-Aldrich P1037 (for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB)
Porcelain mortar Sigma-Aldrich Z247464 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Porcelain pestle Sigma-Aldrich Z247502 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Potato dextrose agar (PDA) Millipore P2182 (for many steps)
PowerBead tubes Qiagen 12888-50 (purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Rapid mounting medium (Entellan) Sigma-Aldrich 1.0796 (for fungi slide culture)
Silica gel Supelco 717185 (for cryopreservation in unhulled rice grains)
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771 Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine) (commercial product, for superficial desinfestation)
Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit) Qiagen 12888-50 (for total DNA extraction from plant organs)
Spectrophotometer - Nanodrop 2000/2000c ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOP (for total DNA extraction from plant organs)
Stereomicroscope (=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses)
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660 (for installation of plant fragments)
Thermoblock Merck/Eppendorf EP5362000035 (or from other companies)
Tissue homogenizer and cell lyzer SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs)
Toluidine blue O Sigma-Aldrich/Harleco 364-M (for hyphae staining)
Trehalose Sigma-Aldrich T9531 (for cryopreservation in vermiculite)
Tris Base Solution (Tris) Sigma-Aldrich T1699 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Unhulled rice grains (for cryopreservation)
U-shaped glass rod (or an adaptation - check step 5.4.1, for fungi slide culture)
Vermiculite Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite)
Vortexer Sigma-Aldrich/BenchMixer BMSBV1000 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625 (for cryopreservation in vermiculite)

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References

  1. de Azevedo, J. L. Endophytic microorganisms. Ecologia Microbiana. , 117-137 (1998).
  2. Stone, J. K., Bacon, C. W., White, J. F. An overview of endophytic microbes: endophytism defined. Microbial Endophytes. , 17-44 (2000).
  3. Schulz, B., Boyle, C. What are Endophytes. Microbial Root Endophytes. , Springer-Verlag. Berlin. 1-13 (2006).
  4. Smith, S. E., Read, D. J. Mycorrhizal Symbiosis. , Elsevier Science Academic Press. London. (2008).
  5. Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jersáková, J., Těšitelová, T. Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements. Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).
  6. Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style. Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).
  7. Ma, X., Kang, J., Nontachaiyapoom, S., Wen, T., Hyde, K. D. Non-mycorrhizal endophytic fungi from orchids. Current Science. 109 (1), 72-87 (2015).
  8. Favre-Godal, Q., Gourguillon, L., Lordel-Madeleine, S., Gindro, K., Choisy, P. Orchids and their mycorrhizal fungi: an insufficiently explored relationship. Mycorrhiza. 30 (1), 5-22 (2020).
  9. Sun, X., Guo, L. -D. Endophytic fungal diversity: review of traditional and molecular techniques. Mycology. 3 (1), 65-76 (2012).
  10. Pena-Passos, M., Sisti, L. S., Mayer, J. L. S. Microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds. Journal of Visualized Experiments. (183), e63777 (2022).
  11. Araújo, W. L., et al. Endophytic microorganisms: Theoretical and Practical Aspects of Isolation and Characterization. 1st ed. 1, Santarém: UFOPA. 257 (2014).
  12. de Souza, R. S. C., et al. Unlocking the bacterial and fungal communities assemblages of sugarcane microbiome. Scientific Reports. 6, 28774 (2016).
  13. Sisti, L. S., et al. The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn. Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).
  14. Araújo, W. L., et al. Variability and interactions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks. Canadian Journal of Microbiology. 47 (3), 229-236 (2001).
  15. Castellani, A. Further researches on the long viability and growth of many pathogenic fungi and some bacteria in sterile distilled water. Mycopathologia. 20 (1-2), 1-6 (1963).
  16. Currah, R. S., Zelmer, C. D., Hambleton, S., Richardson, K. A. Fungi from orchid mycorrhizas. Orchid Biology: Reviews and Perspectives, VII. , 117-170 (1997).
  17. Freitas, E. F. S., et al. Diversity of mycorrhizal Tulasnella associated with epiphytic and rupicolous orchids from the Brazilian Atlantic Forest, including four new species. Scientific Reports. 10 (1), 7069 (2020).
  18. Sato, M., Inaba, S., Noguchi, M., Nakagiri, A. Vermiculite as a culture substrate greatly improves the viability of frozen cultures of ectomycorrhizal basidiomycetes. Fungal Biology. 124 (8), 742-751 (2020).
  19. Pereira, O. L., Kasuya, M. C. M., Borges, A. C., Araújo, E. F. D. Morphological and molecular characterization of mycorrhizal fungi isolated from neotropical orchids in Brazil. Canadian Journal of Botany. 83 (1), 54-65 (2005).
  20. Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
  21. Walsh, T. J., Hayden, R. T., Larone, D. H. Larone's Medically Important Fungi: A Guide to Identification. , ASM Press. (2018).
  22. Malloch, D. Moulds: Isolation, Cultivation, Identification. , Available from: http://website.nbm-mnb.ca/mycologywebpages/Moulds/Moulds.html (1997).
  23. Smith, P. Microscopy: Chemical Reagents. British Mycological Society. , Available from: https://www.britmycolsoc.org.uk/field_mycology/microscopy/reagents (2022).
  24. Senanayake, I. C., et al. Morphological approaches in studying fungi: Collection, examination, isolation, sporulation and preservation. Mycosphere. 11 (1), 2678-2754 (2020).
  25. Slifkin, M., Cumbie, R. Congo red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi. Journal of Clinical Microbiology. 26 (5), 827-830 (1988).
  26. Raeder, U., Broda, P. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology. 1 (1), 17-20 (1985).
  27. Martins, M. K., et al. Molecular characterization of endophytic microorganisms. Endophytic microorganisms: theoretical and practical aspects of isolation and characterization. 1st edition. , Santarém: UFOPA. 189-211 (2014).
  28. Rayner, R. W. A Mycological Colour Chart. Commonwealth Mycological Institute. , (1970).
  29. Kornerup, A., Wanscher, J. H. Methuen Handbook of Colour. Methuen handbook of colour. , Methuen & Co. Ltd. London. (1967).
  30. Ridgway, R. Color Standards and Color Nomenclature. , Washington, DC. Published by the author (1912).
  31. McGinnis, M. R. Laboratory Handbook of Medical Mycology. , Elsevier Science. (2012).
  32. Webster, J., Weber, R. Introduction to Fungi. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  33. Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (2), 251-255 (2012).
  34. Smith, D., Onions, A. H. S. A comparison of some preservation techniques for fungi. Transactions of the British Mycological Society. 81 (3), 535-540 (1983).
  35. Ryan, M. J., Smith, D., Jeffries, P. A decision-based key to determine the most appropriate protocol for the preservation of fungi. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 16 (2), 183-186 (2000).
  36. Lalaymia, I., Cranenbrouck, S., Declerck, S. Maintenance and preservation of ectomycorrhizal and arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 24 (5), 323-337 (2014).
  37. Zettler, L. W., Corey, L. L. Orchid mycorrhizal fungi: isolation and identification techniques. Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses-Methods and Protocols. , 27-59 (2018).
  38. Yu, S., Wang, Y., Li, X., Yu, F., Li, W. The factors affecting the reproducibility of micro-volume DNA mass quantification in Nanodrop 2000 spectrophotometer. Optik. 145, 555-560 (2017).
  39. Martos, F., et al. Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids. New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).
  40. Schoch, C. L., et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6241-6246 (2012).
  41. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  42. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  43. Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: biological and methodological variability. Applied and Environmental Microbiology. 67 (10), 4479-4487 (2001).
  44. Metzker, M. L. Sequencing technologies-the next generation. Nature Reviews Genetics. 11 (1), 31-46 (2010).

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अलगाव लक्षण वर्णन कुल डीएनए निष्कर्षण एंडोफाइटिक कवक माइकोहेटरोट्रॉफ़िक पौधे माइकोरिज़ल निर्भरता ऑटोट्रॉफ़िक क्षमता संबंधित कवक जड़ें भूमिगत अंग संस्कृति-निर्भर तकनीक संस्कृति-स्वतंत्र तकनीक रूपात्मक पहचान विविधता विश्लेषण इनोकुला रखरखाव आर्किड बीजों का सहजीवी अंकुरण गैर-कृषि योग्य कवक आणविक पहचान तकनीक प्रजाति विविधता और प्रचुरता
माइकोहेटरोट्रॉफ़िक पौधों में एंडोफाइटिक कवक की पहचान करने के लिए अलगाव, लक्षण वर्णन और कुल डीएनए निष्कर्षण
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Sisti, L. S., Pena-Passos, M.,… More

Sisti, L. S., Pena-Passos, M., Lishcka Sampaio Mayer, J. Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants. J. Vis. Exp. (195), e65135, doi:10.3791/65135 (2023).

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