Summary
Den nuværende artikel har til formål at give detaljerede og passende protokoller til isolering af planteassocierede endofytiske svampe, langsigtet konservering af isolater, morfologisk karakterisering og total DNA-ekstraktion til efterfølgende molekylær identifikation og metagenomiske analyser.
Abstract
Mycoheterotrofe planter præsenterer en af de mest ekstreme former for mycorrhizal afhængighed, idet de helt har mistet deres autotrofe kapacitet. Så vigtigt som enhver anden vital ressource er de svampe, som disse planter intimt forbinder med, afgørende for dem. Derfor er nogle af de mest relevante teknikker til at studere mycoheterotrofe arter dem, der muliggør undersøgelse af tilknyttede svampe, især dem, der beboer rødder og underjordiske organer. I denne sammenhæng anvendes teknikker til identifikation af kulturafhængige og kulturuafhængige endofytiske svampe almindeligt. Isolering af svampeendofytter giver et middel til morfologisk identifikation af dem, analyse af deres mangfoldighed og opretholdelse af inokula til anvendelser i symbiotisk spiring af orkidéfrø. Det er imidlertid kendt, at der er et stort udvalg af ikke-dyrkelige svampe, der befinder sig i plantevæv. Således tilbyder kulturuafhængige molekylære identifikationsteknikker et bredere dække af artsdiversitet og overflod. Denne artikel har til formål at yde den metodologiske støtte, der er nødvendig for at indlede to undersøgelsesprocedurer: en kulturafhængig og en uafhængig. Med hensyn til den kulturafhængige protokol er processerne til indsamling og vedligeholdelse af planteprøver fra indsamlingssteder til laboratoriefaciliteter detaljeret sammen med isolering af filamentøse svampe fra underjordiske og luftorganer af mycoheterotrofe planter, opbevaring af en samling isolater, morfologisk karakterisering af hyfer ved diaskulturmetode og molekylær identifikation af svampe ved total DNA-ekstraktion. De detaljerede procedurer, der omfatter dyrkningsuafhængige metoder, omfatter indsamling af planteprøver til metagenomiske analyser og total DNA-ekstraktion fra achlorophyllous planteorganer ved hjælp af et kommercielt kit. Endelig foreslås kontinuitetsprotokoller (f.eks. polymerasekædereaktion [PCR], sekventering) også til analyser, og teknikker præsenteres her.
Introduction
Endofytiske svampe er pr. definition dem, der befinder sig i det indre af planteorganer og væv i iøjnefaldende infektioner (dvs. uden at skade deres vært)1,2. Disse svampe kan neutralt eller gavnligt interagere med værtsplanter, kan give resistens over for patogener og ugunstige miljøforhold og kan bidrage til syntesen af gavnlige forbindelser for planten (f.eks. vækstfaktorer og andre fytohormoner)1,3. Mycorrhizal endofytter er svampe, der etablerer mycorrhizal foreninger med planten, der deltager i næringsoverførsel4. I Orchidaceae er interaktionen med mycorrhizal endofytter grundlæggende for frøspiring i langt de fleste arter og frøplanteetablering i alle planter i familien5. I sådanne sammenhænge repræsenterer mycoheterotrofe orkideer et tilfælde af total afhængighed af deres mycorrhizale partnere, da de er afhængige af mineralske næringsstoffer og kulstofforbindelser, der overføres af disse svampe i hele deres livscyklus6. Derfor er isolering og identifikation af associerende svampe en grundlæggende base, når man undersøger mycoheterotrofe livsstrategier. Desuden er der lidt kendt om svampeendofytternes roller i mycoheterotrofe planter eller endda den reelle mangfoldighed af disse svampe 7,8.
Undersøgelsen af endofytiske svampe kan udføres ved hjælp af forskellige teknikker, der traditionelt betegnes som dyrkningsuafhængige eller -afhængige, f.eks.: a) direkte observation, b) svampeisolering og morfologisk og/eller molekylær identifikation og c) total DNA-ekstraktion af plantevæv og molekylær identifikation9. Ved direkte observation (a) kan endofytiske svampe undersøges, mens de stadig er i det indre af planteceller og væv ved lys- eller elektronmikroskopi9, da forskellige mikroskopiprotokoller er beskrevet af Pena-Passos et al.10. Ved isolationsmetoder (b) kan svampeendofytter karakteriseres i henhold til deres kolonier, hyfer og reproduktions- eller resistensstrukturmorfologi. Via isolationsteknikker er det også muligt at foretage molekylær identifikation af isolater gennem DNA-ekstraktion, amplifikation af molekylære identifikationssekvenser (stregkoder eller fingeraftryk) og sekventering11. Sidstnævnte teknik (c) muliggør molekylær identifikation af endofytiske svampe pr. DNA-ekstraktion, mens de befinder sig i det indre af plantevæv (metabarkodning), efterfulgt af biblioteksforberedelse og sekventering12.
Desuden kan svampeisolater anvendes i symbiotiske spiringsforsøg ved hjælp af frø fra autotrofe eller mycoheterotrofe orkideer. Et eksempel på en sådan anvendelse er undersøgelsen foretaget af Sisti et al.13, der beskriver spiring og indledende stadier af protocormudvikling i Pogoniopsis schenckii, en mycoheterotrofisk orkidé, i forbindelse med nogle af dets isolater, der omfatter ikke-mycorrhizal endofytiske svampe. Den anvendte symbiotiske spiringsprotokol er detaljeret og præsenteret i en video af Pena-Passos et al.10. Isolering af svampe i forbindelse med forskellige planteorganer giver mulighed for forskellige undersøgelsesfokus vedrørende arten af plante-svampeinteraktioner (f.eks. at forstå enten økologiske eller fysiologiske aspekter af sammenhængen samt undersøgelser af næringsstofoverførslen fra svampe til planten)9.
De metoder, der præsenteres i afsnit 1, er baseret på en samling underjordiske organprøver, da disse organer frembyder de største vanskeligheder ved indsamling, og de er af stor interesse, da mycorrhizal endofytter koloniserer dem. Begge inkluderede protokoller (trin 1.1 og 1.2) kan dog anvendes på andre mycoheterotrofe planteorganer (f.eks. Jordstængler, blomsterstængler og frugter). Indsamlingsmetoden beskrevet i trin 1.1 er beregnet til isolering af endofytiske svampe (afsnit 2) til morfologisk karakterisering (afsnit 4 og 5) og/eller total DNA-ekstraktion til isolatidentifikation (afsnit 6). På den anden side er indsamlingsmetoden beskrevet i trin 1.2 udelukkende tildelt total DNA-ekstraktion af plantevæv til metabarkodningsteknikker (afsnit 7). I afsnit 3 præsenteres fire metoder til opbevaring og konservering af trådsvampe, to til kortvarig opbevaring (3-6 måneder) og de to andre egnede til langtidsopbevaring (>1 år). Den morfologiske karakterisering (afsnit 4 og 5) kan være forbundet med molekylær identifikation for at forstærke den og give vigtig information om svampemakro- og mikromorfologi. Figur 1 opsummerer de kollektive metoder, der er beskrevet derefter.
Figur 1: Skematisk opsummering af de præsenterede metoder. Planteindsamling og svampeisolering, konservering og molekylær identifikation ved dyrkningsafhængige og -uafhængige metoder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Indsamling af planteprøver
- Prøveindsamling til dyrkningsafhængige metoder
- Grav forsigtigt de underjordiske organer; Disse kan være rødder, stilke, jordstængler eller opbevaringsorganer af planten, der skal indsamles. Bortset fra meget kompakte jordarter skal du indsamle disse prøver manuelt.
BEMÆRK: Brug af værktøjer som murske eller skeer i dette trin anbefales dårligt, da det kan beskadige de skrøbelige strukturer af mycoheterotrofe planter og kan forårsage vævsforurening af ikke-endofytiske svampe. - Saml så mange underjordiske organer som muligt. Opbevar prøverne i papirposer inde i en afkølet beholder (f.eks. polystyrenskumkasse eller termopose med is). Hvis luftorganer også indsamles, skal du transportere dem adskilt fra de underjordiske.
- Grav forsigtigt de underjordiske organer; Disse kan være rødder, stilke, jordstængler eller opbevaringsorganer af planten, der skal indsamles. Bortset fra meget kompakte jordarter skal du indsamle disse prøver manuelt.
- Prøveindsamling til dyrkningsuafhængige metoder
- Grav forsigtigt rødderne på planten, der skal indsamles under de samme anbefalinger, der er påpeget i NOTE fra trin 1.1.1.
- Saml så mange underjordiske organer som muligt. Opbevar de indsamlede prøver i kryorør inde i flydende nitrogen (ønskelig mulighed) eller brug centrifugerør omgivet af tøris (alternativ mulighed). Vedligehold luftorganer separat, hvis de indsamles.
2. Isolering af endofytiske svampe forbundet med planteorganer14
BEMÆRK: Alle materialer, opløsninger og reagenser, der anvendes i dette afsnit, skal være sterile. Dem, der ikke kan købes allerede steriliseret, skal autoklaveres ved 121 ° C i 20 minutter.
- Overfladisk desinfektion af planteorganer
- De indsamlede prøver (trin 1.1.2) vaskes i rindende vand, og så meget substrat og andet affald, som prøverne kan have, fjernes som muligt.
- Inde i en laminær strømningshætte skal du holde de vaskede prøver nedsænket i 70% ethanol i 1 min (et bægerglas eller en glasbeholder kan bruges).
- Overfør prøverne til en anden beholder med natriumhypochlorit med 2% aktivt chlor i 3 min.
- Skift prøverne til en beholder med 70% ethanol og hold dem nedsænket i 1 min. Derefter vaskes prøverne sekventielt i to beholdere med destilleret vand.
- Installation af plantefragmenter i dyrkningsmedium
BEMÆRK: Hvert trin, der er beskrevet i trin 2.2, skal udføres inde i en laminar strømningshætte.- Før installation tilberedes petriskåle (8-10 cm i diameter) med 19,5 g/L kartoffeldextroseagarkulturmedium (PDA) + 7 g/L bakteriologisk agar + 3 ml/l antibiotika (f.eks. streptomycin, penicillin, tetracyklin, ampicillin).
- Lad petriskålene stå med dyrkningsmediet ved 36 °C i 24 timer, før du bruger dem for at sikre, at der ikke er nogen kontaminering. Kassér tallerkener, der er forurenet med bakterier eller svampekolonier.
BEMÆRK: Tilsætningen af antibiotika i mediet er afgørende i dette trin, da organerne er stærkt inficeret af bakterier, der kan hæmme svampevækst. Kontroller, om antibiotika kan opvarmes under autoklavering; nogle antibiotika skal tilsættes efter afkøling af mediet til omkring 36 °C (før det lægges i opvasken). - Umiddelbart efter overfladisk desinfektion af prøverne og stadig inde i en laminar strømningshætte podes der i PDA nogle dråber af det destillerede vand fra den sidste beholder, der blev brugt til at vaske prøverne. Dette trin er vigtigt for at evaluere effektiviteten af overfladisk desinfektion af prøver.
- I en tom autoklaveret skål placeres prøverne og bruges en flammet skalpel og tang til at sektionere prøverne til en tykkelse på ca. 0,2 cm.
- Sektion cylindriske prøver i længderetningen i to halvdele, hvis det ønskes, for at forstærke overfladen i kontakt med mediet. For bedre at udsætte frugt og andre mere sfæriske organer skal du hugge eller skære strukturerne grundigt. Frøene kan også være vigtige svampekilder, så sørg for, at den sektionerede frugt udsætter dem for mediet.
BEMÆRK: Kun sunde organer, uden vævsskade eller signaler om mulige sygdomme eller patogene infektioner, bør anvendes til svampeendofytisolering. - Fordel fem fragmenter af de underjordiske organer i petriskålene med PDA + antibiotika. Sørg for, at fragmenterne er så langt væk fra hinanden som muligt og heller ikke rører skålens kanter. Array ikke fragmenter på mediet. Forbered replikater af hvert installeret organ som en forholdsregel i tilfælde af kontaminering.
- Petriskålene forsegles med husholdningsfilm og opbevares mørkt ved 25-27 °C (helst i en inkubator) i 5 dage.
- Beregning af isolationsfrekvens (IF)11
- Efter 5 dages organfragmentinkubation beregnes IF'en i henhold til antallet af inkuberede fragmenter, der præsenterer svampekolonier, der vokser, divideret med det samlede antal inkuberede fragmenter som repræsenteret i følgende ligning:
- Efter 5 dages organfragmentinkubation beregnes IF'en i henhold til antallet af inkuberede fragmenter, der præsenterer svampekolonier, der vokser, divideret med det samlede antal inkuberede fragmenter som repræsenteret i følgende ligning:
- Oprensning af svampeisolater ved striating og subkulturation
BEMÆRK: Hvert trin, der er beskrevet i trin 2.4, skal udføres inde i en laminar strømningshætte.- Tilbered petriskåle (5 cm i diameter) med 5-7 g/L agar-agar (AA; kun bakteriologisk agar). Oprethold opvasken i 24 timer ved 36 °C for at fjerne eventuelle forurenede.
- Identificer hver dyrket svampekoloni med en kode og afgræns dens margener på bunden af skålen (kan gøres med en permanent markør). Differentier kolonierne efter farve, vækstmønster, tekstur og marginformat.
- Med en autoklaveret trætandstikker, ved hjælp af den fine spids, genvinder en lille mængde mycelium fra en svampekoloni. Koncentrer dig helst om kolonimargenerne og vælg et område så langt som muligt fra en anden koloni, undgå at komme sig mere end en type koloni på én gang.
- Brug den samme tandstikker med mycelium i spidsen, striate AA producerer tre striae (riller). Sørg for, at hver stria er i en afstand af 1 cm fra en anden, og skålens kanter. Skriv den relevante kode (ved hjælp af klistermærkepapir og blyant), forsegl opvasken og hold dem inkuberet i mørke ved 25-27 ° C i 3 dage.
- Tilbered petriskåle (8 cm i diameter) med 39 g/L PDA. Det er ikke nødvendigt at tilføje antibiotika på dette stadium.
- Efter inkubation af AA-skålene skal du omhyggeligt observere dem mod lys (fra en lampe eller et vindue) med det formål at identificere fine hyfer, der danner individuelle kolonier. Afgræns arealet af en individuel koloni pr. skål ved hjælp af en permanent markør på undersiden af petriskålen.
- I en laminar flowhætte skal du bruge en autoklaveret tandstikker til at skære en del af mediet, der indeholder kolonien, og overføre det skårne volumen til midten af en ny PDA-skål.
- Identificer petriskålene med isolaternes koder, forsegl skålene med husholdningsfilm, og opbevar dem i mørke ved 25-27 °C i 7-14 dage.
3. Konservering af rensede svampeisolater
BEMÆRK: Alle materialer, opløsninger og reagenser, der anvendes i dette afsnit, skal være sterile. Dem, der ikke kan købes allerede steriliseret, skal autoklaveres ved 121 ° C i 20 minutter.
- Konservering med Castellanis metode eller i mineralolie (3-6 måneder)11,15
- Forbered 2 ml mikrocentrifugeglas med 0,5 ml destilleret vand eller indeholdende 0,5 ml mineralolie (afhængigt af den valgte metode). Sørg for, at rørene automatisk er tomme, og at det autoklaverede vand og olie tilsættes rørene inde i en laminær strømningshætte.
- I en laminar flowhætte anbringes petriskålene med rensede isolater, der allerede er dyrket i PDA (39 g/L) i 7-14 dage. Brug et autoklaveret tandstikker til at skære små kuboider (0,5 cm x 0,5 cm i øvre område) af medium indeholdende myceliummargenerne.
- Placer fire til seks kuboider i mikrocentrifugerørene med destilleret vand (Castellanis metode) eller mineralolie. Glassene opbevares mørkt ved 25 °C, så længe det er nødvendigt, under overholdelse af metodens tidsbegrænsninger.
BEMÆRK: Undgå at tilføje for mange kuboider til rørene og gøre dem fulde, hvilket kan øge forureningschancerne. Det er muligt at holde rørene nedkølet, hvilket kan favorisere bevarelsen af nogle isolater i længere tid. Currah et al.16 anbefaler opbevaring af replikater af mycorrhizal svampeisolater fra tropiske orkideer både nedkølet og ved 25 °C, da de kan gå tabt ved køleopbevaring. - Genvind en kasse og placer den i midten af en ny PDA-skål for at dyrke et opbevaret isolat.
- Kryopræservering i uafskallede riskorn (>1 år)17
- Vask uafskallede riskorn i rindende vand og kog dem, indtil risskroget begynder at åbne sig. Fordel de kogte korn i glas reagensglas med en skruehætte og autoklave to gange med et interval på 24 timer imellem.
- I en laminar flowhætte anbringes petriskålene med rensede isolater, der allerede er dyrket i PDA (39 g/L) i 7-14 dage. Brug en autoklaveret tandstikker til at genvinde fem små hyferfragmenter fra myceliummargenerne og inokulere dem i røret indeholdende autoklaverede riskorn.
BEMÆRK: Inokulering af hyfer på forskellige punkter og dybder af røret garanterer, at isolatet koloniserer de uafskallede riskorn på kortere tid. - Glassene inkuberes mørkt ved 25-27 °C i 14 dage. Omrør rørene ved at hvirvelstrømme dem hver 3. dag for at holde kornene individualiserede.
- Efter at have observeret svampevækst i riskornene, fordeles kornene i en autoklaveret petriskål foret med filterpapir for at absorbere fugt over papiret, så kornene kan tørre. Opbevares mørkt ved 25-27 °C i 2-3 dage.
- Forbered kryorør med 1/3 silicagel i bunden og 1/3 glasuld over silica. Til sidst fordeles 1/3 af riskornene med dyrket svampemycelium. Opbevares ved -20 °C i 24 timer.
- Efter 24 timer opbevares kryotubeerne ved -80 °C, så længe det er nødvendigt, under overholdelse af metodens tidsbegrænsninger.
- Kryopræservering i vermiculit ved hjælp af et kryoprotektivt middel (>1 år)18
- Forbered et flydende kulturmedium sammensat af 0,2% gærekstrakt og 2% glucose i destilleret vand. Juster pH til 5 og autoklave den.
- Fordel 0,2 g vermiculit (brug fin granulometri) i kryorør med en skruehætte og autoklave dem. Tilsæt 0,8 ml autoklaveret flydende medium til kryorørene indeholdende vermikulit.
- I en laminar flowhætte anbringes petriskålene med rensede isolater, der allerede er dyrket i PDA (39 g/L) i 7-14 dage. Brug et autoklaveret tandstikker til at genvinde tre til fem hyferfragmenter fra myceliummargenerne og inokulere langs røret indeholdende vermiculit + flydende kulturmedium. Husk at identificere kryotubes med den respektive isolatkode.
BEMÆRK: Inokulering af hyfer i forskellige punkter og dybder af kryorøret garanterer, at isolatet koloniserer vermiculitten på kortere tid. - Opbevar kryorørene i mørke ved 25-27 °C, indtil kolonisering af de fleste vermikulitkorn kan observeres, hvilket normalt tager omkring 14 dage.
- Forbered en kryoprotektiv opløsning sammensat af 5% glycerol og 5% trehalose i destilleret vand og autoklav det. Lad opløsningen køle af, inden du bruger den.
- Efter at vermikulitten i kryotuber er koloniseret af det respektive svampeisolat, fordeles 0,4 ml kryoprotektivt middel i hvert rør, og kryotuberne opbevares nedkølet ved 4 °C i 48 timer. Derefter opretholdes kryorørene ved -80 °C, så længe det er nødvendigt, under overholdelse af metodens tidsbegrænsninger.
4. Makromorfologisk karakterisering af filamentøse svampe (kolonimorfologi)
- Oprethold et fotografisk register over myceliet dyrket i hver petriskål med 39 g / L PDA i 7-14 dage. Husk at registrere begge sider af kolonien, over- og underside (omvendt). Hvis skålene skal bruges i afsnit 6 eller ikke vedligeholdes, skal du åbne skålene, når du fotograferer dem for at få bedre fotos.
- Hvis man er interesseret i kvantitative data om kolonimorfologi, kopierer subkulturen isolaterne og opretholder dem under de samme vækstbetingelser og i en konstant periode for at registrere kolonidiameteren og beregne væksthastigheden (normalt i mm/h).
BEMÆRK: Mere sofistikerede kvantitative resultater kan opnås ved at anvende forskellige typer kulturmedier til sammenligning19 og ved at overveje statistikværktøjerne til behandling af data. - Overhold kolonierne under et stereomikroskop samt for at identificere morfologiske egenskaber og fotografere i forstørrelse. Evaluer kolonierne i henhold til deres makromorfologiske egenskaber, som beskrevet i resultatafsnittet. Kontakt forskellige bibliografiske kilder for at hjælpe med at kategorisere og relatere makromorfologien til molekylær og / eller morfologisk identifikation.
5. Mikromorfologisk karakterisering af filamentøse svampe (hyphalmorfologi)
BEMÆRK: De mikromorfologiske teknikker sammenlignes i diskussionsafsnittet under hensyntagen til deres mulige anvendelser og ulemper.
- Dyrk isolaterne på petriskåle med 39 g/L PDA i 7-14 dage. Til evaluering af formodede orkidémykorrhizasvampe dyrkes isolaterne på 17 g / L majsmelagar (CMA; eller et andet næringsstofbegrænsende medium) i 3-7 dage19.
- Drille montering
- Arbejd inde i en laminær strømningshætte. Placer en dråbe af en valgt plet (trin 5.5) på et rent glasglas.
- Brug et autoklaveret tandstikker eller et andet sterilt materiale til forsigtigt at fjerne nogle hyfer fra det dyrkede isolat og læg dem i dråben plet. Placer en dæksel (helst i en indledende vinkel på 45 ° for at undgå luftbobler) og analyser under et lysmikroskop.
- Montering af tape
BEMÆRK: Denne teknik anvendes normalt i svampekulturer, der let kan anvendes i afsnit 6 eller ikke vedligeholdes, da klæbebåndet ikke kan autoklaveres, og der kan forekomme kontaminering efter udførelse af metoden.- Placer en dråbe af en valgt plet (trin 5.5) på et rent glasglas. Skær en strimmel gennemsigtig tape i en størrelse, der passer godt til glasglasset, og den centrale plet falder godt.
- Ret den klæbrige overflade af strimlen til myceliumoverfladen. Tryk ikke, og prøv at samle nogle hyfer uden at stikke for mange af dem.
- Sæt båndet på glasglasset, og sørg for, at pletten er i kontakt med de opsamlede hyfer. Placer en dråbe vand over båndet og læg en dæksel. Analyser diaset under et lysmikroskop.
- Glidekultur af trådsvampe20
- Inde i en stor petriskål (helst >9 cm i diameter) skal du placere: filterpapir i bunden, en U-formet glasstang eller en tilpasning (målet er at give en højde til glasrutschebanen), et glasglas og to dæksedler. Højere petriskåle letter manipulationen. Autoklave disse sæt petriskåle, en for hvert isolat.
- Forbered et lille volumen på 39 g / l PDA eller 17 g / l CMA, tilsæt 10 g / l bakteriologisk agar og autoklave (volumen for en petriskål er nok til mere end 30 isolater). De kulturmedier, der bruges i diaskulturen, skal være sværere end almindelige medier. Autoklave 100 ml destilleret vand.
- Arbejd inde i en laminær strømningshætte. Anbring det flydende medium i en petriskål, der producerer et lag omkring 0,5 cm højt. Lad mediet størkne. Når den er fast, skal du bruge en steril skalpel til at skære firkanter af mediet, der er 1 cm x 1 cm i dimension.
- Åbn petriskålsættet inde i en laminar strømningshætte, og brug flammede tang til at organisere det materiale, der autoklaveres inde i fadet. Arranger materialet i nummereret rækkefølge, som vist i figur 2A, og placer et kvadrat af kulturmedium på glasglasset. Før dækslen anbringes over mediet, fortsættes til trin 5.4.5.
- Brug en autoklaveret tandstikker til at genvinde nogle hyfer fra et isolat og gnid forsigtigt de fire laterale flader af mediet, der er placeret på glasglasset. Placer et automatisk klaveret dæksel over den mellemstore firkant ved hjælp af flammede tang.
- Brug en steril pipettespids til at placere autoklaveret vand i filterpapiret for at skabe et fugtigt kammer. Brug en lydstyrke til at mætte papiret uden at lægge vand i overskud. Petriskålen forsegles med husholdningsfilm, og identificer den med den respektive isolatkode. Oprethold opvasken i mørke ved 25-27 °C i 3-7 dage.
- Evaluer hyfervækst i glasobjektglasset og dæksedlen. Der fremstilles to dias fra hvert diaskultursæt, det ene ved hjælp af glasrutsjebanen med hyfer og det autoklaverede dæksel, det andet ved hjælp af dæksedlen med hyfer og et andet glasdias.
- Når hyphalvækst er observeret, skal du forsigtigt løsne kvadratet af medium fra glasobjektglasset (figur 2B), montere de to dias ved hjælp af en valgt plet (trin 5.5) og analysere under et lysmikroskop. Husk at identificere isolatkoden på diaset. For at fremstille semi-permanente dias skal du forsegle dækslet med klar neglelak.
- For at producere permanente dias skal du omhyggeligt vaske farvestoffet fra klæbende hyfer efter farvning og lade diaset tørre. Monter med et hurtigt monteringsmedium (for detaljer, læs Pena-Passos et al.10).
BEMÆRK: Ulempen ved at producere et permanent dias med denne teknik er, at sporer og strukturer, der ikke klæber til glasset, kan vaskes.
- Farvningsmetoder og hyferobservation
- Lactophenol bomuldsblå (LPCB)21: Tilsæt 20 ml mælkesyre, 40 ml glycerol og 20 ml destilleret vand. 20 g phenolkrystaller opløses i denne opløsning ved forsigtig opvarmning. 0,05 g methylblåt (bomuldsblåt eller 2 ml 1% vandig opløsning) opløses. LPCB kan også let købes allerede forberedt.
FORSIGTIG: Phenol er meget giftigt og flygtigt; Manipuler det udelukkende inde i en stinkhætte og brug handsker. - ToluidinblåtO10(TBO): Forbered 0,05% TBO i 0,1 M fosfatbuffer (pH 6,8).
- Congo rød22,23,24: Forbered en opløsning af 1% Congo rød i destilleret vand og filtrer den. Inkuber i 5-10 min. Dette farvestof kan også anvendes til fluorescensmikroskopi25.
- Når du observerer og fotograferer svampehyfer under et lysmikroskop, skal du konsultere forskellige bibliografiske kilder for at hjælpe med at identificere strukturer (se diskussionen).
- Lactophenol bomuldsblå (LPCB)21: Tilsæt 20 ml mælkesyre, 40 ml glycerol og 20 ml destilleret vand. 20 g phenolkrystaller opløses i denne opløsning ved forsigtig opvarmning. 0,05 g methylblåt (bomuldsblåt eller 2 ml 1% vandig opløsning) opløses. LPCB kan også let købes allerede forberedt.
Figur 2: Procedurer for diaskultur af trådsvampe . (A) Skematisk konfiguration af et diaskultursæt, hvor tallene angiver rækkefølgen af arrangementet af elementerne. (B) Afmontering af kvadratet på kulturmediet, efter at der er observeret hyphalvækst i glasglasset og dæksedlen. Klik her for at se en større version af denne figur.
6. Total DNA-ekstraktion fra svampeisolater (hjemmelavet protokol26 med modifikationer 27)
BEMÆRK: Alle materialer, opløsninger og reagenser, der anvendes i dette afsnit, skal være sterile. Dem, der ikke kan købes allerede steriliseret, skal autoklaveres ved 121 ° C i 20 minutter. Brug handsker under hele protokollen og udfør nogle trin inde i en stinkhætte.
- Forbered ekstraktionsbufferen: 1% natriumdodecylsulfat (SDS), 250 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 25 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). De oprensede isolater dyrkes i 39 g/l PDA i 7-14 dage.
- Skrab forsigtigt myceliet fra et isolat ved hjælp af en spatel eller en ske og overfør fragmenterne til en autoklaveret mørtel, undgå at overføre kulturmediet med hyferaggregatet. Brug en porcelænsstøder, slib myceliet med flydende nitrogen til et fint pulver. Lad ikke myceliet, der males, smelte, tilsæt nitrogen for at undgå det.
- Tilsæt 1 ml ekstraktionsbuffer i et 2 ml mikrocentrifugerør, og anbring den malede prøve indtil 1,5 ml mærket. Omrør forsigtigt indholdet af rørene for at homogenisere.
- Omrør rørene i en hvirvel i 5 sek. og anbring dem i en termoblok ved 65 °C i 20 minutter. Homogeniser forsigtigt indholdet ved invertering hvert 7-10 minut.
- Centrifuger glassene ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Overfør 800 μL fra den øverste fase til et nyt 2 ml mikrocentrifugerør, tilsæt 800 μL phenol til rørene, og bland indholdet ved invertering.
FORSIGTIG: Phenol er et meget giftigt og flygtigt reagens; Det kan forårsage erytem, koldbrand og vævsnekrose. Ved indånding kan det forårsage dyspnø og hoste. Den systemiske absorption kan skade leveren, nyrerne og centralnervesystemet. Manipuler phenol udelukkende inde i en stinkhætte og brug handsker.
BEMÆRK: Fra næste trin skal du bruge handsker og føre protokollen inde i en stinkhætte. - Centrifuger glassene ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4 °C, og overfør 800 μL fra den øverste fase til et nyt 2 ml rør, idet du omhyggeligt undgår overførsel af indholdet af den ringere fase.
- Der tilsættes 400 μL phenol og 400 μL chloroform til glassene, og indholdet blandes på hovedet. De centrifugeres ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
FORSIGTIG: Chloroform er et meget giftigt og flygtigt reagens; Det kan forårsage irritation og skader, når det kommer i kontakt med huden, og ved indånding påvirker det centralnervesystemet og kardiorespiratoriske systemer, lever og nyrer. Manipuler kloroform udelukkende inde i en stinkhætte og brug handsker. - Genvind 800 μL eller mindre fra den overlegne fase til et nyt 2 ml rør. Der tilsættes 800 μL chloroform, indholdet blandes på hovedet, og der centrifugeres ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: I dette trin må ingen rester fra den nedre fase overføres til nye rør. Vær derfor ekstra forsigtig, når du genvinder den overlegne fase. - Overfør 600-800 μL fra den øverste fase til et nyt 1,5 ml rør og tilsæt 450 μL isopropanol. Bland indholdet ved invertering og inkuber ved 25 °C i 5 min.
- Glassene centrifugeres ved 10.000 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres med en mikropipette. Pas på ikke at kassere pelleten, der er deponeret i bunden af røret.
- Tilsæt 500 μL 80% ethanol og centrifuger i 5 min. Gentag to gange, hvis pelleten ikke er afklaret.
- Ethanolen fjernes med en mikropipette og tørrer pillen ved 37 °C i 30-60 minutter. Tilsæt 30-50 μL deioniseret vand, eluer pelleten ved hjælp af en mikropipette.
- Rørene holdes på 4 °C natten over for fuldstændig DNA-eluering, og indholdet fryses ned ved -20 °C.
7. Samlet DNA-ekstraktion fra planteorganer til metabarkodningsmetode (kommercielt sæt)
BEMÆRK: For følgende metode er det nødvendigt at købe det kommercielle kit, der er angivet i materialetabellen , som et jord-DNA-ekstraktionssæt. Hvert materiale, opløsning og reagens, der anvendes i dette afsnit, skal være sterilt. Dem, der ikke kan købes allerede steriliseret, skal autoklaveres ved 121 ° C i 20 minutter. Det anbefales stærkt at bære handsker under hele protokollen, og trinene kan udføres inde i en laminær strømningshætte. Den beskrevne protokol er ændret fra De Souza et al.12, fra protokollen beskrevet af producenten.
- Brug porcelænspestler og mørtel til at male rødderne opsamlet efter trin 1.2 i flydende nitrogen, hvilket reducerer prøverne til et fint pulver. Tilsæt 0,3 g fra de malede prøver til PowerBead-rørene og omrør forsigtigt for at homogenisere.
- Tilsæt 60 μL opløsning C1 (inkluderet i sættet) til PowerBead-rørene og bland indholdet ved invertering. Brug en vævshomogenisator og cellelyser (materialetabel) til at binde rørene fast til en passende støtte, koble støtten til hvirvelstrømmen og starte udstyret med maksimal hastighed i 10-20 minutter.
BEMÆRK: Hvis C1-opløsningen udfældes, opvarmes den til 60 °C, indtil den er fuldstændig opløst. - Glassene centrifugeres ved 10.000 x g i 30 s ved 25 °C. 500 μl supernatant overføres til 2 ml mikrocentrifugeglas. Det overførte indhold kan være partikler.
- Der tilsættes 250 μL opløsning C2 til rørene og omrøres i en hvirvel i 5 s. Der inkuberes ved 4 °C i 5 minutter og centrifugeres derefter ved 10.000 x g i 1-2 minutter ved 25 °C.
- Mere end 600 μL af supernatanten overføres til nye 2 ml reagensglas, idet pellets undgås. Der tilsættes 200 μL opløsning C3 og omrystes på en hvirvel i 5 s.
- Der inkuberes ved 4 °C i 5 minutter, og centrifugeres derefter ved 10.000 x g i 1 minut ved 25 °C. På dette trin skal det sikres, at supernatanten ikke er partikler.
- Mere end 750 μL af supernatanten overføres til nye 2 ml reagensglas, idet pellets undgås. Opløsningen af C4 homogeniseres i et hul, der tilsættes 1,100 μL opløsning C4 til supernatanten, og der omrystes i en hvirvel i 5 sekunder.
- 675 μL af indholdet af glassene i MB-centrifugeringskolonnerne hældes over filteret, og centrifugeres ved 10.000 x g i 1 min ved 25 °C. Kassér væskeindholdet.
- Gentag det forrige trin to gange, indtil alt indholdet af hvert rør er behandlet. Derefter tilsættes 500 μL opløsning C5 i midten af filteret i glassets øverste kolonne, og centrifugeres ved 10.000 x g i 30 s ved 25 °C.
- Kassér væskeindholdet og centrifuger igen under de samme betingelser som det foregående trin. Overfør forsigtigt den øverste søjle i MB-centrifugesøjlen til nye 2 ml mikrocentrifugeglas, og undgå at dryppe væskeindhold i søjlen.
- Tilsæt 85-100 μL opløsning C6 til midten af filteret og vent 1 min. Der centrifugeres ved 10.000 x g i 30 s ved 25 °C, og MB-centrifugeringskolonnen kasseres. Apparaterne opbevares ved -80 °C.
8. DNA-kvantificering i et spektrofotometer (se materialetabellen)
- Åbn softwaren ved hjælp af det angivne spektrofotometer. Vælg indstillingen Nukleinsyre, vælg indstillingen DNA, og indstil koncentrationen til ng / μL.
- Der tilsættes 1 μL deioniseret vand til spektrofotometerdetektoren, og kalibreringen foretages ved at vælge indstillingen Tom. Efter læsning skal du forsigtigt tørre detektoren af med blødt vævspapir.
- Navngiv feltprøven med isolatkoden for den prøve, der skal aflæses, og anbring 1 μL af den i udstyrsdetektoren. Vælg indstillingen Mål; Der genereres en graf og en tabel med resultaterne.
- Gentag trin 8.3, indtil alle eksemplerne er læst. Det anbefales at gemme tabellen med de genererede resultater til registrering og analyse: Vælg indstillingen Rapporter og det sted, hvor den .xml fil gemmes.
- Tilsæt 5 μL deioniseret vand til detektoren, vent flere minutter, og tør det forsigtigt af med blødt silkepapir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I isolationsprotokollen, i betragtning af at der er forurening fra det vand, der blev brugt på den sidste vask, og forureningen også detekteres i petriskålene med podede fragmenter, kan der træffes forskellige foranstaltninger afhængigt af typen af forurenende stof (tabel 1). Denne procedure skal gentages fra begyndelsen i tilfælde af stærkt sporulerende svampekontaminanter, som også præsenterer accelereret vækst og intensmultiplicerende bakterier, der er resistente over for de valgte antibiotika. I stedet, hvis svampeforureningen præsenterer langsom vækst eller ikke sporulerer, er det muligt blot at undgå at isolere det i de efterfølgende trin i protokollen. Endelig kan kontaminering med bakteriestammer, der formerer sig langsomt, også let undgås i de bageste trin, især ved rensning, ved genopretning af hyfer.
I alle de tidligere præsenterede tilfælde er det ideelle scenario at gentage desinfektionsproceduren ved hjælp af andre prøver og installere plantefragmenterne i et dyrkningsmedium, der kombinerer andre antibiotika med et bredere spektrum af handlinger i tilfælde af resistente bakterier, der forurener de første retter. I betragtning af de vanskeligheder, der er forbundet med at indsamle nye prøver og opnå organer fra mycoheterotrofe planter, kan nogle tilfælde imidlertid løses med succes i de bageste stadier af protokollen, som vist i tabel 1.
| Forurenende stof | Forurenende egenskab | Mulig konsekvens af forurening | Påkrævet handling | |||
| Bakterier | Intens multiplikation | Total eller delvis hæmning af væksten af endofytterne af interesse | Genstart isolationen fra begyndelsen | |||
| Langsom multiplikation | Isolering af bakterierne sammen med endofyten af interesse | Undgå bakteriekolonier under rensning | ||||
| Svampe | Kraftig vækst og/eller stærkt sporulerende | Gør det umuligt at isolere og/eller rense endofytter af interesse | Genstart isolationen fra begyndelsen | |||
| Langsom vækst og/eller ikke-sporulerende | Isolering af forureningen ved en fejltagelse | Undgå isolering af forureningen | ||||
Tabel 1: Beskrivelse af de mulige forurenende stoffer i processen med endofytisk svampeisolering, kontamineringskonsekvenser og afbødningsprocedurer.
Efter 5 dage fra installationen af organfragmenter i PDA-mediet er det muligt at visualisere væksten af små grupper af filamentøse svampe mycelia, der kommer ud af fragmenternes indre (figur 3). Hver mycelmorfotype bør resultere i et svampeisolat ved afslutningen af isolationsprotokollen, idet hver enkelt af dem skal stribes i en ny petriskål med AA-medium til rensning. Det anbefales, at de originale retter fra fragmentinstallationen ikke kasseres, før hele isolationsprotokollen er afsluttet. De kan opbevares nedkølet ved 4 °C, indtil de rensede kolonier er fremstillet. Også med hensyn til denne del af protokollen kan IF-analysen være meget nyttig til evaluering af procentdelen af vævsprøver, der resulterer i isolerede svampe blandt de samlede installerede prøver.
Figur 3: Rodfragmenter til svampeisolering i kartoffeldextroseagar. Dyrkelige endofytiske svampe, der vokser fra rodfragmenterne af en mycoheterotrofisk orkidé efter ca. 5 dages inkubation. Hver petriskål (A, B og C) indeholder fem rodfragmenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Efter 3 dage efter inkubation af AA-skålene til isolatrensning skulle små hyphalkolonier, næsten umærkelige, være vokset ud af striae i AA-mediet. På dette stadium, hvis der var nogen forurening fra langsomt voksende bakterier i isolationsskålene, er det muligt, at disse bakterier også blev overført til AA-skålene med de udvalgte svampeendofythyfer. I så fald vil bakterier være begrænset til stria-regioner med ringe vækst sammenlignet med svampen, hvilket gør det muligt at genvinde udelukkende svampen af interesse for nye PDA-retter.
I løbet af 7-14 dages podning af de rensede svampeisolater i PDA-skåle skal den rene koloni vokse centrifugalt (fra midten af skålen til dens periferi) og danne et eneste cirkulært mycelium (figur 4). Mulige forureninger identificeres let i dette stadium, da de i betydelig grad kompromitterer koloniens homogenitet med hensyn til dens vækst, form, aspekt, farve, pigmentproduktion i mediet osv. (figur 5). Forudsat at de endelige kolonier, der opnås, ikke er rene, skal svampene, der oprindeligt dyrkes fra organfragmenterne, igen underkastes rensningsprocedurer ved striation og subkulturation (trin 2.4). Det er muligt at genvinde isolaterne fra enten de oprindeligt installerede organer eller de endelige isolationsskåle, der indeholder heterogene kulturer.
Figur 4: Repræsentation af oprensede svampeisolater, dyrket i 7-14 dage i et PDA-dyrkningsmedium. I første og tredje kolonne (A, C, E, G, I og K) ses de registrerede kolonier fra oversiden; Anden og fjerde kolonne (B, D, F, H, J og L) viser henholdsvis de samme kolonier set fra undersiden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentation af urene svampeisolater, dyrket i 7-14 dage i PDA-dyrkningsmedium. I den første kolonne (A, D og G) ses et generelt billede af kolonierne fra oversiden; den anden kolonne (B, E og F) viser kolonierne i detaljer; den tredje kolonne (C, F og I) viser kolonierne fra undersiden. Tallene repræsenterer forskellige svampemorfotyper, der findes i hver skål, og linjerne repræsenterer en subtil afgrænsning mellem de forskellige svampeisolater. Klik her for at se en større version af denne figur.
Konservering af isolater bør ikke foretages ved hjælp af en enkelt opbevaringsmetode, da hver svamp kan være mere eller mindre følsom over for hver af de beskrevne metoder. Det anbefales stærkt at vælge mindst to typer opbevaring for hvert svampeisolat, hvilket garanterer flere chancer for succes med at bevare det. Vi fremhæver, at uigennemtrængeligheden af svampe konserveret i Castellani eller mineralolie forventes efter 6 måneder eller mindre. Forskere bør overveje, om disse er de eneste konserveringsmetoder, der vælges, for at undgå mulige uventede tab af isolater. For at forlænge denne begrænsede periode er det muligt at reaktivere svampeisolaterne ved at dyrke dem i PDA-mediet (39 g/L) i 2-3 uger og derefter opbevare dem igen. Efter en opbevaringsperiode forventes det, at isolaterne udviser en langsommere vækst sammenlignet med den observerede væksthastighed før dens bevaring og kolonier med mindre kraftige aspekter (dvs. mindre tætte, forskellige i farve). Subkultur et par gange i et næringsrigt kulturmedium er nok til at genoprette sådanne egenskaber.
Ved evaluering af koloniernes makromorfologi opnået i isolationsproceduren skal kvalitative data indsamles under hensyntagen til så mange egenskaber som muligt: (a) koloniens farve (top og underside), som kan analyseres ved hjælp af trykte farveguider (f.eks. Rayner28, Kornerup &; Wanscher29, Ridgway30); b) koloniopacitet: gennemsigtig, uigennemsigtig, gennemskinnelig c) diffusible pigmenter i mediet31 (tilstedeværelse/fravær og farve) d) ekssuderer31 (tilstedeværelse/fravær, farve, almindeligt udseende) e) makroskopiske strukturer31 (tilstedeværelse/fravær, type og udseende, f.eks. sklerotier, pycnidia) f) luftmycelier og neddykkede mycelier 19,32,21 (tilstedeværelse/fravær, ringe eller rigeligt) g) margenudseende19 (farve, form, ensartethed - nedsænket eller luftigt) og (h) kolonitopografi (dynget, rynket, kraterformet, fladt osv.), det generelle udseende og tekstur - bomuldsagtig, fløjlsagtig, pulverformet, ulden, talg (voksagtig), glat, kalkagtig, slimet, læderagtig, stikkende osv.19,21.
Figur 6: Makro- og mikromorfologi af en uidentificeret svamp isoleret fra den mycoheterotrofe orkidé Wullschlaegelia aphylla. (A) Øvre og (B) nedre aspekter af kolonien, (C) forstærket billede af lufthyferne (som set i et stereomikroskop). Hyfernes mikromorfologi (D) uden plet og farvet med (E) LPCB og (F) TBO. Forkortelser: c = conidiophore, p = phialide, s = septum. Skalastænger: A, B = 2 cm; C = 2 mm; D-F = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
I figur 6 vises en koloni isoleret fra fusiforme rødder af mycoheterotrofisk orkidé Wullschlaegelia aphylla, der anvender den beskrevne metode. Kolonien er hvidlig til grå på oversiden (figur 6A) og brunlig på undersiden (figur 6B). Det er uigennemsigtigt, med hverken diffusible pigmenter i mediet eller ekssudater. Mycelierne er luftige og rigelige, margenerne er uregelmæssige og luftige, og kolonien har en fløjlsagtig tekstur og en rynket topografi (figur 6A). Makroskopiske strukturer er fraværende.
Diaskulturmetoden er traditionel og fordelagtig, og selvom den er tidskrævende, kan den anvendes til at producere permanente dias, der kan undersøges bagefter. De forskellige farvestoffer, der præsenteres her, kan bruges til at vise vigtige strukturer, og de kræver test i prøverne for at bestemme den mest passende inkubationstid. Congo rød og TBO er pletter til generelle formål. Congo rød er tilstrækkelig til at demonstrere nogle sarte strukturer (yderligere læsning: Malloch22). TBO pletter celleindholdet mere intenst end svampecellevæggen (figur 6F). Selvom det er et sædvanligt farvestof til plantestrukturer og ikke så almindeligt i svampemikroskopi, har TBO en vigtig metakromatisk egenskab33, som favoriserer andre applikationer, såsom svampeanalyse i plantevæv10. LPCB er et meget anvendt farvestof i svampeanalyse, selvom det kræver forsigtighed på grund af phenol. Bomuldsblå (synonym: methylblåt) er pletten, mælkesyre er et clearingmiddel, og phenol er et dræbende middel21. LPCB har en affinitet for chitin og viser sporevægge og ornamenter23,24. Svampeseptaen farves hverken af LPCB (figur 6E) eller TBO (figur 6F), hvilket letter identifikationen af sådanne strukturer. Påføring af pletter er fordelagtigt for at overbevise strukturer, der ikke let ses, når hyfer ikke er farvede (figur 6D).
For DNA-ekstraktion fra svampe og rodprøver skal mængden af formalet prøve i flydende nitrogen, der skal tilsættes ekstraktionsbufferen, overholdes og ikke overstige den mængde, der er angivet i protokollen. Vi bør fremhæve, at en stor mængde behandlet prøve ikke blot repræsenterer opnåelsen af en høj koncentration af DNA uden større ulemper, da det kan kompromittere den endelige DNA-kvalitet betydeligt. Dette sker ved mætning af følgende stadier af DNA-oprensning. Desuden kan koncentrering af formodede forbindelser produceret af planter eller svampe (f.eks. pigmenter, sekundære metabolitter), der er til stede i den endelige opløsning med DNA, virke for at reducere DNA-kvaliteten og / eller hæmme polymerasekædereaktion (PCR). Et andet problem, der kan reducere DNA-kvaliteten betydeligt, er at skrotte kulturmediet helt med svampemycelium og male det, hvilket kraftigt skal undgås. Nogle reagenser fra ekstraktionsproceduren (f.eks. phenol, ethylalkohol, SDS) og andre stoffer (f.eks. Svampepigmenter) kan være hæmmere, der interfererer med PCR.
I DNA-rensningsfasen skal supernatanten ved anvendelse af phenol og chloroform altid repræsentere fasen med færre urenheder, idet den normalt omfatter den klareste fase. I en sådan fase må den nedre fase ikke genvindes, når supernatanten, der skal overføres til nye glas, aspirerer. Ved afslutningen af protokollen skal pelleten (udgjort af DNA) præsentere en gennemskinnelig (meget ønskelig) til hvidlig farve. I tørringstrinnet er det grundlæggende at fortsætte med tørring af DNA'et i en termoblok for fuldstændig fordampning af ethanol. Efter 12 timer ved 4 °C skal pellet have elueret fuldstændigt i den vandige opløsning, der tilsættes rørene, og derefter ikke være synlig. Hvis elueringen ikke er fuldstændig, og DNA-koncentrationen er langt under den ideelle koncentration, er det muligt at holde opløsningen nedkølet i 12 timer mere uden væsentlige tab i dens kvalitet.
DNA-analyserne i softwaren genererer en tabel, som vist i tabel 2, hvor data relateret til DNA-mængde og kvalitet er angivet. DNA-kvantificeringen er givet ved koncentrationen af nukleinsyrer i nanogram pr. mikroliter af en prøve. I betragtning af den molekylære identifikation af isolerede svampe bør DNA-prøver have en koncentration på ca. 200 ng/μL, hvilket er ideelt til PCR-stadier. I tilfælde af prøver med højere koncentrationer af nukleinsyrer skal en alikvot fra prøven fortyndes, hvorved koncentrationen tilnærmes den tidligere nævnte værdi. Prøver med for høje koncentrationer, såsom prøve 1 og 2 i tabel 2, kan tyde på en falsk detektion på grund af forurenende stoffer i opløsningen. I mellemtiden kan prøver med lavere nukleinsyrekoncentrationer, såsom nummer 7 (tabel 2), stadig anvendes til PCR, hvilket er vigtigt at anvende et højere volumen prøve i reaktionerne. Med hensyn til kvalitetsparametrene er det tilfredsstillende, at kvotienterne 260/280 og 260/230 ligger mellem 1,8 og 2,2 som angivet i prøve 3, 5 og 8 (tabel 2). Prøver, der udviser sådanne værdier (som ligger langt under eller over), bør underkastes nye DNA-ekstraktioner som angivet i prøve 9 og 10 i tabel 2. I tilfælde af prøver med en tilstrækkelig mængde DNA og minimalt overstiger det ideelle kvalitetsområde, som foreslået af værdierne 260/280 og 260/230 i nummer 4 og 6 (tabel 2), er fortynding den mest gavnlige procedure til at gøre nukleinsyrekoncentrationen tilstrækkelig til PCR og fortyndede mulige hæmmere, såsom vestigial reagenser fra ekstraktionsproceduren, i prøverne.
| Prøve | Nukleinsyre konc. | Enhed | A260 | A280 | 260/280 | 260/230 | Eksempel Type |
| 1 | 14491.7 | ng/μL | 289.833 | 141.175 | 2.05 | 1.8 | DNA |
| 2 | 13359.3 | ng/μL | 267.187 | 124.607 | 2.14 | 2.15 | DNA |
| 3 | 1137.6 | ng/μL | 22.751 | 10.574 | 2.15 | 2.13 | DNA |
| 4 | 1472.6 | ng/μL | 29.452 | 13.287 | 2.22 | 2.16 | DNA |
| 5 | 3464.8 | ng/μL | 69.295 | 33.329 | 2.08 | 1.88 | DNA |
| 6 | 1884.2 | ng/μL | 37.684 | 17.912 | 2.1 | 1.78 | DNA |
| 7 | 187.6 | ng/μL | 3.751 | 1.834 | 2.05 | 2.06 | DNA |
| 8 | 1580.3 | ng/μL | 31.607 | 15.281 | 2.07 | 1.98 | DNA |
| 9 | 923.3 | ng/μL | 18.466 | 9.196 | 2.01 | 1.37 | DNA |
| 10 | 2414.4 | ng/μL | 48.287 | 21.008 | 2.3 | 3.45 | DNA |
Tabel 2: Genererede resultater i softwaren fra svampe-DNA-prøver analyseret i et spektrofotometer.
Til forskel fra DNA-prøver fra isolerede endofytiske svampe bør DNA-koncentrationen i prøver til metabarkodningsanalyser præsentere enorme mængder ekstraherede DNA-molekyler med høj kvalitet og molekylvægt. Prøverne skal evalueres ved elektroforese i agarosegel, idet der opnås den maksimale integritet med ringe eller ingen udtværing i gelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den overfladiske desinfektion af planteprøver er et af de mest kritiske stadier i den præsenterede protokol. Ingen forurening i PDA-skålene med dråber fra den sidste vask er meget ønskelig. Bakterier observeres ofte som forurenende stoffer i isolationsskålene, normalt mere end luftbårne sporulerende svampe, i betragtning af at endofytiske bakterier også er almindelige inden for plantevæv 3,11. Således er tilsætningen af antibiotika i kulturmediet ved installation af organfragmenterne afgørende. Bedre resultater opnås ved at kombinere forskellige antibiotikatyper, hvilket resulterer i et bredere spektrum af handlinger. En anden vigtig overvejelse er den iboende bias i isolering af svampene, da brug af PDA og AA uundgåeligt vil vælge visse arter og disfavorisere andre. Kombinationen af andre kulturmedier kan minimere bias, men ikke eliminere sådanne begrænsninger9.
Generelt har svampe, der producerer sporer, mens de vokser i petriskåle, højere overlevelsesrater i konserveringsprotokoller, enten ved lavere temperaturer eller ej, og ikke-sporulerende isolater tåler muligvis ikke Castellanis eller mineraloliekonservering34,35,36, så en kryopræserveringsmetode kan være afgørende i sådanne tilfælde. Derudover kan nogle isolater være følsomme over for frysning, og tilsætning af kryoprotektorer hjælper konserveringen, som i den præsenterede metode ved anvendelse af vermiculit18. Koloni- og hyphalkarakteristika kan være nyttige til at gruppere isolater med lignende træk, hvilket letter udvælgelsen til brug i symbiotiske spiringsbehandlinger (som beskrevet af Pena-Passos et al.10). Disse egenskaber bidrager også til at vælge de bevaringsmetoder, der skal anvendes, især i betragtning af sporulation eller fravær.
Morfologisk karakterisering af isolaterne forbedrer og supplerer også morfologiske beskrivelser, der er tilgængelige i specialiseret litteratur, især når de er forbundet med molekylær karakterisering. På trods af at det er en udfordring med mange isolater, er morfologisk karakterisering af svampe tidskrævende og afhænger af offentliggjorte data. Selvom kun den molekylære karakterisering er planlagt til at blive udført, er det tilrådeligt at opretholde et fotografisk register over koloniens udseende (makromorfologi) og offentliggøre det, når det er muligt, for at bidrage til fremtidige identifikationsprocedurer. Det er også vigtigt at vedligeholde fotos af de retter, hvor fragmenter er installeret, for at muliggøre sammenligning mellem de endelige opnåede isolater og de morfotyper, der observeres i installationsskåle. I et sådant tilfælde skal de sammenlignede svampe dyrkes i samme type medium. Yderligere metoder findes i Currah et al.16 til evaluering af almindelige orkidé mycorrhizal svampe, såsom kultur på garvesyremedium (TAM) for at differentiere Epulorhiza (teleomorf: Tulasnella) og Ceratorhiza (teleomorf: Ceratobasidium) slægter og kultur på CMA for at stimulere monilioidceller til karakterisering af svampe fra Rhizoctonia-komplekset.
I betragtning af de detaljerede metoder til at observere svampehyfer under et lysmikroskop er drillemontering og tapemontering hurtigere end diaskultur, selvom drillemonteringsmetoden ikke er tilstrækkelig til analyse af sporer og måling af grenvinkler. Selvklæbende tapemontering bevarer myceliumorganisationen bedre end drillemonteringsteknikken, selvom brug af tape ikke er så pålidelig som diaskultur til måling af grenvinkler (forfatterens observation). På trods af at det er tidskrævende, er diaskultur den mest passende teknik til at producere semi-permanente og permanente dias. Makro- og mikromorfologi analyseres under hensyntagen til litteraturen. Webster og Weber32 er en omfattende generel kilde til information og yderligere referencer. Currah et al.16 og Zettler og Corey37 giver nyttige oplysninger om orkidé mycorrhizal svampe. Selvom Walsh et al.21 og McGinnis31 beskriver svampe af medicinsk betydning, er de også nyttige til generelle egenskaber ved filamentøse svampekolonier, visuel/beskrivende information og yderligere referencer til svampemikromorfologi.
Ifølge Yu et al.38 præsenterer DNA-kvantificeringsanalyserne i et spektrofotometer stor præcision og nøjagtighed, idet de er i overensstemmelse med kvantitative PCR-analyser i realtid. En vigtig observation er, at nogle isolater muligvis ikke giver DNA-prøver, der er tilstrækkeligt rene til de efterfølgende molekylære identifikationsstadier, da mycoheterotrophs svampeendofytter er ekstremt forskellige, især dem, der er forbundet med tropiske planter39, ligesom de producerede metabolitter. Spektrofotometeranalyser kan anvendes til at evaluere sådanne tilfælde og forskellige protokoller eller kommercielle kits, der anvendes til DNA-oprensning af prøverne. De foreslåede efterfølgende trin i molekylær identifikation af isolater er amplifikationen af den interne transkriberede spacer (ITS) region og sekventering. ITS-regionen er et ribosomalt RNA-afstands-DNA, der i vid udstrækning anvendes i den specialiserede litteratur og formelt accepteres som den vigtigste stregkode til svampeidentifikation 9,40. Det kan forstærkes ved PCR med primerne ITS1 og ITS441 og derefter sekventeres i Sanger-platformen42.
Ud over at gøre det muligt at undersøge mikroorganismers rigdom, overflod og taksonomiske sammensætning i miljø- og planteprøver kan metabarkodningsanalyser give resultater af positive eller negative interaktioner mellem disse mikroorganismer12. Macerationsfasen ved hjælp af flydende nitrogen tilsat DNeasy PowerSoil-standardprotokollen sigter mod at bryde så mange svampeceller som muligt i forhold til plantevæv, hvilket muliggør bedre prøveudtagning af svampesamfundet i det macererede væv11. Primervalg for svampesekvenser (stregkoder) i molekylær identifikation skal overveje interferens med plante-DNA. Vi anbefaler brugen af primere, der forstærker variable områder af svamp 18S-genet, for eksempel ITS1-5,8S-ITS243. Efter opnåelse af DNA-prøverne forbereder de efterfølgende trin de metagenomiske biblioteker, som afhænger af den valgte sekventeringsplatform, posterior sekventering af bibliotekerne og analyse af de opnåede data ved hjælp af bioinformatiske værktøjer. Vi anbefaler at bruge platformen Illumina MiSeq, som repræsenterer en billigere mulighed med højt output, der genererer 250 bp sekvenser i korte tidsperioder11,44.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre og ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker for finansiering fra FAPESP (2015/26479-6) og CNPq (447453/2014-9). JLSM takker CNPq for produktivitetstilskud (303664/2020-7). MPP takker Capes (kandidatgradsstipendium, proces 88887.600591/2021-00) og CNPq.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | (from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses) | ||
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A5354 | (for installation of plant fragments; other antibiotics may be used - check step 2.2.1) |
| Autoclave | (from any company, for materials sterilization in many steps) | ||
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A1296 | (for many steps) |
| C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions | Qiagen | 12888-50 | (purchased with DNeasy PowerSoil kit) |
| Centrifuge | Merck/Eppendorf | 5810 G | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Centrifuge tubes | Merck | CLS430828 | (for samples collection) |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Congo red | Supelco | 75768 | (for hyphae staining) |
| Cryotubes | Merck | BR114831 | (for many steps) |
| Ethanol | Supelco | 100983 | It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps) |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Filter paper | Merck | WHA10010155 | (for many steps) |
| Glass test tubes | Merck | CLS7082516 | (for cryopreservation in unhulled rice grains) |
| Glass wool | Supelco | 20411 | (for cryopreservation in unhulled rice grains) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB) |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | 252476 | (for preparing LPCB - hyphae staining) |
| Lactophenol blue solution (LPCB) | Sigma-Aldrich | 61335 | (for hyphae staining) |
| Laminar flow hood | (class I, from any company, for many steps) | ||
| Light microscope | (from any company, for hyphae observation) | ||
| MB Spin Columns | Qiagen | 12888-50 | (purchased with DNeasy PowerSoil kit) |
| Methyl blue (cotton blue) | Sigma-Aldrich | M5528 | (for preparing LPCB - hyphae staining) |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Merck | HS4323 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Microcentrifuge tube (2 mL) | Merck | BR780546 | (for many steps) |
| Mineral oil | (for preservation of fungal isolates) | ||
| Paper bags | Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection) | ||
| Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm) | Merck/Pyrex | SLW1480/10D | (autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones) |
| Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm) | Merck/Aldrich | Z740618 | (for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable) |
| Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm) | Merck/Brand | BR455732 | (for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable) |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | (for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB) |
| Porcelain mortar | Sigma-Aldrich | Z247464 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Porcelain pestle | Sigma-Aldrich | Z247502 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Potato dextrose agar (PDA) | Millipore | P2182 | (for many steps) |
| PowerBead tubes | Qiagen | 12888-50 | (purchased with DNeasy PowerSoil kit) |
| Rapid mounting medium (Entellan) | Sigma-Aldrich | 1.0796 | (for fungi slide culture) |
| Silica gel | Supelco | 717185 | (for cryopreservation in unhulled rice grains) |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine) | (commercial product, for superficial desinfestation) | ||
| Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit) | Qiagen | 12888-50 | (for total DNA extraction from plant organs) |
| Spectrophotometer - Nanodrop 2000/2000c | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | (for total DNA extraction from plant organs) |
| Stereomicroscope | (=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses) | ||
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | (for installation of plant fragments) |
| Thermoblock | Merck/Eppendorf | EP5362000035 | (or from other companies) |
| Tissue homogenizer and cell lyzer | SPEX SamplePrep | 2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs) | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich/Harleco | 364-M | (for hyphae staining) |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | T9531 | (for cryopreservation in vermiculite) |
| Tris Base Solution (Tris) | Sigma-Aldrich | T1699 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Unhulled rice grains | (for cryopreservation) | ||
| U-shaped glass rod | (or an adaptation - check step 5.4.1, for fungi slide culture) | ||
| Vermiculite | Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite) | ||
| Vortexer | Sigma-Aldrich/BenchMixer | BMSBV1000 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | (for cryopreservation in vermiculite) |
References
- de Azevedo, J. L.
- Stone, J. K., Bacon, C. W., White, J. F. An overview of endophytic microbes: endophytism defined. Microbial Endophytes. , 17-44 (2000).
- Schulz, B., Boyle, C. What are Endophytes. Microbial Root Endophytes. , Springer-Verlag. Berlin. 1-13 (2006).
- Smith, S. E., Read, D. J. Mycorrhizal Symbiosis. , Elsevier Science Academic Press. London. (2008).
- Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jersáková, J., Těšitelová, T. Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements. Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).
- Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style. Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).
- Ma, X., Kang, J., Nontachaiyapoom, S., Wen, T., Hyde, K. D. Non-mycorrhizal endophytic fungi from orchids. Current Science. 109 (1), 72-87 (2015).
- Favre-Godal, Q., Gourguillon, L., Lordel-Madeleine, S., Gindro, K., Choisy, P. Orchids and their mycorrhizal fungi: an insufficiently explored relationship. Mycorrhiza. 30 (1), 5-22 (2020).
- Sun, X., Guo, L. -D. Endophytic fungal diversity: review of traditional and molecular techniques. Mycology. 3 (1), 65-76 (2012).
- Pena-Passos, M., Sisti, L. S., Mayer, J. L. S. Microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds. Journal of Visualized Experiments. (183), e63777 (2022).
- Araújo, W. L., et al. Endophytic microorganisms: Theoretical and Practical Aspects of Isolation and Characterization. 1st ed. 1, Santarém: UFOPA. 257 (2014).
- de Souza, R. S. C., et al. Unlocking the bacterial and fungal communities assemblages of sugarcane microbiome. Scientific Reports. 6, 28774 (2016).
- Sisti, L. S., et al. The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn. Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).
- Araújo, W. L., et al. Variability and interactions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks. Canadian Journal of Microbiology. 47 (3), 229-236 (2001).
- Castellani, A. Further researches on the long viability and growth of many pathogenic fungi and some bacteria in sterile distilled water. Mycopathologia. 20 (1-2), 1-6 (1963).
- Currah, R. S., Zelmer, C. D., Hambleton, S., Richardson, K. A.
- Freitas, E. F. S., et al. Diversity of mycorrhizal Tulasnella associated with epiphytic and rupicolous orchids from the Brazilian Atlantic Forest, including four new species. Scientific Reports. 10 (1), 7069 (2020).
- Sato, M., Inaba, S., Noguchi, M., Nakagiri, A. Vermiculite as a culture substrate greatly improves the viability of frozen cultures of ectomycorrhizal basidiomycetes. Fungal Biology. 124 (8), 742-751 (2020).
- Pereira, O. L., Kasuya, M. C. M., Borges, A. C., Araújo, E. F. D. Morphological and molecular characterization of mycorrhizal fungi isolated from neotropical orchids in Brazil. Canadian Journal of Botany. 83 (1), 54-65 (2005).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Walsh, T. J., Hayden, R. T., Larone, D. H. Larone's Medically Important Fungi: A Guide to Identification. , ASM Press. (2018).
- Malloch, D. Moulds: Isolation, Cultivation, Identification. , Available from: http://website.nbm-mnb.ca/mycologywebpages/Moulds/Moulds.html (1997).
- Smith, P. Microscopy: Chemical Reagents. British Mycological Society. , Available from: https://www.britmycolsoc.org.uk/field_mycology/microscopy/reagents (2022).
- Senanayake, I. C., et al. Morphological approaches in studying fungi: Collection, examination, isolation, sporulation and preservation. Mycosphere. 11 (1), 2678-2754 (2020).
- Slifkin, M., Cumbie, R. Congo red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi. Journal of Clinical Microbiology. 26 (5), 827-830 (1988).
- Raeder, U., Broda, P. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology. 1 (1), 17-20 (1985).
- Martins, M. K., et al. Molecular characterization of endophytic microorganisms. Endophytic microorganisms: theoretical and practical aspects of isolation and characterization. 1st edition. , Santarém: UFOPA. 189-211 (2014).
- Rayner, R. W. A Mycological Colour Chart. Commonwealth Mycological Institute. , (1970).
- Kornerup, A., Wanscher, J. H. Methuen Handbook of Colour. Methuen handbook of colour. , Methuen & Co. Ltd. London. (1967).
- Ridgway, R. Color Standards and Color Nomenclature. , Washington, DC. Published by the author (1912).
- McGinnis, M. R. Laboratory Handbook of Medical Mycology. , Elsevier Science. (2012).
- Webster, J., Weber, R. Introduction to Fungi. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
- Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (2), 251-255 (2012).
- Smith, D., Onions, A. H. S. A comparison of some preservation techniques for fungi. Transactions of the British Mycological Society. 81 (3), 535-540 (1983).
- Ryan, M. J., Smith, D., Jeffries, P. A decision-based key to determine the most appropriate protocol for the preservation of fungi. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 16 (2), 183-186 (2000).
- Lalaymia, I., Cranenbrouck, S., Declerck, S. Maintenance and preservation of ectomycorrhizal and arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 24 (5), 323-337 (2014).
- Zettler, L. W., Corey, L. L. Orchid mycorrhizal fungi: isolation and identification techniques. Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses-Methods and Protocols. , 27-59 (2018).
- Yu, S., Wang, Y., Li, X., Yu, F., Li, W. The factors affecting the reproducibility of micro-volume DNA mass quantification in Nanodrop 2000 spectrophotometer. Optik. 145, 555-560 (2017).
- Martos, F., et al. Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids. New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).
- Schoch, C. L., et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6241-6246 (2012).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: biological and methodological variability. Applied and Environmental Microbiology. 67 (10), 4479-4487 (2001).
- Metzker, M. L.
